Summary
Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.
Abstract
Viele neurologische Erkrankungen des Menschen werden durch die Degeneration von Neuronen und Gliazellen im Gehirn verursacht. Aufgrund von Einschränkungen in pharmakologischen und anderen therapeutischen Strategien gibt es derzeit keine Heilung für das verletzte oder erkrankte Gehirn. Zellersatz erscheint als vielversprechende therapeutische Strategie für neurodegenerative Erkrankungen. Bis heute werden neuronale Stammzellen (NSCs) erfolgreich aus fetalem Gewebe, menschlichen embryonalen Zellen (ES) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugt. Ein Prozess der Dedifferenzierung wurde durch die Aktivierung des neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Glykoproteins eingeleitet, das zur Erzeugung pluripotenter Stammzellen führt. Diese aus dem Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) differenzieren sich in vitro zu Zellen mit einem neuronalen Phänotyp, wie die Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt. Die ultrastrukturelle Analyse dieser Zellen mittels Elektronenmikroskopie bestätigt ihre primitive Struktur sowie neuronale Morphologie und subzelluläre Eigenschaften.
Introduction
Die Entwicklung grundlegender und präklinischer Stammzellforschungsmethoden fördert die klinische Anwendung stammzellbasierter Therapien bei neurologischen Erkrankungen. Eine solche mögliche Therapie hängt entscheidend von der Methode zur Erzeugung menschlicher Nervenzellen ab, die zur funktionellen Erholung führen1.
Neuronale Stammzellen (NSCs) erneuern sich selbst und differenzieren sich im Laufe des Lebens in einem Prozess, der als adulte Neurogenese bezeichnet wird. Nur sehr eingeschränkte Hirnareel beherbergen NSCs, die in der Lage sind, neugeborene Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen. Solche NSCs können reife Neuronen hervorbringen, die am Lernen und Gedächtnis beteiligt sind und so verlorene oder beschädigte Neuronen ersetzen. Leider sind diese NSCs in begrenzten Mengen vorhanden und diese begrenzte Neurogenese nimmt während der juvenilen Entwicklung schnell ab2. Daher müssen andere Quellen von Nervenzellen in einem Zelltherapieziel berücksichtigt werden.
Degenerative neurologische Erkrankungen sind mit pharmakologischen Standardansätzen schwer zu heilen. Neue therapeutische Strategien zur Umarmung vieler nicht medikamentöser neurologischer Erkrankungen basieren auf Zellersatztherapien von erkranktem und verletztem Gewebe. Die NSC-Transplantation könnte beschädigte Zellen ersetzen und positive Wirkungen erzielen. Andere Quellen für den Neuronalen Zellersatz sind humane embryonale Stammzellen (ESC), die aus der inneren Zellmasse der Säugetier-Blastozysten3gewonnen werden, sowie iPSCs4,die wie ESCs über eine umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit verfügen und in der Lage sind, sich in verschiedene Zelllinien zu differenzieren. NSCs können auch durch direkte Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten erzeugt werden, wodurch der pluripotente Zustand5vermieden wird.
Die Zellersatztherapie ist nach wie vor ein herausforderndes Thema. Obwohl ESC, fetal oder iPS eine Quelle für die Erzeugung neuronaler Zellen zur Behandlung vieler unheilbarer neurologischer Erkrankungen sein können, ist der autologe adulte SCs-Zellersatz von beschädigtem Gewebe eine bessere Alternative, die immunologische, ethische und Sicherheitsbedenken umgeht.
Die Aktivierung des humanen GPI-verknüpften Proteins durch Antikörpervernetzung durch Phosphorylierung von PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initiiert eine Dedifferenzierung von Blutvorläuferzellen und die Erzeugung von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs)6. Diese Zellen differenzieren sich in vitro gegenüber neuronalen Zellen, wie durch Hellfeld-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt.
In dieser Arbeit beschreiben wir die GEN-freie Erzeugung von BD-PSCs und deren erfolgreiche Redifferenzierung in Zellen mit neuronalem Phänotyp.
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Protocol
Bei der Durchführung der Experimente wurden ethische Genehmigungen eingeholt.
1. Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes (PBMNCs)
- Stellen Sie sicher, dass alle Spender eine Einwilligung nach Aufklärung unterzeichnet haben, bevor sie die Blutentzugskonformität in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchführen.
