Summary
نحن نقدم طريقة خالية من المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا خالية) للحصول على الخلايا مع النمط الظاهري العصبية من خلايا الدم الطرفية المبرمجة. تنشيط مسار الإشارات المرتبطة بروتين الإنسان الجديد المرتبطة GPI يكشف عن طريقة فعالة خالية من المعدلة وراثيا للحصول على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
Abstract
تحدث العديد من الاضطرابات العصبية البشرية بسبب انحطاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ. بسبب القيود المفروضة في الاستراتيجيات الدوائية وغيرها من الاستراتيجيات العلاجية، لا يوجد حاليا علاج متاح للدماغ المصاب أو المريض. استبدال الخلايا يظهر كاستراتيجية علاجية واعدة للظروف العصبية. حتى يومنا هذا، تم إنشاء الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بنجاح من أنسجة الجنين أو الخلايا الجنينية البشرية (ES) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). بدأت عملية التمايز عن طريق تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتبط ب GPI ، والذي يؤدي إلى توليد خلايا جذعية متعددة القدرات. هذه الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) تفرق في المختبر إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي كما هو مبين في المجهر الساطع والمناعة. يؤكد التحليل الهيكلي الفائق لهذه الخلايا عن طريق المجهر الإلكتروني بنيتها البدائية وكذلك مورفولوجيا تشبه الخلايا العصبية وخصائص دون الخلوية.
Introduction
تطوير طرق أبحاث الخلايا الجذعية الأساسية وقبل السريرية يشجع التطبيق السريري للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للأمراض العصبية. يعتمد هذا العلاج المحتمل بشكل حاسم على طريقة توليد الخلايا العصبية البشرية مما يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي1.
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) تجديد الذات وتفرق إلى خلايا عصبية جديدة طوال الحياة في عملية تسمى تكوين الأعصاب الكبار. فقط مناطق الدماغ المقيدة جدا تؤوي NSCs المختصة لتوليد الخلايا العصبية حديثي الولادة في مرحلة البلوغ. يمكن أن تؤدي هذه NSCs إلى خلايا عصبية ناضجة ، والتي تشارك في التعلم والذاكرة ، وبالتالي استبدال الخلايا العصبية المفقودة أو التالفة. لسوء الحظ، هذه NSCs موجودة بكميات محدودة وهذا التكوين العصبي المحدود ينخفض بسرعة خلال نمو الأحداث2. لذلك ، يجب النظر في مصادر أخرى للخلايا العصبية في هدف العلاج الخلوي.
من الصعب علاج الأمراض العصبية التنكسية باستخدام النهج الدوائية القياسية. وتستند استراتيجيات علاجية جديدة لاحتضان العديد من الاضطرابات العصبية التي لا يمكن عصبها على علاجات استبدال الخلايا من الأنسجة المريضة والمصابة. زرع NSC يمكن أن تحل محل الخلايا التالفة وتوفير آثار مفيدة. وتشمل المصادر الأخرى لاستبدال الخلايا العصبية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC)، والتي تستمد من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الأريمية الثديية3، وكذلك iPSCs4، والتي لديها قدرة واسعة على التجديد الذاتي مثل ESCs وقادرة على التفريق إلى أنساب الخلايا المختلفة. ويمكن أيضا أن تنشأ NSCs عن طريق إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية البشرية تجنب الدولة متعددة القدرات5.
العلاج ببدائل الخلايا لا يزال يمثل مشكلة صعبة. على الرغم من أن ESC أو الجنين أو iPS يمكن أن يكون مصدرا لتوليد الخلايا العصبية لعلاج العديد من الأمراض العصبية غير القابلة للشفاء ، فإن استبدال خلايا SCs البالغة الذاتية للأنسجة التالفة هو بديل أفضل يتحايل على المخاوف المناعية والأخلاقية والسلامة.
