Summary
We presenteren een genetisch gemodificeerde vrije (GM-vrije) methode om cellen met een neuronaal fenotype te verkrijgen uit geherprogrammeerde perifere bloedcellen. Activering van een signaleringsroute gekoppeld aan nieuwe menselijke GPI-gebonden eiwitten onthult een efficiënte GM-vrije methode voor het verkrijgen van menselijke pluripotente stamcellen.
Abstract
Veel menselijke neurologische aandoeningen worden veroorzaakt door degeneratie van neuronen en gliacellen in de hersenen. Vanwege beperkingen in farmacologische en andere therapeutische strategieën is er momenteel geen remedie beschikbaar voor de gewonde of zieke hersenen. Celvervanging verschijnt als een veelbelovende therapeutische strategie voor neurodegeneratieve aandoeningen. Tot op de dag van vandaag zijn neurale stamcellen (NSC's) met succes gegenereerd uit foetale weefsels, menselijke embryonale cellen (ES) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). Een proces van dedifferentiatie werd geïnitieerd door activering van het nieuwe menselijke GPI-gebonden glycoproteïne, wat leidt tot de generatie van pluripotente stamcellen. Deze van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) onderscheiden in vitro in cellen met een neuraal fenotype, zoals blijkt uit brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie. Ultrastructurele analyse van deze cellen door middel van elektronenmicroscopie bevestigt hun primitieve structuur, neuronale morfologie en subcellulaire kenmerken.
Introduction
De ontwikkeling van basis- en preklinische stamcelonderzoeksmethoden stimuleert de klinische toepassing van stamcelgebaseerde therapieën voor neurologische ziekten. Een dergelijke potentiële therapie hangt kritisch af van de methode voor het genereren van menselijke neurale cellen die leidt tot functioneel herstel1.
Neurale stamcellen (NSC's) vernieuwen zichzelf en differentiëren zich gedurende het hele leven in nieuwe neuronen in een proces dat volwassen neurogenese wordt genoemd. Alleen zeer beperkte hersengebieden herbergen NSC's die bevoegd zijn om pasgeboren neuronen op volwassen leeftijd te genereren. Dergelijke NSC's kunnen aanleiding geven tot volwassen neuronen, die betrokken zijn bij leren en geheugen, waardoor verloren of beschadigde neuronen worden vervangen. Helaas zijn deze NSC's in beperkte hoeveelheden aanwezig en neemt deze beperkte neurogenese snel af tijdens de ontwikkeling van de juvenieleontwikkeling 2. Daarom moeten andere bronnen van neurale cellen worden overwogen in een celtherapiedoelstelling.
Degeneratieve neurologische ziekten zijn moeilijk te genezen met behulp van standaard farmacologische benaderingen. Nieuwe therapeutische strategieën voor het omarmen van veel immedicable neurologische aandoeningen zijn gebaseerd op celvervangende therapieën van ziek en gewond weefsel. NSC-transplantatie kan beschadigde cellen vervangen en gunstige effecten hebben. Andere bronnen voor neurale celvervanging zijn menselijke embryonale stamcellen (ESC), die zijn afgeleid van de binnencelmassa van zoogdierblastocysten3, evenals iPSC's4, die een uitgebreid zelfvernieuwingsvermogen hebben zoals ESC's en in staat zijn om zich te onderscheiden in verschillende cellijnen. NSC's kunnen ook worden gegenereerd door directe herprogrammering van menselijke fibroblasten die pluripotente toestand vermijden5.
Celvervangingstherapie is nog steeds een uitdagend probleem. Hoewel ESC, foetale of iPS een bron kan zijn voor het genereren van neuronale cellen voor de behandeling van veel ongeneeslijke neurologische ziekten, is autologe volwassen SCs-celvervanging van beschadigde weefsels een beter alternatief dat immunologische, ethische en veiligheidsproblemen omzeilt.
Activering van humaan GPI-gebonden eiwit door antilichaam-crosslinking via fosforylering van PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initieert een dedifferentiatie van bloedvoorlopercellen en degeneratie van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's)6. Deze cellen onderscheiden in vitro naar neuronale cellen zoals bevestigd door middel van brightfield, immunofluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) analyse.
