このプロトコルは、質量分析イメージングと組み合わせた薄膜(DGT)の拡散勾配を用いた複数の不安定な無機栄養素および汚染物質溶質種のサブmm2D視覚化のワークフローを提示する。地表植物の根層圏における溶質の定量的マッピングについては、溶質サンプリングおよび高解像度の化学分析について詳細に説明します。
我々は、2次元(2D)の視覚化及び、亜硝子体(すなわち、可逆吸着)無機栄養(例えば、P、Fe、Mn)および汚染物質(例えば、A、Cd、Pb)の植物根に隣接する土壌中の溶質種(10μmの空間空間)における分布の可視化と定量化の方法を記述する。この方法は、薄膜(DGT)技術における拡散勾配によるシンクベースの溶質サンプリングと、レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析(LA-ICP-MS)による空間的に解決された化学分析を組み合わせたものです。DGT技術は、均質に分布した分析物選択的結合相を有する薄いヒドロゲルに基づいている。様々な結合段階により、簡単なゲル製造手順に従って、異なるDGTゲルタイプの調製が可能になります。根球のDGTゲルの展開のために、植物は平らで透明な成長容器(根茎)で成長し、土壌成長した根系への最低侵襲的アクセスを可能にする。成長前の期間の後、DGTゲルは根茎の皮質のサンプリングで興味のある選択された領域に適用される。その後、DGTゲルを回収し、LA-ICP-MSラインスキャンイメージングを使用して結合された溶質のその後の化学分析のために調製される。マトリックスマッチゲル規格を用いた 13Cと外部キャリブレーションを使用した内部正規化の適用により、2D溶質フラックスの定量化がさらに可能になります。この方法は、土壌プラント環境における多元質溶質フラックスの定量的なサブmmスケール2D画像を生成する能力においてユニークであり、根峡の溶質勾配を実質的に測定するための他の方法の達成可能な空間分解能を超える。我々は、地上植物の根層圏における複数のカチオンおよびアニオン性溶質種をイメージングする方法の応用と評価を提示し、この方法を相補的な溶質イメージング技術と組み合わせる可能性を強調する。
作物植物による栄養摂取は、作物の生産性を決定する上で重要な要素です。作物による栄養素の効率的な取り込みを支配するプロセスは、特に土壌根界面の根根に対する栄養供給を制御するメカニズムと、根茎水層の栄養素の摂取におけるその役割について認識されている。植物の栄養素の取り込みのための重要なプロセスが含まれます: 根に向かって栄養輸送;土壌の細孔水に溶解した種と固体土壌表面に結合された種との間の動的な吸収平衡;栄養素のための微生物の競争;土壌有機物に含まれる栄養素の微生物のミネラル化;そして根のシンプラスムへの栄養の内在化。無機微量金属(oid)汚染物質の取り込みは、同じメカニズムによって大きく制御されます。
土壌中の栄養成分や汚染物の入手可能性、植物需要、拡散性に応じて、根層圏の微分栄養パターンが観察されます。比較的高い内在化率(例えば、P、Fe、Mn、Zn、As、Cd、Pb)を持つ強くソービング要素については、バルク土壌と比較した不安定な(すなわち、可逆吸着された)元素分率の枯渇が見つかり、枯渇ゾーンの幅はしばしば≤1mmであり、NO 3のようなより移動性の栄養素の場合は、枯渇ゾーンは数センチメートルまで拡張できる。さらに、AlやCdなどの要素の蓄積は、利用可能性が植物の取り込み率2,3を超えたときに観察されている。
栄養素および汚染物質循環における根圏プロセスの重要性を考えると、植物利用可能な要素分率を高い空間分解能で測定するためのいくつかの技術が4,5に開発された。しかし、小規模な不安定な溶質分布の測定は、いくつかの理由で困難であることが証明されています。主な難点は、根茎の急な栄養勾配を解決するために、生きている植物の根に隣接する定義された位置で、非常に小さな(低μL範囲)の土壌および/または細孔水の量をサンプリングすることです。この問題に対処するための1つのアプローチは、細孔水サンプル6の抽出にマイクロ吸引カップを使用することです。この方法により、A.ギョットリン、A.ハイム、E.マッツナー7は、ケルカス・ロバー L.根付近の土壌ポア水栄養濃度を、約1cmの空間分解能で測定した。土壌や土壌溶液のμL量を分析することの難しさは、これらの小さなサンプル量は、主要な栄養種を除くすべての低濃度と組み合わせて、高感度な化学分析技術を必要とすることです。