تفعيل البروتين البشري المرتبط ب GPI عن طريق ربط الأجسام المضادة عبر الفوسفور من PLCа/PI3K/Akt/mTor/PTEN يبدأ متمايزة خلايا سلف الدم وتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs)6. هذه الخلايا تفرق في المختبر نحو الخلايا العصبية كما أكد عن طريق التحليل المجهري للإلكترون برايتفيلد والمناعة وانتقال الإلكترون (TEM).
في هذا العمل نقوم بوصف الجيل الخالي من المعدلات وراثيا من BD-PSCs وإعادة تمايزها بنجاح إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على الموافقات الأخلاقية عند إجراء التجارب.
1. عزل خلايا الدم المحيطي البشري أحادية النوى (PBMNCs)
- التأكد من أن جميع المتبرعين وقعوا على موافقة مستنيرة قبل سحب الدم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- خذ 30 مل من الدم من المتبرعين الأصحاء من قبل الموظفين الطبيين المدربين وفقا للبروتوكول القياسي.
- عزل PBMNCs حسب كثافة التدرج الوسائط. استخدم 10 مل من الوسائط مع 25 مل من الدم المخفف بموجب الفوسفات العازل (PBS)، والطرد المركزي عند 300 × ز لمدة 30 دقيقة.
- عزل الطبقة الفاصلة بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق الأنابيب. اغسل الخلايا المعزولة ب 5 مل من برنامج تلفزيوني معقم وطارد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق.
- عد عدد الخلايا بالطرق القياسية باستخدام غرفة العد.
2. تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتكز على GPI بواسطة الأجسام المضادة التي تتشابك على سطح PBMNCs
- ضع الخلايا أحادية النووية 6 ×10 6 (MNCs) في أنابيب 15 مل وأد ربط الأجسام المضادة عن طريق احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الخاصة ببروتين الغشاء المرتبط ب GPI البشري (30 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة في PBS مع 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA) عند 37 درجة مئوية.
- استبدال وسيط الحضانة مع المتوسطة Dulbecco المعدلة من إيسكوف تستكمل مع مصل البقر الجنين 10٪ (FBS).
- تنمو الخلايا في 15 مل أنابيب البوليسترين، ووضع الأنابيب في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 8-10 أيام (دون اهتزاز). على D5، إضافة إضافية 1-2 مل من المتوسطة إيسكوف تكملها مع 10٪ FBS إلى كل أنبوب 15 مل.
3. فرز الخلايا المتمايزة التي تم إنشاؤها حديثا
- عد الخلايا مع عداد الخلية الآلي (18 μL تعليق الخلية + 2 ميكرولتر صبغة مضان) أو في غرفة العد.
- الطرد المركزي تعليق الخلية المستزرعة (5-7 × 106) في 300 × ز لمدة 10 دقيقة ونسبر الناسخ الناتج مع ماصة باستور معقمة.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من درجة الحموضة برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا 7.2، 0.5٪ BSA و 2 M M EDTA.
- أضف CD45 حبات مغناطيسية إيجابية بحجم نانو (80 ميكرولتر) إلى تعليق الخلية واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- غسل الخلايا بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت PBS والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة.
- إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS.
- غسل العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا ووضعه في المجال المغناطيسي.
- ضع تعليق الخلية على العمود واغسله ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (مرتين) وتدفق الطرد المركزي الذي يحتوي على خلايا سلبية CD45. جمعها في المتوسطة إيسكوف تكملها مع 1٪ BSA.
- عد الخلايا في غرفة العد.
4. إعداد أطباق زراعة الخلايا للتمايز العصبي للخلايا الجذعية التي تم إنشاؤها حديثا
- معطف الأوعية الثقافة مع بولي-L-ornithine واللامينين لنمو الخلايا العصبية.
- ضع الأغطية الزجاجية في لوحات 4-جيدا ومعطف مع 1:5 المخفف بولي-L-ornithine (0.1 ملغ/مل في ddH2O) في DDH2O. وضع الأغطية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم يغسل مع DDH2O.