In dit werk beschrijven we de GM-vrije generatie van BD-PSC's en hun succesvolle herdifferentiatie in cellen met neuronaal fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische goedkeuringen werden verkregen bij het uitvoeren van de experimenten.
1. Isolatie van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMNCs)
- Zorg ervoor dat alle donoren geïnformeerde toestemming hebben ondertekend voordat het bloed zich terugtrok in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
- Neem 30 ml bloed van gezonde donoren door opgeleid medisch personeel volgens het standaardprotocol.
- Isoleer PBMNCs op dichtheidsgradiëntmedia. Gebruik 10 ml media met 25 ml 1:1 bloed verdund met fosfaatbufferoplossing (PBS) en centrifugeer gedurende 30 minuten op 300 x g.
- Isoleer de interfaselaag tussen het plasma en de dichtheidsgradiëntmedia door pipetten. Was de geïsoleerde cellen met 5 ml steriel PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g. Herhaal dit tweemaal.
- Tel het aantal cellen met standaardmethoden met behulp van een telkamer.
2. Activering van humaan GPI-verankerd glycoproteïne door kruiskoppeling van antilichamen op het oppervlak van PBMNCs
- Plaats de 6 x 106 mononucleaire cellen (MNC's) in buizen van 15 ml en voer kruiskoppeling van antilichamen uit door de cellen gedurende 30 minuten te incuberen met humaan GPI-gebonden membraaneiwitspecifiek antilichaam (30 μg/ml) in PBS met 1% runderserumalbumine (BSA) bij 37 °C.
- Vervang incubatiemedium door Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS).
- Kweek cellen in polystyreenbuizen van 15 ml, plaats de buizen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 8-10 dagen (zonder schudden). Voeg op D5 een extra 1-2 ml iscove's medium aangevuld met 10% FBS toe aan elke buis van 15 ml.
3. Sorteren van nieuw gegenereerde gedifferentieerde cellen
- Tel cellen met een geautomatiseerde celteller (18 μL celsuspensie + 2 μL fluorescentiekleurstof) of in een telkamer.
- Centrifugeer gekweekte celsuspensie (5-7 x10 6) bij 300 x g gedurende 10 minuten en aspireer het resulterende supernatant met een steriele Pasteur pipet.
- Hang de celkorrel opnieuw op in 90 μL voorgekoelde PBS pH 7,2, 0,5% BSA en 2 mM EDTA.
- Voeg CD45 positieve nanogrote magnetische kralen (80 μL) toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
- Was de cellen door 2 ml PBS-buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g.
- Sgroeper de cellen opnieuw in 500 μL PBS-buffer.
- Was de kolom met 500 μL voorgekoelde PBS-buffer en plaats deze in het magnetisch veld.
- Plaats de celsuspensie op de kolom en was deze met 500 μL PBS-buffer (twee keer) en de centrifugestroom met CD45-negatieve cellen. Verzamel ze in het medium van Iscove aangevuld met 1% BSA.
- Tel de cellen in de telkamer.
4. Celkweekgerechten voorbereiden voor neuronale differentiatie van nieuw gegenereerde stamcellen
- Bedek de kweekvaten met poly-L-ornithine en lag voor het kweken van neuronale cellen.
- Plaats de glasafdekkingslips in 4-putplaten en bekleed deze met 1:5 verdunde poly-L-ornithine (0,1 mg/ml in ddH2O) in ddH2O. Plaats de afdeklips gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Was vervolgens met ddH2O.
- Ontdooi langzaam lag (0,5-2,0 mg/ml) en voeg toe aan de bovenkant van de afdeklips. Incubeer het bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Bereid neurale inductiemedium N2 voor bestaande uit 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-supplement, 400 μL niet-essentiële aminozuren (NEAA), basisch FGF-oplossing bij 20 ng/ml eindconcentratie (bereid uit 100 μg/ml stamoplossing) en heparine bij 2 ng/ml eindconcentratie.
- Verwijder overtollige lag door pipetten en voeg neuronaal medium N2 toe aan kweekgerechten.