- Nehmen Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern durch geschultes medizinisches Personal gemäß dem Standardprotokoll.
- Isolieren Sie PBMNCs durch Dichtegradientenmedien. Verwenden Sie 10 ml Medium mit 25 ml 1:1 Blut, verdünnt mit Phosphatpuffersalzlösung (PBS), und Zentrifuge bei 300 x g für 30 min.
- Isolieren Sie die Interphasenschicht zwischen dem Plasma und dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren. Waschen Sie die isolierten Zellen mit 5 ml sterilem PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min. Wiederholen Sie es zweimal.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen nach Standardmethoden mit einer Zählkammer.
2. Aktivierung des humanen GPI-verankerten Glykoproteins durch Antikörpervernetzung auf der Oberfläche von PBMNCs
- Die 6 x 106 mononukleären Zellen (MNCs) werden in 15 ml Röhrchen eingelegt und eine Antikörpervernetzung durchgeführt, indem die Zellen mit humanen GPI-verknüpften Membranprotein-spezifischen Antikörpern (30 μg/ml) für 30 min in PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) bei 37 °C inkubiert werden.
- Ersetzen Sie das Inkubationsmedium durch das modifizierte Dulbecco-Medium von Iscove, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
- Züchten Sie die Zellen in 15 ml Polystyrolröhrchen, legen Sie die Röhrchen für 8-10 Tage in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 (ohne Schütteln). Fügen Sie auf D5 zusätzliche 1-2 ml Iscove-Medium hinzu, ergänzt mit 10% FBS, zu jeder 15-ml-Röhre.
3. Sortierung neu erzeugter dedifferenzierter Zellen
- Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzähler (18 μL Zellsuspension + 2 μL Fluoreszenzfarbstoff) oder in einer Zählkammer.
- Zentrifugen kultivierte Zellsuspension (5-7 x10 6) bei 300 x g für 10 min und den resultierenden Überstand mit einer sterilen Pasteur-Pipette absaugen.
- Suspendieren Sie das Zellpellet in 90 μL vorgekühltem PBS pH 7,2, 0,5% BSA und 2 mM EDTA.
- CD45-positive magnetische Perlen in Nanogröße (80 μL) in die Zellsuspension geben und 15 Minuten lang auf Eis inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 2 ml PBS-Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min hinzufügen.
- Suspendieren Sie die Zellen in 500 μL PBS-Puffer.
- Waschen Sie die Säule mit 500 μL vorgekühltem PBS-Puffer und legen Sie sie in das Magnetfeld.
- Legen Sie die Zellsuspension auf die Säule und waschen Sie sie mit 500 μL PBS-Puffer (zweimal) und dem Zentrifugenstrom mit CD45-negativzellen. Sammeln Sie sie in Iscoves Medium, ergänzt mit 1% BSA.
- Zählen Sie die Zellen in der Zählkammer.
4. Vorbereitung von Zellkulturschalen zur neuronalen Differenzierung neu erzeugter Stammzellen
- Beschichten Sie die Kulturgefäße mit Poly-L-Ornithin und Laminin, um neuronale Zellen zu züchten.
- Legen Sie die Glasdeckschichten in 4-Well-Platten und beschichten Sie sie mit 1:5 verdünntem Poly-L-Ornithin (0,1 mg/ml in ddH2O) in ddH2O. Legen Sie die Deckrutsche für 1 h in einen 37 °C-Inkubator. Anschließend mit ddH2O waschen.
- Laminin langsam auftauen (0,5-2,0 mg / ml) und oben auf den Abdeckeln hinzufügen. Inkubieren Sie es bei 37 °C für 2 h.
- Vorbereiten des neuronalen Induktionsmediums N2, bestehend aus 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-Ergänzung, 400 μL nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), basische FGF-Lösung bei 20 ng/ml Endkonzentration (hergestellt aus 100 μg/ml Stammlösung) und Heparin bei 2 ng/ml Endkonzentration.
- Entfernen Sie überschüssiges Laminin durch Pipettieren und fügen Sie dem Kulturschalen neuronales Medium N2 hinzu.
5. Kultivierung neuronaler dedifferenzierter Blutzellen
- Kultur BD-abgeleitete CD45-negative Zellen auf Laminin/Ornithin-beschichteten Glasabdeckungen für 2 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 in N2-Medium, um eine neuronale Differenzierung von neu BD-erzeugten Zellen einzuleiten.