〜0.5mmまでの分解能で栄養勾配を解決することができる代替システムは、土壌ブロックの表面に根マットを成長させ、根8,9から土壌を分離する薄い親水性膜層を有することである。この構成では、溶質は膜を通過することができ、根は土壌から栄養素や汚染物質を取り込み、根が滲出して土壌に拡散する可能性があります。密な根層の確立後、土壌ブロックをサンプリングし、その後の要素画分の抽出のために得られた土壌サンプルにスライスすることができます。このようにして、一次元栄養素、および汚染勾配は、比較的大きな領域(〜100cm2)にわたって平均化して分析することができる。
さらに課題は、ほとんどの化学土壌抽出技術が植物が栄養素や汚染物質を取り込むメカニズムと比較して非常に異なって動作するため、不安定な植物利用可能な要素分率のサンプルを取得することです。多くの土壌抽出プロトコルでは、土壌は、溶解し、ソルベッド要素分率の間の(疑似)平衡を確立することを目的として抽出液と混合されます。しかし、植物は継続的に栄養素を内部化し、したがって、多くの場合、根茎の土壌を徐々に枯渇させます。平衡抽出プロトコルは、実施が容易であるため土壌試験として広く採用されているが、抽出された分画は、植物利用可能な分画ウェル10、11、12、13を表さないことが多い。栄養物のサンプリングされた土壌を連続的に枯渇させるシンク法は、有利な方法として提案されており、根取り取りプロセス10、11、14、15を模倣することによって、基礎となる栄養取り込み機構に似ている可能性がある。
上記の方法に加えて、本物のイメージングアプリケーションは、数cm2の視野を越えて解像度≤100 μmの連続的なパラメータマップを測定することができるが、特定の元素および土壌(生物)化学パラメータ5のために開発されている。オートラジオグラフィーは、適切な放射性同位元素が利用可能である場合には根圏の要素分布を画像化するために使用することができます16.平面光はpHおよびpO217、18、19のような重要な土壌化学パラメータの視覚化を可能にし、酵素活性または全タンパク質分布は、土壌ザイモグラフィ20、21、22、23および/またはルートブロット法などの蛍光指標イメージング技術を用いてマッピングすることができる。ザイモグラフィーとオートラジオグラフィーは一度に1つのパラメータの測定に制限されていますが、平面光素を用いたpHとpO2イメージングは同時に行うことができます。従来のルートマット技術では1D情報のみが提供され、マイクロ吸引カップは点数計測や低解像度の2D情報を提供しますが、どちらの方法でも多要素解析が可能です。最近では、P. D.Ilhardt,ら25は、レーザー誘導分解分光法(LIBS)を用いて、2Dの全多元分布を、慎重なサンプル調製によって自然元素分布が保存された土壌根コアサンプル中の~100 μmの分解能でマッピングする新しいアプローチを提示した。
高い空間分解能で複数の栄養素および汚染物質の溶質を2Dサンプリングする唯一の技術は、薄膜(DGT)技術における拡散勾配であり、ヒドロゲル層26,27に埋め込まれた結合材料に陰唇微量金属(loid)種をその場で固定化するシンクベースのサンプリング法である。DGTは、堆積物および海域中の不安定な溶物を測定するための化学種分化技術として導入され、すぐに土壌28での使用に採用された。これは、最初に川の堆積物29で実証されたサブmmスケール多元溶質イメージングを可能にし、さらに植物根球30、31、32、33でその適用のために開発された。
DGTサンプリングの場合、約3cm x 5cmの大きさのゲルシートを、土壌ブロックの表層に成長している単一の植物根に塗布し、ゲルを土壌から分離する親水性膜を使用します。接触時間中、不安定な栄養素および/または汚染物質はゲルに向かって拡散し、ゲルに組み込まれた結合材料によって直ちに結合されます。このようにして、濃度勾配、およびこのようにゲルに向かって連続的なネットフラックスが確立され、サンプリング時間の間に優勢になる。サンプリング後、ハイドロゲルを除去し、空間的に解決された分析を可能にする分析化学技術を使用して分析することができます。この目的のために非常に専門化され、頻繁に使用される技術は、誘導結合プラズマ質量分析(LA-ICP-MS)であるレーザーアブレーションです。初期の研究では、マイクロ粒子誘導X線放射(PIXE)も29.29を用いた。DGTサンプリングとLA-ICP-MS分析を組み合わせることで、100μmの空間分解能で多元的な化学イメージングが可能です。高感度ICP-MS技術(例えば、セクターフィールドICP-MS)が採用されている場合、検出の極めて低い限界を達成することができます。トウモロコシ15によるZnとCd取り込みへのリミングの影響に関する研究では、汚染されていない土壌中のトウモロコシ層根圏の不安定なCdを、ゲル面積当たりCdの38pgcm-2の検出限界でマッピングすることができました。DGT、平面オプトデス、およびザイモグラフィーは、土壌からゲル層へのターゲット要素の拡散に依存しており、植物の栄養素および汚染物質の取り込みに関連する多数のパラメータを同時に、または連続的に画像化するために、これらの方法の組み合わせ用途に利用することができます。DGTイメージングの分析的化学的側面に関する詳細な情報、DGTと他のイメージング方法を組み合わせる可能性、およびその用途については、ref.34,35で総合的にレビューされています。