5. Cultivering van neuronale gedifferentieerde bloedcellen
- Kweek BD-afgeleide CD45 negatieve cellen op laminine/ornithine-gecoate glasafdekkingslips gedurende 2 dagen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 in N2-medium om een neuronale differentiatie van nieuw BD-gegenereerde cellen te initiëren.
- Kweekcellen verder in neuronaal differentiatiemedium bestaande uit 48 ml neurobasaal medium, 500 μL L-glutamine, 1 ml B27-supplement, 500 μL NEAA, 50 μL recombinante menselijke glial-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) bij 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA, en 50 μL recombinante humane hersen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL van recombinante humane hersenafwisselingsfactor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniët (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefinale neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniëtum neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefinie (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniëtatie (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 Plaats platen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
6. Immunofluorescentiemicroscopieanalyse van bloedafname neurale cellen
- Kweek de cellen zoals hierboven beschreven gedurende 16 dagen en verwijder de media.
- Incubeer met voorverwarmd fixatief bestaande uit 75 ml steriel water, 4 g paraformaldehyde. Voeg indien nodig 10 N NaOH toe en roer tot de oplossing op is. Voeg vervolgens 10 ml 10x PBS, 0,5 ml MgCl2, 2 ml 0,5 m EGTA en 4 g sacharose toe. Titreer tot pH 7,4 met 6 N HCl en breng tot 100 ml steriel water gedurende 15 minuten, volgens Marchenko et al.7.
- Gooi het fixatief weg en was de cellen elke keer 3 keer gedurende 5 minuten. Voeg onmiddellijk een vers gemaakte 0,3% Triton X-oplossing toe en permeabiliseer de cellen gedurende 5 minuten. Was 3 keer met PBS en voeg een blokkeeroplossing van PBS en 5% BSA toe.
- Blokkeer de cellen bij kamertemperatuur op een schommelplaat gedurende 1 uur.
- Bereid de juiste verdunning van antilichamen voor in 1% BSA/PBS en incubeer de cellen met antilichaamverdunningen op de tuimelplaat gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was de cellen 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten, incubeer de cellen met DAPI en monteer de afdeklips met montagemedia voor visualisatie op een microscoop.
OPMERKING: Direct gelabelde antilichamen die in dit experiment worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen.
7. Transmissie elektronenmicroscopie analyse van nieuw gegenereerde cellen
- Zaai de cellen voor TEM in 8-well chamber slides.
- Bevestig de cellen in 3,5% glutaraldehyde gedurende 1 uur bij 37 °C, postfixeer in 2% OsO4 gedurende een extra uur bij kamertemperatuur en bevlek in 2% uranylacetaat in het donker bij 4 °C gedurende 2 uur en 30 min.
- Spoel ten slotte de cellen af in gedestilleerd water, dehydrateer het in ethanol en sluit het 's nachts in epoxyhars in. Breng de volgende dag de monsters gedurende 72 uur over in een oven van 70 °C voor harsverharding.
- Maak de ingebedde celculturen los van kamerschuif en lijm tot aralditeblokken.
- Snijd seriële halfdunne secties (1,5 μm) met een machine, monteer op glasglijbanen en bevlek licht met 1% toluidineblauw.
- Lijm geselecteerde halfdunne secties op araldite blokken en maak ze los van de glazen schuif door herhaaldelijk in te vriezen (in vloeibare stikstof) en te ontdooien.
- Bereid ultraduinesecties (0,06-0,08 μm) voor met een machine en contrasteer verder met loodcitraat.
- Verkrijg micrografen met behulp van elektronenscanmicroscoop met digitale camera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten leveren bewijs dat deze nieuwe GM-vrije methode in staat is om bloed voorlopercellen terug te brengen naar hun meest primitieve toestand zonder direct in te werken op het menselijk genoom.
We hebben eerder aangetoond dat GPI-gebonden eiwitspecifieke antilichaam crosslinking initieert via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulatie van sterk geconserveerde ontwikkelingsrelevante genen zoals WNT, NOTCH en C-Kit, waardoor een proces van dedifferentiatie wordt gestart dat leidt tot de eerste stap naar generatie van HSC 's en een tweede en laatste naar een generatie BD-PSC 's6,8.