- تذوب ببطء صفح (0.5-2.0 ملغ / مل) وإضافة إلى الجزء العلوي من coverlips. احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- إعداد الحث العصبي متوسط N2 تتكون من 49 مل من D-MEM/F12, 500 ميكرولتر من N2 الملحق, 400 ميكرولتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA), الحل الأساسي FGF في 20 نانوغرام / مل التركيز النهائي (أعدت من 100 ميكروغرام / مل محلول الأسهم), وهيبارين في 2 نانوغرام / مل التركيز النهائي.
- إزالة صفح الزائدة عن طريق pipetting وإضافة N2 الخلايا العصبية المتوسطة إلى أطباق الثقافة.
5. زراعة خلايا الدم المتمايزة العصبية
- الثقافة BD المشتقة CD45 الخلايا السلبية على الأغطية الزجاجية المغلفة بالنعناع / ornithine لمدة 2 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في N2 المتوسطة لبدء التمايز العصبي للخلايا التي ولدتها BD حديثا.
- خلايا الثقافة كذلك في الوسط التمايز العصبي تتكون من 48 مل من المتوسط العصبي, 500 ميكرولتر من L-الجلوتامين, 1 مل من الملحق B27, 500 ميكرولتر من NEAA, 50 ميكرولتر من العامل العصبي المشتق من الدبقية البشرية المؤتلفة (GDNF) عند 5 ميكروغرام/250 ميكرولتر في PBS/0.1٪ BSA، و50 ميكرولتر من الدماغ البشري المؤتلف عامل الضوائية العصبية المشتقة (BDNF) في 5 ميكروغرام/200 ميكرولتر في PBS/0.1٪ BSA و 50 ميكرولتر من محلول حمض الأسكوربيك 2.9 غرام/50 مل في برنامج تلفزيوني. ضع لوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
6. تحليل المجهر المناعي للخلايا العصبية المشتقة من الدم
- ثقافة الخلايا كما هو موضح أعلاه لمدة 16 يوما وإزالة وسائل الإعلام.
- احتضان مع مثبت قبل الحارة تتكون من 75 مل من الماء العقيم، 4 غرام من بارافورمالديهايد. إضافة 10 N NaOH حسب الحاجة ويحرك حتى ينجلي الحل. ثم أضف 10 مل من 10x PBS، 0.5 مل من MgCl2، 2 مل من 0.5 M EGTA، و 4 غرام من السكروز. تيترات إلى درجة الحموضة 7.4 مع 6 N HCl، وجلب إلى 100 مل من المياه العقيمة لمدة 15 دقيقة، وفقا لمارسينكووآخرون.
- تجاهل المثبت وغسل الخلايا 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة. إضافة على الفور الطازجة 0.3٪ تريتون X-الحل و permeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق. غسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة حل حظر التي أدلى بها برنامج تلفزيوني و 5٪ BSA.
- منع الخلايا في درجة حرارة الغرفة على لوحة الروك لمدة 1 ساعة.
- إعداد التخفيف المناسب من الأجسام المضادة في 1٪ BSA / PBS واحتضان الخلايا مع تخفيف الأجسام المضادة على لوحة الروك لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، واحتضان الخلايا مع DAPI وجبل coverlips مع وسائل الإعلام المتصاعدة للتصور على المجهر.
ملاحظة: يتم سرد الأجسام المضادة المسماة مباشرة المستخدمة في هذه التجربة في جدول المواد.
7. تحليل المجهر الإلكتروني انتقال الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا
- بذور الخلايا لTEM في الشرائح غرفة 8-جيدا.
- إصلاح الخلايا في 3.5٪ الجلوتارالدهيد لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، بعد الإصلاح في 2٪ OsO4 لمدة ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة ووصمة عار في خلات أورانيل 2٪ في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة 30 دقيقة.
- وأخيرا، شطف الخلايا في الماء المقطر، وتجفيفه في الإيثانول وتضمينها في راتنج الايبوكسي بين عشية وضحاها. في اليوم التالي نقل العينات إلى فرن 70 درجة مئوية لمدة 72 ساعة لتصلب الراتنج.
