Summary
우리는 유전자 변형되지 않은 (GM 무료) 방법을 제시하여 재프로그래밍 된 말초 혈액 세포에서 신경 표현형을 가진 세포를 얻습니다. 새로운 인간 GPI 연결 단백질에 연결 된 신호 경로의 활성화 인간의 다능 한 줄기 세포를 얻기 위한 효율적인 GM 무료 방법을 밝혀.
Abstract
많은 인간 신경 장애는 두뇌에 있는 신경 세포 및 신경교 세포의 변성에 기인합니다. 약리학 및 기타 치료 전략의 한계로 인해 현재 부상또는 병에 걸린 뇌에 사용할 수있는 치료법이 없습니다. 세포 교체는 신경 퇴행성 조건에 대한 유망한 치료 전략으로 나타납니다. 현재까지, 신경 줄기 세포(NSC)는 태아 조직, 인간 배아 세포(ES) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 성공적으로 생성되었다. 변분화 과정은 다능성 줄기 세포의 생성으로 이어지는 새로운 인간 GPI 연결 당단백질의 활성화에 의해 시작되었다. 이러한 혈액 유래 만능 줄기 세포 (BD-PSC)는 밝은 필드와 면역 형광 현미경 검사법에 의해 나타난 바와 같이 신경 표현형을 가진 세포로 시험관내에서 분화한다. 전자 현미경 검사를 통해 이러한 세포의 초구조적 분석은 그들의 원시 구조뿐만 아니라 뉴런 형 형태와 세포 극성 특성을 확인합니다.
Introduction
기본 및 전임상 줄기 세포 연구 방법의 개발은 신경 질환에 대한 줄기 세포 기반 치료의 임상 적용을 장려합니다. 이러한 잠재적 치료는 기능적 회복1로이어지는 인간 신경 세포의 생성 방법에 비판적으로 의존한다.
신경 줄기 세포 (NSC) 자체 갱신 하 고 성인 신경 발생 이라고 하는 프로세스에 평생 새로운 뉴런으로 분화. 만 매우 제한 된 뇌 영역 은 성인기에 신생아 뉴런을 생성 할 수있는 NsCs를 항구. 이러한 NSC는 학습과 메모리에 관여하는 성숙한 뉴런을 초래할 수 있으므로 분실되거나 손상된 뉴런을 대체할 수 있습니다. 불행하게도, 이러한 NSC는 제한된 양에 존재하고이 제한된 신경 발생은 청소년 발달 동안 급속하게감소2. 따라서 신경 세포의 다른 소스는 세포 치료 목적으로 고려되어야합니다.
퇴행성 신경 질환은 표준 약리학적 접근법을 사용하여 치료하기가 어렵습니다. 많은 치료 신경 장애를 수용 하기위한 새로운 치료 전략은 질병과 부상 조직의 세포 대체 요법에 기초. NSC 이식은 손상된 세포를 대체하고 유익한 효력을 제공할 수 있었습니다. 신경세포 교체를 위한 그밖 근원은 포유류 분폭물3의내세포 질량에서 파생되는 인간 배아 줄기 세포 (ESC) 및 ESC 같이 광대한 자기 갱신 능력을 가지고 있고 각종 세포 혈통으로 분화할 수 있는 iPSCs4를포함합니다. 또한 만능 상태5를피하는 인간 섬유아세포로부터 직접 리프로그래밍하여 NSC를 생성할 수 있다.
세포 대체 요법은 여전히 어려운 문제입니다. ESC, 태아 또는 iPS는 많은 난치성 신경 질환을 치료하기위한 신경 세포의 세대에 대한 소스가 될 수 있지만 손상된 조직의 자가 성 성인 SCs 세포 교체는 면역학적, 윤리적 및 안전 문제를 우회하는 더 나은 대안입니다.
PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN의 인산화를 통해 항체-교차연결에 의한 인간 GPI 연계 단백질의 활성화는 혈액 전구 세포의 비차별화를 시작하고 혈액 유래 만능 줄기 세포(BD-PSC)6. 이 세포는 밝은 필드, 면역 형광 및 전염 전자 현미경 검사 (TEM) 분석을 통해 확인 된 바와 같이 신경 세포를 향해 시험관 내 분화.
