Summary
Ce protocole présente un flux de travail pour la visualisation sous-mm 2D de multiples espèces inorganiques de nutriments labiles et de soluté contaminants à l'aide de gradients diffusifs dans les couches minces (DGT) combinés à l'imagerie par spectrométrie de masse. L'échantillonnage soluté et l'analyse chimique à haute résolution sont décrits en détail pour la cartographie quantitative des solutés dans la rhizosphère des plantes terrestres.
Abstract
Nous décrivons une méthode de visualisation et de quantification bidimensionnelles (2D) de la distribution des espèces de soluté inorganique (p. ex., P, Fe, Mn) et contaminantes (p. ex., espèces de soluté As, Cd, Pb) dans le sol adjacentes aux racines végétales (la rhizosphère) à une résolution spatiale inférieure à 100 μm. La méthode combine l'échantillonnage soluté basé sur l'évier par les gradients diffusifs dans la technique des couches minces (DGT) avec l'analyse chimique spatialement résolue par ablation au laser couplée inductivement spectrométrie de masse plasmatique (LA-ICP-MS). La technique DGT est basée sur des hydrogels minces avec des phases de liaison analyte sélectives réparties de manière homogène. La variété des phases de liaison disponibles permet la préparation de différents types de gel DGT suivant des procédures simples de fabrication de gel. Pour le déploiement du gel DGT dans la rhizosphère, les plantes sont cultivées dans des contenants de croissance plats et transparents (rhizotrons), ce qui permet un accès invasif minimal à un système racinaire cultivé dans le sol. Après une période de pré-croissance, les gels DGT sont appliqués à certaines régions d'intérêt pour l'échantillonnage in situ de soluté dans la rhizosphère. Par la suite, les gels DGT sont récupérés et préparés pour une analyse chimique ultérieure des solutés liés à l'aide de l'imagerie par balayage en ligne LA-ICP-MS. L'application de la normalisation interne à l'aide de 13C et de l'étalonnage externe à l'aide de normes de gel appariées par matrice permet en outre la quantification des flux solutés 2D. Cette méthode est unique dans sa capacité à générer des images 2D quantitatives à l'échelle submm de flux solutés multi-éléments dans les environnements sol-plantes, dépassant considérablement la résolution spatiale réalisable d'autres méthodes de mesure des gradients solutés dans la rhizosphère. Nous présentons l'application et l'évaluation de la méthode d'imagerie de multiples espèces de soluté cationique et anionique dans la rhizosphère des plantes terrestres et soulignons la possibilité de combiner cette méthode avec des techniques complémentaires d'imagerie soluté.
Introduction
L'acquisition de nutriments par les plantes cultivées est un facteur clé dans la détermination de la productivité des cultures. Les processus régissant l'absorption efficace des nutriments par les cultures ont été étudiés intensément, en particulier les mécanismes contrôlant la disponibilité des nutriments et l'internalisation des éléments nutritifs par les racines des plantes à l'interface sol-racine, la rhizosphère, sont reconnus pour leur rôle dans l'acquisition de nutriments des cultures. Les processus importants d'absorption des éléments nutritifs des plantes comprennent : le transport des nutriments vers la racine; équilibres dynamiques de sorption entre les espèces dissoutes dans l'eau de pore du sol et les espèces liées à des surfaces solides du sol; la concurrence microbienne pour les nutriments; minéralisation microbienne des nutriments contenus dans la matière organique du sol; et l'internalisation des nutriments dans le symplasme racinaire. L'absorption de contaminants inorganiques de métaux traces (oid) est largement contrôlée par les mêmes mécanismes.
Selon la disponibilité des éléments nutritifs et des contaminants, la demande des plantes et la diffusivité du sol, des modèles nutritifs différentiels dans la rhizosphère peuvent être observés. Pour les éléments fortement sorbing avec des taux d'internalisation relativement élevés (p.g., P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), l'épuisement de la fraction d'élément labile (c.-à-d. inversiblement adsorbed) par rapport au sol en vrac est trouvé, avec des largeurs de zone d'épuisement étant souvent ≤1 mm, tandis que pour plus d'éléments nutritifs mobiles tels que NO3-, zones d'épuisement peuvent s'étendre jusqu'à plusieurs centimètres1. En outre, l'accumulation d'éléments tels que Al et Cd a été observée lorsque la disponibilité dépasse les taux d'absorptiondes plantes 2,3.
Compte tenu de l'importance des processus rhizosphère dans le cycle des nutriments et des contaminants, plusieurs techniques de mesure de la fraction d'élément disponible dans les plantes à haute résolution spatialeont été développées 4,5. Toutefois, la mesure des distributions de soluté labile à petite échelle s'est avérée difficile pour plusieurs raisons. Une difficulté majeure est d'échantillonner de très petits volumes (faible plage de μL) de sol et/ou d'eau pore à des positions définies adjacentes aux racines vivantes des plantes pour résoudre les gradients nutritifs abrupts de la rhizosphère. Une approche pour résoudre ce problème est d'utiliser des gobelets de micro-aspiration pour l'extraction d'échantillons d'eau depore 6. Avec cette méthode, A. Göttlein, A. Heim et E. Matzner7 ont mesuré les concentrations nutritives de l'eau du sol à proximité des racines de Quercus robur L. à une résolution spatiale d'environ 1 cm. La difficulté d'analyser les volumes de μL de solution du sol ou du sol est que ces petits volumes d'échantillons, combinés aux faibles concentrations de toutes les espèces nutritives, sauf les principales, nécessitent des techniques d'analyse chimique très sensibles.
Un système alternatif, capable de résoudre les gradients nutritifs à une résolution jusqu'à ~0,5 mm, est de faire pousser un tapis racinaire à la surface d'un bloc de sol, avec une mince couche membranaire hydrophilique séparant lesol des racines 8,9. Dans cette configuration, les solutés peuvent passer à travers la membrane et les racines peuvent absorber les nutriments et les contaminants du sol tandis que les exsudats de racines peuvent se diffuser dans le sol. Après l'établissement d'une couche de racine dense, le bloc de sol peut être échantillonné et tranché pour obtenir des échantillons de sol pour l'extraction ultérieure de fractions d'éléments. De cette façon, on peut analyser les gradients unidimensionnels d'éléments nutritifs et de contaminants, en moyenne sur une superficie relativement grande (~100 cm2).
Un autre défi consiste à obtenir des échantillons de la labile, fraction d'élément disponible dans les plantes, puisque la plupart des techniques d'extraction chimique du sol fonctionnent très différemment par rapport aux mécanismes par lesquels les plantes prennent des nutriments et des contaminants. Dans de nombreux protocoles d'extraction du sol, le sol est mélangé à une solution extractif dans le but d'établir un (pseudo-)équilibre entre la fraction d'élément dissoute et sorbée. Cependant, les plantes intériorisent continuellement les nutriments et, par conséquent, épuisent souvent progressivement le sol rhizosphère. Bien que les protocoles d'extraction d'équilibre aient été largement adoptés comme tests de sol car ils sont faciles à mettre en œuvre, la fraction nutritive extraite ne représente souvent pas la fractionnutritive disponible dans les plantes bien 10,11,12,13. Les méthodes d'évier qui épuisent continuellement le sol échantillonné pour les éléments nutritifs ont été proposées comme méthodes avantageuses et peuvent mieux ressembler au mécanisme sous-jacent d'absorption des éléments nutritifs en imitant les processus d'absorptiondes racines 10,11,14,15.