- فصل ثقافات الخلايا المضمنة من الشريحة غرفة والغراء لكتل araldite.
- قطع أقسام شبه رقيقة المسلسل (1.5 ميكرومتر) مع آلة، جبل على الزجاج الشرائح وصمة عار طفيفة مع الأزرق toluidine 1٪.
- الغراء المقاطع المحددة شبه رقيقة لكتل araldite وفصلها عن الشريحة الزجاجية عن طريق تجميد المتكررة (في النيتروجين السائل) وذوبان الجليد.
- إعداد أقسام ultrathin (0.06-0.08 ميكرومتر) مع آلة ومزيد من التباين مع سترات الرصاص.
- الحصول على ميكروجراف باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي مع الكاميرا الرقمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقدم النتائج أدلة على أن هذه الطريقة الجديدة الخالية من جنرال موتورز قادرة على إعادة خلايا سلف الدم إلى حالتها الأكثر بدائية دون العمل مباشرة على الجينوم البشري.
لقد أظهرنا سابقا أن البروتين المرتبط ب GPI يبدأ الربط المتبادل بين الأجسام المضادة المحددة عبر PLCа/IP3K/Akt/mTOR/PTEN من الجينات ذات الصلة بالتنمية المحفوظة للغاية مثل WNT و NOTCH و C-Kit ، وبالتالي بدء عملية dedifferentiation تؤدي إلى الخطوة الأولى إلى جيل من HSCs والثانية والأخيرة لجيل من BD-PSCs6،8.
تعرضت ثقافات MNC المنشطة للفرز المغناطيسي المناعي باستخدام الميكروبات CD45. تم الاحتفاظ بخلايا الدم الناضجة التي لا يمكن إعادة برمجتها بهذه الطريقة (مثل الخلايا الإيجابية CD45) على العمود ، في حين تم استخدام الكسر السلبي الذي يحتوي على خلايا مبرمجة (خلايا سلبية CD45) لتوليد خلايا نسب الخلايا العصبية المختلفة.
درسنا لأول مرة الجوانب المورفولوجية للخلايا الطرفية ثنائية الأبعاد المتمايزة عن طريق الضوء وTEM. كما هو مبين في الشكل 1، محددة GPI الراسية الأجسام المضادة للبروتين الجليكوبروتين الوصلات المتقاطعة من الشركات متعددة التنامي البشري يولد تزايد مطرد في عدد السكان الجدد من الخلايا (الشكل 1A). حللنا هذه الخلايا عن طريق TEM. الخلايا ثنائية التمايز صغيرة الحجم وتظهر خصائص الخلايا الأغرانية غير الناضجة ، مع خلايا عضوية أقل تدريجيا ونوى كبيرة مع الكروماتين المكثف ، على غرار ESCs (الشكل 1B). وأظهرت الثقافات غير المعالجة اتجاها نحو الاختفاء التدريجي.
تعرضت الخلايا السلبية BD-CD45 لتمايز الخلايا العصبية في خطوتين. بدأنا التمايز نحو الأنساب العصبية عن طريق بذر الخلايا السلبية CD45 على لوحات الثقافة المغلفة بولي-L-ornithine/laminin لمدة 2 أيام في N2 المتوسطة التالية الثقافة في وسط التمايز العصبي. تم الحصول على صور برايتفيلد في الأيام 4 و 8 و 10 و 14 و 30 على التوالي عند بدء التمايز العصبي للخلايا الجذعية التي يولدها BD.
في وقت مبكر من 4 أيام بعد بدء التمايز المستهدف للخلايا التي تم إنشاؤها حديثا ، يمكن الكشف عن أول خلايا تشبه الخلايا العصبية ذات الهياكل المتفرعة الطويلة. نلاحظ التغيرات المورفولوجية من D2 إلى D30 مع هيكل أكثر تعقيدا بما في ذلك تشعبات ، مما يعني عملية نشطة نحو التمايز إلى الأنساب العصبية طوال الفترة الزمنية للثقافة(الشكل 2). لتأكيد السمات العصبية للخلايا المعاد تمييزها بعد زراعة لهم في وسط الخلايا العصبية لمدة 16 يوما، تم إصلاح الخلايا وفقا للبروتوكول السابق7،وتم إجراء الكيمياء المناعية (ICC) باستخدام الكشف عن الأجسام المضادة إلى نستين، البروتين الحمضي الرجفان الدبقية (GFAP)، البروتين المرتبطة microtubule 2 (MAP2) والفئة الخاصة بالخلايا العصبية الثالث بيتا توبولين (Tuj1).
GFAP هو البروتين الذي يشكل جزءا من الهيكل الخلوي في الخلايا الفلكية التي تمثل خيوط وسيطة رئيسية من الخلايا الفلكية الناضجة. كما هو مبين في الشكل 3، والأجسام المضادة لGFAP تعترف هذه الهياكل في الخلايا العصبية التي تم إنشاؤها حديثا ، مما يؤكد أن BD - PSCs قادرة على إعادة التمايز نحو الخلايا الفلكية البشرية9.
MAP2 هو بروتين الهيكل الخلوي الذي يرتبط توبولي ويستقر microtubules. يتم التعبير عنه داخل المحاور والتشعبات وأجسام الخلايا وهذا التعبير هو الأنسجة والتنمية محددة. تؤكد نتائج الفحص المجهري المناعي التعبير عن هذا البروتين في الخلايا المتمايزة10.
Tuj1 هو علامة الخلايا العصبية النموذجية. وظيفتها هي تحقيق الاستقرار في microtubili في جسم الخلية العصبية والمكونات. كما أنها متورطة في النقل المحوري11. أكدت الخلايا التي أعيد تمييزها حديثا بوضوح التعبير عن هذا البروتين في D16 عند بدء التمايز العصبي تحت الحالة الموصوفة هنا.
تم تمييز نستين لأول مرة في NSCs ويمثل بروتين الخلايا الجذعية الظهارية العصبية ، والذي ينتمي إلى بروتين خيوط وسيطة (IF)12 يميز خلايا السلف العصبية عن الخلايا العصبية الأكثر تميزا. يتم التعبير عن هذه البروتينات IF في الغالب في الخلايا العصبية حيث تشارك في النمو الشعاعي للمكون، ولكنها موجودة أيضا في عدد من الأنسجة الإضافية. يتم التعبير عن نستين كعلامة على NSCs في الغالب بشكل ضعيف في الخلايا الموجودة بالفعل على الطريق للتمييز إلى أنساب عصبية محددة كما هو الحال مع خلايا BD-re-differentiated في D16.
الشكل 1:جيل الخلايا الجذعية (متعددة القدرات) المتمايزة. (أ) نمت الخلايا أحادية النووية المعزولة في Ficoll في وسط إيسكوف مع استكمال 10٪ FBS. تم أخذ الصور الدقيقة للخلايا المستزرعة المنشطة في الأيام 1 و 5 و 10 على التوالي. ودرست الشركات غير المنشطة متعددة الأجهزة كعنصر تحكم. شريط المقياس: 50 ميكرومتر (ب) تحليل TEM للخلايا التي تم إنشاؤها حديثا طوال وقت الثقافة يظهر أن العضيات من الخلايا الناضجة (D1) تختفي تدريجيا (D8)، مما يؤدي إلى توليد خلايا متمايزة تماما تشبه ESCs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعادةالتمايز العصبي ل BD-PSCs. (أ) وضعت خلايا متمايزة BD في أطباق الثقافة المغلفة أورنيثين / لامينين ومثقفة لمدة 30 يوما على النحو المبين في البروتوكول. يتم أخذ الصور الدقيقة في الأيام 4 و 8 