Summary
Vi præsenterer en genetisk modificeret-fri (GM-fri) metode til at opnå celler med en neuronal fænotype fra omprogrammerede perifere blodlegemer. Aktivering af en signalvej, der er knyttet til nyt humant GPI-forbundet protein, afslører en effektiv GM-fri metode til at opnå menneskelige pluripotente stamceller.
Abstract
Mange menneskelige neurologiske lidelser er forårsaget af degeneration af neuroner og gliaceller i hjernen. På grund af begrænsninger i farmakologiske og andre terapeutiske strategier, er der i øjeblikket ingen kur til rådighed for den sårede eller syge hjerne. Celle udskiftning fremstår som en lovende terapeutisk strategi for neurodegenerative tilstande. Den dag i dag er neurale stamceller (NSC'er) med succes blevet genereret fra fostervæv, menneskelige embryonale celler (ES) eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC). En proces med dedifferentiering blev indledt ved aktivering af det nye menneskelige GPI-forbundet glycoprotein, som fører til generering af pluripotente stamceller. Disse blod-afledte pluripotente stamceller (BD-PSCs) differentiere in vitro i celler med en neural fænotype som vist ved brightfield og immunofluorescens mikroskopi. Ultrastrukturel analyse af disse celler ved hjælp af elektronmikroskopi bekræfter deres primitive struktur samt neuronal-lignende morfologi og subcellulære egenskaber.
Introduction
Udvikling af grundlæggende og prækliniske stamcelleforskningsmetoder tilskynder til klinisk anvendelse af stamcellebaserede terapier til neurologiske sygdomme. En sådan potentiel terapi afhænger kritisk af metoden til generering af menneskelige neurale celler, der fører til funktionel genopretning1.
Neurale stamceller (NSC'er) selvfornyer og differentierer sig til nye neuroner gennem hele livet i en proces kaldet voksen neurogenese. Kun meget begrænsede hjerneområder har NSC'er, der er kompetente til at generere nyfødte neuroner i voksenalderen. Sådanne NSC'er kan give anledning til modne neuroner, som er involveret i læring og hukommelse og dermed erstatte tabte eller beskadigede neuroner. Desværre er disse NSC'er til stede i begrænsede mængder, og denne begrænsede neurogenese falder hurtigt under ungdomsudvikling2. Derfor skal andre kilder til neurale celler overvejes i et celleterapimål.
Degenerative neurologiske sygdomme er vanskelige at helbrede ved hjælp af standard farmakologiske tilgange. Nye terapeutiske strategier for at omfavne mange uigennemsigelige neurologiske lidelser er baseret på celle udskiftning behandlinger af syge og sårede væv. NSC-transplantation kan erstatte beskadigede celler og give gavnlige virkninger. Andre kilder til neurale celle udskiftning omfatter menneskelige embryonale stamceller (ESC), som er afledt af den indre cellemasse af pattedyr blastocyster3, samt iPSCs4, som har omfattende selvfornyelse kapacitet som ESC'er og er i stand til at differentiere i forskellige celle afstamning. NSC'er kan også genereres ved direkte omprogrammering fra menneskelige fibroblaster, der undgår pluripotent tilstand5.
Celleerstatningsterapi er stadig et udfordrende problem. Selvom ESC, føtal, eller iPS kan være en kilde til generation af neuronale celler til behandling af mange uhelbredelige neurologiske sygdomme, autologe voksne SCS celle udskiftning af beskadigede væv er et bedre alternativ, der omgår immunologiske, etiske og sikkerhedsmæssige betænkeligheder.
Aktivering af humant GPI-forbundet protein ved antistofkrydsning via fosforylering af PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN indleder en dedifferentiering af blod stamceller og generering af blod-afledte pluripotente stamceller (BD-PSC)6. Disse celler differentierer in vitro mod neuronale celler som bekræftet ved hjælp af brightfield, immunfluorescens og transmission elektronmikroskopi (TEM) analyse.
I dette arbejde beskriver vi gm-fri generation af BD-PSCs og deres vellykkede re-differentiering i celler med neuronal fænotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev opnået etiske godkendelser ved udførelsen af forsøgene.
1. Isolering af humane perifere mononukleare blodceller (PBMNCs)
- Sikre, at alle donorer underskrev informeret samtykke, før blodet trækker sig tilbage i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer.
- Tag 30 mL blod fra raske donorer af uddannet medicinsk personale i henhold til standardprotokollen.
- Isoler PBMNCs efter tæthedsgradientmedier. Brug 10 mL medier med 25 mL 1:1 blod fortyndet med fosfat buffer saltvand (PBS), og centrifuge ved 300 x g i 30 min.