이 작품에서 우리는 BD-PSC의 GM 없는 생성 및 그들의 성공적인 재 분화 신경 표현형을 가진 세포로 기술합니다.
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Protocol
실험을 수행할 때 윤리 승인을 얻었다.
1. 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 (PBMC)
- 모든 기부자가 기관 지침에 따라 혈액을 철회하기 전에 정보에 입각한 동의서에 서명하도록 하십시오.
- 표준 프로토콜에 따라 숙련 된 의료 인력에 의해 건강한 기증자로부터 30 mL의 혈액을 가져 가라.
- 밀도 그라데이션 미디어를 통해 PBMC를 분리합니다. 인산염 완충식염(PBS)으로 희석된 1:1 혈액의 25mL, 30분 동안 300 x g의 원심분리기를 사용하여 10mL의 미디어를 사용하십시오.
- 파이펫팅을 통해 플라즈마와 밀도 그라데이션 미디어 사이의 위상 간 층을 분리합니다. 멸균 PBS와 원심분리기의 5mL로 10분 간 300 x g로 세척합니다.
- 카운팅 챔버를 사용하여 표준 방법으로 셀 수를 계산합니다.
2. PBMC의 표면에 교차하는 항체에 의한 인간 GPI 고정 당단백질의 활성화
- 6 x 106 단핵세포(MNC)를 15mL 튜브에 배치하고 37°C에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 가진 PBS에서 30분 동안 인간 GPI 연결 막 단백질 특이적 항체(30 μg/mL)를 가진 세포를 배양하여 항체 교차 연결을 수행한다.
- 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 이스코브의 수정된 덜벡코의 배지로 인큐베이션 배지를 교체하십시오.
- 15mL 폴리스티렌 튜브에서 세포를 성장시키고, 튜브를 37°C, 8-10일 동안 5%CO2로 인큐베이터에 넣습니다(흔들림 없이). D5에, 각 15 mL 튜브에 10 % FBS로 보충 이스코브의 매체의 추가 1-2 mL을 추가합니다.
3. 새로 생성된 분화 세포의 정렬
- 자동 세포 카운터(18 μL 셀 서스펜션 + 2 μL 형광 염료) 또는 카운팅 챔버를 가진 셀수를 계산합니다.
- 원심분리기 배양 셀 서스펜션(5-7 x 106)은300 x g에서 10분 동안 멸균 파스퇴르 파이펫으로 생성된 슈퍼네티트를 흡인시합니다.
- 미리 냉각된 PBS pH 7.2, 0.5% BSA 및 2mM EDTA의 90 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단한다.
- CD45 양성 나노 크기의 마그네틱 비즈(80 μL)를 세포 현탁액에 넣고 얼음에 15분 동안 배양합니다.
- PBS 버퍼 와 원심분리기의 2mL를 300 x g에서 10 분 동안 추가하여 세포를 씻으하십시오.
- PBS 버퍼의 500 μL에서 셀을 다시 일시 중단합니다.
- 미리 냉각된 PBS 버퍼500μL로 컬럼을 세척하고 자기장에 놓습니다.
- 셀 서스펜션을 기둥에 놓고 500 μL의 PBS 버퍼(2회)와 CD45 네거티브 셀을 함유한 원심분리기 흐름으로 세척한다. 1% BSA로 보충된 이스코브의 매체에서 수집합니다.
- 카운팅 챔버의 셀을 계산합니다.
4. 새로 생성된 줄기 세포의 신경 분화를 위한 세포 배양 접시 준비
- 성장 하는 신경 세포를 위한 폴리 L-ornithine 및 라미닌배양 혈관을 코팅.
- 유리 커버립을 4웰 플레이트에 넣고 ddH2O.에서 1:5 희석 된 폴리 L-ornithine (0.1 mg / mL in ddH2O)로 코팅하여 커버립을 37 °C 인큐베이터에 1 시간 동안 배치합니다. 그런 다음 ddH2O로 씻으시다.
- 천천히 라미닌 (0.5-2.0 mg /mL)을 해동하고 커버립의 상단에 추가합니다. 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- D-MEM/F12의 49mL, N2 보충제의 500 μL, 비필수 아미노산(NEAA)의 400μL, 기본 FGF 용액 20 ng/mL 최종 농도(100μg/mL 스톡 용액에서 제조), 그리고 2ng/mL 농도로 구성된 신경 유도 매체 N2를 준비한다.
