Summary
我们提出了一种无转基因（无转基因）的方法，从重新编程的周围血细胞中获取具有神经元表型的细胞。激活与新型人类GPI相关蛋白质相关的信号通路，揭示了获得人类多能干细胞的高效无转基因方法。
Abstract
许多人类神经系统疾病是由大脑中神经元和胶质细胞的退化引起的。由于药理学和其他治疗策略的限制，目前没有治疗受伤或患病的大脑的方法。细胞置换似乎是神经退行性疾病的有希望的治疗策略。时至今日，神经干细胞（NSC）已经成功地从胎儿组织、人类胚胎细胞（ES）或诱导多能干细胞（iPSC）中产生。通过激活新的人类GPI相关糖蛋白，导致多能干细胞的产生，启动了分化过程。这些血液衍生的多能干细胞（BD-PSCs） 在体外 分化成具有神经表型的细胞，亮场和免疫荧光显微镜就证明了这一点。通过电子显微镜对这些细胞进行超结构分析，证实了它们的原始结构以及神经元样形态和亚细胞特征。
Introduction
基础和临床前干细胞研究方法的开发鼓励了基于干细胞的神经系统疾病疗法的临床应用。这种潜在的治疗关键取决于人类神经细胞的生成方法，导致功能恢复1。
神经干细胞（NSC）在称为成人神经生成的过程中，自更新并终生分化成新的神经元。只有非常有限的大脑区域才拥有 NSC，能够在成年后产生新生儿神经元。这种 NSC 可以产生成熟的神经元，这些神经元涉及学习和记忆，从而取代丢失或损坏的神经元。不幸的是，这些NSC存在数量有限，这种有限的神经发生在青少年发育过程中迅速减少2。因此，神经细胞的其他来源必须在细胞治疗目标中考虑。
退行性神经系统疾病难以使用标准药理学方法治愈。接受许多不动的神经系统疾病的新治疗策略基于疾病和受伤组织的细胞替代疗法。NSC移植可以取代受损的细胞，并提供有益的效果。神经细胞替代的其他来源包括人类胚胎干细胞（ESC），它来自哺乳动物胚泡3的内细胞质量，以及iPSC4，它们具有广泛的自我更新能力，如ESC，能够分化成不同的细胞谱系。NSC也可以通过直接重新编程从人类成纤维细胞产生，避免多能状态5。
细胞替代疗法仍然是一个具有挑战性的问题。虽然ESC、胎儿或iPS可以成为治疗许多不治之症的神经元细胞的来源，但自体成人SC细胞替代受损组织是规避免疫、伦理和安全问题的更好选择。
通过PLC+/PI3K/Akt/mTor/PTEN的磷酸化，通过抗体交叉链接激活人类GPI相关蛋白质，启动血液祖细胞的分化和血液衍生多能干细胞（BD-PSCs）6的生成。这些细胞通过亮场、免疫荧光和传输电子显微镜 （TEM） 分析确认，在体外向神经元细胞分化。
在这项研究中，我们描述了无转基因的BD-PSCs生成及其成功重新分化成具有神经元表型的细胞。
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Protocol
在进行实验时获得了伦理学的批准。
1. 分离人类外周血单核细胞（PBMNCs）
- 确保所有献血者在血液提取前签署知情同意书，以符合机构准则。
- 根据标准协议，由训练有素的医务人员从健康献血者手中取出30兆L的血液。
- 通过密度梯度介质隔离 PBMNC。使用 10 mL 的介质，25 mL 的 1：1 血液稀释磷酸盐缓冲盐水 （PBS），离心机在 300 x g 30 分钟。
- 通过管道隔离等离子体和密度梯度介质之间的相间层。用5兆L的无菌PBS和离心机在300×g下清洗分离的细胞，10分钟重复两次。
- 使用计数室使用标准方法计算细胞数。
2. 通过在 PBMNC 表面的抗体交叉链接激活人体 GPI 锚定糖蛋白
- 将 6 x 106 单核细胞 （MNCs） 放入 15 mL 管中，通过在 PBS 中用人类 GPI 链接膜蛋白特异性抗体 （30 μg/mL） 孵育细胞，在 37 °C 下用 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 进行抗体交叉链接。
- 用伊斯科夫改良的杜尔贝科介质替换孵化介质，辅以10%的胎儿牛血清（FBS）。
- 在 15 mL 聚苯乙烯管中生长细胞，将管子在 37 °C 和 5% CO2 的孵化器中放置 8-10 天（不摇晃）。在 D5 上，在每 15 mL 管中再添加 1-2 mL 的 Iscove 介质，并辅以 10% FBS。
3. 对新生成的分化细胞进行排序
- 用自动电池计数器（18 μL 细胞悬浮 + 2 μL 荧光染料）或计数室中计算细胞。