本稿では、不飽和土壌環境における陸上植物の根に対して、植物栽培、ゲル製造、ゲル化、ゲル分析、画像生成などのDGT技術を用いて溶質イメージング実験を行う方法について説明します。重要なステップや実験的な代替手段に関する注意事項を含め、すべてのステップについて詳しく説明しています。
ここで紹介する溶質イメージングプロトコルは、土壌植物環境における2D栄養および汚染フラックスを可視化し、定量化するための多目的な方法です。それは、土壌根界面で陰唇溶質種のサブmmスケール多元素画像を生成する能力において独特であり、根層圏における溶質勾配を実質的に4に測定するための代替方法の達成可能な空間分解能を超える。DGTのインテク・サンプリング手法を対象とし、LA-ICP-MSのような高感度な化学分析法と組み合わせて、土壌または類似の基質で成長した個々の植物根の周りの溶質フラックスダイナミクスの詳細な調査を容易にします。シンクベースのサンプリングプロセスのために、得られた画像は視覚化された溶物の可否を反映し、したがって植物の利用可能性10の推定である。溶質フラックスの方法固有の測定は、植物が入手可能な栄養素画分としての解釈性のようなかなりの利点を有するが、フラックス測定は、孔水濃度測定よりも理解する方がはるかに簡単ではない。バルク土壌用途の標準的なDGTサンプリング幾何学(具体的には、その設定で使用される0.8 mm-厚の拡散ゲル)は、実際の孔水濃度、csoln、バルクDGT測定による時間平均の孔水濃度推定値cDGT、および溶質種の再供給ダイナミクスに関するこれらのパラメータの解釈を比較することができます。しかし、このような比較は、非常に薄い拡散層を持つDGTアプリケーションをイメージングに基づいて行うことはできません。したがって、DGTイメージングの結果は、常に単純で解釈が速いとは限らず、従来の孔水濃度測定に直接匹敵するわけではありません。
この方法を適用する場合、根茎成長容器の充填と水を主に行う重要なステップを慎重に検討する必要があります。土壌を根茎に充填する際には、植物の根が強く圧縮された土壌に浸透できず、根の成長が阻害されることから、土壌をあまり圧縮しないようにすることが非常に重要です。私たちは、強く圧縮された土壌を避け、土壌が通常あまり圧縮されていない根ツォトロン成長容器の内側の端に沿って成長する根を観察しました。この場合、根茎の中央に位置する個々の根は、DGTゲルを簡便に塗布することができ、全く現れず、ゲルの塗布を効果的に阻害する。我々の研究室では、経験は1.0-1.4 g cm-3の乾燥した土壌かさ密度が妨げられない根の開発を可能にすることを示した。さらに、過剰な土壌圧縮は、酸化還元に敏感な元素および生物地球化学的に関連する種の溶解性に関するアーティファクトの潜在的な供給源でもある。総孔容積が減少し、細孔径分布が高度に圧縮された土壌で低径に向かってシフトすると、空気充填された大口径の細孔体積が少なくなり、局所的に還元条件を引き起こし得る。その結果、MnIII/IV-およびFeIII-オキシドが減少し、Mn2+およびFe2+フラックスが増加する可能性があります。例えば、リン酸塩や微量栄養素に対して重要な吸収部位であるFe-オキシドの溶解は、ソルベッドおよび/または共沈殿種を解放し、それによって生物地球化学的に関連する種の束束を人為的に上昇させる可能性がある。同様の問題は、成長容器に水を与えすぎると発生する可能性があります。成長容器の上部にある小さな土壌表面積を介した蒸発は低く、土壌は植え付け後数週間まで水飽和状態のままであり、酸化還元物を引き起こす可能性もあります。