- 파이펫팅으로 과도한 라미닌을 제거하고 배양 요리에 뉴런 배지 N2를 추가하십시오.
5. 신경 분화 혈액 세포의 배양
- 배양 BD 유래 CD45 네거티브 셀은 라미닌/오르니틴 코팅 유리 커버립을 2일 동안 인큐베이터에서 37°C, N2 배지에서 5%CO2로 분리하여 새로 BD 생성 된 세포의 뉴런 분화를 개시한다.
- 배양 세포는 신경 물질 배지 48mL, L-글루타민 500 μL, B27 보충제 1mL, NEAA 500 μL, 재조합 인간 신경교에서 유래한 신경영양계수(GDNF) 5μg/250 μL로 구성된 뉴런 분화 배지에서 더 많은 BS%에서 1μg/250 μL, BS%에서 150 μL/250 μL로 구성된 세포 PBS/0.1% BSA및 아스코르브산 용액 의 50 μLPBS에서 5 μg/200 μL에서 재조합 인간 뇌 유래 신경 영양인자(BDNF)의 50 μL 및 PBS에서 아스코르브 산 용액 2.9 g/50 mL의 50 μL. 플레이트를 인큐베이터에 37°C 및 5% CO2로놓습니다.
6. 혈액 유래 신경 세포의 면역 형광 현미경 분석
- 위에서 설명한 바와 같이 세포를 16일 동안 배양하고 미디어를 제거한다.
- 멸균수 75mL, 파라포름알데히드 4g으로 구성된 사전 데운 고착처리된 인큐베이션을 증식합니다. 필요에 따라 10 N NaOH를 추가하고 용액이 지워날 때까지 저어줍니다. 그런 다음 10x PBS 10mL, MgCl2mL 0.5mL, 0.5M EGTA 2mL, 자당 4 g를 추가합니다. 6 N HCl로 pH 7.4에 titrate, 15 분 동안 멸균 수의 100 mL에 가져, 마르첸코 등7. 7.
- 고정을 버리고 매번 5 분 동안 세포를 3 번 씻으십시오. 즉시 새로 만든 0.3 % 트리톤 X 용액을 추가하고 5 분 동안 세포를 permeabilize. PBS로 3번 세척하고 PBS및 5% BSA로 만든 블로킹 솔루션을 추가합니다.
- 로커 플레이트의 실온에서 셀을 1시간 동안 차단합니다.
- 1% BSA/PBS에서 항체의 적절한 희석을 준비하고 실온에서 1.5 시간 동안 로커 플레이트에 항체 희석으로 세포를 배양한다. 각각 5 분 동안 PBS로 세포를 3 번 세척하고 DAPI로 세포를 배양하고 현미경에 시각화를위한 장착 매체로 커버립을 장착하십시오.
참고: 본 실험에 사용된 직접 표지된 항체는 재료표에기재되어 있다.
7. 새로 생성된 세포의 전송 전자 현미경 분석
- 8웰 챔버 슬라이드에서 TEM에 대한 세포를 시드합니다.
- 37°C에서 1시간 동안 3.5% 글루타랄데히드로 세포를 고정하고, 실온에서 2% OsO4에서 2% 후고리, 2시간 30분 동안 어둠 속에서 2%의 우란 아세테이트를 2% 소변을 드린 후 수정한다.
- 마지막으로, 증류수에 세포를 헹구고 에탄올에 탈수하고 하룻밤 에폭시 수지에 담근다. 다음 날 수지 경화에 대해 72h의 시료를 70°C 오븐으로 옮기다.
- 임베디드 세포 배양을 챔버 슬라이드및 접착제에서 아랄디테 블록으로 분리합니다.
- 기계로 직렬 반박형 섹션(1.5 μm)을 자르고, 유리 슬라이드에 장착하고, 1% 토루이딘 블루로 가볍게 얼룩을 감습니다.
- 접착제는 반박면을 선택하여 아를디테 블록을 차단하고 유리 슬라이드에서 분리하여 반복된 동결(액체 질소)과 해동을 반복합니다.
- 기계로 초박형 섹션(0.06-0.08 μm)을 준비하고 납 구연산염과 더욱 대조를 이룹니다.