- 离心培养细胞悬架（5-7 x 106）在300×g 10分钟，并吸气产生的超高纳特与无菌巴斯德移液器。
- 将细胞颗粒重新悬挂在预冷却 PBS pH 7.2、0.5% BSA 和 2 m M EDTA 的 90 μL 中。
- 将CD45正纳米大小的磁珠（80微升）加入细胞悬浮物中，在冰上孵育15分钟。
- 通过在 300 x g 下添加 2 mL 的 PBS 缓冲器和离心机来清洗电池 10 分钟。
- 将细胞重新悬挂在 500 μL 的 PBS 缓冲器中。
- 用 500 μL 预冷却 PBS 缓冲器清洗柱子，并将其放置在磁场中。
- 将电池悬架放在柱子上，用 500 μL 的 PBS 缓冲器（两次）和包含 CD45 负细胞的离心机流清洗。收集他们在伊斯科夫的介质补充1%的BSA。
- 数计数室中的细胞。
4. 为新生成干细胞的神经元分化准备细胞培养皿
- 用多L-兽人及层压素涂抹培养血管，以生长神经元细胞。
- 将玻璃盖唇放在 4 井板中，涂上 1：5 稀释的多 L-ornithine（0.1 毫克/毫升（ddH2O），在 ddH2O 中将盖片放入 37 °C 孵化器中 1 小时。然后用 ddh2O 清洗。
- 慢慢解冻层压素（0.5-2.0毫克/毫升），并添加到盖片顶部。在 37 °C 下孵育 2 小时。
- 准备神经感应介质N2，包括49 mL的D-MEM/F12，500微升的N2补充剂，400微升的非必需氨基酸（NEAA），基本FGF溶液在20 ng/mL最终浓度（从100微克/mL库存溶液中制备），肝素在2 ng/mL最终浓度。
- 通过管道去除多余的层压素，并在培养皿中加入神经元介质N2。
5. 培养神经元分化血细胞
- 培养BD衍生的CD45负细胞在层压素/兽人涂层玻璃盖片上2天在37°C的孵化器和5%的CO2 在N2介质启动新BD生成细胞的神经元分化。
- 神经元分化介质中的培养细胞进一步包括 48 mL 神经基础介质、500 微升 L-谷氨酰胺、1 mL B27 补充剂、500 微升 NEAA， 50 μL 重组人类胶质衍生神经营养因子 （GDNF） 在 PBS/0.1% BSA 中的 5 μg/250 μL 和 50 μL 重组人脑 衍生神经营养因子 （BDNF） 在 PBS/0.1% BSA 中为 5 μg/200 μL，在 PBS 中为 50 μL 的抗坏血酸溶液 2.9 g/50 mL。将板材放在37°C和5%CO2的孵化器中。
6. 血液衍生神经细胞免疫荧光显微镜分析
- 培养上述细胞16天，并删除介质。
- 用预热固定剂孵育，包括75mL的无菌水，4克的副甲醛。根据需要添加 10 N NaOH 并搅拌，直到溶液清除。然后加入 10 mL 的 10 倍 PBS、0.5 mL 的 MgCl2、2 mL 的 0.5 M EGTA 和 4 克蔗糖。据马尔琴科等人说，Titrate到pH 7.4与6N HCl，并带来100ml的无菌水15分钟。
- 丢弃固定剂，每次洗3次细胞5分钟。立即添加新鲜制作的 0.3% Triton X 溶液，使细胞渗透 5 分钟。用 PBS 清洗 3 次，并添加由 PBS 和 5% BSA 制成的阻塞解决方案。
- 在室温下将细胞在摇摇盘上阻挡1小时。
- 在 1% BSA/PBS 中准备适当的抗体稀释，并在室温下用抗体稀释在摇板上孵育 1.5 小时的细胞。用 PBS 清洗细胞 3 次，每次 5 分钟，用 DAPI 孵育细胞，然后用安装介质安装盖片，在显微镜上进行可视化。
注：本实验中使用的直接标记抗体列在 材料表中。
7. 新生成细胞的传输电子显微镜分析
- 在 8 井室幻灯片中为 TEM 种子细胞。
- 在 37 °C 下将 3.5% 谷胱甘肽中的细胞修复 1 小时，在室温下在 2% OsO4 中修复后再修复一小时，在 4 °C 时在 2°C 下在 2 小时 30 分钟在黑暗中染色 2% 的醋酸尿素。
- 最后，在蒸馏水中冲洗细胞，将其脱水到乙醇中，并在一夜之间嵌入环氧树脂中。第二天将样品转移到 70 °C 烤箱 72 小时，用于树脂硬化。
- 将嵌入的细胞培养物从室滑梯和胶水分离到咸土块。
- 用机器切割串行半薄部分（1.5 μm），安装在玻璃滑梯上，轻轻弄脏 1% 的甲苯蓝色。
- 胶水选择半薄部分到咸土块，并通过反复冻结（液氮）和解冻将其从玻璃滑梯中分离出来。
- 使用机器准备超音速部分（0.06-0.08 μm），并与铅柠檬酸盐进一步对比。
- 使用数码相机使用电子扫描显微镜获取显微图。
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Representative Results
研究结果证明，这种新型的无转基因方法能够将血液祖细胞恢复到最原始的状态，而无需直接作用于人类基因组。
我们之前已经表明，GPI链接蛋白特异性抗体交叉链接启动通过PLC+/IP3K/Akt/mTOR/PTEN对高度保存的发展相关基因，如WNT，NOTCH和C-Kit进行调节，从而启动分化过程，导致HSC的第一步，以及BD-PSc6，8的第二步和最后一代。
激活的跨国公司培养物使用CD45微珠进行免疫磁分拣。不能用这种方法重新编程的成熟血细胞（例如CD45阳性细胞）保留在列中，而含有重新编程细胞（CD45阴性细胞）的负分数用于生成各种神经元血统细胞。
我们首先通过光和TEM研究了外周BD分化细胞的形态方面。如图 1所示，人类跨国公司的特定GPI锚定糖蛋白抗体交叉链接产生稳定增长的新细胞群（图1A）。我们通过 TEM 分析这些细胞。BD分化细胞体积小，显示出不成熟的农用细胞的特征，细胞细胞逐渐减少，大核与浓缩色素相似，类似于ESC（图1B）。未经治疗的文化呈现出逐渐消失的趋势。
BD-CD45阴性细胞分两步进行神经元分化。我们通过在多L-兽人/拉米宁涂层培养板上播种CD45阴性细胞，在N2介质中分化2天，在神经元分化介质中培养，从而开始了对神经元谱系的分化。布莱特菲尔德图片分别在第4天、第8天、第10天、第14天和第30天获得，开始对BD生成的干细胞进行神经元分化。
早在新生成细胞开始靶向分化4天后，就可以检测到第一个具有长分支结构的神经元状细胞。我们观察从 D2 到 D30 的形态变化，其结构更为复杂，包括影响，这意味着在整个培养时期（图 2）向神经元血统的分化方向积极推进。为了确认在神经元介质中培养细胞16天后重新分化细胞的神经元特征，细胞按照先前的协议7进行修复，免疫细胞化学（ICC）使用抗体检测来筑巢，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）和神经元特异性III类β-图布林（Tuj1）。
GFAP是代表成熟星形细胞主要中间丝的星形细胞骨骼的一部分的蛋白质。如图 3所示，GFAP的抗体在新生成的神经元细胞中识别这些结构，确认BD-PSC能够对人类星形细胞9进行重新分化。
MAP2是一种细胞骨骼蛋白，与图布利结合，稳定微管。它在轴突、树突和细胞体中表达，这种表达是组织和发育特异性的。免疫荧光显微镜结果证实这种蛋白质在重新分化的细胞10中的表达。
Tuj1 是典型的神经元细胞标记。其功能是稳定神经元细胞体内的微生物和轴突。它也涉及轴向运输11。新重新分化的细胞在D16中明确确认了这种蛋白质在D16下在以下条件下开始神经元分化时的表达。
Nestin 首先在 NSC 中具有特征，代表一种神经上皮干细胞蛋白，它属于中间丝 （IF） 蛋白12 区分神经元祖细胞和更差异化的神经元细胞。这些IF蛋白主要表现在神经细胞中，它们参与轴心的径向生长，但它们也存在于一些额外的组织中。内分市场作为主要 NSC 的标记，在已经走上分化为特定神经元谱系的细胞中表达较弱，就像 D16 中 BD 重新分化的细胞一样。
图1：分化（多能）干细胞的生成。（A） 在伊斯科夫的介质中生长了菲科尔分离的单核细胞，辅以10%的FBS。激活培养细胞的显微图分别在第1天、第5天和第10天进行。将非激活的跨国公司作为对照进行研究。比例栏：50μm. （B） TEM 分析整个培养时间内新生成的细胞表明，成熟细胞 （D1） 的细胞逐渐消失 （D8），导致生成类似于 ESC 的完全分离细胞。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：BD-PSC的神经再分化。（A） BD分化细胞被放置在兽人/层压涂层培养皿中，按照协议中描述培养30天。显微图分别在第4天、第8天、第10天、第14天和第30天在神经元分化条件下生长。培养中的大多数细胞从小球形变为较大、拉长的形状，在某些情况下是分支细胞。比例栏：100 μm. （B） BD 分化细胞在神经元介质中生长 16 天，固定在谷胱甘肽中，并按协议部分进行 EM 分析。这些细胞的细胞体和过程表现出比未分化细胞更高的复杂性，在细胞器和细胞骨架方面呈现高密度的粗糙内质质视网膜和大量的作用素丝 束（a，b）。与未分化的BD细胞不同，在分化介质中生长的细胞经常建立细胞对细胞的联系人。其中一些专门接触涉及细胞体 （c）， 而另一些则以类似神经质的方式涉及细胞过程 （d）。 秤杆 ：（a） 20μm; （b-d），500 纳米请单击此处查看此图的较大版本。
图3：新生成神经元细胞的免疫表型。BD-分化细胞按照协议中描述培养了16天，并用抗体对神经元标记巢素、GFAP、MAP2和Tuj1进行了免疫细胞化学分析。显示的是重新分化的细胞的亮场显微图，并附有免疫荧光图，DAPI作为核染色，以及相关抗体的染色。所描绘的字段显示了特定人群，这些磁场表示特定线条的特定神经元标记特征之一。秤吧：100μm。 控制在补充图1中提出。请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：BD分化细胞控制。 BD 衍生的无差别细胞在伊斯科夫的改良杜尔贝科介质中培养，并辅以 10% FBS，在协议中描述的 16 天，并染有抗体，以筑巢 GFAP、Tuj1 和 MAP2。DAPI用于核污渍。比例栏： 100 μm.请点击这里下载此文件。
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Discussion
本工作中描述的非转基因人体细胞重新编程方法基于GPI链接的人类膜糖蛋白背后的信号机制的膜到细胞核活化，该机制启动分化过程，导致从非受操纵的人类外周血液中获取的自续PC 的体外 生成和扩展。这些细胞在适当的介质中培养时，能够重新分化成属于不同生殖层6的细胞。
本研究中提供的数据表明，在神经元分化介质中培养时，无转基因生成的BD-PSCs细胞获得了完全不同的表型，其形状较长，细胞器发育较高，细胞之间建立了更复杂的相互作用。此外，使用此处描述的情况进行重新分化，意味着神经元对各种神经元血统的区分。
为了获得重新编程细胞的最佳数量和最佳质量，以便在重新分化研究中使用，与冷冻的跨国公司制剂相比，新鲜的跨国公司制剂可能具有优势。将BD-PSC与无法通过这种方法重新编程的绝症分化细胞分离的免疫磁分拣方法可能不完整，需要重复该过程，这对细胞来说压力很大，并导致其过早死亡。
协议中的关键步骤涉及通过所述方法可以获得的跨国公司的数量和质量。神经分化介质的改变以及培养时间的改变可以提高BD-PSCs的分化潜力，从而产生特定类型的神经元细胞。
此方法的局限性是这些重新编程的细胞的非致畸性质，因为无法用此方法生成细胞线。一旦分化细胞进入最后阶段，即多能细胞，它们就变得基本静止，必须再次分化新的跨国公司，以获得数量更高的BD-PSC。
此处描述的重新编程依赖于血液祖细胞表面的抗体交叉链接激活。与转基因方法相比，这种范式在临床安全性方面具有许多潜在的优势。实现产生神经组织的自体干细胞的目标可以通过最小的 前体内 操作来实现：因此，强烈建议这种细胞疗法可以成为神经学中高效、安全的临床方法的有希望的候选者。
帕金森病、阿尔茨海默氏症和脑缺血是欧洲和全世界社会社会和经济负担最重的疾病之一。随着人口老龄化，神经退行性疾病的负担预计将增加，成为一个重要的社会经济问题，并迫切需要解决这个问题。提出的方法为非侵入性治疗策略开辟了一条新途径，利用简单和具有成本效益的程序产生合适的自体干细胞种群，为治愈目前难以治愈的神经系统疾病带来了希望。
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Disclosures
相应的作者宣称，她是与新人类GPI相关蛋白质相关的专利持有人，也是ACA CELL生物技术公司的共同创始人和工作人。其他作者宣布他们没有任何利益冲突。
Acknowledgments
献给雷纳·萨弗里希博士的记忆
作者特别感谢何塞·曼努埃尔·加西亚-韦尔杜戈和维森特·赫兰茨-佩雷斯在西班牙瓦伦西亚大学卡瓦尼耶生物多样性和进化生物学研究所比较神经生物学实验室进行EM实验和分析，该实验室得到了普罗梅蒂奥卓越研究团体PROMETEO/2019/075研究资助。这项工作的其余部分得到了德国海德堡ACA CELL生物技术有限公司的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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