En plus des méthodes décrites ci-dessus, de véritables applications d'imagerie, capables de mesurer des cartes de paramètres continus avec des résolutions ≤100 μm à travers des champs de vue de plusieurs cm2 ont été développées pour des éléments spécifiques et des paramètres (bio)chimiques du sol5. L'autoradiographie peut être utilisée pour l'image de la distribution des éléments dans la rhizosphère à condition que des radioisotopes appropriés soientdisponibles 16. Les optodes planaires permettent la visualisation de paramètres chimiques importants du sol tels que le pH et le pO217 , 18,19, et l'activité enzymatique ou la distribution totale des protéines peut être cartographiée à l'aide de techniques d'imagerie par indicateurs fluorescents tels que la zymographiedu sol 20,21,22,23 et/ou les méthodes de ballonnementdes racines 24. Alors que la zymographie et l'autoradiographie sont limitées à la mesure d'un seul paramètre à la fois, l'imagerie par pH et pO2 à l'aide d'optodes planaires peut être effectuée simultanément. Les techniques plus traditionnelles du tapis racinaire ne fournissent que des informations 1D, tandis que les micro ventouses fournissent des mesures de points ou des informations 2D à basse résolution, mais les deux approches permettent une analyse multi-éléments. Plus récemment, P. D. Ilhardt, et coll.25 ont présenté une nouvelle approche utilisant la spectroscopie induite par laser de panne (LIBS) pour cartographier les distributions totales de multi-éléments 2D à une résolution d'environ 100 μm dans les échantillons de noyau de sol-racine où la distribution d'élément naturel a été préservée par la préparation soignigneur d'échantillon.
La seule technique capable d'échantillonner en 2D de multiples solutés nutritifs et contaminants à haute résolution spatiale est les gradients diffusifs dans la technique des couches minces (DGT), une méthode d'échantillonnage basée sur l'évier qui immobilise les espèces de métaux traces labile (loid) in situ sur un matériau liant incorporé dans une couche hydrogel26,27. La DGT a été introduite comme technique de spéciation chimique pour mesurer les solutés labiles dans les sédiments et les eaux, et a rapidement été adoptée pour son utilisation dans les sols28. Il permet l'imagerie soluté multi-éléments à l'échelle submm, qui a été initialement démontrée dansun sédiment fluvial 29, et a été développé davantage pour son application dans les rhizosphèresvégétales 30,31,32,33.
Pour l'échantillonnage DGT, une feuille de gel d'une taille d'environ 3 cm x 5 cm est appliquée sur une seule racine végétale qui pousse dans la couche superficielle d'un bloc de sol, avec une membrane hydrophilique séparant le gel du sol. Pendant le temps de contact, les nutriments labiles et/ou les contaminants se diffusent vers le gel et sont immédiatement liés par le matériau liant incorporé dans le gel. De cette façon, un gradient de concentration, et donc un flux net continu vers le gel est établi et a prévalu pendant le temps d'échantillonnage. Après échantillonnage, l'hydrogel peut être enlevé et analysé à l'aide d'une technique chimique analytique permettant une analyse résolue spatialement. Une technique hautement spécialisée et fréquemment utilisée à cette fin est l'ablation au laser inductivement couplé spectrométrie de masse plasmatique (LA-ICP-MS). Dans certaines premières études, l'émission de rayons X induite par micro particule (PIXE) a également étéutilisée 29. L'échantillonnage DGT combiné à l'analyse LA-ICP-MS permet l'imagerie chimique multi-éléments à une résolution spatiale d'environ 100 μm. Si des techniques ICP-SP hautement sensibles (p. ex., le domaine du secteur ICP-MS) sont utilisées, des limites exceptionnellement faibles de détection peuvent être atteintes. Dans une étude sur l'effet du liming sur l'absorption de Zn et de Cd par lemaïs 15, nous avons pu cartographier le Cd de labile dans la rhizosphère de maïs dans le sol non contaminé avec une limite de détection de 38 pg cm-2 de Cd par zone de gel. La DGT, les optodes planaires et la zymographie reposent sur la diffusion de l'élément cible du sol en couche de gel, qui peut être exploitée pour l'application combinée de ces méthodes afin d'imager simultanément, ou consécutivement, un grand nombre de paramètres pertinents pour l'absorption des éléments nutritifs et des contaminants végétaux. Des informations détaillées sur les aspects chimiques analytiques de l'imagerie DGT, sur la possibilité de combiner la DGT et d'autres méthodes d'imagerie, et sur ses applications sont examinées en détail à l'réf.34,35.
Dans cet article, nous décrivons comment réaliser une expérience d'imagerie solutée en utilisant la technique DGT sur les racines des plantes terrestres dans un environnement de sol insaturé, y compris la culture des plantes, la fabrication de gel, l'application de gel, l'analyse de gel et la génération d'images. Toutes les étapes sont élaborées en détail, y compris des notes sur les étapes critiques et les alternatives expérimentales.
Protocol
1. Fabrication de gels DGT
REMARQUE : Plusieurs types de gel DGT sont disponibles pour l'imagerie 2D des espèces de soluté labile à haute résolution spatiale (sous-mm)35. Ici, la fabrication de trois gels de liaison haute résolution (HR)-DGT bien caractérisés utilisés dans les applications d'imagerie soluté est brièvement résumée. Les procédures de laboratoire pour l'analyse des oligo-éléments, ainsi que les procédures de fabrication détaillées de tous les gels HR-DGT présentés sont décrites dans les sections S1 et S2 de l'information à l'appui (SI).
- Gel de fixation à base d'anion mixte à base de polyuréthane et de cation (HR-MBG; SI S2.1)31
- Préparer une suspension en gel de polyuréthane avec des phases homogènement dispersées d'hydroxyde de zirconium (IV) et d'iminodiacécète (IDA).
- Enduire la suspension gel d'un film mince sur une plaque de verre et initier la formation de gel par évaporation des solvants pour obtenir un gel de liaison mixte à l'anion et à la cation (HR-MBG) de 0,1 mm d'épaisseur et à l'épreuve des déchirures.
- Gel liant à l'anion polyacrylamide-zirconia (HR-ABG; SI S2.2)36
- Fabriquer un gel de polyacrylamide croisé (APA) de 0,4 mm d'épaisseur à la suite des procédures établies de coulée de gel37 (voir SI S2.4 pour un protocole détaillé de la fabrication de l'APA).
- Précipiter les phases d'hydroxyde de zirconium (IV) dans le gel APA préfabricé pour obtenir un gel liant d'anion de 0,4 mm d'épaisseur (HR-ABG).
- Gel liant de cation de polyacrylamide-iminodiacetate (HR-CBG ; SI S2.3)38
- Préparer une suspension de gel polyacrylamide avec des phases IDA homogènement dispersées.
- Jetez le gel entre deux plaques de verre et initiez la réaction de polymérisation pour obtenir un gel liant de cation de 0,4 mm de épaisseur (HR-CBG) où les phases IDA sont réglées d'un côté du gel.
2. Culture de plantes
REMARQUE : Le système expérimental utilise les rhizotrons4 (figure 1) pour cultiver des plantes dans un sol insaturé pour l'imagerie solutée. Tout d'abord, le remplissage et l'arrosage du sol rhizotron sont décrits, puis des détails sur la croissance expérimentale des plantes sont donnés. Les détails sur la conception du rhizotron et la préparation du substrat du sol avant de le remplir dans le rhizotron sont présentés dans la section SI S3.
Figure 1 : Conception rhizotron (à ne pas mettre à l'échelle). (A) Vue explosée d'un récipient de croissance rhizotron. (B) Rhizotron assemblé pendant la croissance des plantes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Remplissage du sol rhizotron
- Avant de remplir le rhizotron d'un sol pré-humidifié (teneur en eau gravimétrique,
est connue; voir SI S3.2),fermer les points d'eau à l'arrière du rhizotron à l'aide de ruban adhésif et enlever la plaque avant et ses rails et vis de fixation. - Pesez le rhizotron vide (à l'exclusion de la plaque avant, des rails et des vis), huit plaques acryliques de 5 cm x 11 cm et 16 pinces(table des matériaux)et enregistrez la somme des poids.
- Fixez une petite plaque acrylique au bas du rhizotron à l'aide de deux pinces de chaque côté, avec la pression des pinces dirigées sur le cadre rhizotron, de sorte que la plaque ne se plie pas vers l'intérieur et le volume est constant.