- Kulturzellen weiter in neuronalem Differenzierungsmedium bestehend aus 48 ml neurobasalem Medium, 500 μL L-Glutamin, 1 ml B27-Ergänzung, 500 μL NEAA, 50 μL rekombinantem humanem Glia-abgeleitetem neurotrophen Faktor (GDNF) bei 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA und 50 μL rekombinantem neurotrophen Faktor (BDNF) des menschlichen Gehirns bei 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA und 50 μL Ascorbinsäurelösung 2,9 g/50 ml in PBS. Legen Sie die Platten in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
6. Immunfluoreszenzmikroskopische Analyse von blutabgeleiteten Nervenzellen
- Kulturieren Sie die Zellen wie oben beschrieben für 16 Tage und entfernen Sie die Medien.
- Inkubieren Sie mit vorgewärmten Fixiermitteln, bestehend aus 75 ml sterilem Wasser, 4 g Paraformaldehyd. Fügen Sie nach Bedarf 10 N NaOH hinzu und rühren Sie um, bis die Lösung klar ist. Dann fügen Sie 10 mL 10x PBS, 0,5 mlMgCl2, 2 mL 0,5 M EGTA und 4 g Saccharose hinzu. Titrieren Sie auf pH 7,4 mit 6 N HCl und bringen Sie auf 100 ml steriles Wasser für 15 minuten, nach Marchenko et al.7.
- Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen 3 Mal für jeweils 5 min. Sofort eine frisch hergestellte 0,3% Triton X-Lösung hinzufügen und die Zellen für 5 min permeabilisieren. 3 Mal mit PBS waschen und eine Blockierungslösung von PBS und 5% BSA hinzufügen.
- Blockieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf einer Wippplatte für 1 Stunde.
- Bereiten Sie eine geeignete Verdünnung von Antikörpern in 1% BSA / PBS vor und inkubieren Sie die Zellen mit Antikörperverdünnungen auf der Rockerplatte für 1,5 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen 3 mal mit PBS für jeweils 5 min, inkubieren Sie die Zellen mit DAPI und montieren Sie die Abdecklappen mit Montagemedien zur Visualisierung auf einem Mikroskop.
HINWEIS: Direkt markierte Antikörper, die in diesem Experiment verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
7. Transmissionselektronenmikroskopische Analyse neu erzeugter Zellen
- Säen Sie die Zellen für TEM in 8-Well-Kammerobjektträgern.
- Fixieren Sie die Zellen in 3,5% Glutaraldehyd für 1 h bei 37 °C, postfixieren Sie in 2% OsO4 für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur und färben Sie sie in 2% Uranylacetat im Dunkeln bei 4 °C für 2 h 30 min.
- Zum Schluss die Zellen in destilliertem Wasser abspülen, in Ethanol dehydrieren und über Nacht in Epoxidharz einbetten. Am nächsten Tag werden die Proben für 72 h zur Harzhärtung in einen 70 °C-Ofen überführen.
- Lösen Sie die eingebetteten Zellkulturen vom Kammerschieber und kleben Sie sie auf Aralditblöcke.
- Schneiden Sie serielle halbdünne Abschnitte (1,5 μm) mit einer Maschine, montieren Sie sie auf Glasobjektträger und färben Sie sie leicht mit 1% Toluidinblau.
- Ausgewählte halbdünne Abschnitte auf Aralditblöcke kleben und durch wiederholtes Einfrieren (in flüssigem Stickstoff) und Auftauen vom Glasobjektträger lösen.
- Bereiten Sie ultradünne Abschnitte (0,06-0,08 μm) mit einer Maschine vor und kontrastieren Sie sie mit Bleicitrat.
- Erhalten Sie Mikroaufnahmen mit dem Elektronenrinnenmikroskop mit Digitalkamera.
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Representative Results
Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass diese neuartige gentechnikfreie Methode in der Lage ist, Blutvorläuferzellen in ihren primitivsten Zustand zurückzusetzen, ohne direkt auf das menschliche Genom einzuwirken.
Wir haben bereits gezeigt, dass die GPI-verknüpfte proteinspezifische Antikörpervernetzung über PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN eine Hochregulierung hochkonservierender entwicklungsrelevanter Gene wie WNT, NOTCH und C-Kit initiiert und damit einen Prozess der Dedifferenzierung einleitet, der zum ersten Schritt zur Generierung von HSCs und einem zweiten und letzten zu einer Generation von BD-PSCs führt6,8.
Aktivierte MNC-Kulturen wurden einer immunmagnetischen Sortierung mit CD45-Mikroperlen unterzogen. Reife Blutzellen, die mit dieser Methode nicht umprogrammiert werden können (z.B. CD45-positive Zellen), wurden auf der Säule beibehalten, während die negative Fraktion mit reprogrammierten Zellen (CD45-negative Zellen) zur Erzeugung verschiedener neuronaler Linienzellen verwendet wurde.
Wir untersuchten zunächst die morphologischen Aspekte peripherer BD-dedifferenzierter Zellen mittels Licht und TEM. Wie in Abbildung 1gezeigt, erzeugt die spezifische GPI-verankerte Glykoprotein-Antikörpervernetzung menschlicher MNCs eine stetig wachsende neue Zellpopulation (Abbildung 1A). Wir haben diese Zellen mittels TEM analysiert. BD-dedifferenzierte Zellen sind klein und zeigen die Eigenschaften unreifer agranularer Zellen, mit allmählich weniger Organellen und großen Kernen mit kondensiertem Chromatin, ähnlich wie ESCs (Abbildung 1B). Nicht behandelte Kulturen zeigten einen Trend zum allmählichen Verschwinden.
BD-CD45-negative Zellen wurden in zwei Schritten einer neuronalen Differenzierung unterzogen. Wir initiierten die Differenzierung in Richtung neuronaler Linien, indem wir die CD45-negativen Zellen auf poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten Kulturplatten für 2 Tage in N2-Medium nach Kultur in neuronalem Differenzierungsmedium aussäten. Hellfeldbilder wurden an den Tagen 4, 8, 10, 14 bzw. 30 aufgenommen, als mit der neuronalen Differenzierung von BD-erzeugten Stammzellen begonnen wurde.
Bereits 4 Tage nach Beginn der gezielten Differenzierung neu erzeugter Zellen konnten die ersten neuronalen Zellen mit lang verzweigten Strukturen nachgewiesen werden. Wir beobachten die morphologischen Veränderungen von D2 zu D30 mit einer komplexeren Struktur einschließlich Verzweigung, was einen aktiven Prozess zur Differenzierung zu neuronalen Linien während des gesamten Kulturzeitraums impliziert (Abbildung 2). Um die neuronalen Merkmale von redifferenzierten Zellen zu bestätigen, nachdem sie 16 Tage lang in neuronalem Medium kultiviert wurden, wurden die Zellen gemäß einem früheren Protokoll7fixiert und die Immunzytochemie (ICC) wurde mit Antikörpernachweis gegen Nestin, Gliafibrillary Acidic Protein (GFAP), Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2) und neuronenspezifisches Beta-Tubulin der Klasse III (Tuj1) durchgeführt.
GFAP ist das Protein, das einen Teil des Zytoskeletts in Astrozyten bildet, die das wichtigste Zwischenfilament reifer Astrozyten darstellen. Wie in Abbildung 3gezeigt, erkennt der Antikörper gegen GFAP diese Strukturen in den neu erzeugten neuronalen Zellen und bestätigt, dass BD-PSCs in der Lage sind, sich in Richtung menschlicher Astrozyten neu zu differenzieren9.
MAP2 ist ein Zytoskelettprotein, das an Tubuli bindet und Mikrotubuli stabilisiert. Es wird in Axonen, Dendriten und Zellkörpern exprimiert und diese Expression ist gewebe- und entwicklungsspezifisch. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigen die Expression dieses Proteins in neu differenzierten Zellen10.
Tuj1 ist ein typischer neuronaler Zellmarker. Seine Funktion ist es, Mikrotubuli im neuronalen Zellkörper und Axonen zu stabilisieren. Es ist auch am axonalen Transportbeteiligt 11. Neu differenzierte Zellen bestätigten die Expression dieses Proteins bei D16 eindeutig, als die neuronale Differenzierung unter der hier beschriebenen Bedingung begann.
Nestin wurde zuerst in NSCs charakterisiert und stellt ein neuroepitheliales Stammzellprotein dar, das zum Intermediate Filament (IF) Protein12 gehört, das neuronale Vorläuferzellen von differenzierteren neuronalen Zellen unterscheidet. Diese IF-Proteine werden hauptsächlich in Nervenzellen exprimiert, wo sie am radialen Wachstum des Axons beteiligt sind, aber sie sind auch in einer Reihe von zusätzlichen Geweben vorhanden. Nestin als Marker von überwiegend NSCs wird in den Zellen, die sich bereits auf dem Weg zur Differenzierung in spezifische neuronale Linien befinden, schwach exprimiert, wie es bei BD-redifferenzierten Zellen bei D16 der Fall ist.
Abbildung 1: Erzeugung dedifferenzierter (pluripotenter) Stammzellen. (A) Ficoll-isolierte mononukleäre Zellen wurden in Iscoves Medium gezüchtet, ergänzt mit 10% FBS. Mikroaufnahmen von aktivierten kultivierten Zellen wurden an den Tagen 1, 5 und 10 gemacht. Nicht aktivierte MNCs wurden als Kontrolle untersucht. Maßstabsbalken: 50 μm. (B) Die TEM-Analyse neu erzeugter Zellen während der Kulturzeit zeigt, dass Organellen reifer Zellen (D1) allmählich verschwinden (D8), was zur Bildung von vollständig dedifferenzierten Zellen führt, die ESCs ähneln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Neuro-Redifferenzierung von BD-PSCs. (A) BD-dedifferenzierte Zellen wurden in mit Ornithin/Laminin beschichtete Kulturschalen gelegt und 30 Tage lang kultiviert, wie im Protokoll beschrieben. Mikroaufnahmen werden an den Tagen 4, 8, 10, 14 und 30 nach dem Wachstum unter neuronalen Differenzierungsbedingungen gemacht. Die meisten Zellen in der Kultur änderten ihre Morphologie von kleinen Kugelformen zu größeren, länglichen Formen und in einigen Fällen verzweigten Zellen. Maßstabsbalken: 100 μm. (B) BD-dedifferenzierte Zellen wurden 16 Tage lang in neuronalem Medium gezüchtet, in Glutaraldehyd fixiert und EM-Analysen durchgeführt, die wie im Protokollabschnitt beschrieben durchgeführt wurden. Der Zellkörper und die Prozesse dieser Zellen zeigten eine höhere Komplexität als die undifferenzierter Zellen in Bezug auf Organellen und Zytoskelett, die eine hohe Dichte an gestapelten Zisternaen aus rauem endoplasmatischem Retikulum und reichlich Bündeln von Aktinfilamenten (a, b)aufwiesen. Im Gegensatz zu undifferenzierten BD-Zellen haben Zellen, die in Differenzierungsmedien wachsen, häufig Zell-zu-Zell-Kontakte hergestellt. Einige dieser spezialisierten Kontakte betrafen den Zellkörper (c), während andere zelluläre Prozesse in neuritischer Weise (d) beinhalteten. Maßstabsbalken: a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Immunphänotypisierung neu erzeugter neuronaler Zellen. BD-dedifferenzierte Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben für 16 Tage kultiviert und die immunzytochemische Analyse wurde mit Antikörpern gegen die neuronalen Marker Nestin, GFAP, MAP2 und Tuj1 durchgeführt. Gezeigt sind Hellfeldmikroskopieaufnahmen von redifferenzierten Zellen, begleitet von Immunfluoreszenzbildern mit DAPI als Kernfärbung sowie Färbung mit relevanten Antikörpern. Dargestellt sind die Felder, die eine bestimmte Population zeigen, die einen der spezifischen neuronalen Marker ausdrückt, die für bestimmte Linien charakteristisch sind. Maßstabsleiste: 100 μm. Die Steuerung ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: BD-dedifferenzierte Zellkontrolle. BD-abgeleitete undifferenzierte Zellen wurden in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium kultiviert, das wie im Protokoll beschrieben 16 Tage lang mit 10% FBS ergänzt und mit Antikörpern gegen Nestin GFAP, Tuj1 und MAP2 gefärbt wurde. DAPI wurde für die nukleare Färbung verwendet. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die in dieser Arbeit beschriebene Nicht-GM-Methode zur Reprogrammierung menschlicher Zellen basiert auf der Membran-zu-Kern-Aktivierung der Signalmaschinerie hinter dem GPI-verknüpften menschlichen Membranglykoprotein, das den Prozess der Dedifferenzierung einleitet, der zur Ex-vivo-Erzeugung und -Expansion von sich selbst erneuernden PSCs führt, die aus nicht manipuliertem menschlichem peripherem Blut gewonnen werden. Diese Zellen sind, wenn sie in geeigneten Medien kultiviert werden, in Zellen umzudifferenzieren, die zu verschiedenen Keimschichten gehören6.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, dass gentechnikfrei erzeugte BD-PSCs-Zellen, wenn sie in einem neuronalen Differenzierungsmedium kultiviert wurden, einen völlig anderen Phänotyp mit länglichen Formen, einer höheren Entwicklung ihrer Organellen und komplexeren Interaktionen zwischen Zellen erhielten. Darüber hinaus impliziert die Neudifferenzierung unter Verwendung der hier beschriebenen Bedingung eine neuronale Differenzierung in Richtung verschiedener neuronaler Linien.