- Det interfasede lag mellem plasmaet og massefyldegradientmediet isoleres ved pipettering. De isolerede celler vaskes med 5 mL steril PBS og centrifuge ved 300 x g i 10 min. Gentag to gange.
- Tæl antallet af celler ved hjælp af standardmetoder ved hjælp af et tællekammer.
2. Aktivering af humant GPI-forankret glycoprotein ved hjælp af antistofkrydslinking på overfladen af PBMNCs
- Placer 6 x 106 mononukleare celler (MNCs) i 15 mL rør og udfør antistof crosslinking ved at inkubere cellerne med humant GPI-forbundet membranproteinspecifikt antistof (30 μg/mL) i 30 minutter i PBS med 1% kvægserumalbumin (BSA) ved 37 °C.
- Udskift inkubationsmediet med Iskoves modificerede Dulbeccos medium suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS).
- Vokse celler i 15 mL polystyren rør, sætte rørene i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i 8-10 dage (uden rystelse). På D5 tilsættes yderligere 1-2 mL Iscoves medium suppleret med 10% FBS til hvert 15 mL rør.
3. Sortering af nygenererede dedifferentierede celler
- Tæl celler med en automatiseret celletæller (18 μL celleophæng + 2 μL fluorescensfarve) eller i et tællekammer.
- Centrifuge kulturperler celle suspension (5-7 x 106)ved 300 x g i 10 min og indsug den resulterende supernatant med en steril Pasteur pipette.
- Cellepillen suspenderes igen i 90 μL forkølet PBS pH 7,2, 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
- Der tilsættes magnetiske perler i nanostørrelse (80 μL) til celleaffjedringen og inkuberes på is i 15 minutter.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 2 mL PBS-buffer og centrifuge ved 300 x g i 10 min.
- Ophæng cellerne igen i 500 μL PBS-buffer.
- Kolonnen vaskes med 500 μL forkølet PBS-buffer, og den anbringes i magnetfeltet.
- Celleaffjedringen anbringes på kolonnen, og den vaskes med 500 μL PBS-buffer (to gange) og centrifugeflowet, der indeholder CD45-negative celler. Saml dem i Iskovves medium suppleret med 1% BSA.
- Tæl cellerne i tællekammeret.
4. Forberedelse af cellekulturretter til neuronal differentiering af nygenererede stamceller
- Coat kulturkarrene med poly-L-ornitin og laminin til dyrkning af neuronale celler.
- Glasovertrækspladerne anbringes i 4-brøndsplader, og den belægges med 1:5 fortyndet poly-L-ornitin (0,1 mg/mL i ddH2O) i ddH2O. Dækslet anbringes i en 37 °C inkubator i 1 time. Vask derefter med ddH2O.
- Tø langsomt laminin (0,5-2,0 mg/mL) op og tilsæt til toppen af coverslips. Inkuber den ved 37 °C i 2 timer.
- Neural induktionsmedium N2 bestående af 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-tillæg, 400 μL ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), grundlæggende FGF-opløsning ved 20 ng/mL endelig koncentration (fremstillet af 100 μg/mL stamopløsning) og heparin ved 2 ng/mL endelig koncentration.
- Fjern overskydende laminin ved pipetter og tilsæt neuronalt medium N2 til kulturretter.
5. Dyrkning af neuronale dedifferentiated blodlegemer
- Dyrkning BD-afledte CD45-negative celler på laminin-/ornitinbelagte glasovertræk i 2 dage i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2 i N2-medium for at indlede en neuronal differentiering af nyligt BD-genererede celler.
- Dyrkningsceller yderligere i neuronal differentieringsmedium bestående af 48 mL neurobasal medium, 500 μL L-glutamin, 1 mL B27 Supplement, 500 μL NEAA 50 μL rekombinant humant glia-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) ved 5 μg/250 μL i PBS/0,1% BSA og 50 μL rekombinant human hjerne afledt neurotrofisk faktor (BDNF) ved 5 μg/200 μL i PBS/0,1% BSA og 50 μL ascorbinsyreopløsning 2,9 g/50 ml i PBS. Pladerne anbringes i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
6. Immunfluorescensmikroskopianalyse af blodbaserede neurale celler
- Kultur cellerne som beskrevet ovenfor i 16 dage og fjerne medierne.
- Inkuber med forvarmet fikseringsmiddel bestående af 75 mL sterilt vand, 4 g paraformaldehyd. Tilsæt 10 N NaOH efter behov og rør rundt, indtil opløsningen rydder. Derefter tilsættes 10 mL 10x PBS, 0,5 mL MgCl2, 2 mL 0,5 M EGTA og 4 g saccharose. Titrere til pH 7,4 med 6 N HCl, og bringe til 100 mL sterilt vand i 15 min, ifølge Marchenko et al.7.
- Kassér fikseringsmiddel og vask cellerne 3 gange i 5 min hver gang. Tilsæt straks en frisklavet 0,3% Triton X-opløsning og gennemtræng cellerne i 5 min. Vask 3 gange med PBS og tilsæt en blokeringsløsning lavet af PBS og 5% BSA.
- Bloker cellerne ved stuetemperatur på en rockerplade i 1 time.
- Forbered passende fortynding af antistoffer i 1% BSA/PBS og inkuber cellerne med antistoffortyndinger på vippepladen i 1,5 timer ved stuetemperatur. Vask cellerne 3 gange med PBS i 5 min hver, inkuber cellerne med DAPI og monter coverlips med monteringsmedier til visualisering på et mikroskop.
BEMÆRK: Direkte mærkede antistoffer, der anvendes i dette eksperiment, er anført i Materialeoversigten.
7. Transmission elektronmikroskopi analyse af nygenererede celler
- Seed cellerne til TEM i 8-brønd kammer dias.
- Cellerne fikseres i 3,5% glutaraldehyd i 1 time ved 37 °C, efter 2% OsO4 i yderligere en time ved stuetemperatur og plet i 2% uranylacetat i mørke ved 4 °C i 2 h 30 min.
- Til sidst skylles cellerne i destilleret vand, dehydreres det i ethanol og indlejres i epoxyharpiks natten over. Den følgende dag overføres prøverne til en ovn på 70 °C i 72 timer til hærdning af harpiks.
- Fjern de indlejrede cellekulturer fra kammerdias og lim til araldite blokke.
- Skær serielle halvtynde sektioner (1,5 μm) med en maskine, monter på glasrutsjebaner og let plet med 1% toluidinblå.
- Lim udvalgte halvtynde sektioner til araldite blokke og løsrive dem fra glasset dias ved gentagen frysning (i flydende nitrogen) og optøning.
- Der fremstilles ultratynde sektioner (0,06-0,08 μm) med en maskine og yderligere kontrast til blycitrat.
- Få mikrografer ved hjælp af elektronscanning mikroskop med digitalt kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne giver bevis for, at denne nye GM-fri metode er i stand til at vende blod stamceller til deres mest primitive tilstand uden direkte at handle på det menneskelige genom.
Vi har tidligere vist, at GPI-forbundet proteinspecifikt antistofkrydslinking indledes via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN-opregulering af stærkt bevarede udviklingsrelevante gener som WNT, NOTCH og C-Kit, hvilket indleder en dedifferentiationsproces, der fører til det første skridt til gener af HSC'er og en anden og sidste til en generation af BD-PSC'er6,8.
Aktiverede MNC-kulturer blev udsat for immunomagnetisk sortering ved hjælp af CD45 mikroperler. Modne blodlegemer, der ikke kan omprogrammeres med denne metode (f.eks. CD45-positive celler), blev bevaret på kolonnen, mens den negative fraktion, der indeholder omprogrammerede celler (CD45-negative celler), blev brugt til generering af forskellige neuronale afstamningsceller.
Vi undersøgte først de morfologiske aspekter af perifere BD-afdifferentierede celler ved hjælp af lys og TEM. Som det fremgår af figur 1, genererer specifik gPI-forankret glycoproteinantistofkrydsklinking af humane MDC'er en stadig voksende ny population af celler (Figur 1A). Vi analyserede disse celler ved hjælp af TEM. BD-afdifferentierede celler er små i størrelse og viser egenskaberne ved umodne agranulære celler med gradvist mindre organeller og store kerner med kondenseret kromatin, svarende til ESC 'er (Figur 1B). Ikke-behandlede kulturer viste en tendens til en gradvis forsvinden.
BD-CD45 negative celler blev udsat for neuronal differentiering i to trin. Vi indledte differentieringen mod neuronale afstamninger ved at så cd45 negative celler på poly-L-ornithin / laminin belagt kultur plader i 2 dage i N2 medium følgende kultur i neuronal differentiering medium. Brightfield billeder blev erhvervet på dag 4, 8, 10, 14 og 30 henholdsvis ved start neuronal differentiering af BD-genererede stamceller.
Så tidligt som 4 dage efter start af den målrettede differentiering af nygenererede celler kunne de første neuronallignende celler med lange forgreningsstrukturer detekteres. Vi observerer de morfologiske ændringer fra D2 til D30 med en mere kompleks struktur, herunder forgrening, hvilket indebærer en aktiv proces mod differentiering til neuronale afstamninger i hele kulturperioden (Figur 2). For at bekræfte de neuronale træk ved redifferentierede celler efter dyrkning af dem i neuronalt medium i 16 dage blev cellerne fastsat i henhold til en tidligere protokol7, og immunocytochemistry (ICC) blev udført ved hjælp af antistofdetektion til nestin, glial fibrillary surt protein (GFAP), mikrotubule-associeret protein 2 (MAP2) og neuronspecifik klasse III beta-tubulin (Tuj1).
GFAP er det protein, der udgør en del af cytoskelet i astrocytter, der repræsenterer den vigtigste mellemliggende glødetråd af modne astrocytter. Som vist i figur 3genkender antistoffet mod GFAP disse strukturer i de nyligt genererede neuronale celler, hvilket bekræfter, at BD-PSC'er er i stand til at re-differentiere mod menneskelige astrocytter9.
MAP2 er et cytoskeletonprotein, der binder sig til tubuli og stabiliserer mikrotubuli. Det udtrykkes i axoner, dendritter og cellelegemer, og dette udtryk er vævs- og udviklingsspecifikt. Resultaterne af immunfluorescensmikroskopien bekræfter ekspressionen af dette protein i redifferentierede celler10.
Tuj1 er typisk neuronal celle markør. Dens funktion er at stabilisere mikrotubili i neuronal celle krop og axoner. Det er også impliceret i axonal transport11. Nyligt re-differentierede celler klart bekræftet udtrykket af dette protein på D16 ved start af neuronal differentiering under den betingelse, der er beskrevet her.
Nestin blev først karakteriseret i NSC'er og repræsenterer et neuro epitel stamcelleprotein, som tilhører mellemliggende glødetråd (IF) protein12, der adskiller neuronale stamceller fra mere differentierede neuronale celler. Disse IF proteiner udtrykkes mest i nerveceller, hvor de er involveret i den radiale vækst af axon, men de er også til stede i en række ekstra væv. Nestin som en markør for overvejende NSC'er udtrykkes svagt i de celler, der allerede er på vej til at differentiere sig til specifikke neuronale afstamninger, som det er tilfældet med BD-redifferentierede celler ved D16.
Figur 1:Generering af dedifferentierede (pluripotente) stamceller. (A) Ficoll-isolerede mononukleare celler blev dyrket i Iscoves medium suppleret med 10% FBS. Mikrografer af aktiverede dyrkede celler blev taget på henholdsvis dag 1, 5 og 10. Ikke-aktiverede MNIC'er blev undersøgt som en kontrol. Skalabjælke: 50 μm. (B) TEM-analyse af nygenererede celler gennem hele kulturtiden viser, at organeller af modne celler (D1) gradvist forsvinder (D8), hvilket fører til generering af fuldstændig dedifferentierede celler, der ligner ESC'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Neuro-differentiering af BD-PSC'er. (A) BD-dedifferentierede celler blev placeret i ornitin/laminin belagte kulturretter og dyrket i 30 dage som beskrevet i protokollen. Mikrografer tages på henholdsvis dag 4, 8, 10, 14 og 30 efter at være vokset i neuronale differentieringsforhold. De fleste celler i kulturen ændrede deres morfologi fra små sfæriske former til større, aflange former og i nogle tilfælde forgrenede celler. Skalabjælke: 100 μm. (B) BD-dedifferentiated celler blev dyrket i 16 dage i neuronal medium, fastgjort i glutaraldehyd og EM-analyse udført som beskrevet i protokolafsnittet. Cellekroppen og processerne i disse celler viste en højere kompleksitet end dem i udifferentierede celler med hensyn til organeller og cytoskelet, der præsenterede en høj tæthed af stablet cisternae af ru endoplasmisk reticulum og rigelige bundter af actin filamenter (a, b). I modsætning til udifferentierede BD-celler, celler vokser i differentiering medier ofte etableret celle-til-celle kontakter. Nogle af disse specialiserede kontakter involverede cellulære organ (c), mens andre involverede cellulære processer i neurite-lignende mode (d). Skalastænger: a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Immunophenotyping af nygenererede neuronale celler. BD-afdifferentierede celler blev dyrket som beskrevet i protokollen i 16 dage, og immunokytokemianalyse blev udført ved hjælp af antistoffer mod neuronale markører nestin, GFAP, MAP2 og Tuj1. Vist er brightfield mikrografer af re-differentierede celler ledsaget af immunfluorescens billeder med DAPI som nuklear farvning, samt farvning med relevante antistoffer. Afbildet er de felter, der viser en bestemt befolkning, der udtrykker en af de specifikke neuronale markør karakteristisk for specifikke linjer. Skalastang: 100 μm. Kontrollen er vist i supplerende figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: BD-dedifferentieret cellekontrol. BD-afledte udifferentierede celler blev dyrket i Iskoves modificerede Dulbeccos medium suppleret med 10% FBS i 16 dage som beskrevet i protokollen og farvet med antistof til nestin GFAP, Tuj1 og MAP2. DAPI blev brugt til atomståning. Skalalinje: 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ikke-GM-metode til omprogrammering af menneskelige celler, der er beskrevet i dette arbejde, er baseret på membran til kerneaktivering af signalmaskiner bag GPI-forbundet humanmembran glycoprotein, der indleder den dedifferentiationsproces, der fører til ex vivo-generering og udvidelse af selvfornyende PSC'er opnået fra ikke-manipuleret humant perifert blod. Disse celler, når de dyrkes i passende medier, er i stand til at re-differentiere sig i celler, der tilhører forskellige kimlag6.
De data, der præsenteres i dette arbejde, viser, at GM-fri genererede BD-PSC-celler, når de dyrkes i et neuronalt differentieringsmedie, erhvervede en helt anden fænotype med aflange former, højere udvikling af deres organeller og etablerede mere komplekse interaktioner mellem celler. Desuden, re-differentiering ved hjælp af tilstand beskrevet her, indebærer neuronal differentiering i retning af forskellige neuronale afstamninger.
For at opnå det optimale antal og den bedste kvalitet af omprogrammerede celler til deres anvendelse i redifferentieringsundersøgelser kan friske MNC-præparater være fordelagtige sammenlignet med frosne MNC-præparater. Metoden til immunomagnetisk sortering, der adskilte BD-PSC'er fra uhelbredeligt differentierede celler, der ikke kan omprogrammeres ved denne metode, kan være ufuldstændig og kræve, at proceduren gentages, hvilket er meget stressende for celler og resulterer i deres for tidlige dødsfald.
Det kritiske trin i protokollen vedrører antallet og kvaliteten af de MNCs, der kunne opnås ved hjælp af den beskrevne metode. Ændring af neurale differentiering medier samt kultur tid kan forbedre differentiering potentiale BD-PSCs, hvilket fører til generation af specifikke typer af neuronale celler.
En begrænsning af denne metode er den ikke-teratogene karakter af disse omprogrammerede celler, da det ikke er muligt at generere cellelinjerne med denne metode. Når de afdifferentierede celler har nået den sidste fase, at pluripotency, bliver de for det meste hvilende og en ny del af MNCs skal afdifferentieres igen for at opnå et højere antal BD-PSCs.
Omprogrammering beskrevet her er afhængig af antistof crosslinking aktivering på overfladen af blod stamceller. Dette paradigme giver mange potentielle fordele med hensyn til klinisk sikkerhed sammenlignet med GM-metoder. Målet om at opnå autologe stamceller til generering af neurale væv kan nås ved minimalt ex vivo manipulation; derfor kraftigt tyder på, at denne celleterapi kunne være en lovende kandidat til en effektiv og sikker klinisk tilgang i neurologi.
Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom og cerebral iskæmi er blandt de sygdomme, der har den største sociale og økonomiske byrde for samfundet i Europa og resten af verden. Byrden af neurodegenerative lidelser forventes at stige med den aldrende befolkning, bliver et vigtigt socioøkonomisk problem og skaber et desperat behov for et svar på problemet. Den præsenterede metode åbner en ny vej for ikke-invasive terapeutiske strategier ved at anvende en enkel og omkostningseffektiv procedure for at generere egnede autologe stamcellepopulationer, der har et håb om helbredelse af aktuelt vanskelige neurologiske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den tilsvarende forfatter erklærer, at hun er patenthaver relateret til Novel Human GPI-forbundet Protein samt hun medstifter og arbejder for ACA CELL Biotech. De andre forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dedikeret til mindet om Dr. Rainer Saffrich.
Forfatterne er især taknemmelige for José Manuel García-Verdugo og Vicente Herranz-Pérez for at udføre EM-eksperimenter og analyser på Laboratoriet for Komparativ Neurobiologi, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, som blev støttet af forskningsmidler fra Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Resten af dette arbejde blev støttet af ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