Geactiveerde MNC-culturen werden onderworpen aan immunomagnetische sortering met behulp van CD45-microbeads. Rijpe bloedcellen die niet met deze methode kunnen worden geherprogrammeerd (bijv. CD45-positieve cellen) werden in de kolom behouden, terwijl de negatieve fractie met geherprogrammeerde cellen (CD45-negatieve cellen) werd gebruikt voor het genereren van verschillende neuronale afstammingscellen.
We bestudeerden eerst de morfologische aspecten van perifere BD-gedifferentieerde cellen door middel van licht en TEM. Zoals blijkt uit figuur 1, genereert specifieke GPI-verankerde glycoproteïne antilichaam crosslinking van menselijke MNC's een gestaag groeiende nieuwe populatie cellen (Figuur 1A). We analyseerden deze cellen door middel van TEM. BD-gedifferentieerde cellen zijn klein van formaat en vertonen de kenmerken van onrijpe agranulaire cellen, met geleidelijk minder organellen en grote kernen met gecondenseerd chromatine, vergelijkbaar met VOS (Figuur 1B). Niet-behandelde culturen vertoonden een trend naar een geleidelijke verdwijning.
BD-CD45 negatieve cellen werden in twee stappen onderworpen aan neuronale differentiatie. We initieerden de differentiatie naar neuronale afstammingen door de CD45 negatieve cellen gedurende 2 dagen in N2-medium te zaaien op poly-L-ornithine/laminine gecoate kweekplaten na kweek in neuronaal differentiatiemedium. Brightfield-foto's werden verworven op respectievelijk dag 4, 8, 10, 14 en 30 bij het starten van neuronale differentiatie van BD-gegenereerde stamcellen.
Al 4 dagen na het starten van de gerichte differentiatie van nieuw gegenereerde cellen konden de eerste neuronaal-achtige cellen met lange vertakkingsstructuren worden gedetecteerd. We observeren de morfologische veranderingen van D2 naar D30 met een complexere structuur inclusief vertakking, wat een actief proces impliceert naar differentiatie naar neuronale afstamming gedurende de hele cultuurperiode (Figuur 2). Om de neuronale kenmerken van opnieuw gedifferentieerde cellen te bevestigen nadat ze gedurende 16 dagen in neuronaal medium waren geculpeerd, werden cellen vastgesteld volgens een eerder protocol7, en immunocytochemie (ICC) werd uitgevoerd met behulp van antilichaamdetectie voor nestine, gliafibrillair zuur eiwit (GFAP), microtubuli-geassocieerd eiwit 2 (MAP2) en neuronspecifieke klasse III bèta-tubuline (Tuj1).
GFAP is het eiwit dat een deel van cytoskelet in astrocyten vormt dat het belangrijkste intermediaire filament van volwassen astrocyten vertegenwoordigt. Zoals weergegeven in figuur 3, herkent het antilichaam tegen GFAP deze structuren in de nieuw gegenereerde neuronale cellen , wat bevestigt dat BD-PSC 's in staat zijn om opnieuw te differentiëren ten opzichte van menselijke astrocyten9.
MAP2 is een cytoskeleteiwit dat zich bindt aan tubuli en microtubuli stabiliseert. Het wordt uitgedrukt in axonen, dendrieten en cellichamen en deze uitdrukking is weefsel- en ontwikkelingsspecifiek. De immunofluorescentiemicroscopieresultaten bevestigen de expressie van dit eiwit in gedifferentieerde cellen10.
Tuj1 is een typische neuronale celmarker. De functie is om microtubili te stabiliseren in neuronaal cellichaam en axonen. Het is ook betrokken bij axonale transport11. Nieuw opnieuw gedifferentieerde cellen bevestigden duidelijk de expressie van dit eiwit bij D16 bij het starten van de neuronale differentiatie onder de hier beschreven aandoening.