- Inclinez légèrement le rhizotron vers la petite plaque de plastique et remplissez de terre pré-humidifié jusqu'à une hauteur d'~4 cm (Figure 2A). Répartir le sol à l'intérieur du rhizotron en agitant légèrement le rhizotron et en comprimant doucement le sol de quelques mm (selon les caractéristiques spécifiques du sol) à l'aide d'un outil de compactage(figure 2B).
- Répétez 2.1.3 - 2.1.4 jusqu'à ce que le rhizotron soit rempli de terre (Figure 2C). Laissez un espace d'environ 3 cm au sommet pour la plantation subséquente de semis dans le rhizotron.
- Pesez le rhizotron rempli de terre (y compris 8 petites assiettes et 16 pinces) et enregistrez le poids. De là, soustrayez le poids vide du rhizotron obtenu en 2,1,2 et enregistrez la différence de poids, c'est-à-dire la masse du sol
humide (g), dans le rhizotron. - Calculer la masse de sol sec dans le
rhizotron,(g), selon eq. 1, puis calculer la densité en vrac du sol 
sec, (g cm-3), dans le rhizotron selon eq. 2.
Ici,
(cm3) est le volume intérieur total du rhizotron.
REMARQUE : Les valeurs typiques du rhizotron se situent entre 1,0 et 1,4 g cm-3. Ne dépassez pas 1,5 g cm-3, car la croissance des racines peut être entravée au-dessus de cette valeur. - Déposer le rhizotron rempli de terre sur une boîte de soutien et retirer toutes les pinces et les petites assiettes du rhizotron(figure 2D). Nettoyez soigneusement le cadre rhizotron (c.-à-d. les bords) à l'aide de papier de soie, car le reste des particules de sol sur le cadre peut causer des fuites.
REMARQUE : La surface exposée du sol doit être homogène et nivelé avec le cadre rhizotron sans fissures ni lacunes. Sinon, videz le rhizotron et répétez 2.1.2 - 2.1.8. - Couper deux morceaux de papier d'aluminium polytétrafluoroéthylène (PTFE)(Tableau des matériaux)à 22 cm x 13 cm chacun. De plus, couper un morceau de papier d'aluminium à 46 cm x 15 cm. Enregistrez la somme des poids ptfe et papier d'aluminium en plastique. Placer le premier morceau de papier d'aluminium PTFE sur la moitié supérieure de la surface exposée du sol dans le rhizotron, en s'étendant ~ 1 cm sur le niveau du sol au sommet du rhizotron.
- Fixez soigneusement le papier d'aluminium PTFE sur le cadre rhizotron à l'aide de ruban adhésif (Figure 2E). Commencez par fixer un coin en haut du rhizotron d'abord, suivi de son coin opposé et enfin les deux coins plus bas dans le rhizotron. Appliquez une tension lors de la fixation des coins 2-4 pour assurer une surface de papier d'aluminium plat. Si des plis émergent, ouvrez et réparez le ruban aux coins individuels (pas tous à la fois) jusqu'à ce que tous les plis soient enlevés et que le papier d'aluminium PTFE soit plat et contigu avec la surface du sol.
- Placez le deuxième morceau de papier d'aluminium PTFE sur l'extrémité inférieure du rhizotron, en chevauchant le morceau supérieur de papier d'aluminium PTFE d'environ 1 cm. Répétez 2,1,10 pour fixer la deuxième feuille PTFE au rhizotron.
- Déposer la feuille de plastique (46 cm x 15 cm) sur les feuilles PTFE. Fixer la feuille de plastique en utilisant la procédure de fixation comme détaillé en 2.1.10.
- Déposer une plaque avant sur le rhizotron rempli de terre et recouvert de papier d'aluminium. Placez un rail de chaque côté du rhizotron et serrez les vis à la main pour fixer les rails et, par conséquent, la plaque avant au rhizotron. Les vis sont placées vers le côté fermé du rhizotron, c'est-à-dire le côté avec les points d'eau (figure 1A).
- Avant de remplir le rhizotron d'un sol pré-humidifié (teneur en eau gravimétrique,
est connue; voir SI S3.2),fermer les points d'eau à l'arrière du rhizotron à l'aide de ruban adhésif et enlever la plaque avant et ses rails et vis de fixation.
humide (g), dans le rhizotron.
rhizotron,(g), selon eq. 1, puis calculer la densité en vrac du sol 
sec, (g cm-3), dans le rhizotron selon eq. 2.
(cm3) est le volume intérieur total du rhizotron.
Figure 2 : Assemblage et remplissage rhizotron pour faire pousser des plantes dans le sol pour l'imagerie solutée dans la rhizosphère. (A) Remplissage du sol dans le rhizotron. (B) Compactage du sol rempli à l'aide d'un outil de compactage. (C) Rhizotron rempli de terre avec de petites assiettes acryliques et pinces. (D) Rhizotron rempli de sol avec surface de sol exposée. (E) Rhizotron rempli de sol partiellement recouvert d'une feuille ptfe protectrice. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Manipulation rhizotron et application de gel DGT. (A) Arrosage du sol à l'aide de pointes de pipette de 10 mL dans les points d'eau à l'arrière du rhizotron. (B) Plantation de semis (indiqués comme taches vertes) dans le rhizotron rempli de sol et fermé. (C) Rhizotron planté de boutures Salix smithiana et enlevé plaque avant et couvercle en papier d'aluminium en plastique. (D) Peler soigneusement le couvercle de papier d'aluminium PTFE avant l'application de gel DGT. (E) Photo haute résolution de l'interface sol-racine roi. (F) Application de la plaque avant équipée du gel DGT sur le rhizotron. (G) Photo du retour sur investissement avec le gel DGT appliqué lors de l'échantillonnage soluté. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Arrosage du sol
- Déterminer la capacité de détention de l'eau (WHC) du sol expérimental dans le rhizotron. À cette fin, fabriquer deux rhizotrons avec un fond ouvert et les remplir de terre comme indiqué dans la section 2.1. Saturez complètement ces rhizotrons ouverts remplis de sol par immersion dans un récipient d'eau pendant 16 h et égouttez les rhizotrons pendant 8 h.
- Présédez un échantillon composite de sol d'environ 50 g à partir d'endroits aléatoires dans les rhizotrons à fond ouvert et séchez l'échantillon à 105 °C pour déterminer selon eq. S1. Le déterminé correspond au WHC du sol et est donc exprimé comme
(g-1). - Définissez la cible dans le rhizotron expérimental. Au cours de la phase de croissance, définir un de 60 % du WHC (c.-à-d. le facteur WHC, ) pour fournir
aux plantes une quantité suffisante d'eau tout en évitant les conditions anoxiques dans le rhizotron. - Calculer la masse totale d'eau à
ajouter, (g), pour irriguer le sol dans le rhizotron à la cible selon eq. 3. Tenir compte de la masse d'eau présente dans le sol dans le rhizotron, 
(g).
- Diviser par le nombre de trous d'arrosage rhizotron (ici 14) pour obtenir la masse d'eau à ajouter dans chaque arrosage. Ajouter de l'eau en poussant des pointes de pipette de 10 mL dans les points d'eau et en laissant l'eau s'écouler dans le sol par gravité (figure 3A).
- Croissance des plantes
- Pré-germer les graines de la plante expérimentale (p. ex., sur du papier filtre humide) selon les besoins spécifiques en germination des graines jusqu'à ce que le radicle émerge (jusqu'à 1 cm de long).
- Plantez jusqu'à deux semis dans le rhizotron, comme l'indique la figure 3B. À la plantation, ajouter environ 5 mL d'eau directement aux semis pour soutenir leur croissance. Couvrir l'ouverture supérieure du rhizotron pendant les deux premiers jours après la plantation avec un film transparent et résistant à l'humidité (Table of Materials). Envelopper le rhizotron dans du papier d'aluminium pour prévenir la croissance microphytique.
REMARQUE : Outre les semis, les boutures végétales peuvent également être cultivées en rhizotrons. - Transférer le rhizotron planté dans une salle de croissance, avec des conditions environnementales (c.-à-d. température, humidité, intensité lumineuse) fixées aux exigences spécifiques de l'usine. Inclinez le rhizotron à 25°-35° pour assurer le développement des racines le long de la plaque avant par gravitropisme.
- Pendant la croissance des plantes, maintenir gravimétriquement la teneur en eau cible dans le rhizotron en arrosant périodiquement tous les 2-4 jours en utilisant les trous d'arrosage rhizotron comme détaillé dans 2.2.5. Gardez la surface du sol à l'ouverture supérieure humide par des ajouts réguliers d'eau ~ 5 mL.
REMARQUE : Si les plantes sont cultivées pendant de longues périodes et que la biomasse végétale devrait réduire considérablement la quantité d'eau ajoutée au rhizotron par la méthode proposée, tenir compte du poids de la biomasse végétale en cultivant des plantes dans des reproductions rhizotron distinctes et en récoltant et en pesant les tissus végétaux à intervalles définis. - Une fois que les racines atteignent un endroit approprié le long de la plaque avant, préférentiellement au centre du rhizotron, appliquez des gels DGT pour l'échantillonnage de la distribution rhizosphérique de soluté.
(g-1).
aux plantes une quantité suffisante d'eau tout en évitant les conditions anoxiques dans le rhizotron.
ajouter, (g), pour irriguer le sol dans le rhizotron à la cible 
(g).
3. Échantillonnage de la distribution de soluté
- Application gel
- Augmentation du rhizotron de 60 % à 80 % 24 h avant application de gel tel que détaillé en 2.2.4.-2.2.5. Cela assure un bon contact sol-gel et permet la diffusion du soluté dans le gel tout en évitant les conditions anoxiques du sol lors de l'échantillonnage du soluté.
- Prenez une nouvelle plaque avant nettoyée à l'acide, alignez-la sur le rhizotron utilisé pour l'échantillonnage et marquez les régions d'intérêt (IA) sur la plaque. Transférez la plaque dans un banc d'écoulement laminaire ou tout autre environnement exempt de poussière et de métal, côté non marqué orienté vers le haut.
- Coupez le gel de fixation DGT sur un support acrylique à la taille rectangulaire requise correspondant au retour sur investissement, généralement autour de 3 cm × 5 cm, à l'aide de lames de rasoir recouvertes de PTFE. Couper le gel en appuyant plutôt que de glisser la lame de rasoir pour assurer une coupe claire. Placez le morceau de gel rectangulaire sur le côté non marqué de la plaque à l'emplacement marqué du retour sur investissement.
REMARQUE : Si hr-MBG est utilisé, une feuille d'espaceur de 100 μm d'épaisseur peut être ajoutée sous le gel pour s'assurer que le gel est en bon contact avec le système sol-racine. - Couper une membrane en polycarbonate de 10 μm d'épaisseur (taille de 0,2 μm de pore; Tableau des matériaux) à une taille qui prolonge la taille du gel de ≥1 cm de chaque côté et place la membrane sur le gel. Appliquer un peu d'eau pour enlever les bulles d'air de la pile.
- Fixer la membrane le long des quatre bords à l'aide de ruban électrique en vinyle( Table of Materials). Dans le processus, retirez soigneusement les bulles d'air emprisonnées entre le gel et la membrane à l'aide de pinces à épiler en plastique. La bande ne doit entrer en contact avec la membrane et non avec le gel.
REMARQUE : Si la bande entre en contact avec le gel, que des bulles d'air sont emprisonnées entre le gel et la membrane, ou que la surface finale de la membrane montre des plis, la pile gel/membrane doit être réassemblée car le flux diffusif de solutés dans le gelpeut être altéré 35 (répétition 3.1.3 - 3.1.5). - Placez le rhizotron sur un support, retirez les rails et soulevez soigneusement la plaque avant (Figure 3C). Retirer le papier d'aluminium, couper le papier d'aluminium PTFE sur les bords du rhizotron et décoller lentement le papier d'aluminium PTFE pour éviter les perturbations du système sol-racine (Figure 3D).
- Prenez une photo orthogonale du retour sur investissement à l'aide d'un appareil photo numérique à objectif unique (DSLR)(Table of Materials)pour faciliter l'interprétation et la présentation de la distribution du soluté en fonction de la structure du sol et de la morphologie des racines (Figure 3E). Utilisez un support d'appareil photo et, si disponible, un objectif macro. Alignez l'appareil photo de sorte que le centre de la photo corresponde au centre du retour sur investissement, et le plan de mise au point de l'appareil photo est parallèle à la surface du sol. Inclure une barre d'échelle (p. ex., une règle) sur la photo.
- Attachez la plaque équipée de la pile gel/membrane au rhizotron ouvert(figure 3F). Par conséquent, alignez un bord de la plaque avec un bord du rhizotron et pliez doucement la plaque vers le sol. Ce mode d'application permet d'éviter les bulles d'air entre la pile gel/membrane et le système sol-racine. Fixer la plaque avant à l'aide des rails et des vis.
REMARQUE : Cette étape est essentielle et doit être effectuée avec soin. La plaque ne peut pas être déplacée après avoir établi le contact entre la pile gel/membrane et le système sol-racine sans déplacer le sol et les racines. - Enregistrez l'heure de début exacte du déploiement du gel et prenez une photo du gel déployé au retour sur investissement tel que donné en 3.1.7 (Figure 3G). Envelopper le rhizotron dans du papier d'aluminium et le transférer dans la salle de croissance jusqu'à la fin de la période d'échantillonnage du soluté (souvent 24 h).
- Augmentation
- Récupération de gel
- Déposer le rhizotron sur une boîte de soutien, soulever soigneusement la plaque avant et rincer la pile gel/membrane sur la plaque avec de l'eau pour laver les particules adhérentes (Figure 4A). Enregistrez l'heure de fin exacte du déploiement du gel. Échantillonner le sol du retour sur investissement pour déterminer lesol w réel dans le rhizotron selon Eq. S1.
- Transférer la plaque avant dans le banc d'écoulement laminaire, tapis gel / membrane face vers le haut. Récupérer le gel de la plaque avant en enlevant soigneusement d'abord le ruban le long des quatre bords, puis la membrane en polycarbonate couvrant le gel (Figure 4B). Appliquer de l'eau pour aider le gel à flotter librement sur une mince couche d'eau sur la plaque avec le côté contact avec le sol face vers le haut.
REMARQUE : Il est essentiel de garder une trace de l'orientation du gel. Le côté gel exposé au sol et aux racines doit toujours faire face (vers l'utilisateur).
- Séchage du gel
- Couper un morceau rectangulaire de papier buvard de gel (Table of Materials) et placer un morceau légèrement plus petit d'une membrane polyethersulfone (taille de 0,45 μm pore; Tableau des matériaux) dessus.
- Transférer le gel de la plaque sur la pile de papier blotting gel / membrane à l'aide de pinces en plastique, côté contact avec le sol face vers le haut. Le gel doit être détendu (c.-à-d. non étiré) et complètement plat, sans bulles d'air entre gel et membrane. Appliquez un peu d'eau sur la pile de papier blotting/membrane de gel pour faciliter le transfert et le positionnement de gel.
- Couvrir complètement la pile de papier blotting/membrane/gel de gel avec un morceau de papier d'aluminium et étiqueter l'échantillon de gel et son orientation sur la feuille de plastique (Figure 4C). Placer le gel buvard de papier/membrane/gel/pile de papier d'aluminium en plastique dans un séchoir à gel sous vide(Table of Materials)et sécher jusqu'à ce que la pile soit complètement dessiccated (généralement 48-72 h). Pour hr-MBG, réglez la température à 50-55 °C, pour HR-ABG et HR-CBG mieux sec à température ambiante.
- Retirer le papier buvard de gel de la pile séchée et transférer le gel, qui est maintenant inséparablement fusionné avec la membrane polyethersulfone, dans un sac zip. Le couvercle en papier d'aluminium reste sur le gel jusqu'à peu de temps avant l'analyse LA-ICP-MS.