- 디지털 카메라로 전자 스캐닝 현미경을 사용하여 현미경을 얻을 수 있습니다.
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Representative Results
결과는 이 새로운 GM 자유로운 방법이 인간 게놈에 직접 행동하지 않고 그들의 가장 원시적인 상태로 혈액 전구 세포를 되돌릴 수 있다는 증거를 제공합니다.
앞서 우리는 이전에 GPI 연결 단백질 특정 항체 교차 연결이 PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN 강화 조절을 통해 WNT, NOTCH 및 C-Kit와 같은 고도의 발달 관련 유전자의 개시를 보여주었으며, 따라서 HSC의 세대와2세대,2세대, 최종PSC의2단계로 이어지는 비차별적 과정을 개시하는 것으로나타났다.
활성화된 MNC 배양은 CD45 마이크로비드를 사용하여 면역자기 분류를 실시하였다. 이 방법으로 다시 프로그래밍할 수 없는 성숙한 혈액 세포(예를 들어, CD45 양성 세포)는 컬럼상에 유지되었지만, 재프로그래밍된 세포(CD45 네거티브 셀)를 함유하는 음수분은 다양한 뉴런 계보 세포의 생성에 사용되었다.
우리는 먼저 빛과 TEM을 통해 주변 BD-분화 세포의 형태학적 측면을 연구했습니다. 도 1에도시된 바와 같이, 인간 MC의 특정 GPI 고정 당단백질 항체 교차연결은 세포의 꾸준한 성장새로운 집단을 생성한다(도1A). 우리는 TEM을 통해 이 세포를 분석했습니다. BD-분화 세포는 크기가 작고 미성숙 성 과립 세포의 특성을 나타내며, 점차적으로 덜 세포기관과 응축 된 크로마틴을 가진 큰 핵을 가진, ESCs(도 1B)와유사합니다. 비처리 된 문화는 점진적 인 실종을 향한 추세를 보였다.
BD-CD45 음성 세포는 두 단계로 뉴런 분화를 실시하였다. 우리는 뉴런 분화 배지에서 배양다음 N2 배지에서 2일 동안 폴리 L-ornithine/laminin 코팅 배양 판에 CD45 네거티브 세포를 시드하여 뉴런 혈통을 향한 분화를 시작했다. 브라이트필드 사진은 BD 생성 줄기세포의 뉴런 분화를 시작하면 각각 4일, 8, 10, 14 및 30일에 획득되었다.
새로 생성된 세포의 표적 분화를 시작한 지 4일 후, 긴 분기 구조를 가진 최초의 뉴런 과 같은 세포를 검출할 수 있었다. 우리는 D2에서 D30까지의 형태학적 변화를 파급효과를 포함하는 보다 복잡한 구조로 관찰하고, 배양 기간 동안 뉴런 혈통으로 분화하는 활성 과정을 암시한다(도2). 16일 동안 뉴런 배지에서 배양한 후 재분화된 세포의 신경 특징을 확인하기 위해, 세포는 이전 프로토콜7에따라 고정되었고, 면역세포화학(ICC)은 항체 검출을 이용하여 네신, 신경교피산성 단백질(GFAP), 미세투필 관련 단백질 2(MAP2) 및 뉴런 특이적 클래스 III 베타-튜룰(Tu-tubulj)에 의해 수행되었다.
GFAP는 성숙한 성상세포의 주요 중간 필라멘트를 나타내는 성상세포에서 세포골격의 일부를 구성하는 단백질입니다. 도 3에도시된 바와 같이, GFAP에 대한 항체는 새로 생성된 뉴런 세포에서 이러한 구조를 인식하고, BD-PSC가 인간 성상세포9를향해 재분화할 수 있음을 확인한다.
MAP2는 튜툴리에 결합하고 마이크로투블러를 안정화시키는 세포골격 단백질입니다. 축축, 원원수 및 세포 체 내에서 발현되며 이 발현은 조직 및 발달에 특이적이다. 면역형광 현미경 검사기 결과는 재분화된세포(10)에서이 단백질의 발현을 확인한다.
Tuj1은 전형적인 신경 세포 마커입니다. 그것의 기능은 신경 세포 바디및 축소에 있는 microtubili를 안정시키는 것입니다. 그것은 또한 축 하 수송에 연루 되어있습니다 11. 새롭게 다시 분화된 세포는 여기에 설명된 조건하에서 신경 분화를 시작하면 D16에서 이 단백질의 발현을 명확하게 확인하였다.
네신은 먼저 NSC에서 특징화되었고 중급 필라멘트(IF)단백질(12)에 속하는 신경 상피 줄기 세포 단백질을 나타내며, 보다 분화된 뉴런 세포로부터 뉴런 전구세포를 구별한다. 이 IF 단백질은 축축의 방사형 성장에 관여하는 신경 세포에서 주로 표현됩니다, 그러나 그(것)들은 또한 추가 조직의 수에서 나타나고 있습니다. 네신은 D16에서 BD 재분화 세포의 경우와 같이 특정 뉴런 계보로 분화하는 경로에 이미 있는 세포에서 약하게 발현된다.
그림 1: 탈분화 (만능) 줄기 세포의 생성. (A) 피콜 분리 된 단일 핵 세포는 10 %의 FBS로 보충 이스코브의 배지에서 성장했다. 활성화된 배양 세포의 현미경 사진은 각각 1일, 5 및 10일에 촬영되었다. 비활성화 된 MC는 대조군으로 연구되었다. 스케일 바: 배양 시간 동안 새로 생성된 세포의 50 μm. (B) TEM 분석은 성숙한 세포(D1)의 세포기관이 점차 사라지는 것을 보여 주며(D8) ESC를 닮은 완전히 분화된 세포의 생성으로 이어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: BD-PSC의 신경 재분화. (A) BD-탈분화 세포는 프로토콜에 설명된 바와 같이 30일 동안 오니틴/라미닌 코팅 배양 배양에 배치되었다. 현미경 사진은 뉴런 분화 조건에서 성장한 후 각각 4일, 8, 10, 14 및 30일에 취합니다. 배양에 있는 대부분의 세포는 더 크고 길쭉한 모양 및 어떤 경우에는 분기된 세포로 작은 구형 모양에서 그들의 형태를 바꾸었습니다. 스케일 바: 100 μm. (B) BD-분화 세포는 신경 배지에서 16일 동안 성장하였고, 글루타랄데히드 및 EM 분석에 고정되어 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 수행되었다. 이들 세포의 세포 체와 과정은 세포기관과 세포골격의 관점에서 미분화 세포의 세포보다 더 높은 복잡성을 보였으며, 거친 풍토성 망상과 액틴 필라멘트의 풍부한 번들로 쌓인 시스테네의 고밀도를 제시했다(a, b). 미분화 BD 세포와는 달리, 분화 매체에서 성장하는 세포는 세포 대 세포 접촉을 자주 확립하였다. 이러한 전문 접촉 중 일부는 세포 본체를 포함 (c) 다른 neurite 같은 패션에 세포 프로세스를 포함 하는 동안 (d). 스케일 바: (a) 20 μm; (b-d), 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 새로 생성된 뉴런 세포의 면역페노티핑. BD-분화 세포는 16일 동안 프로토콜에 기재된 바와 같이 배양되었고, 면역세포화학 분석은 항체를 이용하여 신경마커 네스티닌, GFAP, MAP2 및 Tuj1을 수행하였다. DAPI를 핵 염색으로 면역형광 사진과 함께 재분화 된 세포의 밝은 필드 현미경 그래프뿐만 아니라 관련 항체로 염색하는 것으로 나타났습니다. 묘사된 필드는 특정 라인에 대한 특정 신경 마커 특성 중 하나를 표현하는 특정 인구를 나타내는 필드입니다. 스케일 바: 100 μm. 제어는 보충 도 1에제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 1: BD-분화 세포 제어. BD 유래 미분화 세포는 프로토콜에 설명된 바와 같이 16일 동안 10% FBS로 보충된 이스코브의 수정된 덜벡코의 배지에서 배양되었고, 항체로 염색되어 GFAP, Tuj1 및 MAP2에 염색하였다. DAPI는 핵 염색에 사용되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 업무에서 기재된 인간 세포를 재프로그래밍하는 비GM 방법은 비조작된 인간 말초 혈액으로부터 얻은 전 생체 생성 및 자가 갱신 PSC의 확장으로 이어지는 비분화 과정을 개시하는 GPI 연계 인간 막 당단백질 의 뒤에 있는 신호(들) 기계류의 핵 활성화에 기초한다. 이러한 세포는 적절한 배지에서 배양될 때 상이한세균층(6)에속하는 세포로 재분화할 수 있다.
이 작품에서 제시된 데이터는 신경 분화 매체에서 배양할 때 GM이 없는 생성된 BD-PSCs 세포가 완전히 다른 표현형을 획득했다는 것을 보여줍니다, 길쭉한 모양으로, 그들의 세포기관의 더 높은 발달및 세포 사이 더 복잡한 상호 작용을 설치하. 더욱이, 여기에 설명된 조건을 사용하여 재분화, 다양한 신경 혈통을 향한 신경 분화를 의미한다.
재분화 연구에서 사용하기 위해 최적의 수와 재프로그래밍 된 세포의 최고 품질을 얻으려면 냉동 MNC 준비와 비교할 때 신선한 MNC 준비가 유리할 수 있습니다. BD-PSC를 말기 분화 세포로부터 분리한 면역자기 분류 방법은 이 방법으로 다시 프로그래밍할 수 없는 절차반복을 요구하는 불완전할 수 있으며, 이는 세포에 매우 스트레스가 많고 조기 사망을 초래합니다.
프로토콜 내의 중요한 단계는 설명된 방법에 의해 얻을 수 있는 MMC의 수 와 품질에 관한 것입니다. 배양 시간뿐만 아니라 신경 분화 물질의 변형은 BD-PSC의 분화 잠재력을 향상시킬 수 있으므로 특정 유형의 뉴런 세포의 생성으로 이어질 수 있습니다.
이 방법의 한계는 이 방법으로 세포주를 생성하는 것이 불가능하기 때문에 이러한 재프로그래밍 된 세포의 비 기성 성질이다. 분화 세포가 최종 단계에 도달하면, 그 분수의, 그들은 대부분 정지되고 MN의 새로운 부분은 BD-PSC의 높은 수를 얻기 위해 다시 차별화해야합니다.
여기에 설명된 재프로그래밍은 혈액 전구 세포의 표면에 있는 항체 교차 연결 활성화에 의존합니다. 이 패러다임은 GM 방법에 비해 임상 안전에 관한 수많은 잠재적 인 이점을 제공합니다. 신경 조직의 생성을 위한 자가 줄기 세포를 달성하는 목표는 최소한의 전 생체 조작에 의해 달성될 수 있습니다; 따라서 강력하게이 세포 치료는 신경학에 효율적이고 안전한 임상 접근에 대한 유망한 후보가 될 수 있음을 시사한다.
파킨슨 병, 알츠하이머 병 및 대뇌 허혈은 유럽과 전 세계 사회에서 가장 높은 사회적, 경제적 부담을 가진 질병 중 하나입니다. 신경퇴행성 질환의 부담은 고령화 인구와 함께 증가할 것으로 예상되며, 중요한 사회 경제적 문제가 되고 문제에 대한 해답을 절실히 필요로 합니다. 제시된 방법은 현재 난치성 신경질환의 치료에 대한 희망을 품고 있는 적당한 자가줄기세포 집단을 생성하기 위한 간단하고 비용 효율적인 절차를 활용하여 비침습적 치료 전략을 위한 새로운 길을 열어준다.
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Disclosures
해당 저자는 그녀가 소설 인간 GPI 연결 단백질과 관련된 특허 보유자뿐만 아니라 그녀가 공동 설립및 ACA CELL 생명 공학에 대한 작동한다고 선언합니다. 다른 저자들은 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
라이너 사프리치 박사의 기억력에 전념합니다.
저자는 특히 호세 마누엘 가르시아 베르두고와 비센테 헤르란츠-페레즈가 비교 신경생물학 연구소, 생물 다양성 및 진화 생물학 연구소, 발렌시아 대학, CIBERNED, 발렌시아, 스페인에서 EM 실험 및 분석을 수행한 것에 대해 특히 감사하고 있으며, 이는 Prometeo Grant의 연구 자금 지원으로 지원되었다. 이 작품의 나머지 는 ACA 셀 생명 공학 GmbH 하이델베르크, 독일에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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