もう一つの重要な考慮事項は、製造されたHR-DGT結合ゲルの化学的機能性である。プロトコルに従うことによって、結合相の均質な分布を有する薄いゲルが得られる。ゲルが不均一な材料分布の領域(例えば、ゲルの穴または結合相の凝集部)を有する場合、これらの領域を除去するか、または、あまりにも広範な場合は、ゲル製造プロトコルを繰り返す必要がある。正しく調製されれば、ゲルは直ちにゲルに拡散する標的溶質種を結合できなければならないし、定量的に27は、分析物特異的なゲル結合能力によって決定される。ゲル容量を超えると汚染されていない土壌ではあまり問題はありませんが、金属汚染土壌や生理食類土壌環境で考慮する必要があります。ゲル結合相の飽和は、定量的な溶質サンプリングを損なうだけでなく、ゲル中の結合相間の溶質の横方向拡散をもたらし、小規模な溶質フラックス特徴の不定の局在化をもたらす。したがって、標的土壌環境において非常に多量の不安定な栄養素/汚染物質が予想される場合は、予備試験を行う必要があります。予想されるDGT負荷を推定するために、バルク土壌DGTピストンサンプリング後にゲル溶出および湿式化学分析を15,49に適用することができる。必要に応じて、DGTの展開時間を調整してゲル接触時間を短縮し、したがって、容量閾値を超えるゲル飽和を回避することができます。逆に、予備試験は、極めて低い溶質荷重が予想される場合に必要なゲル接触時間および/またはLA-ICP-MS感度を同定するのにも役立つ可能性があり、これは天然土壌背景レベル15で微量元素溶質をマッピングするために重要である可能性がある。また、正しいDGTゲル機能は、DGT LA-ICP-MSキャリブレーション標準の調製において、ゲルの制御ローディングを介して実験アプリケーションの前に検証する必要があります。このゲル標準は、LA-ICP-MSによって決定されるサンプルゲルローディングが期待される範囲内にあるかどうかを評価するために使用できる、マトリックスマッチ参照ゲル検体ローディングを提供します。ガスとメソッドブランクのバックグラウンドノイズと異なる信号を得ることができない場合、オペレータは、トレース要素解析のための実験室の手順が実装され、すべてのプロトコルステップが正しく実行されたことを確認する必要があります。時には、DGTゲルは、土壌露出、レーザービームではなくガラス板に向かってロードされた側で溶質サンプリング後に誤って反転し、最終的な溶質フラックス画像で低信号強度と誤って反転された特徴をもたらします。
LA-ICP-MS 分析の間に大量のデータが生成され、評価にかなりの時間がかかります。当研究室では、標準のスプレッドシートソフトウェアを使用して、ターゲットデータ出力形式に合わせた社内データ評価スクリプトを使用しています。半自動の並べ替えとキャリブレーションの後、画像プロットはオープンソースのオープンアクセス画像解析ツール(ImageJ、フィジー50)を使用して行われます。この方法では、データの並べ替え、評価、および表示を完全に制御できます。さらに、データ処理時には、ピクセルの補間は慎重に避けるべきです。ピクセル補間は、化学画像の勾配を平滑化し、その結果、しばしば円形の要素分布特徴が軟化し、したがって、元のデータの望ましくない変化をもたらす。ピクセル補間は、多くの画像処理ソフトウェア製品での再スケーリングと再フォーマット操作の標準的な手順ですが、通常は選択解除できます。
結論として、この方法は、天然土壌根球植物系における栄養素および汚染ダイナミクスを理解するための重要な進歩である。DGTのみの用途に加えて、この方法は、平面光変換3、33、42、43、48、51およびzymography 20、21、22、23、24のような他の拡散ベースのイメージング技術と組み合わせることができ、さらに追加の要素および土壌パラメータを含むために開発され得る。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、オーストリア科学基金(FWF):P30085-N28(トーマス・プロハスカ)とオーストリア科学基金(FWF)とオーストリア連邦科学基金(FWF)と連邦オーストリア州:P27571-BBL(ヤコブ・サントナー)によって共同出資されました。
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
Clamp | Local warehouse | n/a | |
Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
Horizontal shaker | GFL | 305 | |
HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
Overhead shaker | GFL | 3040 | |
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |