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Visualizzazione bidimensionale e quantificazione di labile, nutrienti vegetali inorganici e contaminanti nel suolo

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61661
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

Summary

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro per la visualizzazione 2D sub-mm di più specie di nutrienti inorganici labili e soluti contaminanti utilizzando gradienti diffusivi in pellicole sottili (DGT) combinati con l'imaging della spettrometria di massa. Il campionamento del soluto e l'analisi chimica ad alta risoluzione sono descritti in dettaglio per la mappatura quantitativa dei soluti nella rizosfera delle piante terrestri.

Abstract

Descriviamo un metodo per la visualizzazione bidimensionale (2D) e la quantificazione della distribuzione di nutrienti inorganici labili (cioè reversibilmente adsorbiti) (ad esempio, P, Fe, Mn) e contaminanti (ad esempio, As, Cd, Pb) specie di soluto nel terreno adiacente alle radici delle piante (la 'rizosfera') a risoluzione spaziale sotto millimetro (~100 μm). Il metodo combina il campionamento del soluto a base di lavandino mediante i gradienti diffusivi nella tecnica delle pellicole sottili (DGT) con l'analisi chimica risolta spazialmente mediante spettrometria di massa plasmatica accoppiata induttivamente all'ablazione laser (LA-ICP-MS). La tecnica DGT si basa su idrogel sottili con fasi di legame aliticamente selettive distribuite in modo omogeneo. La varietà di fasi di rilegatura disponibili consente la preparazione di diversi tipi di gel DGT seguendo semplici procedure di fabbricazione del gel. Per l'impiego di gel DGT nella rizosfera, le piante vengono coltivate in contenitori di crescita piatti e trasparenti (rizotroni), che consentono un accesso invasivo minimo a un sistema radicale coltivato nel suolo. Dopo un periodo di pre-crescita, i gel DGT vengono applicati a regioni selezionate di interesse per il campionamento del soluto in situ nella rizosfera. Successivamente, i gel DGT vengono recuperati e preparati per successive analisi chimiche dei soluti legati utilizzando l'imaging line-scan LA-ICP-MS. L'applicazione della normalizzazione interna con 13C e la calibrazione esterna utilizzando standard di gel abbinati a matrice consentono ulteriormente la quantificazione dei flussi di soluto 2D. Questo metodo è unico nella sua capacità di generare immagini 2D quantitative su scala sub-mm di flussi di soluto multi-elemento in ambienti suolo-pianta, superando la risoluzione spaziale raggiungibile di altri metodi per misurare sostanzialmente i gradienti di soluto nella rizosfera. Presentiamo l'applicazione e la valutazione del metodo per l'imaging di più specie di soluto cationico e anionico nella rizosfera delle piante terrestri ed evidenziamo la possibilità di combinare questo metodo con tecniche complementari di imaging del soluto.

Introduction

L'acquisizione di nutrienti da parte delle piante coltivate è un fattore chiave per determinare la produttività delle colture. I processi che regolano l'assorbimento efficiente dei nutrienti da parte delle colture sono stati studiati intensamente, in particolare i meccanismi che controllano la disponibilità di nutrienti e l'internalizzazione dei nutrienti da parte delle radici delle piante nell'interfaccia suolo-radice, la rizosfera, sono riconosciuti per il loro ruolo nell'acquisizione dei nutrienti delle colture. I processi importanti per l'assorbimento dei nutrienti vegetali includono: trasporto di nutrienti verso la radice; equilibri dinamici di assorbimento tra le specie disciolte nell'acqua dei pori del suolo e le specie legate a superfici solide del suolo; competizione microbica per i nutrienti; mineralizzazione microbica dei nutrienti contenuti nella materia organica del suolo; e l'internalizzazione dei nutrienti nel simplasma radicale. L'assorbimento di contaminanti inorganici in metallo traccia (oid) è in gran parte controllato dagli stessi meccanismi.

A seconda della disponibilità di nutrienti e contaminanti, della domanda e della diffusività delle piante nel suolo, è possibile osservare modelli nutritivi differenziali nella rizosfera. Per elementi fortemente assorbenti con tassi di internalizzazione relativamente elevati (ad esempio, P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), si trova l'esaurimento della frazione dell'elemento labile (cioè reversibilmente adsorbito) rispetto al terreno sfuso, con larghezze della zona di esaurimento spesso ≤1 mm, mentre per nutrienti più mobili come NO3-, le zone di esaurimento possono estendersi fino a diversicentimetri 1. Inoltre, l'accumulo di elementi come Al e Cd è stato osservato quando la disponibilità supera i tassi di assorbimento degliimpianti 2,3.

Data l'importanza dei processi della rizosfera nel ciclo dei nutrienti e dei contaminanti, sono state sviluppate diverse tecniche per misurare la frazione di elementi disponibile per le piantead alta risoluzione spaziale 4,5. Tuttavia, misurare distribuzioni di soluti labili su piccola scala si è dimostrato impegnativo per diversi motivi. Una delle maggiori difficoltà è campionare volumi molto piccoli (bassa gamma di μL) di suolo e/o acqua di poro in posizioni definite adiacenti alle radici delle piante viventi per risolvere i ripidi gradienti nutritive nella rizosfera. Un approccio per affrontare questo problema è quello di utilizzare coppe di micro-aspirazione per l'estrazione di campioni di acqua poro6. Con questo metodo, A. Göttlein, A. Heim e E. Matzner7 misuravano le concentrazioni di nutrienti nell'acqua dei pori del suolo in prossimità delle radici di Quercus robur L. ad una risoluzione spaziale di ~1 cm. Una difficoltà nell'analizzare i volumi μL della soluzione del suolo o del suolo è che questi piccoli volumi di campioni, in combinazione con le basse concentrazioni di tutte le specie nutritive tranne le principali, richiedono tecniche di analisi chimiche altamente sensibili.

Un sistema alternativo, in grado di risolvere i gradienti nutritive a una risoluzione fino a ~ 0,5 mm, è quello di far crescere un tappetino sulla superficie di un blocco di terreno, con un sottile strato di membrana idrofila che separa ilterreno dalle radici 8,9. In questa configurazione, i soluti possono passare attraverso la membrana e le radici possono assumere nutrienti e contaminanti dal terreno mentre gli essudati delle radici possono diffondersi nel terreno. Dopo la creazione di uno strato di radice denso, il blocco del suolo può essere campionato e tagliato a campioni di terreno ottenuti per la successiva estrazione di frazioni di elementi. In questo modo, è possibile analizzare i nutrienti unidimensionali e i gradienti contaminanti, medi su un'area relativamente grande (~ 100 cm2).

Un'altra sfida consiste nell'ottenere campioni della frazione di elemento labile disponibile nelle piante, poiché la maggior parte delle tecniche chimiche di estrazione del suolo funzionano in modo molto diverso rispetto ai meccanismi con cui le piante assovono nutrienti e contaminanti. In molti protocolli di estrazione del suolo, il terreno viene mescolato con una soluzione estrattiva con l'obiettivo di stabilire un (pseudo-)equilibrio tra frazione di elementi disciolti e sorbiti. Tuttavia, le piante interiorizzano continuamente i nutrienti e, quindi, spesso esaurono progressivamente il suolo della rizosfera. Sebbene i protocolli di estrazione dell'equilibrio siano stati ampiamente adottati come test del suolo in quanto facili da implementare, la frazione nutritiva estratta spesso non rappresenta bene la frazione nutritiva disponibile per lepiante10,11,12,13. I metodi di assorbimento che esaurivano continuamente il terreno campionato per i nutrienti sono stati proposti come metodi vantaggiosi e possono assomigliare meglio al meccanismo di assorbimento dei nutrienti sottostante imitando i processi diassorbimento delle radici 10,11,14,15.

Oltre ai metodi sopra descritti, sono state sviluppate vere e proprie applicazioni di imaging, in grado di misurare mappe di parametri continui con risoluzioni ≤100 μmattraverso campi visivi di diversi cm 2 per elementi specifici e parametri (bio)chimicidel suolo 5. L'autoradiografia può essere utilizzata per immaginare la distribuzione degli elementi nella rizosfera a condizione che siano disponibili radioisotopiadatti 16. Gli optodi planari consentono la visualizzazione di importanti parametri chimici del suolo come pH e pO217,18,19e l'attività enzimatica o le distribuzioni totali delle proteine possono essere mappati utilizzando tecniche di imaging di indicatori fluorescenti come la zimografia delsuolo 20,21,22,23 e / o metodi di soffiatura delle radici24. Mentre la zimografia e l'autoraitografia sono limitate alla misurazione di un singolo parametro alla volta, l'imaging pH e pO2 usando optodi planari può essere fatto contemporaneamente. Le tecniche più tradizionali del tappetino radice forniscono solo informazioni 1D, mentre le coppe di micro aspirazione forniscono misurazioni dei punti o informazioni 2D a bassa risoluzione, tuttavia entrambi gli approcci consentono l'analisi multi-elemento. Più recentemente, P. D. Ilhardt, etal.

L'unica tecnica in grado di campioare in modo mirato 2D più soluti nutritivi e contaminanti ad alta risoluzione spaziale sono i gradienti diffusivi nella tecnica delle pellicole sottili (DGT), un metodo di campionamento a base di lavandino che immobilizza le specie di labile trace metal (loid) in situ su un materiale legante incorporato in uno strato di idrogel26,27. La DGT è stata introdotta come tecnica di speciazione chimica per la misurazione dei soluti labili nei sedimenti e nelle acque, ed è stata presto adottata per il suo utilizzo nei suoli28. Consente l'imaging di soluto multi-elemento in scala sub-mm, che è stato inizialmente dimostrato in un sedimentofluviale 29,ed è stato ulteriormente sviluppato per la sua applicazione nelle rizosferevegetali 30,31,32,33.

Per il campionamento DGT, un foglio di gel di dimensioni di circa 3 cm x 5 cm viene applicato su una singola radice vegetale che sta crescendo nello strato superficiale di un blocco di terreno, con una membrana idrofila che separa il gel dal terreno. Durante il tempo di contatto, i nutrienti labili e/o contaminanti si diffondono verso il gel e sono immediatamente legati dal materiale legante incorporato nel gel. In questo modo, un gradiente di concentrazione, e quindi un flusso netto continuo verso il gel viene stabilito e prevalso durante il tempo di campionamento. Dopo il campionamento, l'idrogel può essere rimosso e analizzato utilizzando una tecnica chimica analitica che consente un'analisi risolta spazialmente. Una tecnica altamente specializzata e frequentemente utilizzata a questo scopo è la spettrometria di massa plasmatica accoppiata induttivamente all'ablazione laser (LA-ICP-MS). In alcuni primi studi, è stata utilizzata anche l'emissione di raggi X indotta da micro particelle (PIXE)29. Il campionamento DGT combinato con l'analisi LA-ICP-MS consente l'imaging chimico multi-elemento a una risoluzione spaziale di ~ 100 μm. Se si impiegano tecniche ICP-SM altamente sensibili (ad esempio, PIC-SM sul campo di settore), è possibile ottenere limiti di rilevamento eccezionalmente bassi. In uno studio sull'effetto della liming sull'assorbimento di Zn e Cd da parte del mais15, siamo stati in grado di mappare cd labile nella rizosfera di mais in terreno incontaminato con un limite di rivelazione di 38 pg cm-2 di Cd per area gel. La DGT, gli optodi planari e la zimografia si basano sulla diffusione dell'elemento bersaglio dal suolo in uno strato di gel, che può essere sfruttato per l'applicazione combinata di questi metodi al fine di immaginare contemporaneamente, o consecutivamente, un gran numero di parametri rilevanti per l'assorbimento di nutrienti e contaminanti vegetali. Informazioni dettagliate sugli aspetti chimici analitici dell'imaging DGT, sul potenziale di combinazione della DGT e di altri metodi di imaging e sulle sue applicazioni sono esaminate in modo completo nellarif.

In questo articolo descriviamo come eseguire un esperimento di imaging del soluto utilizzando la tecnica DGT sulle radici delle piante terrestri in un ambiente del suolo insaturo, tra cui coltivazione di piante, fabbricazione di gel, applicazione di gel, analisi del gel e generazione di immagini. Tutti i passaggi sono elaborati in dettaglio, comprese le note sui passaggi critici e le alternative sperimentali.

Protocol

1. Fabbricazione di gel DGT

NOTA: Diversi tipi di gel DGT sono disponibili per l'imaging 2D di specie di soluto labile ad alta risoluzione spaziale (sub-mm)35. Qui, la fabbricazione di tre gel leganti ad alta risoluzione ben caratterizzati (HR)-DGT utilizzati nelle applicazioni di imaging del soluto è brevemente riassunta. Le procedure di laboratorio per l'analisi degli oligoelementi, nonché le procedure di fabbricazione dettagliate di tutti i gel HR-DGT presentati sono descritte nelle sezioni Support Information (SI) S1 e S2.

  1. Gel di legame misto a base di poliuretano e catione (HR-MBG; SI S2.1)31
    1. Preparare una sospensione in gel di poliuretano con fasi di idrossido di zirconio (IV) e iminodiacetato (IDA) omogeneamente disperse.
    2. Rivestire le sospensioni in gel in un film sottile su una piastra di vetro e avviare la formazione di gel per evaporazione del solvente per ottenere un anione misto sottile 0,1 mm e un gel legante a strappo (HR-MBG).
  2. Gel legante anione poliacrilammide-zirconia (HR-ABG; SI S2.2)36
    1. Fabbricare un gel di poliacrilammide cross-linked ad agarosio sottile 0,4 mm (APA) seguendo le procedure di fusione del gelstabilite 37 (vedi SI S2.4 per un protocollo dettagliato della fabbricazione APA).
    2. Precipitare le fasi dell'idrossido di zirconio (IV) nel gel APA prefabbricato per ottenere un gel legante anionico sottile 0,4 mm (HR-ABG).
  3. Gel legante catione poliacrilammide-iminodiacetato (HR-CBG; SI S2.3)38
    1. Preparare una sospensione in gel di poliacrilammide con fasi IDA omogeneamente disperse.
    2. Gettare il gel tra due piastre di vetro e avviare la reazione di polimerizzazione per ottenere un gel legante di catione sottile 0,4 mm (HR-CBG) in cui le fasi IDA sono sistemate su un lato del gel.

2. Coltivazione vegetale

NOTA: Il sistema sperimentale utilizza i rizotroni4 (Figura 1) per coltivare piante in terreni insaturi per l'imaging del soluto. In primo luogo, vengono descritti il riempimento e l'irrigazione del suolo del rizotrone, quindi vengono forniti dettagli sulla crescita sperimentale delle piante. I dettagli sul design del rizotrone e sulla preparazione del substrato del terreno prima di riempirsi nel rizotrone sono presentati nella sezione SI S3.

Figure 1
Figura 1: Progettazione del rhizotron (non in scala). (A) Vista esplosa di un contenitore per la crescita del rizotrone. (B) Rizotrono assemblato durante la crescita delle piante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Riempimento del suolo del rizotrone
    1. Prima di riempire il rizotrone con terreno pre-inumidito (contenuto gravimetrico di acqua, Equation 6 , è noto; vedi SI S3.2), chiudere i fori di irrigazione nella parte posteriore del rizotrone utilizzando nastro adesivo e rimuovere la piastra anteriore e le relative rotaie e viti di fissaggio.
    2. Pesare il rizotrone vuoto (esclusa la piastra anteriore, le rotaie e le viti), otto piastre acriliche da 5 cm x 11 cm e 16 morsetti(tabella dei materiali)e registrare la somma dei pesi.
    3. Attaccare una piccola piastra acrilica nella parte inferiore del rizotrone utilizzando due morsetti su ciascun lato, con la pressione dei morsetti diretti sul telaio del rizotrone, in modo che la piastra non si pieghi verso l'interno e il volume sia costante.
    4. Inclinare leggermente il rizotrone verso la piccola piastra di plastica e riempire con terreno pre-inumidito fino a un'altezza di ~ 4 cm(Figura 2A). Distribuire il terreno all'interno del rizotrone agitando leggermente il rizotrone e comprimere delicatamente il terreno di pochi mm (a seconda delle caratteristiche specifiche del suolo) con uno strumento di compattazione(Figura 2B).
    5. Ripetere 2.1.3 - 2.1.4 fino a quando il rizotrone non è riempito di terreno (Figura 2C). Lasciare uno spazio di ~ 3 cm in alto per la successiva semina di piantine nel rizotrone.
    6. Pesare il rizotrone riempito di terreno (incluse 8 piccole piastre e 16 morsetti) e registrare il peso. Da questo, sottrarre il peso di rizotrone vuoto ottenuto in 2.1.2 e registrare la differenza di peso, cioè la massa del terreno umido, Equation 7 (g), nel rizotrone.
    7. Calcolare la massa del terreno secco nel rizotrone, Equation 8 (g), secondo Eq. 1, quindi calcolare la densità di massa del suolo secco, Equation 9 (g cm-3), nel rizotrone secondo Eq. 2.
      Equation 1
      Equation 2
      Qui, Equation 10 (cm3) è il volume interno totale del rizotrone.
      NOTA: I Equation 9 valori tipici nel rizotrone sono tra 1,0-1,4 g cm-3. Non superare 1,5 g cm-3 poiché la crescita delle radici potrebbe essere impedita al di sopra di questo valore.
    8. Posizionare il rizotrone riempito di terreno su una scatola di supporto e rimuovere tutti i morsetti e le piccole piastre dal rizotrone (Figura 2D). Pulire con cura il telaio del rizotrone (cioè i bordi) utilizzando carta velina, poiché le particelle di terreno rimanenti sul telaio possono causare perdite.
      NOTA: La superficie esposta del suolo deve essere omogenea e livellata con il telaio del rizotrone senza crepe o spazi vuoti. In caso meno, svuotare il rizotrone e ripetere 2.1.2 - 2.1.8.
    9. Tagliare due pezzi di foglio di politetrafluoroetilene (PTFE)(Table of Materials)a 22 cm x 13 cm ciascuno. Inoltre, tagliare un pezzo di foglio di plastica a 46 cm x 15 cm. Registrare la somma dei pesi ptfe e fogli di plastica. Posizionare il primo pezzo di foglio di PTFE sulla metà superiore della superficie esposta del terreno nel rizotrone, estendendosi di ~ 1 cm sul livello del terreno nella parte superiore del rizotrone.
    10. Fissare con cura il foglio PTFE al telaio del rizotrone utilizzando nastro adesivo (Figura 2E). Inizia fissando prima un angolo in cima al rizotrone, seguito dall'angolo opposto e infine dai due angoli più in basso nel rizotron. Applicare la tensione quando si fissano gli angoli 2-4 per garantire una superficie piana del foglio. Se emergono pieghe, aprire e riparare nuovamente il nastro ai singoli angoli (non tutti in una volta) fino a quando tutte le pieghe non vengono rimosse e il foglio PTFE è piatto e contiguo con la superficie del terreno.
    11. Posizionare il secondo pezzo di foglio PTFE all'estremità inferiore del rizotrone, sovrapponendo il pezzo superiore in lamina PTFE di ~1 cm.
    12. Posizionare il foglio di plastica (46 cm x 15 cm) sui fogli PTFE. Fissare il foglio di plastica utilizzando la procedura di fissazione come descritto al 2.1.10.
    13. Posizionare una piastra frontale sul rizotrono pieno di terreno e ricoperto di lamina. Posizionare una rotaia attorno a ciascun lato del rizotrone e stringere le viti a mano per fissare le rotaie e, quindi, la piastra anteriore al rizotrone. Le viti sono posizionate verso il lato chiuso del rizotrone, cioè il lato con i fori di irrigazione(Figura 1A).

Figure 2
Figura 2: Assemblaggio e riempimento del rizotrone per coltivare piante nel suolo per l'imaging del soluto nella rizosfera. (A) Riempimento del suolo nel rizotrone. (B) Compattazione del terreno riempito mediante uno strumento di compattazione. (C) Rizotrone riempito di terreno con piccole piastre e morsetti acrilici. (D) Rizotrono riempito di suolo con superficie esposta del suolo. (E) Rizotrono riempito di suolo parzialmente ricoperto da un foglio protettivo di PTFE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Manipolazione del rhizotron e applicazione del gel DGT. (A) Irrigazione del suolo con punte di pipetta da 10 mL nelle pozza d'acqua nella parte posteriore del rizotrone. (B) Piantagione di piantine (indicate come macchie verdi) nel rizotrono chiuso e riempito di suolo. (C) Rhizotron piantato con talee Salix smithiana e rimosso piatto anteriore e coperchio in lamina di plastica. (D) Staccare con cura il coperchio del foglio PTFE prima dell'applicazione del gel DGT. (E) Foto ad alta risoluzione del ROI dell'interfaccia suolo-radice. (F) Applicazione della piastra frontale dotata del gel DGT sul rizotron. (G) Foto del ROI con il gel DGT applicato durante il campionamento del soluto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Irrigazione del terreno
    1. Determinare la capacità di tenuta dell'acqua (WHC) del terreno sperimentale nel rizotrone. A tal fine, produrre due rizotroni con un fondo aperto e riempirli di terreno come specificato nella sezione 2.1. Saturare completamente questi rizotroni aperti e riempiti di terreno immersione in un contenitore d'acqua per 16 ore e drenare i rizotroni per 8 ore.
    2. Prelevano un campione di terreno composito di ~ 50 g da posizioni casuali nei rizotroni a fondo aperto e asciugate il campione a 105 °C per determinare secondo Equation 6 Eq. S1. Il determinato Equation 6 corrisponde alla WHC del suolo ed è quindi espresso come Equation 11 (g g-1).
    3. Definire il bersaglio Equation 6 nel rizotrone sperimentale. Durante la fase di crescita, impostare un Equation 6 60 % della WHC (cioè il fattore WHC) per fornire agli impianti una quantità adeguata di acqua evitando Equation 12 condizioni anossiche nel rizotrone.
    4. Calcolare la massa totale di acqua da aggiungere, Equation 13 (g), per irrigare il terreno nel rizotrone al bersaglio Equation 6 secondo Eq. 3. Conto della massa d'acqua presente nel terreno nel rizotrone, Equation 14 (g).
      Equation 3
    5. Dividere Equation 13 per il numero di porci d'acqua del rizotrone (qui 14) per ottenere la massa d'acqua da aggiungere in ogni poccio d'acqua. Aggiungere acqua spingendo punte di pipetta da 10 mL nei fori di irrigazione e lasciando che l'acqua fluisca nel terreno per gravità(Figura 3A).
  2. Crescita delle piante
    1. Semi pre-germinati della pianta sperimentale (ad esempio, su carta da filtro bagnata) in base alle specifiche esigenze di germinazione delle sementi fino a quando non emerge il radicolo (lungo fino a 1 cm).
    2. Piantare fino a due piantine nel rizotrone come indicato nella figura 3B. Durante la semina, aggiungere ~ 5 mL di acqua direttamente alle piantine per sostenere la loro crescita. Coprire l'apertura superiore del rizotrone per i primi ~ due giorni dopo la semina con un film trasparente che mantiene l'umidità(Table of Materials). Avvolgere il rizotrone in un foglio di alluminio per prevenire la crescita microfita.
      NOTA: Oltre alle piantine, le talee vegetali possono anche essere coltivate in rizotroni.
    3. Trasferire il rizotrone piantato in una stanza di crescita, con condizioni ambientali (cioè temperatura, umidità, intensità luminosa) impostate sulle specifiche esigenze dell'impianto. Inclinare il rizotrone a 25°-35° per garantire lo sviluppo delle radici lungo la piastra frontale attraverso il gravitropismo.
    4. Durante la crescita delle piante, mantenere gravimetricamente il contenuto d'acqua bersaglio nel rizotrone annaffiando periodicamente ogni 2-4 giorni utilizzando le poggiacatrici di rizotrone come descritto al punto 2.2.5. Mantenere la superficie del terreno all'apertura superiore umida con aggiunte regolari di ~ 5 mL di acqua.
      NOTA: Se le piante vengono coltivate per periodi prolungati e si prevede che la biomassa vegetale diminuirà sostanzialmente la quantità di acqua aggiunta al rizotrone con il metodo proposto, tenere conto del peso della biomassa vegetale coltivando piante in repliche di rizotrone separate e raccogliendo e pesando i tessuti vegetali a intervalli definiti.
    5. Una volta che le radici raggiungono una posizione adatta lungo la piastra frontale, preferenzialmente al centro del rizotrone, applicare i gel DGT per campioare la distribuzione del soluto rizosferico.