- Inclure un morceau de gel de la feuille de gel d'origine comme une méthode vierge, qui ne s'expose pas au sol. Traiter le gel blanc méthode identique au gel échantillon suivant 3,3,2 - 3,3,4.
Figure 4 : Récupération du gel DGT et préparation au séchage lors de l'échantillonnage au soluté. (A) Plaque avec le gel DGT et rhizotron directement après l'échantillonnage soluté. (B) Récupération du gel DGT de la plaque dans un banc d'écoulement laminaire. (C) Pile de papier buvard gel / membrane polyethersulfone / gel DGT / couvercle de papier d'aluminium en plastique pour le séchage du gel. Notez que le gel est légèrement coloré après son déploiement sur le sol rhizosphère. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
4. Analyse chimique du gel liant DGT
REMARQUE : Dans ce protocole, l'analyse de la distribution solutée sur le gel de liaison DGT est effectuée par LA-ICP-MS à l'aide d'un nanoseconde 193 nm ArF excimer LA système équipé d'une cellule d'ablation en deux volumes couplée à un quadrupole ICP-MS (Figure 5). Tous les instruments sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. Alternativement, nanoseconde 213 nm ou 266 nm à l'état solide LA systèmes peuvent êtreappliqués 36,39,40,41,42,43. Si une sensibilité accrue ou une résolution de masse est nécessaire, le champ sectoriel ICP-MS est une alternative au quadrupole ICP-MS15,44. Les détails sur la préparation des normes de gel DGT pour l'étalonnage externe et le couplage du système LA au quadrupole ICP-MS sont présentés dans les sections SI S4 et S5.
Figure 5 : Configuration LA-ICP-MS pour l'analyse du gel DGT. (A) Nanoseconde 193 nm ArF excimer LA système et quadrupole ICP-MS. (B) Gels séchés montés sur des plaques de verre et fixés sur l'étape de l'échantillon de Los Angeles prêt pour l'introduction dans la cellule d'ablation. (C) Gaz nébuliseur (Ar) de l'ICP-MS et du gaz porteur d'aérosol (He ou Ar) de la cellule d'ablation reliée à l'ICP par l'intermédiaire d'un séparateur Y dans les deux sens et d'un adaptateur de torche. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Préparation de l'échantillon pour LA-ICP-MS
- Transférer les échantillons de gel séché, les normes et les blancs de méthode (qui sont fusionnés avec le support de la membrane polyethersulfone) sur des morceaux individuels de ruban adhésif à double face (Table of Materials), côté gel face vers le haut. Recadrer les parties de ruban adhésif excédentaires pour économiser de l'espace dans la cellule d'ablation.
- Monter les gels séchés sur des assiettes en verre. Utilisez des plaques de verre individuelles pour chaque échantillon de gel, série standard ou méthode vierge pour permettre un arrangement flexible sur le stade de l'échantillon de Los Angeles (taille typique de 10 cm × 10 cm). Utilisez un coupe-verre pour ajuster la taille de la plaque de verre au besoin. Fixer les plaques de verre avec les gels sur l'étape de l'échantillon de Los Angeles (Figure 5B) à l'aide de plasticine (Table of Materials). Niveler la surface du gel en ajustant le plancher de scène et verrouiller le stade de l'échantillon dans la cellule d'ablation.
- Analyse de l'analyse de la ligne LA-ICP-MS
- Couplez le système LA à l'ICP-MS tel que spécifié dans la section SI S5. Dans le logiciel LA (Table of Materials), réglez les paramètres de lumière de la caméra (c.-à-d., «Anneau»,« Coax» et «Transmis») pour éclairer la surface du gel dans la cellule d'ablation et se concentrer sur la surface du gel en ajustant la distance z-axe. Déplacez-vous vers des endroits aléatoires à travers la cellule pour s'assurer que toutes les surfaces de gel sont au point.
- Définissez les paramètres LA dans la fenêtre« Configurationlaser » du logiciel LA. Les paramètres typiques utilisés dans l'analyse de la ligne LA-ICP-MS des gels DGT sont les plus continus; production d'énergie de 20 à 30 %; taux de répétition 10-20 Hz; diamètre de la tache 100-200 μm; vitesse de balayage 150-250 μm s-1.
REMARQUE : Les paramètres doivent être optimisés pour le type de gel utilisé et peuvent varier. Les paramètres peuvent également être améliorés pour augmenter le rapport signal/bruit, la résolution spatiale ou réduire les temps d'acquisition en fonction de la configuration expérimentale et instrumentale. Utiliser une production d'énergie relativement faible (≤40 %) et taux de répétition (≤25 Hz) pour éviter de pénétrer à travers les gels dans les matériaux de soutien39. Assurez-vous que la vitesse de balayage laser est de ≤ le diamètre de la tache divisé par la durée totale du cycle de balayage ICP-MS (voir 4.2.6) pour éviter la compression des points de données et donc une perte de résolution dans la direction de balayage45. Par exemple, lors de la mise en place d'un diamètre de tache de 200 μm et d'une durée totale du cycle de balayage ICP-MS de 0,25 s, la vitesse d'analyse doit être de ≤800 μm s-1. - Sélectionnez l'outil de ligne et dessinez un modèle de ligne simple, ~1 mm de long à travers une norme de gel. Cliquez à droite sur le modèle de ligne dans lafenêtre « Modèles d'analyse» et vérifiez que les paramètres la sont définis en 4.2.3. ont été adoptés. Utilisezl'outil « Scans en double» pour dupliquer cette ligne quatre fois, avec une distance interlline (distance entre le centre de la ligne) supérieure au diamètre de la tache ( figure6). Cette approche offre un total de cinq lignes parallèles par norme de gel(n = 5). Répétez cette étape pour chaque norme de gel, étalonnage vierge et la méthode vierge.
- Déplacez-vous vers l'échantillon de gel et tracez une seule ligne le long du bord supérieur de la zone rectangulaire à analyser. Dupliquer la ligne pour créer des lignes parallèles pour l'ensemble de la zone de l'échantillon tel que spécifié dans 4.2.3. Utilisez une distance interlienne de 300-400 μm. Assurez-vous que la mise au point (distance z-axe) est réglée correctement pour chaque point de départ et de fin de chaque ligne.
REMARQUE : La résolution spatiale de l'analyse est plus élevée le long de la direction de balayage que la distance interlienne. Par conséquent, les points de départ et d'extrémité des lignes peuvent mieux suivre la direction des gradients analyte. Pour les gradients rhizosphère, il s'agit généralement d'un gradient perpendiculaire à l'axe des racines( figure 6). - Dans le logiciel ICP-MS (Tableau des matériaux), mettre en place une méthode « Donnéesseulement» résolue dans le temps dans l'écran «Méthode», sélectionnez un ou plusieurs isotopes appropriés pour chaque analyte et incluez 13C comme norme de normalisation interne31,36,40,41,42. Vérifiez que la détection des isotopes n'est pas altérée par les interférences46.
- Réglez la durée totale du cycle d'analyse de la méthode ICP-MS (« Temps delecture est.») à ≤0,5 s avec des temps de vie appropriés par isotope (généralement entre 10 et 50 ms). Réglez les « lectures»de l'ICP-MS à 1 et modifiez la valeur «Lectures/Répliques» pour définir le temps total de mesure par échantillon («Temps d'échantillonnage est.») c'est-à-dire par ligne d'ablation individuelle. Cela dépend des paramètres spécifiques de Los Angeles et des distances de ligne définies en 4.2.2 - 4.2.4.
- Pour les rapports de données, utilisez un mode de collecte de données d'intensité par rapport au temps etdéfinissez l'option « File Write Option» à « New PerSample» pour créer un fichier de données individuel (ici .xl) pour chaque ligne d'ablation.
- Configurer une séquenced'échantillons« Batch » dans l'écran de l'échantillon ICP-MS, chaque entréed'échantilloncorrespondant à une ligne d'ablation individuelle définie en 4.2.3 - 4.2.4.
