Summary
Vi presenterar en genetiskt modifierad-fri (GM-fri) metod för att erhålla celler med en neuronal fenotyp från omprogrammerade perifera blodkroppar. Aktivering av en signalväg kopplad till nytt humant GPI-kopplat protein avslöjar en effektiv GM-fri metod för att erhålla mänskliga pluripotenta stamceller.
Abstract
Många mänskliga neurologiska störningar orsakas av degeneration av nervceller och gliaceller i hjärnan. På grund av begränsningar i farmakologiska och andra terapeutiska strategier finns det för närvarande inget botemedel tillgängligt för den skadade eller sjuka hjärnan. Cell ersättning visas som en lovande terapeutisk strategi för neurodegenerativa villkor. Än i dag har neurala stamceller (NSC) framgångsrikt genererats från fetala vävnader, mänskliga embryonala celler (ES) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). En process av dedifferentiation initierades genom aktivering av den nya mänskliga GPI-länkade glykoprotein, vilket leder till generering av pluripotenta stamceller. Dessa blod-härledda pluripotenta stamceller (BD-PSCs) skiljer in vitro till celler med en neural fenotyp som visas av brightfield och immunofluorescens mikroskopi. Strukturella analys av dessa celler med hjälp av elektronmikroskopi bekräftar deras primitiva struktur samt neuronal-liknande morfologi och subcellulära egenskaper.
Introduction
Utveckling av grundläggande och prekliniska stamcellsforskningsmetoder uppmuntrar klinisk tillämpning av stamcellsbaserade terapier för neurologiska sjukdomar. Sådan potentiell terapi beror kritiskt på metoden för generering av mänskliga neurala celler som leder till funktionell återhämtning1.
Neurala stamceller (NSCs) självförnya och differentiera till nya nervceller under hela livet i en process som kallas vuxen neurogenes. Endast mycket begränsade hjärnområden hyser NSCs kompetent att generera nyfödda nervceller i vuxen ålder. Sådana NSCs kan ge upphov till mogna nervceller, som är involverade i lärande och minne, vilket ersätter förlorade eller skadade nervceller. Tyvärr finns dessa NSCs i begränsade mängder och denna begränsade neurogenes minskar snabbt under ungdomsutveckling2. Därför måste andra källor till neurala celler beaktas i ett cellterapimål.
Degenerativa neurologiska sjukdomar är svåra att bota med hjälp av vanliga farmakologiska metoder. Nya terapeutiska strategier för att omfamna många omätbara neurologiska störningar är baserade på cellersättningsterapier av sjuk och skadad vävnad. NSC-transplantation kan ersätta skadade celler och ge positiva effekter. Andra källor för neuralcellsersättning inkluderar mänskliga embryonala stamceller (ESC), som härrör från den inre cellmassan hos däggdjur blastocyster3, liksom iPSCs4, som har omfattande självförnyelsekapacitet som EIC och kan skilja sig åt i olika cellstammar. NSCs kan också genereras genom direkt omprogrammering från mänskliga fibroblaster undvika pluripotent tillstånd5.
Cellersättningsterapi är fortfarande en utmanande fråga. Även om ESC, fetala eller iPS kan vara en källa för generation av neuronala celler för behandling av många obotliga neurologiska sjukdomar, är autolog vuxen SCs cellersättning av skadade vävnader ett bättre alternativ som kringgår immunologiska, etiska och säkerhetsproblem.
Aktivering av humant GPI-kopplat protein genom antikroppskorsning via fosforylering av PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initierar en dedifferentiering av blodavkommaceller och generering av blodbaserade pluripotenta stamceller (BD-PSC)6. Dessa celler skiljer in vitro mot neuronala celler som bekräftas med hjälp av brightfield, immunofluorescens och transmission elektronmikroskopi (TEM) analys.
I detta arbete beskriver vi den GM-fria generationen av BD-PSCs och deras framgångsrika åter differentiering i celler med neuronal fenotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikgodkännanden erhölls när experimenten utfördes.
1. Isolering av mononukleära celler i perifert blod (PBMNCs)
- Se till att alla givare har undertecknat informerat samtycke innan blod dras tillbaka i enlighet med institutionella riktlinjer.
- Ta 30 ml blod från friska donatorer av utbildad medicinsk personal enligt standardprotokollet.
- Isolera PBMNCs med densitetsgradientmedier. Använd 10 ml media med 25 ml 1:1 blod utspädd med fosfatbuffertens saltlösning (PBS) och centrifugera vid 300 x g i 30 min.