و 10 و 14 و 30 على التوالي ، بعد النمو في ظروف التمايز العصبي. غيرت معظم الخلايا في الثقافة مورفولوجيا من الأشكال الكروية الصغيرة إلى أشكال أكبر وممدودة وفي بعض الحالات خلايا متفرعة. شريط المقياس: نمت 100 ميكرومتر (ب) خلايا BD-dedifferentiated لمدة 16 يوما في الوسط العصبي، ثابتة في الجلوتارالدهيد وتحليل EM أجريت على النحو المبين في قسم البروتوكول. أظهر جسم الخلية وعمليات هذه الخلايا تعقيدا أعلى من تلك الموجودة في الخلية غير المتمايزة من حيث العضيات والهيكل الخلوي الذي يمثل كثافة عالية من السيسترناي المكدس من الشبكية الإنتوبلازمية الخام وحزم وفيرة من خيوط الأكتين (أ، ب). على عكس خلايا BD غير المتمايزة ، فإن الخلايا المتنامية في وسائط التمايز غالبا ما تنشئ جهات اتصال من خلية إلى خلية. وشملت بعض هذه الاتصالات المتخصصة الجسم الخلوي (ج) في حين أن البعض الآخر ينطوي على العمليات الخلوية بطريقة تشبه neurite (د). أشرطة المقياس: (أ) 20 ميكرومتر؛ (ب) 20 ميكرومتر؛ (ب) 20 ميكرومتر؛ (ب) 20 ميكرومتر؛ (ب (ب-د)، 500 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:مناعة الخلايا العصبية التي تم إنشاؤها حديثا. تم استزراع الخلايا المتمايزة BD كما هو موضح في البروتوكول لمدة 16 يوما وتم إجراء تحليل الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة لعلامات الخلايا العصبية nestin و GFAP و MAP2 و Tuj1. تظهر صور دقيقة من الخلايا المعاد تمييزها مصحوبة بصور ذات فلورة مناعية مع DAPI كتلطيخ نووي ، بالإضافة إلى تلطيخها بالأجسام المضادة ذات الصلة. يصور هي الحقول التي تظهر مجموعة معينة من السكان التي تعبر عن واحدة من مميزة محددة علامة الخلايا العصبية لخطوط محددة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يتم عرض المراقبة في الشكل التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: التحكم في الخلايا المتمايزة BD. تم استزراع الخلايا غير المتمايزة المشتقة من BD في وسيط Dulbecco المعدل في Iscove المكمل بنسبة 10٪ FBS لمدة 16 يوما كما هو موضح في البروتوكول وملطخا بالأجسام المضادة ل nestin GFAP و Tuj1 و MAP2. تم استخدام DAPI للتلطيخ النووي. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعتمد طريقة إعادة برمجة الخلايا البشرية غير المعدلة وراثيا الموصوفة في هذا العمل على تنشيط الغشاء إلى النواة لآلات الإشارات (الآلات) وراء بروتين الغشاء البشري المرتبط ب GPI الذي يبدأ عملية التمايز مما يؤدي إلى توليد الجسم الحي السابق وتوسيع PSCs ذاتية التجديد التي يتم الحصول عليها من الدم المحيطي البشري غير المتلاعب به. هذه الخلايا عندما مثقف في وسائل الإعلام المناسبة قادرة على إعادة التمايز إلى خلايا تنتمي إلى طبقات جرثومية مختلفة6.
تظهر البيانات المقدمة في هذا العمل أن خلايا BD-PSCs الخالية من جنرال موتورز عندما يتم استزراعها في وسائط التمايز العصبي اكتسبت نمطا فينوبيا مختلفا تماما ، مع أشكال ممدودة ، وتطوير أعلى لعضياتها وأنشأت تفاعلات أكثر تعقيدا بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، إعادة التمايز باستخدام حالة وصفها هنا، يعني التمايز العصبي نحو الأنساب العصبية المختلفة.
للحصول على العدد الأمثل وأفضل نوعية من الخلايا المبرمجة لاستخدامها في دراسات إعادة التفريق، قد تكون الاستعدادات MNC جديدة مفيدة بالمقارنة مع الاستعدادات MNC المجمدة. يمكن أن تكون طريقة الفرز المغناطيسي المناعي التي تفصل BD-PSCs عن الخلايا المتمايزة بشكل نهائي والتي لا يمكن إعادة برمجتها بهذه الطريقة غير مكتملة تتطلب تكرار الإجراء ، وهو أمر مرهق للغاية للخلايا ويؤدي إلى وفاتها المبكرة.
وتتعلق الخطوة الحاسمة في البروتوكول بعدد ونوعية الشركات عبر الوطنية التي يمكن الحصول عليها بذلك الأسلوب الموصوف. تعديل وسائل الإعلام التمايز العصبي وكذلك وقت الثقافة يمكن أن تحسن إمكانات التمايز من BD-PSCs، مما يؤدي إلى توليد أنواع محددة من الخلايا العصبية.
وهناك قيود على هذا الأسلوب هو الطبيعة غير المسخية لهذه الخلايا المبرمجة لأنه ليس من الممكن لتوليد خطوط الخلية مع هذا الأسلوب. وبمجرد أن تصل الخلايا المتمايزة إلى المرحلة النهائية، وهي مرحلة الخلايا المتعددة الشخصيات، فإنها تصبح في معظمها هادئة ويجب أن يكون جزء جديد من الشركات المتعددة الأجهزة متمايزا مرة أخرى للحصول على عدد أكبر من مركبات ثنائية الأبعاد- PSCs.
تعتمد إعادة البرمجة الموصوفة هنا على تنشيط الربط المتبادل للأجسام المضادة على سطح خلايا السلف في الدم. يوفر هذا النموذج العديد من المزايا المحتملة فيما يتعلق بالسلامة السريرية بالمقارنة مع أساليب جنرال موتورز. يمكن تحقيق هدف تحقيق الخلايا الجذعية الذاتية لتوليد الأنسجة العصبية (الأنسجة) عن طريق الحد الأدنى من التلاعب في الجسم الحي؛ ولذلك تشير بقوة إلى أن هذا العلاج بالخلايا يمكن أن يكون مرشحا واعدا لنهج سريري فعال وآمن في علم الأعصاب.
مرض باركنسون ومرض الزهايمر والكيمياء الدماغية هي من بين الأمراض التي تتحمل أعلى العبء الاجتماعي والاقتصادي للمجتمع في أوروبا والعالم. ومن المتوقع أن يزداد عبء الاضطرابات العصبية مع شيخوخة السكان، ليصبح مشكلة اجتماعية واقتصادية هامة ويخلق حاجة ماسة إلى حل للمشكلة. وتفتح الطريقة المعروضة سبيلا جديدا للاستراتيجيات العلاجية غير الغازية من خلال استخدام إجراء بسيط وفعال من حيث التكلفة لتوليد مجموعات مناسبة من الخلايا الجذعية الذاتية التي تحمل الأمل في علاج الأمراض العصبية المستعصية حاليا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلف المقابلة تعلن أنها صاحب براءة اختراع تتعلق رواية الإنسان GPI المرتبطة البروتين فضلا عن أنها شاركت في تأسيس ويعمل في ACA CELL التكنولوجيا الحيوية. ويعلن أصحاب البلاغ الآخرون أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
مكرسة لذكرى الدكتور راينر سافريش.
يشعر المؤلفون بالامتنان بشكل خاص لخوسيه مانويل غارسيا فيردوغو وفيسنتي هيرانز بيريز على إجراء تجارب EM وتحليلها في مختبر البيولوجيا العصبية المقارنة، معهد كافانيليس للتنوع البيولوجي والبيولوجيا التطورية، جامعة فالنسيا، CIBERNED، فالنسيا، إسبانيا، والذي تم دعمه بتمويل بحثي من منحة بروميتيو لمجموعات أبحاث التميز PROMETEO/2019/075. بقية هذا العمل كان مدعوما من قبل ACA CELL التكنولوجيا الحيوية GmbH هايدلبرغ، ألمانيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
