Summary
Presentiamo un metodo privo di OGM per ottenere cellule con un fenotipo neuronale da cellule del sangue periferiche riprogrammate. L'attivazione di un percorso di segnalazione collegato a nuove proteine umane legate alla GPI rivela un metodo efficiente privo di OGM per ottenere cellule staminali pluripotenti umane.
Abstract
Molti disturbi neurologici umani sono causati dalla degenerazione di neuroni e cellule gliali nel cervello. A causa delle limitazioni nelle strategie farmacologiche e in altre strategie terapeutiche, attualmente non è disponibile alcuna cura per il cervello ferito o mato. La sostituzione cellulare appare come una promettente strategia terapeutica per le condizioni neurodegenerative. Ad oggi, le cellule staminali neurali (NSC) sono state generate con successo da tessuti fetali, cellule embrionali umane (ES) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Un processo di dedifferenziazione è stato avviato dall'attivazione della nuova glicoproteina umana legata alla GPI, che porta alla generazione di cellule staminali pluripotenti. Queste cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) si differenziano in vitro in cellule con un fenotipo neurale come dimostrato dalla microscopia a campo luminoso e immunofluorescenza. L'analisi ultrastrutturale di queste cellule mediante microscopia elettronica conferma la loro struttura primitiva, nonché la morfologia neuronale e le caratteristiche subcellulari.
Introduction
Lo sviluppo di metodi di ricerca sulle cellule staminali di base e preclinali incoraggia l'applicazione clinica di terapie a base di cellule staminali per le malattie neurologiche. Tale potenziale terapia dipende in modo critico dal metodo per la generazione di cellule neurali umane che porta al recupero funzionale1.
Le cellule staminali neurali (NSC) si rinnovano e si differenziano in nuovi neuroni per tutta la vita in un processo chiamato neurogenesi adulta. Solo aree cerebrali molto ristrette ospitano NSC competenti a generare neuroni appena nati in età adulta. Tali NSC possono dare origine a neuroni maturi, che sono coinvolti nell'apprendimento e nella memoria, sostituendo così i neuroni persi o danneggiati. Sfortunatamente, questi NSC sono presenti in quantità limitate e questa neurogenesi limitata diminuisce rapidamente durante lo sviluppo giovanile2. Pertanto, altre fonti di cellule neurali devono essere considerate in un obiettivo di terapia cellulare.
Le malattie neurologiche degenerative sono difficili da curare utilizzando approcci farmacologici standard. Le nuove strategie terapeutiche per abbracciare molti disturbi neurologici imedicabili si basano su terapie di sostituzione cellulare del tessuto danneggiato e ferito. Il trapianto NSC potrebbe sostituire le cellule danneggiate e fornire effetti benefici. Altre fonti per la sostituzione delle cellule neurali includono le cellule staminali embrionali umane (ESC), che derivano dalla massa cellulare interna delle blastocsti dei mammiferi3, così come gli iPSC4, che hanno un'ampia capacità di autorinnovizzo come gli ESC e sono in grado di differenziarsi in vari lignaggi cellulari. Gli NSC possono anche essere generati dalla riprogrammazione diretta da fibroblasti umani evitando lo stato pluripotente5.
La terapia sostitutiva cellulare è ancora un problema impegnativo. Sebbene ESC, fetale o iPS possano essere una fonte per la generazione di cellule neuronali per il trattamento di molte malattie neurologiche incurabili, la sostituzione automatica delle cellule dei PC adulti adulti dei tessuti danneggiati è un'alternativa migliore che aggira i problemi immunologici, etici e di sicurezza.
L'attivazione di proteine umane legate alla GPI mediante collegamento incrociato anticorpale tramite fosforilazione di PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN avvia una dedifferentiazione delle cellule progenitrici del sangue e la generazione di cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PDC)6. Queste cellule si differenziano in vitro verso le cellule neuronali come confermato mediante analisi di radiologia, immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
In questo lavoro descriviamo la generazione senza OGM di BD-PSC e la loro riuscita ri-differenziazione in cellule con fenotipo neuronale.
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Protocol
Le approvazioni etico sono state ottenute durante l'esecuzione degli esperimenti.
1. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMNC)
- Garantire che tutti i donatori hanno firmato il consenso informato prima del ritiro del sangue nel rispetto delle linee guida istituzionali.
- Prendi 30 mL di sangue da donatori sani da personale medico addestrato secondo il protocollo standard.
- Isolare i PBMIC in base ai supporti gradienti di densità. Utilizzare 10 mL di mezzi con 25 mL di sangue 1:1 diluito con tampone di fosfato salina (PBS) e centrifuga a 300 x g per 30 min.
- Isolare lo strato interfase tra il plasma e il mezzo gradiente di densità mediante pipettazione. Lavare le cellule isolate con 5 mL di PBS sterile e centrifuga a 300 x g per 10 min. Ripetere due volte.
- Contare il numero di celle con metodi standard utilizzando una camera di conteggio.
2. Attivazione della glicoproteina ancorata alla GPI umana mediante reticoli anticorpali sulla superficie dei PBBC
- Posizionare le 6 x 106 cellule mononucleari (MBC) in tubi da 15 ml ed eseguire il crosslinking degli anticorpi incubando le cellule con anticorpi specifici delle proteine di membrana legati alla GPI umana (30 μg/ml) per 30 minuti in PBS con albumina sierica bovina all'1% (BSA) a 37 °C.
- Sostituire il mezzo di incubazione con il mezzo Dulbecco modificato di Iscove integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS).
- Far crescere le cellule in tubi di polistirolo da 15 ml, mettere i tubi in un incubatore a 37 °C e 5% co2 per 8-10 giorni (senza tremare). Su D5, aggiungere altri 1-2 ml del mezzo di Iscove integrato con FBS al 10% a ogni tubo da 15 ml.
3. Ordinamento delle celle didifferenziate appena generate
- Contare le cellule con un contatore di celle automatizzato (sospensione cellulare da 18 μL + 2 μL di colorante a fluorescenza) o in una camera di conteggio.
- Sospensione cellulare coltivata centrifuga (5-7 x 106) a 300 x g per 10 minuti e aspirare il supernatante risultante con una pipetta Pasteur sterile.
- Sospendere di nuovo il pellet cellulare in 90 μL di PBS pH 7,2 prerispesto, 0,5% BSA e 2 mM EDTA.
- Aggiungere perline magnetiche positive di dimensioni nanometriche CD45 (80 μL) alla sospensione cellulare e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
- Lavare le cellule aggiungendo 2 mL di tampone PBS e centrifuga a 300 x g per 10 min.
- Sospendere di nuovo le cellule in 500 μL di tampone PBS.
- Lavare la colonna con 500 μL di tampone PBS pre-raffreddato e posizionarla nel campo magnetico.
- Posizionare la sospensione cellulare sulla colonna e lavarla con 500 μL di tampone PBS (due volte) e il flusso di centrifuga contenente celle negative CD45. Raccoglili nel mezzo di Iscove integrato con l'1% di BSA.
- Contare le celle nella camera di conteggio.
4. Preparare piatti di coltura cellulare per la differenziazione neuronale delle cellule staminali appena generate
- Rivestire i vasi di coltura con poli-L-ornitina e laminina per la crescita delle cellule neuronali.
- Posizionare le coperture in vetro in piastre a 4 pozzoli e ricoprirla con poli-L-ornitina diluita 1:5 (0,1 mg/mL in ddH2O) in ddH 2 O.Posizionarei copripacchi in un incubatore a 37 °C per 1 h. Quindi lavare con ddH2O.
- Scongelare lentamente la laminina (0,5-2,0 mg/mL) e aggiungere alla parte superiore dei copripasci. Incubarlo a 37 °C per 2 ore.
- Preparare il mezzo di induzione neurale N2 composto da 49 mL di D-MEM/F12, 500 μL di integratore N2, 400 μL di amminoacidi non essenziali (NEAA), soluzione FGF di base a concentrazione finale di 20 ng/mL (preparata da soluzione stock di 100 μg/mL) ed eparina a concentrazione finale di 2 ng/mL.
- Rimuovere la laminina in eccesso pipettando e aggiungere il mezzo neuronale N2 ai piatti di coltura.
5. Coltivazione di cellule del sangue disferenziate neuronali
- Cellule negative CD45 derivate da coltura BD su coverlips in vetro rivestito di laminina/ornitina per 2 giorni in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO2 nel mezzo N2 per avviare una differenziazione neuronale delle cellule appena generate dalla BD.
- Cellule di coltura ulteriormente in mezzo di differenziazione neuronale costituito da 48 mL di mezzo neurobasale, 500 μL di L-glutammina, 1 mL di B27 Supplemento, 500 μL di NEAA, 50 μL di fattore neurotrofico ricombinante derivato dal glial umano (GDNF) a 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA e 50 μL di cervello umano ricombinante fattore neurotrofico derivato (BDNF) a 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA e 50 μL di soluzione di acido ascorbico 2,9 g/50 mL in PBS. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
6. Analisi della microscopia a immunofluorescenza delle cellule neurali derivate dal sangue
- Coltura delle celle come descritto sopra per 16 giorni e rimuovere il supporto.
- Incubare con fissante prerifavorato composto da 75 mL di acqua sterile, 4 g di paraformaldeide. Aggiungere 10 N NaOH in base alle esigenze e mescolare fino a quando la soluzione non si sgombre. Aggiungere quindi 10 mL di 10x PBS, 0,5 mL di MgCl2, 2 mL di 0,5 M EGTA e 4 g di saccarosio. Titolare a pH 7.4 con 6 N HCl, e portare a 100 mL di acqua sterile per 15 min, secondo Marchenko etal.
- Scartare il fissatore e lavare le cellule 3 volte per 5 minuti ogni volta. Aggiungere immediatamente una soluzione Triton X allo 0,3% appena fatta e permeabilizzare le cellule per 5 minuti. Lavare 3 volte con PBS e aggiungere una soluzione di blocco realizzata da PBS e 5% BSA.
- Bloccare le celle a temperatura ambiente su una piastra rocker per 1 ora.
- Preparare un'adeguata diluizione degli anticorpi nell'1% di BSA/PBS e incubare le cellule con diluizioni anticorpali su piastra rocker per 1,5 ore a temperatura ambiente. Lavare le celle 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuna, incubare le cellule con DAPI e montare i copripavimenti con supporti di montaggio per la visualizzazione al microscopio.
NOTA: Gli anticorpi etichettati direttamente utilizzati in questo esperimento sono elencati in Table of Materials.
7. Analisi della microscopia elettronica a trasmissione di cellule appena generate
- Seminare le cellule per TEM in vetrini da camera a 8 pozzi.
- Fissare le cellule in glutaraldeide al 3,5% per 1 h a 37 °C, post-fissare in 2% OsO4 per un'ora aggiuntiva a temperatura ambiente e macchiare nel 2% acetato di uranil al buio a 4 °C per 2 h 30 min.
- Infine, sciacquare le cellule in acqua distillata, disidratarle in etanolo e incorporarle nella resina epossidica durante la notte. Il giorno seguente trasferire i campioni in un forno a 70 °C per 72 ore per l'indurimento della resina.
- Staccare le colture cellulari incorporate dallo scivolo della camera e incollare ai blocchi di araldite.
- Tagliare sezioni semisottili seriali (1,5 μm) con una macchina, montare su vetri-scivoli e macchiare leggermente con l'1% di blu toluidina.
- Incollare sezioni semisottili selezionate ai blocchi di araldite e staccarle dal vetrino mediante congelamento ripetuto (in azoto liquido) e scongelamento.
- Preparare sezioni ultrathin (0,06-0,08 μm) con una macchina e contrasto ulteriore con il citrato di piombo.
- Ottenere micrografie utilizzando il microscopio a scansione elettronica con fotocamera digitale.
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Representative Results
I risultati forniscono la prova che questo nuovo metodo privo di OGM è in grado di ripristinare le cellule progenitrici del sangue al loro stato più primitivo senza agire direttamente sul genoma umano.
Abbiamo precedentemente dimostrato che il crosslinking di anticorpi specifici della proteina legata alla GPI inizia tramite PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation di geni altamente conservati rilevanti per lo sviluppo come WNT, NOTCH e C-Kit, avviando così un processo di dedifferentiazione che porta al primo passo verso la generazione di HSC e un secondo e ultimo a una generazione di BD-PSC6,8.
Le colture MNC attivate sono state sottoposte a cernita immunomagnetica utilizzando microperline CD45. Le cellule del sangue mature che non possono essere riprogrammate con questo metodo (ad esempio, cellule positive CD45) sono state trattenute sulla colonna, mentre la frazione negativa contenente cellule riprogrammate (cellule negative CD45) è stata utilizzata per la generazione di varie cellule di lignaggio neuronale.
Abbiamo studiato per la prima volta gli aspetti morfologici delle cellule periferiche di DD-dedifferentiate per mezzo della luce e del TEM. Come mostrato nella figura 1, il collegamento incrociato specifico degli anticorpi della glicoproteina ancorati alla GPI degli MNC umani genera una nuova popolazione di cellule in costante crescita (Figura 1A). Abbiamo analizzato queste cellule per mezzo di TEM. Le cellule di dedifenziate BD sono di piccole dimensioni e mostrano le caratteristiche delle cellule agranulari immature, con gradualmente meno organelli e grandi nuclei con cromatina condensata, simili agli ESC(Figura 1B). Le culture non trattate hanno mostrato una tendenza verso una graduale scomparsa.
Le cellule negative BD-CD45 sono state sottoposte a differenziazione neuronale in due fasi. Abbiamo iniziato la differenziazione verso i lignaggi neuronali seminando le cellule negative CD45 su piastre di coltura rivestite in poli-L-ornitina / laminina per 2 giorni in mezzo N2 seguendo la coltura nel mezzo di differenziazione neuronale. Le immagini di Brightfield sono state acquisite rispettivamente nei giorni 4, 8, 10, 14 e 30 all'inizio della differenziazione neuronale delle cellule staminali generate dalla BD.
Già 4 giorni dopo aver iniziato la differenziazione mirata delle cellule appena generate, potrebbero essere rilevate le prime cellule neuronali con lunghe strutture ramificate. Osserviamo i cambiamenti morfologici da D2 a D30 con una struttura più complessa che include la ramificazione, implicando un processo attivo verso la differenziazione ai lignaggi neuronali durante tutto il periodo di coltura (Figura 2). Per confermare le caratteristiche neuronali delle cellule ri-differenziate dopo averle coltivate in mezzo neuronale per 16 giorni, le cellule sono state fissate secondo un precedente protocollo7e l'immunocitochimica (ICC) è stata eseguita utilizzando il rilevamento di anticorpi alla nedcina, alla proteina acida fibrillare gliale (GFAP), alla proteina associata al microtubulo 2 (MAP2) e alla beta-tubulina di classe III specifica del neurone (Tuj1).
Gfap è la proteina che costituisce una porzione di citoscheletro negli astrociti che rappresenta il principale filamento intermedio di astrociti maturi. Come mostrato nella figura 3, l'anticorpo della GFAP riconosce queste strutture nelle cellule neuronali appena generate, confermando che i BD-PSC sono in grado di ri-differenziazione verso gli astrocitiumani 9.
MAP2 è una proteina citoscheletro che si lega ai tubuli e stabilizza i microtubuli. È espresso all'interno di assoni, dendriti e corpi cellulari e questa espressione è specifica per i tessuti e lo sviluppo. I risultati della microscopia ad immunofluorescenza confermano l'espressione di questa proteina nelle cellule ri-differenziate10.
Tuj1 è il tipico marcatore cellulare neuronale. La sua funzione è stabilizzare i microtubili nel corpo cellulare neuronale e negli assoni. È anche implicato nel trasporto assonale11. Le cellule appena ri-differenziate hanno chiaramente confermato l'espressione di questa proteina in D16 all'inizio della differenziazione neuronale nella condizione qui descritta.
La nedrina è stata caratterizzata per la prima volta negli NSC e rappresenta una proteina delle cellule staminali neuro epiteliali, che appartiene alla proteina del filamento intermedio (IF)12 distinguendo le cellule progenitrici neuronali dalle cellule neuronali più differenziate. Queste proteine IF sono espresse principalmente nelle cellule nervose dove sono coinvolte nella crescita radiale dell'assone, ma sono anche presenti in un certo numero di tessuti aggiuntivi. La nedrina come marcatore di NSC prevalentemente è debolmente espressa nelle cellule già in cammino per differenziarsi in specifici lignaggi neuronali come nel caso delle cellule ri-differenziate BD in D16.
Figura 1: Generazione di cellule staminali ddifferenziate (pluripotenti). (A) Le cellule mononucleari isolate da Ficoll sono state coltivate nel mezzo di Iscova integrate con FBS al 10%. Le micrografie delle cellule coltivate attivate sono state prese rispettivamente nei giorni 1, 5 e 10. Gli MNC non attivati sono stati studiati come controllo. Barra di scala: 50 μm. (B) L'analisi TEM delle cellule appena generate durante il tempo di coltura mostra che gli organelli di cellule mature (D1) scompaiono gradualmente (D8), portando alla generazione di cellule completamente disferenziate simili agli ESC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Neurori differenziazione dei BDC. (A) Le cellule dedifferenziate BD sono state collocate in piatti di coltura rivestiti di ornitina/laminina e coltivate per 30 giorni come descritto nel protocollo. Le micrografie vengono prese rispettivamente ai giorni 4, 8, 10, 14 e 30, dopo essere state crescono in condizioni di differenziazione neuronale. La maggior parte delle cellule della coltura ha cambiato la loro morfologia da piccole forme sferiche a forme più grandi e allungate e in alcuni casi cellule ramificate. Barra di scala: 100 μm. (B) Le cellule di dedifferenziate BD sono state coltivate per 16 giorni in mezzo neuronale, fissate in glutaraldeide e analisi EM eseguite come descritto nella sezione del protocollo. Il corpo cellulare e i processi di queste cellule hanno mostrato una complessità superiore a quelli delle cellule indifferenziate in termini di organelli e citoscheletro che presentano un'alta densità di cisterne impilate di reticolo endoplasmatico ruvido e abbondanti fasci di filamenti di actina (a, b). A differenza delle cellule BD indifferenziate, le cellule che crescono nei mezzi di differenziazione hanno spesso stabilito contatti da cellula a cella. Alcuni di questi contatti specializzati hanno coinvolto il corpo cellulare (c) mentre altri hanno coinvolto processi cellulari in modo neurite(d). Barre di scala: (a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immunofenotipizzazione delle cellule neuronali di nuova età. Le cellule dedifferenziate BD sono state coltivate come descritto nel protocollo per 16 giorni e l'analisi immunocitochimica è stata eseguita utilizzando anticorpi contro i marcatori neuronali annidcina, GFAP, MAP2 e Tuj1. Sono mostrate micrografie a campo luminoso di cellule ri-differenziate accompagnate da immagini di immunofluorescenza con DAPI come colorazione nucleare, nonché colorazione con anticorpi pertinenti. Sono raffigurati i campi che mostrano una particolare popolazione che esprime uno dei marcatori neuronali specifici caratteristici per linee specifiche. Barra di scala: 100 μm. Il controllo è presentato nella figura complementare 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1: Controllo delle cellule dedifenziate BD. Le cellule indifferenziate derivate da BD sono state coltivate nel mezzo modificato di Dulbecco di Iscove integrato con FBS al 10% per 16 giorni come descritto nel protocollo e macchiato di anticorpi contro la nidificazione GFAP, Tuj1 e MAP2. Il DAPI è stato utilizzato per la colorazione nucleare. Barra di scala: 100 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il metodo non GM di riprogrammazione delle cellule umane descritto in questo lavoro si basa sull'attivazione da membrana a nucleo di macchinari di segnalazione dietro la glicoproteina a membrana umana legata alla GPI che avvia il processo di dedifferentiazione che porta alla generazione ex vivo e all'espansione di PSC autorenonti ottenuti da sangue periferico umano non manipolato. Queste cellule, se coltivate in mezzi appropriati, sono in grado di ri-differenziarsi in cellule appartenenti a diversi stratigerminali 6.
I dati presentati in questo lavoro mostrano che le cellule BD-PSC generate senza OGM quando coltivate in un mezzo di differenziazione neuronale hanno acquisito un fenotipo completamente diverso, con forme allungate, maggiore sviluppo dei loro organelli e stabilito interazioni più complesse tra le cellule. Inoltre, la ri-differenziazione usando la condizione descritta qui, implica una differenziazione neuronale verso vari lignaggi neuronali.
Per ottenere il numero ottimale e la migliore qualità delle cellule riprogrammate per il loro utilizzo in studi di ri-differenziazione, i preparati MNC freschi potrebbero essere vantaggiosi rispetto ai preparati MNC congelati. Il metodo di smistamento immunomagnetico che separava i BD-PSC da cellule differenziate terminali che non possono essere riprogrammate con questo metodo potrebbe essere incompleto richiedendo che la procedura venga ripetuta, il che è molto stressante per le cellule e provoca la loro morte prematura.
Il passaggio critico all'interno del protocollo riguarda il numero e la qualità degli MNC che potrebbero essere ottenuti con il metodo descritto. La modifica dei mezzi di differenziazione neurale e del tempo di coltura può migliorare il potenziale di differenziazione dei BD-PSC, portando così alla generazione di tipi specifici di cellule neuronali.
Una limitazione di questo metodo è la natura non teratogena di queste cellule riprogrammate in quanto non è possibile generare le linee cellulari con questo metodo. Una volta che le cellule disferenziate hanno raggiunto lo stadio finale, quello della pluripotenza, diventano per lo più quiescenti e una nuova porzione di MNC deve essere nuovamente differenziata per ottenere un numero maggiore di BD-PSC.
La riprogrammazione qui descritta si basa sull'attivazione del reticolamento degli anticorpi sulla superficie delle cellule progenitrici del sangue. Questo paradigma offre numerosi potenziali vantaggi rispetto alla sicurezza clinica rispetto ai metodi GM. L'obiettivo di raggiungere cellule staminali autologhe per la generazione di tessuti neurali può essere raggiunto con una manipolazione minimamente ex vivo; quindi fortemente suggerendo che questa terapia cellulare potrebbe essere un candidato promettente per un approccio clinico efficiente e sicuro in neurologia.
Il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer e l'ischemia cerebrale sono tra le malattie con il più alto onere sociale ed economico per la società in Europa e nel mondo. Si prevede che il peso dei disturbi neurodegenerativi aumenterà con l'invecchiamento della popolazione, diventando un importante problema socioeconomico e creando un disperato bisogno di una risposta al problema. Il metodo presentato apre una nuova strada per strategie terapeutiche non invasive utilizzando una procedura semplice ed economica per generare popolazioni di cellule staminali autologhe idonee che hanno una speranza nella cura delle malattie neurologiche attualmente intrattabili.
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Disclosures
L'autrice corrispondente dichiara di essere titolare di brevetto relativa a Novel Human GPI-linked Protein, nonché di aver co-fondato e lavora per ACA CELL Biotech. Gli altri autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Dedicato alla memoria del Dr. Rainer Saffrich.
Gli autori sono particolarmente grati a José Manuel García-Verdugo e Vicente Herranz-Pérez per aver eseguito esperimenti e analisi dei mercati emergenti presso il Laboratorio di Neurobiologia Comparata, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, Università di Valencia, CIBERNED, Valencia, Spagna, che è stato supportato da finanziamenti per la ricerca del Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Il resto di questo lavoro è stato supportato da ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Germania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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