- Cliquez sur 'Analyser batch' pour lancer la séquence d'échantillon sur l'ICP-MS, qui attendra avec l'acquisition de données jusqu'à ce qu'elle soit déclenchée par la première impulsion laser (voir SI S5 pour plus de détails sur la configuration de la gâchette).
- Dans le logiciel LA, sélectionnez toutes les lignes à analyser et vérifiez que la méthode ICP-MS («Est. Sampling Time», voir 4.2.6.) correspond à la durée des ablations de ligne individuelles, qui est généralement différente pour les échantillons de gel, les normes et les blancs de méthode. Répétez 4.2.6. pour ajuster la méthode ICP-MS si nécessaire.
- Cliquez sur' Emission' dans la fenêtre 'Laser Energy' pour recharger la tête laser, puis cliquez sur 'Run' pour ouvrir la fenêtre 'Run Experiment'. Ici, sélectionnez «Modèles sélectionnés seulement», réglez le « délai delavage» à 20-30 s, cochez la case « Activer le laser pendantles scans» et réglez le «temps d'échauffementlaser » à 10 s.
- Cliquez sur «Exécuter» dans la fenêtre «Exécuter l'expérience» pour commencer l'analyse de balayage en ligne et surveiller l'intensité brute du signal en nombre par seconde (cps) pour chaque isotope de l'ICP-MS en temps réel. Chaque ligne doit démarrer ('Laser Warmup Time', 10 s) et se terminer ('Washout Delay', 20-30 s) avec un gaz vide.
- Surveillez la fluence laser (J cm-2) pendantl'analyse pour évaluer la stabilité du laser. Si la fluence varie en grande partie, interrompez l'analyse et vérifiez que la source laser et/ou son système miroir sont entièrement fonctionnels.
- Après l'analyse, arrêter le plasma ICP-MS et définir le débit de gaz porteur sur le système LA à 0 mL min-1. Retirer les gels de la cellule d'ablation et les conserver dans des sacs zippés pour une utilisation plus complète.
Figure 6 : Schéma de la conception expérimentale de la DGT LA-ICP-MS (à ne pas mettre à l'échelle). L'illustration représente l'échantillonnage soluté in situ basé sur le DGT dans la rhizosphère et la cartographie LA-ICP-MS de la distribution du soluté sur la surface du gel, y compris un gros plan montrant des dimensions et des paramètres exemplaires de balayage de ligne. Notez que le gel DGT est retourné horizontalement lorsqu'il est transféré du sol rhizosphère sur la plaque de verre, comme l'indique la position du rectangle dans le coin inférieur du gel DGT. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Traitement et étalonnage des données
- Importer le fichier de données brutes (.xl) pour chaque ligne ablated dans le logiciel de feuille de calcul (Tableau des matériaux). Le tableau de données brutes montre les lectures ICP-MS (points de données) pour chaque isotope dans cps et les points de temps correspondants en s. Énumérez toutes les lignes les unes à côté des autres dans différentes colonnes.
- Évaluer les données de balayage en ligne pour la stabilité du signal de la norme interne(13C) et les temps de lavage adéquats.
- Calculer un blanc de gaz moyen pour chaque isotope à partir de toutes les valeurs vierges de gaz enregistrées avant les ablations de la ligne (c.-à-d. pendant le temps d'échauffement au laser) et soustraire le gaz moyen vide des intensités brutes correspondantes pour chaque isotope à corriger pour le signal de fond.
- Appliquer la normalisation interne en divisant l'intensité du signal de chaque isotope (cps) par l'intensité du signal de la norme interne (cps) pour chaque point de données afin de corriger les variations de la quantité de dérive ablated et instrumentale du matériau.
- Recadrer les données avant le début et après la fin de chaque ligne ablated pour supprimer le signal d'arrière-plan. Transposez le tableau de données pour obtenir une matrice de grille où chaque ligne correspond à une ligne ablated et à chaque colonne à une valeur normalisée d'intensité isotopique. Séparez les matrices de chaque isotope en feuilles de travail individuelles.
- Calculer le rapport normalisé moyen d'intensité du signal par isotope pour les normes d'étalonnage et l'étalonnage vierge et calculer la fonction d'étalonnage (y = ax + b) à l'aide d'un modèle de régression linéaire avec les charges d'analyte standard gel (μg cm-2; voir SI S4) comme x-valeurs. Évaluer la fonction d'étalonnage de chaque isotope pour la linéarité47.
- Appliquez la fonction d'étalonnage à la matrice de données de l'échantillon. Convertir les ratios normalisés d'intensité du signal,
en gel analyte charges, 
(μg cm-2), et par la suite en flux solutés moyenne dans le temps, 
(pg cm-2 s-1), pour chaque isotope et point de données selon Eq. 4 et Eq. 5:
Ici, a est la pente de la ligne d'étalonnage, b est l'interception de la ligne d'étalonnage, et t (s) est le temps de déploiement de gel pendant l'échantillonnage soluté. - Enregistrez la matrice de données d'échantillon calibrée pour chaque analyte sous forme de fichier txt.
- Génération d'images
REMARQUE : Assurez-vous d'éviter toute opération d'interpolation des pixels à toutes les étapes de la génération d'images, car cela peut conduire à des gradients de flux soluté lissés artificiellement dans les images qui en résultent.- Importez la matrice de données d'échantillon calibrée (.txt) comme image de texte dans le logiciel d'analyse d'image (Tableau des matériaux).
- Calculer la distance par pixel en direction x (c.-à-d. résolution latérale) en multipliant la vitesse de balayage laser avec la durée totale du cycle de balayage ICP-MS (p. ex., en supposant une vitesse d'analyse de 200 μm s-1 et une durée totale du cycle de balayage de 0,25 s, la résolution latérale équivaut à 50 μm). La distance par pixel dans la direction y équivaut à la distance interlienne (figure 6).
- Calculez le facteur de correction du rapport d'aspect de l'image. Par conséquent, divisez la distance par pixel dans la direction y (p. ex., 300 μm) par la distance par pixel dans la direction x (p. ex., 50 μm). Appliquez le facteur de correction y/x obtenu (dans cet exemple 6) sous« Échelle». Appliquez la distance par pixel (en μm ou mm) dans la direction x comme mise à l'échelle sous «Échelle définie».
- Appliquez une «table de recherche» c'est-à-dire une échelle pseudo-couleur pour une meilleure visualisation des gradients chimiques dans l'image solutée et ajustez l'équilibre des couleurs de l'image pour contrôler les limites inférieures/supérieures de la plage d'affichage. Ajoutez une barred'étalonnage etenregistrez l'image solutée sous forme de fichier tiff.
- Copiez l'image solutée à l'aidede la commande « Copier-système» dans le logiciel d'analyse d'image et coller dans un logiciel d'édition de bureau ( Table ofMaterials). Scale-match, aligner et composer l'image solutée avec la photo du ROI obtenu en 3.1.7.
REMARQUE : Avant de copier, resize l'image solutée par exemple, facteur 10 via l'application d'une «échelle X» de 10 et d'une «échelle Y» de 10 sous « échelledéfinie» pour assurer des pixels suffisants pour la publication haute résolution.
en gel analyte charges, 
(μg cm-2), et par la suite en flux solutés moyenne dans le temps, 
(pg cm-2 s-1), pour chaque isotope et point de données selon Eq. 4 et Eq. 5:
| Fabrication de gel DGT | Culture de plantes | Échantillonnage soluté in situ | Cartographie du flux soluté LA-ICP-MS |
| HR-MBG (en) 1 semaine |
Préparation du sol 1 semaine |
Application gel 1 heure par gel |
Préparation de l'échantillon 1 heure par gel |
| HR-ABG (en) 3 jours |
Assemblage rhizotron 2 heures par réplique |
Période d'échantillonnage soluté variable, généralement 24 heures |
Analyse LA-ICP-MS 1 jour par gel |
| HR-CBG (en) 3 jours |
Croissance des plantes dépendant de l'étude |
Récupération de gel 1 heure par gel |
traitement des données 4 heures par gel |
| Séchage du gel 2-3 jours |
Génération d'images 10 min par image |
Tableau 1 : Temps approximatifs pour les étapes générales de la technique DGT LA-ICP-MS.
Representative Results
Afin de démontrer la capacité et le détail des données de la méthode d'imagerie DGT, nous avons compilé la distribution en flux 2D sous-mm de plusieurs espèces d'éléments nutritifs labiles et de solutés contaminants dans le sol adjacent aux racines de Fagopyrum esculentum et de Salix smithiana (figure 7). Les délais approximatifs pour les étapes procédurales générales du protocole sont présentés au tableau 1.
Les images solutées de la figure 7 ont été générées dans trois études différentes à l'aide de gels liants HR-MBG ou HR-CBG. Les images chimiques montrent la distribution du flux soluté 2D à une résolution spatiale de 82-120 μm le long de l'axe x et de 300 à 400 μm le long de l'axe Y, selon les paramètres LA-ICP-MS utilisés. Étant donné qu'aucune interpolation n'a été appliquée pendant l'étalonnage et le resizing de l'image, les pixels simples représentent des points de données mesurés. L'alignement des images solutées avec une image photographique du retour sur investissement révèle que la distribution de flux soluté sous-mm et 2D de différents éléments est très variable selon la structure du sol et la morphologie des racines. Ceci peut être attribué au comportement biogéochimique différentiel des éléments dans le système sol-rhizosphère-plante, et à leur interaction avec la matrice du sol et les racines des plantes.
Dans la figure 7A labile inorganique Mg, Al, P, Mn et Fe solute flux ont été visualisés autour d'une jeune racine F. esculentum cultivée dans un sol sans carbonate fertilisé avec NH4NO3. La distribution solutée sub-mm a montré des zones de flux diminués d'Al, P et Fe le long des sections plus anciennes de racine dues à l'absorption de racine, et des flux fortement accrus de Mg, d'Al, de P, de Mn et de Fe au sommet de racine dû aux processus localisés de mobilisation de P de la racine de F. esculentum. Notez que l'extrémité de la racine est située un peu derrière la surface du sol et donc à peine visible dans l'image photographique. La figure 7B montre la distribution de métaux traces de labile, y compris Mn, Fe, Zn, Cd et Pb autour d'une racine de S. smithiana tolérant aux métaux cultivée dans un sol modérément contaminé par le Zn, le Cd et le Pb. Les images solutées visualisent l'épuisement distinct en particulier de Zn, Cd et Pb à la position racine immédiate, montrant que les racines de S. smithiana agissent comme un évier localisé pour les métaux traces labile dans le sol contaminé. En outre, des augmentations localisées du flux Zn, Cd et Pb peuvent être observées, ce qui indique l'accumulation de ces métaux traces à l'interface sol-racine immédiate.
En plus de l'imagerie soluté multi-élémentaire, la méthode présentée peut également être combinée avec des techniques complémentaires d'imagerie basée sur la diffusion telles que les optodes planaires34. Ceci est démontré dans la figure 7C, où la distribution de métaux traces labile dans la rhizosphère de S. smithiana a été co-localisée avec la distribution du pH à l'aide d'un combiné, un seul couche planaire optode-DGT gel liant la cation33. Le substrat du sol a été fertilisé avec (NH4)2SO4, conduisant à une diminution du pH le long des axes racinaires d'environ 1 unité par rapport au sol en vrac. Les diminutions de pH ont été co-localisées avec des flux solutés accrus de Mn, Fe, Co, Ni, Cu et Pb, suggérant la solubilization en métal pH-induite.
De plus, ces exemples de résultats montrent certains des artefacts d'imagerie potentiels qui peuvent être obtenus. Par exemple, les inhomogènes structurales du sol, p. ex., observées comme ligne horizontale dans le tiers inférieur de l'image roi de la figure 7A,peuvent causer des discontinuités de contact sol-gel, ce qui entraîne une diffusion limitée à cet endroit dans le gel liant. Inversement, un compactage excessif du sol dans le rhizotron peut entraîner une mauvaise porosité entraînant un déplacement artificiel du statut redox du sol vers l'anoxie. Ceci est illustré dans la figure 7B, où de vastes zones de flux Mn et Fe très élevés dans les images solutées visuellement assorties à une couche dense de sol dans l'image roi. Ceci suggère un potentiel diminué de redox de sol dû au compactage élevé de sol, ayant pour résultat la dissolution réductrice et la solubilization des éléments fortement redox-sensibles. Il est donc recommandé de remplir soigneusement le rhizotron et d'inspecter visuellement la surface du sol directement après le remplissage.
Figure 7 : Distribution sous-mm 2D d'espèces de solutés nutritifs et contaminants labiles entre différentes interfaces sol-racines. (A) Distribution de P anionique et cationic Mg, Al, Mn, et Fe solutes autour d'une jeune racine F. esculentum. L'échantillonnage co-localisé des solutés anioniques et cationiques a été réalisé à l'aide de HR-MBG pendant 24 h à une saturation en eau du sol d'environ 75 % de WHC. Les images Al, P et Mn sont affichées sous forme de valeurs calibrées fDGT (pg cm-2 s-1),tandis que les images mg et fe montrent 13intensités normalisées en C. La barre d'échelle représente 1 cm. Ce chiffre est adapté de l'arbitre48. (B) Distribution de Mn, Fe, Zn, Cd et Pb autour d'une racine de S. smithiana cultivée dans un sol modérément contaminé par des solutés en métal traces Zn, Cd et Pb. Cationic ont été échantillonnés à l'aide de HR-CBG pendant 20 h à une saturation en eau du sol d'environ 80 % de WHC. Toutes les images sont affichées sous forme de valeurs dgtcalibrées f (pg cm-2 s-1). La barre d'échelle représente 0,5 cm. Ce chiffre est adapté de l'arbitre3. (C) La distribution du pH et de multiples solutés cationiques autour des racines de S. smithiana cultivées dans le sol piquée avec cd. La co-localisation de la dynamique du pH et du soluté a été réalisée à l'aide d'une modification du protocole HR-MBG, permettant un échantillonnage soluté simultané et une imagerie optode planaire33. Les images Mn, Cu, Zn et Cd sont affichées sous forme de valeurs de DGT calibrées f (pg cm-2 s-1),tandis que les images Fe, Co, Ni et Pb montrent 13intensités normalisées en C. La barre d'échelle représente 1 cm. Ce chiffre est adapté de l'arbitre33. Les chiffres présentés sont reproduits à partir des articlescités 3,33,48 sous licence CC BY. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Dossier supplémentaire 1. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Le protocole d'imagerie soluté présenté ici est une méthode polyvalente pour visualiser et quantifier les flux 2D d'éléments nutritifs et de contaminants dans les environnements sol-plantes. Il est unique dans sa capacité à générer des images à l'échelle submm multi-éléments d'espèces de soluté labile à l'interface sol-racine, dépassant la résolution spatiale réalisable des méthodes alternatives pour mesurer les gradients solutés dans la rhizosphèreconsidérablement 4. L'approche d'échantillonnage in situ ciblée de la DGT, combinée à une méthode d'analyse chimique hautement sensible comme la LA-ICP-MS, facilite l'étude détaillée de la dynamique du flux soluté autour des racines individuelles des plantes cultivées dans le sol ou dans des substrats similaires. En raison du processus d'échantillonnage basé sur l'évier, les images obtenues reflètent la labilité des solutés visualisés, et sont donc une estimation de leur disponibilité végétale10. Bien que la mesure inhérente à la méthode des flux solutés présente des avantages considérables comme l'interprétabilité en tant que fractions nutritives disponibles pour les plantes, les mesures du flux sont beaucoup moins directes à comprendre que les mesures de la concentration d'eau de pore. La géométrie d'échantillonnage standard de la DGT dans les applications de sol en vrac (en particulier les gels de diffusion de 0,8 mm d'épaisseur utilisés dans cette configuration) permet de comparer la concentration réelle d'eau pore, csoln,et une estimation de la concentration moyenne de porewater par une mesure en vrac du DGT, cDGT, et pour l'interprétationde ces paramètres concernant la dynamique de réapprovisionnement d'une espèce de soluté. Toutefois, une telle comparaison ne peut pas être faite sur la base de l'application d'imagerie DGT avec des couches de diffusion très minces, car les valeurs dérivées cDGT sontirréalistement petites 34. Les résultats de l'imagerie DGT ne sont donc pas toujours simples et rapides à interpréter et ne sont souvent pas directement comparables aux mesures plus conventionnelles de la concentration d'eau de pore.
Lors de l'application de la méthode, quelques étapes critiques doivent être soigneusement examinées, principalement liées au remplissage et à l'arrosage des contenants de croissance rhizotron. Lors du remplissage du sol dans le rhizotron, il est très important d'éviter de trop compacter le sol, car les racines des plantes ne peuvent pas pénétrer le sol fortement compacté et la croissance des racines sera inhibée. Nous avons observé des racines en évitant le sol fortement compacté et en cultivant le long des bords intérieurs du récipient de croissance rhizotron, où le sol est généralement moins compacté. Dans ce cas, les racines individuelles situées au centre des rhizotrons, où les gels DGT peuvent être appliqués commodément, peuvent ne pas se développer du tout, inhibant efficacement l'application réussie de gel. Dans notre laboratoire, l'expérience a montré que les densités en vrac du sol sec de 1,0-1,4 g cm-3 permettent le développement des racines sans entraves. De plus, le compactage excessif du sol est également une source potentielle d'artefacts concernant la solubilité des éléments sensibles aux redox et des espèces associées à la biogéochimie. Au fur et à mesure que le volume total des pores est réduit et que la distribution du diamètre des pores est déplacée vers des diamètres inférieurs dans un sol fortement compacté, un volume de pore de plus grand diamètre rempli d'air est disponible, ce qui peut entraîner des conditions réductrices localement. Par conséquent, les oxydes MnIII/IV- et FeIII- peuvent être réduits, ce qui entraîne une augmentation des flux Mn2+ et Fe2+. La dissolution des oxydes fe, qui sont d'importants sites de sorption, par exemple pour le phosphate et les micronutriments, peut libérer des espèces sorbées et/ou coprécipitées et ainsi provoquer des flux artificiellement élevés des espèces associées à la biogéochimie. Un problème semblable peut survenir si les contenants de croissance sont trop arrosés. L'évaporation par l'intermédiaire de la petite surface du sol au sommet du récipient de croissance est faible et le sol peut rester saturé d'eau jusqu'à plusieurs semaines après la plantation, ce qui peut également causer des artefacts redox.
Une autre considération importante est la fonctionnalité chimique du gel de liaison HR-DGT fabriqué. En suivant le protocole, des gels minces avec une distribution homogène des phases de liaison sont obtenus. Si les gels ont des zones de distribution de matériaux inhomogènes (p. ex., trous dans le gel ou les agrégats des phases de liaison), ces zones doivent être enlevées ou, si elles sont trop étendues, le protocole de fabrication du gel doit être répété. S'il est préparé correctement, le gel doit être en mesure de lier les espèces cibles de soluté qui diffusent dans le gel immédiatement etquantitativement 27, qui est déterminée par la capacité de liaison gel spécifique à l'analyte. Bien que le dépassement de la capacité de gel soit moins problématique dans les sols non contaminés, il devrait être envisagé dans les sols contaminés par les métaux et les milieux salins du sol. La saturation des phases de liaison du gel nuira non seulement à l'échantillonnage quantitatif du soluté, mais entraînera également la diffusion latérale de solutés entre les phases de liaison du gel, ce qui entraînera une localisation indéfinie des entités de flux soluté à petite échelle. Ainsi, si des quantités très élevées d'espèces nutritives/contaminantes de labile sont attendues dans l'environnement du sol cible, des tests préliminaires devraient être effectués. Pour estimer les charges prévues de DGT, l'échantillonnage en vrac des pistons DGT du sol, suivi de l'élitution du gel et de l'analyse des produits chimiqueshumides, peut être appliqué 15,49. Si nécessaire, les temps de déploiement de la DGT peuvent être ajustés pour réduire le temps de contact avec le gel et ainsi éviter la saturation en gel au-dessus des seuils de capacité. Inversement, des tests préliminaires peuvent également être utiles pour identifier les temps de contact requis en gel et/ou les sensibilités LA-ICP-MS si des charges solutées très faibles sont attendues, ce qui peut être important pour cartographier les solutés des oligo-éléments aux niveaux naturels de fonddu sol 15. En outre, le bon fonctionnement du gel DGT doit être vérifié avant son application expérimentale par le chargement contrôlé de gels dans la préparation des normes d'étalonnage DGT LA-ICP-MS. La norme de gel fournit une charge d'analyte de gel de référence appariée par matrice qui peut être utilisée pour évaluer si la charge de gel d'échantillon déterminée par LA-ICP-MS se trouve dans la plage prévue. S'il n'est pas en mesure d'obtenir un signal différent du bruit de fond blanc du gaz et de la méthode, l'exploitant doit s'assurer que les procédures de laboratoire pour l'analyse des oligo-éléments ont été mises en œuvre et que toutes les étapes du protocole ont été effectuées correctement. Parfois, le gel DGT est accidentellement retourné après l'échantillonnage soluté avec le côté chargé exposé au sol face à la plaque de verre plutôt que le faisceau laser, ce qui entraîne de faibles intensités de signal et des caractéristiques retournées par erreur dans les images finales de flux soluté.
Au cours de l'analyse LA-ICP-MS, une grande quantité de données est générée, ce qui prend beaucoup de temps à évaluer. Dans notre laboratoire, nous utilisons des scripts d'évaluation de données à l'interne adaptés à notre format de sortie de données cible à l'aide d'un logiciel standard de feuille de calcul. Après le tri et l'étalonnage semi-automatisés, le traçage d'images est effectué à l'aide d'outils d'analyse d'images open source et open access (ImageJ, Fiji50). Cette approche permet un contrôle total sur le tri, l'évaluation et la présentation des données, ce qui est essentiel parce que les données collectées correspondent à des pixels rectangulaires et non quadratiques, qui doivent être correctement affichés dans les cartes solutées générées. De plus, lors du traitement des données, toute interpolation des pixels doit être soigneusement évitée. L'interpolation des pixels conduit à des gradients lissés dans les images chimiques, ce qui entraîne des caractéristiques de distribution d'éléments adoucies, souvent circulaires, et est donc une altération indésirable des données d'origine. L'interpolation des pixels est une procédure standard de re-mise à l'échelle et de re-mise en forme des opérations dans de nombreux produits logiciels de traitement d'image, mais peut être désélectionnée habituellement.
En conclusion, la méthode décrite est un progrès significatif pour comprendre la dynamique des nutriments et des contaminants dans les systèmes naturels sol-rhizosphère-plantes. En plus des applications DGT uniquement, la méthode peut être combinée avec d'autres techniques d'imagerie basées sur la diffusion comme les optodes planaires3,33,42,43,48,51 et la zymographie20,21,22,23,24, et peut être développée davantage pour inclure des éléments supplémentaires et des paramètres du sol.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été cofinancée par le Fonds autrichien pour la science (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) et le Fonds autrichien pour la science (FWF) et l'Etat fédéral de Basse-Autriche: P27571-BBL (Jakob Santner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
| Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
| Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
| Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
| Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
| Clamp | Local warehouse | n/a | |
| Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
| DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
| DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
| Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
| Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
| Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
| Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
| Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
| High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
| HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
| Horizontal shaker | GFL | 305 | |
| HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
| ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
| Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
| Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
| LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
| LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
| Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
| Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
| Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
| Overhead shaker | GFL | 3040 | |
| Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
| pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
| pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
| Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
| Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
| Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
| Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
| PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
| PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
| PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
| Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
| Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
| Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
| Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
| Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
| Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
| Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
| Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
| Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
| ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |
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