Um die optimale Anzahl und die beste Qualität von reprogrammierten Zellen für ihre Verwendung in Redifferenzierungsstudien zu erhalten, könnten frische MNC-Präparate im Vergleich zu gefrorenen MNC-Präparaten von Vorteil sein. Die Methode der immunmagnetischen Sortierung, die BD-PSCs von terminal differenzierten Zellen trennt, die mit dieser Methode nicht umprogrammiert werden können, könnte unvollständig sein und erfordern, dass das Verfahren wiederholt wird, was für die Zellen sehr belastend ist und zu ihrem vorzeitigen Tod führt.
Der kritische Schritt innerhalb des Protokolls bezieht sich auf die Anzahl und Qualität der MNCs, die mit der beschriebenen Methode erhalten werden könnten. Die Modifikation der neuronalen Differenzierungsmedien sowie der Kulturzeit kann das Differenzierungspotenzial von BD-PSCs verbessern und so zur Erzeugung spezifischer Arten von neuronalen Zellen führen.
Eine Einschränkung dieser Methode ist die nicht-teratogene Natur dieser reprogrammierten Zellen, da es nicht möglich ist, die Zelllinien mit dieser Methode zu erzeugen. Sobald die dedifferenzierten Zellen das Endstadium, das der Pluripotenz, erreicht haben, werden sie meist ruhend und ein neuer Teil der MNCs muss wieder dedifferenziert werden, um eine höhere Anzahl von BD-PSCs zu erhalten.
Die hier beschriebene Reprogrammierung beruht auf der Aktivierung von Antikörpervernetzung auf der Oberfläche von Blutvorläuferzellen. Dieses Paradigma bietet zahlreiche potenzielle Vorteile in Bezug auf die klinische Sicherheit im Vergleich zu GM-Methoden. Das Ziel, autologe Stammzellen zur Erzeugung von Nervengewebe(n) zu erreichen, kann durch minimale Ex-vivo-Manipulation erreicht werden; Daher deutet dies stark darauf hin, dass diese Zelltherapie ein vielversprechender Kandidat für einen effizienten und sicheren klinischen Ansatz in der Neurologie sein könnte.
Parkinson, Alzheimer und zerebrale Ischämie gehören zu den Krankheiten mit der höchsten sozialen und wirtschaftlichen Belastung für die Gesellschaft in Europa und weltweit. Es wird erwartet, dass die Belastung durch neurodegenerative Erkrankungen mit der alternden Bevölkerung zunehmen wird, zu einem wichtigen sozioökonomischen Problem wird und ein verzweifeltes Bedürfnis nach einer Antwort auf das Problem schafft. Die vorgestellte Methode eröffnet einen neuen Weg für nicht-invasive therapietherapeutische Strategien, indem sie ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Erzeugung geeigneter autologer Stammzellpopulationen einsetzt, die auf die Heilung derzeit hartnäckiger neurologischer Erkrankungen hoffen.
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Disclosures
Die korrespondierende Autorin erklärt, dass sie Patentinhaberin im Zusammenhang mit Novel Human GPI-linked Protein ist und für ACA CELL Biotech mitbegründet und arbeitet. Die anderen Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Dem Andenken an Dr. Rainer Saffrich gewidmet.
Die Autoren danken insbesondere José Manuel García-Verdugo und Vicente Herranz-Pérez für die Durchführung von EM-Experimenten und -Analysen am Labor für Vergleichende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, die durch Forschungsmittel aus dem Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 unterstützt wurden. Der Rest dieser Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Deutschland, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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