- Isolera interfasskiktet mellan plasma- och densitetsgradientmediet genom pipetting. Tvätta de isolerade cellerna med 5 ml steril PBS och centrifugera vid 300 x g i 10 min. Upprepa två gånger.
- Räkna antalet celler med standardmetoder med hjälp av en räknekammare.
2. Aktivering av humant GPI-förankrat glykoprotein genom antikroppskorslänkning på PBMNCs yta
- Placera de 6 x 106 mononukleära cellerna (MNCs) i 15 ml-rör och utför antikroppskorslänkning genom att inkubera cellerna med humant GPI-kopplat membranproteinspecifikt antikropp (30 μg/ml) i 30 minuter i PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA) vid 37 °C.
- Ersätt inkubationsmediet med Iscoves modifierade Dulbeccos medium kompletterat med 10% fetala nötkreatursserum (FBS).
- Odla celler i 15 ml polystyrenrör, sätt rören i en inkubator vid 37 °C och 5% CO2 i 8-10 dagar (utan skakningar). På D5, tillsätt ytterligare 1-2 ml av Iscoves medium kompletterat med 10% FBS till varje 15 ml rör.
3. Sortering av nygenererade dedifferentierade celler
- Räkna celler med en automatiserad cellräknare (18 μL cellupphängning + 2 μL fluorescensfärg) eller i en räknekammare.
- Centrifuge odlad cellupphängning (5-7 x 106) vid 300 x g i 10 min och aspirera den resulterande supernaten med en steril Pasteur-pipett.
- Suspendera cellpelleten i 90 μL förkylt PBS pH 7,2, 0,5 % BSA och 2 mM EDTA.
- Tillsätt CD45-positiva magnetiska pärlor i nanostorlek (80 μL) till cellfjädringen och inkubera på is i 15 minuter.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 2 ml PBS-buffert och centrifugering vid 300 x g i 10 min.
- Suspendera cellerna igen i 500 μL PBS-buffert.
- Tvätta kolonnen med 500 μL förkyld PBS-buffert och placera den i magnetfältet.
- Placera cellfjädringen på kolonnen och tvätta den med 500 μL PBS-buffert (två gånger) och centrifugflödet som innehåller CD45-negativa celler. Samla dem i Iscoves medium kompletterat med 1% BSA.
- Räkna cellerna i räknekammaren.
4. Förbereda cellkulturrätter för neuronal differentiering av nyproducerade stamceller
- Belägga kulturkärlen med poly-L-ornitin och laminin för odling av neuronala celler.
- Placera glaslocken i 4-brunnsplattor och täck det med 1:5 utspädd poly-L-ornitin (0,1 mg/ml i ddH2O) i ddH2O. Placera täckglasen i en 37 °C inkubator i 1 timme. Tvätta sedan med ddH2O.
- Tina långsamt laminin (0,5-2,0 mg/ml) långsamt och lägg till toppen av täckglasen. Inkubera den vid 37 °C i 2 timmar.
- Förbered neural induktionsmedium N2 bestående av 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-tillägg, 400 μL icke-essentiella aminosyror (NEAA), grundläggande FGF-lösning vid 20 ng/ml slutlig koncentration (framställd av 100 μg/mL stamlösning) och heparin vid 2 ng/ml slutlig koncentration.
- Ta bort överflödig laminin genom pipetting och tillsätt neuronal medium N2 till odlingsrätter.
5. Odling av neuronala dedifferentierade blodkroppar
- Kultur BD-härledda CD45 negativa celler på laminin/ornitinbelagda glaslock i 2 dagar i en inkubator vid 37 °C och 5% CO2 i N2 medium för att initiera en neuronal differentiering av nyligen BD-genererade celler.
- Odlingsceller vidare i neuronal differentiering medium bestående av 48 ml neurobasalt medium, 500 μL L-glutamin, 1 ml B27-tillägg, 500 μL NEAA, 50 μL rekombinant human glia härledd neurotrofisk faktor (GDNF) vid 5 μg/250 μL i PBS/0,1% BSA och 50 μL rekombinant mänsklig hjärna de neurotrofisk faktor (BDNF) vid 5 μg/200 μL i PBS/0,1% BSA och 50 μL askorbinsyralösning 2,9 g/50 ml i PBS. Placera plattorna i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
6. Immunofluorescensmikroskopianalys av blodbaserade neurala celler
- Odla cellerna enligt beskrivningen ovan i 16 dagar och ta bort media.