Nestine werd voor het eerst gekarakteriseerd in NSC's en vertegenwoordigt een neuro-epitheelstamceleiwit, dat behoort tot intermediair filament (IF) eiwit12 dat neuronale voorlopercellen onderscheidt van meer gedifferentieerde neuronale cellen. Deze IF-eiwitten worden meestal uitgedrukt in zenuwcellen waar ze betrokken zijn bij de radiale groei van het axon, maar ze zijn ook aanwezig in een aantal extra weefsels. Nestine als marker van overwegend NSC's wordt zwak uitgedrukt in de cellen die al op het pad zijn om te differentiëren in specifieke neuronale afstammingen, zoals het geval is met BD-re-gedifferentieerde cellen bij D16.
Figuur 1: Generatie van gedifferentieerde (pluripotente) stamcellen. (A) Ficoll-geïsoleerde mononucleaire cellen werden gekweekt in het medium van Iscove aangevuld met 10% FBS. Micrografen van geactiveerde gekweekte cellen werden genomen op respectievelijk dag 1, 5 en 10. Niet-geactiveerde MNCs werden bestudeerd als een controle. Schaalbalk: 50 μm. (B) TEM-analyse van nieuw gegenereerde cellen gedurende de kweektijd toont aan dat organellen van volwassen cellen (D1) geleidelijk verdwijnen (D8), wat leidt tot de generatie van volledig gedifferentieerde cellen die lijken op ESC's. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Neuro-differentiatie van BD-PSC's. A) BD-gedifferentieerde cellen werden in ornithine/laminine gecoate kweekgerechten geplaatst en gedurende 30 dagen gekweekt zoals beschreven in het protocol. Micrografen worden genomen op respectievelijk dag 4, 8, 10, 14 en 30, na te zijn gegroeid in neuronale differentiatieomstandigheden. De meeste cellen in de cultuur veranderden hun morfologie van kleine bolvormige vormen in grotere, langwerpige vormen en in sommige gevallen vertakte cellen. Schaalbalk: 100 μm. (B) BD-gedifferentieerde cellen werden gedurende 16 dagen gekweekt in neuronaal medium, gefixeerd in glutaraldehyde en EM-analyse uitgevoerd zoals beschreven in de protocolsectie. Het cellichaam en de processen van deze cellen vertoonden een hogere complexiteit dan die van ongedifferentieerde cellen in termen van organellen en cytoskelet met een hoge dichtheid van gestapelde cisternae van ruw endoplasmatisch reticulum en overvloedige bundels actinefilamenten (a, b). In tegenstelling tot ongedifferentieerde BD-cellen, vestigden cellen die in differentiatiemedia groeien vaak cel-tot-celcontacten. Sommige van deze gespecialiseerde contacten hadden betrekking op het cellulaire lichaam (c), terwijl andere cellulaire processen op neurietachtige wijze betroffen (d). Schaalbalken: a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Immunofenotypering van nieuw gegenereerde neuronale cellen. BD-gedifferentieerde cellen werden gedurende 16 dagen gekweekt zoals beschreven in het protocol en immunocytochemieanalyse werd uitgevoerd met behulp van antilichamen tegen neuronale markers nestine, GFAP, MAP2 en Tuj1. Getoond zijn brightfield micrografen van opnieuw gedifferentieerde cellen vergezeld van immunofluorescentiefoto's met DAPI als nucleaire kleuring, evenals kleuring met relevante antilichamen. Afgebeeld zijn de velden met een bepaalde populatie die een van de specifieke neuronale markerkenmerken voor specifieke lijnen uitdrukt. Schaalbalk: 100 μm. De controle is weergegeven in aanvullende figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1: BD-gedifferentieerde celcontrole. BD-afgeleide ongedifferentieerde cel werd gekweekt in iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium aangevuld met 10% FBS gedurende 16 dagen zoals beschreven in het protocol en gekleurd met antilichamen tegen nestine GFAP, Tuj1 en MAP2. DAPI werd gebruikt voor nucleaire kleuring. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om dit Bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De niet-GM-methode voor het herprogrammeren van menselijke cellen die in dit werk wordt beschreven, is gebaseerd op membraan-naar-kernactivering van signaleringsmachines achter het GPI-gebonden menselijke membraanglycoproteïne dat het proces van dedifferentiatie initieert dat leidt tot de ex vivo generatie en uitbreiding van zelfvernieuwende PSC's verkregen uit niet-gemanipuleerd menselijk perifeer bloed. Deze cellen kunnen, wanneer ze in geschikte media worden gekweekt, opnieuw differentiëren in cellen die tot verschillende kiemlagen behoren6.
De gegevens in dit werk tonen aan dat GM-vrije gegenereerde BD-PSC-cellen, gekweekt in een neuronaal differentiatiemedium, een heel ander fenotype kregen, met langwerpige vormen, een hogere ontwikkeling van hun organellen en complexere interacties tussen cellen. Bovendien impliceert herdifferentiatie met behulp van de hier beschreven aandoening neuronale differentiatie naar verschillende neuronale afstammingen.
Om het optimale aantal en de beste kwaliteit van geherprogrammeerde cellen te verkrijgen voor gebruik in herdifferentiatiestudies, kunnen verse MNC-preparaten voordelig zijn in vergelijking met bevroren MNC-preparaten. De methode van immunomagnetische sortering die BD-PSC's scheidde van terminaal gedifferentieerde cellen die niet met deze methode kunnen worden geherprogrammeerd, kan onvolledig zijn en vereist dat de procedure wordt herhaald, wat zeer stressvol is voor cellen en resulteert in hun voortijdige dood.
De kritieke stap binnen het protocol heeft betrekking op het aantal en de kwaliteit van MNC's die met de beschreven methode kunnen worden verkregen. Modificatie van de neurale differentiatiemedia en de cultuurtijd kan het differentiatiepotentieel van BD-PSC's verbeteren, wat leidt tot het genereren van specifieke soorten neuronale cellen.
Een beperking van deze methode is het niet-teratogene karakter van deze geherprogrammeerde cellen, omdat het niet mogelijk is om de cellijnen met deze methode te genereren. Zodra de gedifferentieerde cellen de laatste fase hebben bereikt, die van pluripotentie, worden ze meestal rustgevend en moet een nieuw deel van de MNC's opnieuw worden gededifferentieerd om een hoger aantal BD-PSC's te verkrijgen.
Herprogrammering die hier wordt beschreven, is afhankelijk van antilichaam crosslinking activering op het oppervlak van bloedvoorlopercellen. Dit paradigma biedt tal van potentiële voordelen met betrekking tot klinische veiligheid in vergelijking met GM-methoden. Het doel van het bereiken van autologe stamcellen voor de generatie van neuraal weefsel(en) kan worden bereikt door minimale ex vivo manipulatie; daarom sterk suggererend dat deze celtherapie een veelbelovende kandidaat zou kunnen zijn voor een efficiënte en veilige klinische benadering in de neurologie.
De ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer en cerebrale ischemie behoren tot de ziekten met de hoogste sociale en economische last voor de samenleving in Europa en wereldwijd. De last van neurodegeneratieve aandoeningen zal naar verwachting toenemen met de vergrijzende bevolking, een belangrijk sociaal-economisch probleem worden en een wanhopige behoefte creëren aan een antwoord op het probleem. De gepresenteerde methode opent een nieuwe weg voor niet-invasieve therapeutische strategieën door gebruik te maken van een eenvoudige en kosteneffectieve procedure voor het genereren van geschikte autologe stamcelpopulaties die hoop hebben op de genezing van momenteel hardnekkige neurologische ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De corresponderende auteur verklaart dat ze octrooihouder is met betrekking tot Novel Human GPI-linked Protein en ze is medeoprichter en werkt voor ACA CELL Biotech. De andere auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.
Acknowledgments
Opgedragen aan de nagedachtenis van Dr. Rainer Saffrich.
De auteurs zijn josé Manuel García-Verdugo en Vicente Herranz-Pérez bijzonder dankbaar voor het uitvoeren van EM-experimenten en -analyses in het Laboratorium voor Vergelijkende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, Universiteit van Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanje, dat werd ondersteund door onderzoeksfinanciering van de Prometeo Grant for Excellence Onderzoeksgroepen PROMETEO/2019/075. De rest van dit werk werd ondersteund door ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