- Inkubera med förvärmt fixativ bestående av 75 ml sterilt vatten, 4 g paraformaldehyd. Tillsätt 10 N NaOH efter behov och rör om tills lösningen är klar. Tillsätt sedan 10 ml 10x PBS, 0,5 ml MgCl2, 2 ml 0,5 M EGTA och 4 g sackaros. Titrera till pH 7,4 med 6 N HCl och ta till 100 ml sterilt vatten i 15 min, enligt Marchenko et al.7.
- Kassera fixeringen och tvätta cellerna 3 gånger i 5 minuter varje gång. Tillsätt omedelbart en nygjord 0,3% Triton X-lösning och permeabilisera cellerna i 5 minuter. Tvätta 3 gånger med PBS och tillsätt en blockeringslösning tillverkad av PBS och 5% BSA.
- Blockera cellerna i rumstemperatur på en vippplatta i 1 timme.
- Bered lämplig utspädning av antikroppar i 1% BSA/PBS och inkubera cellerna med antikroppsutspädningar på vippplattan i 1,5 timmar vid rumstemperatur. Tvätta cellerna 3 gånger med PBS i 5 minuter vardera, inkubera cellerna med DAPI och montera täckena med monteringsmedier för visualisering på ett mikroskop.
OBS: Direkt märkta antikroppar som används i detta experiment listas i Materialförteckningen.
7. Analys av transmissionselektronmikroskopi av nyproducerade celler
- Kärna ur cellerna för TEM i 8-brunns kammarrutschbanor.
- Fixera cellerna i 3,5% glutaraldehyd i 1 timme vid 37 °C, efter fixering i 2% OsO4 i ytterligare en timme vid rumstemperatur och fläck i 2% uranylacetat i mörkret vid 4 °C i 2 h 30 min.
- Skölj slutligen cellerna i destillerat vatten, torka ut det i etanol och bädda in i epoxiharts över natten. Följande dag överför proverna till en ugn på 70 °C i 72 timmar för hartshärdning.
- Lossa de inbäddade cellkulturerna från kammarrutschbanan och limma till alalditblock.
- Skär seriella halvtunna sektioner (1,5 μm) med en maskin, montera på glasrutschbanor och måla lätt med 1% toluidinblått.
- Limma valda halvtunna sektioner till aldalditeblock och lossa dem från glasrutschbanan genom upprepad frysning (i flytande kväve) och upptining.
- Förbered ultrathinsektioner (0,06-0,08 μm) med en maskin och ytterligare kontrast med blycitrat.
- Få mikrografer med hjälp av elektronskanningsmikroskop med digitalkamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten ger bevis för att denna nya GM-fria metod kan återföra blod stamceller till sitt mest primitiva tillstånd utan att direkt agera på det mänskliga genomet.
Vi har tidigare visat att GPI-länkade proteinspecifika antikroppskorslänkning initierar via PLCγ / IP3K / Akt / mTOR / PTEN uppreglering av mycket bevarade utvecklingsrelevanta gener som WNT, NOTCH och C-Kit, vilket initierar en dedifferentieringsprocess som leder till det första steget till generering av HSCs och en andra och sista till en generation BD-PSCs6,8.
Aktiverade MNC kulturer utsattes för immunomagnetisk sortering med CD45 mikrober. Mogna blodkroppar som inte kan omprogrammeras med denna metod (t.ex. CD45-positiva celler) behölls på kolumnen, medan den negativa fraktionen som innehåller omprogrammerade celler (CD45-negativa celler) användes för generering av olika neuronala härstamningsceller.
Vi studerade först morfologiska aspekter av perifera BD-dedifferentierade celler med hjälp av ljus och TEM. Som visas i figur 1genererar specifik GPI-förankrad glykoproteinantikroppskorsning av mänskliga MNCs en stadigt växande ny population av celler(figur 1A). Vi analyserade dessa celler med hjälp av TEM. BD-dedifferentierade celler är små i storlek och visar egenskaperna hos omogna agranulära celler, med gradvis mindre organeller och stora kärnor med kondenserad kromatin, liknande EIC (Figur 1B). Icke-behandlade kulturer visade en trend mot ett gradvist försvinnande.
BD-CD45 negativa celler utsattes för neuronal differentiering i två steg. Vi initierade differentiering mot neuronal härstamning genom att så CD45 negativa celler på poly-L-ornitin/laminin belagda kulturplattor i 2 dagar i N2 medium efter kultur i neuronal differentiering medium. Brightfield bilder förvärvades vid dagar 4, 8, 10, 14 och 30 respektive vid start neuronal differentiering av BD-genererade stamceller.
Så tidigt som 4 dagar efter att ha startat den riktade differentiering av nygenererade celler, kunde de första neuronal-liknande cellerna med långa förgrening strukturer upptäckas. Vi observerar de morfologiska förändringarna från D2 till D30 med en mer komplex struktur inklusive förgreningar, vilket innebär en aktiv process mot differentiering till neuronala härstamningar under hela kulturperioden (Figur 2). För att bekräfta de neuronala funktionerna i återdifferentierade celler efter odling av dem i neuronalt medium i 16 dagar, cellerna fastställdes enligt ett tidigareprotokoll 7, och immunocytokemi (ICC) utfördes med antikroppsdetektering till nestin, glial fibrillary surt protein (GFAP), mikrotubule-associerade protein 2 (MAP2) och neuron-specifika klass III beta-tubulin (Tuj1).
GFAP är proteinet som utgör en del av cytoskeleton i astrocyter som representerar den huvudsakliga mellanliggande glödtråden av mogna astrocyter. Som visas i figur 3känner antikroppen till GFAP igen dessa strukturer i de nygenererade neuronala cellerna, vilket bekräftar att BD-PSCs kan åter differentieras mot mänskliga astrocyter9.
MAP2 är ett cytoskelettprotein som binder till tubuli och stabiliserar mikrotubuli. Det uttrycks inom axoner, dendriter och cellkroppar och detta uttryck är vävnads- och utvecklingsspecifikt. Immunofluorescensmikroskopi resultaten bekräftar uttrycket av detta protein i åter differentierade celler10.
Tuj1 är typisk neuronal cell markör. Dess funktion är att stabilisera mikrotubili i neuronal cell kropp och axoner. Det är också inblandat i axonal transport11. Nyligen re-differentierade celler bekräftade tydligt uttrycket av detta protein vid D16 när man startar neuronal differentiering under villkoret beskrivs här.
Nestin karakteriserades först i NSCs och representerar en neuro epitelial stamcell protein, som tillhör mellanliggande glödtråd (IF) protein12 särskiljande neuronal stamceller från mer differentierade neuronal celler. Dessa IF-proteiner uttrycks mestadels i nervceller där de är involverade i axonens radiella tillväxt, men de finns också i ett antal ytterligare vävnader. Nestin som en markör för övervägande NSCs uttrycks svagt i de celler som redan är på väg att differentiera sig till specifika neuronala härstamningar som det är fallet med BD-re-differentierade celler vid D16.
Figur 1: Generering av dedifferentierade (pluripotenta) stamceller. (A) Ficoll-isolerade mononukleära celler odlades i Iscoves medium kompletterat med 10% FBS. Mikrografer av aktiverade odlade celler togs vid dag 1, 5 respektive 10. Icke-aktiverade MNCs studerades som en kontroll. Skalstång: 50 μm. (B) TEM-analys av nyproducerade celler under hela odlingstiden visar att organeller av mogna celler (D1) gradvis försvinner (D8), vilket leder till generering av helt dedifferentierade celler som liknar EIC. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Neuro-differentiering av BD-PSCs. A) BD-dedifferentierade celler placerades i ornitin/lamininbelagda odlingsrätter och odlades i 30 dagar enligt beskrivningen i protokollet. Mikrografer tas vid dagarna 4, 8, 10, 14 respektive 30, efter att ha vuxit i neuronal differentiering villkor. De flesta celler i kulturen ändrade sin morfologi från små sfäriska former till större, långsträckta former och i vissa fall förgrenade celler. Skala bar: 100 μm. (B) BD-dedifferentierade celler odlades i 16 dagar i neuronal medium, fast i glutaraldehyd och EM analys utförs som beskrivs i protokoll avsnitt. Cellkroppen och processerna i dessa celler visade en högre komplexitet än de av odifferentierade celler när det gäller organeller och cytoskeleton presenterar en hög densitet av staplade cisternae av grova endoplasmic reticulum och rikliga buntar av aktin filament (a, b). Till skillnad från odifferentierade BD-celler etablerade celler som växer i differentieringsmedier ofta cell-till-cell-kontakter. Några av dessa specialiserade kontakter involverade cellulär kropp (c) medan andra involverade cellulära processer i neuritliknande mode (d). Skalstänger: a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Immunofenotypning av nygenererade neuronala celler. BD-dedifferentierade celler odlades som beskrivs i protokollet i 16 dagar och immunocytochemistry analys utfördes med antikroppar mot neuronal markörer nestin, GFAP, MAP2 och Tuj1. Visas är brightfield mikrografer av re-differentierade celler tillsammans med immunofluorescens bilder med DAPI som nukleära färgning, samt färgning med relevanta antikroppar. Avbildade är fälten som visar en viss population som uttrycker en av de specifika neuronala marköregenskaperna för specifika linjer. Skalstång: 100 μm. Kontrollen presenteras i kompletterande figur 1. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Kontroll av BD-dedifferentierade celler. BD-härledda odifferentieradeceller odlades i Iscoves modifierade Dulbeccos medium kompletteras med 10% FBS i 16 dagar som beskrivs i protokollet och färgas med antikroppar mot nestin GFAP, Tuj1 och MAP2. DAPI användes för kärnfärgning. Skalbar: 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den icke-GM-metod för omprogrammering av mänskliga celler som beskrivs i detta arbete är baserad på membran till kärna aktivering av signaleringsmaskiner bakom det GPI-kopplade mänskliga membranet glykoprotein som initierar dedifferentiationsprocessen som leder till ex vivo-generering och expansion av självförnyande PSC som erhållits från icke-manipulerat mänskligt perifert blod. Dessa celler när de odlas i lämpliga medier kan åter differentieras till celler som tillhör olika bakterielager6.
De data som presenteras i detta arbete visar att GM-fri genererade BD-PSCs celler när odlas i en neuronal differentiering media förvärvade en helt annan fenotyp, med långsträckta former, högre utveckling av deras organeller och etablerade mer komplexa interaktioner mellan celler. Dessutom innebär åter differentiering med tillstånd som beskrivs här neuronal differentiering mot olika neuronala härstamningar.
För att få det optimala antalet och bästa kvaliteten på omprogrammerade celler för deras användning i åter differentieringsstudier kan färska MNC-preparat vara fördelaktiga jämfört med frysta MNC-preparat. Metoden för immunomagnetisk sortering som separerade BD-PSC från terminalt differentierade celler som inte kan omprogrammeras med denna metod kan vara ofullständig och kräva att förfarandet upprepas, vilket är mycket stressande för celler och resulterar i deras för tidiga dödsfall.
Det kritiska steget i protokollet gäller antalet och kvaliteten på de MNC som kan erhållas med den beskrivna metoden. Modifiering av neurala differentieringsmedier samt kulturtid kan förbättra differentieringspotentialen hos BD-PSCs, vilket leder till generering av specifika typer av neuronala celler.
En begränsning av denna metod är den icke-teratogena karaktären hos dessa omprogrammerade celler eftersom det inte är möjligt att generera cellinjerna med denna metod. När de dedifferentierade cellerna har nått slutstadiet, pluripotensens, blir de mestadels quiescenta och en ny del MNCs måste dedifferentieras igen för att få ett högre antal BD-PSC.
Omprogrammering beskrivs här förlitar sig på antikropp crosslinking aktivering på ytan av blod stamceller. Detta paradigm ger många potentiella fördelar när det gäller klinisk säkerhet jämfört med GM-metoder. Målet att uppnå autologa stamceller för generering av neurala vävnader kan uppnås genom minimal ex vivo manipulation; därför starkt tyder på att denna cell terapi kan vara en lovande kandidat för effektiv och säker klinisk strategi i neurologi.
Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom och cerebral ischemi är bland de sjukdomar som har den högsta sociala och ekonomiska bördan för samhället i Europa och världen. Bördan av neurodegenerativa störningar förväntas öka med den åldrande befolkningen, bli ett viktigt socioekonomiskt problem och skapa ett desperat behov av ett svar på problemet. Den presenterade metoden öppnar en ny väg för icke-invasiva terapeutiska strategier genom att använda ett enkelt och kostnadseffektivt förfarande för att generera lämpliga autologa stamcellspopulationer som håller ett hopp om botemedel mot för närvarande svårbehandlade neurologiska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Motsvarande författare förklarar att hon är patentinnehavare relaterad till Novel Human GPI-linked Protein samt att hon var med och grundade och arbetar för ACA CELL Biotech. De andra författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Tillägnad minnet av dr Rainer Saffrich.
Författarna är särskilt tacksamma mot José Manuel García-Verdugo och Vicente Herranz-Pérez för att ha utfört EM-experiment och analyser vid Laboratoriet för jämförande neurobiologi, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, som stöddes av forskningsfinansiering från Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Resten av detta arbete stöddes av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