3. Campionamento della distribuzione del soluto

  1. Applicazione gel
    1. Aumento Equation 6 del rizotrone dal 60 % Equation 11 all'80 % Equation 11 24 ore prima dell'applicazione del gel come descritto al 2.2.4.-2.2.5. Ciò garantisce un buon contatto suolo-gel e consente la diffusione del soluto nel gel evitando condizioni anossiche del suolo durante il campionamento del soluto.
    2. Prendi una nuova piastra frontale pulita con acido, allineala sul rizotrone utilizzato per il campionamento e contrassegna le regioni di interesse (ROM) sulla piastra. Trasferire la piastra in un banco di flusso laminare o in qualsiasi altro ambiente privo di polvere e metallo, lato non marcato rivolto verso l'alto.
    3. Tagliare il gel legante DGT su un supporto acrilico alla dimensione rettangolare richiesta corrispondente al ROI, di solito circa 3 cm × 5 cm, utilizzando lamette rivestite in PTFE. Tagliare il gel premendo piuttosto che far scorrere la lama del rasoio per garantire un taglio chiaro. Posizionare il pezzo di gel rettangolare sul lato non marcato della piastra nella posizione contrassegnata del ROI.
      NOTA: Se si utilizza HR-MBG, sotto il gel può essere aggiunto un foglio distanziale sottile 100 μm per garantire che il gel sia in buon contatto con il sistema di radici del suolo.
    4. Tagliare una membrana in policarbonato sottile 10 μm (dimensione del poro di 0,2 μm; Tavola dei materiali) ad una dimensione che estende le dimensioni del gel di ≥1 cm su ciascun lato e posizionare la membrana sul gel. Applicare un po 'd'acqua per rimuovere le bolle d'aria dalla pila.
    5. Fissare la membrana lungo tutti e quattro i bordi utilizzando nastro elettrico in vinile(Tabella dei materiali). Nel processo, rimuovere con cura le bolle d'aria intrappolate tra il gel e la membrana utilizzando pinzette di plastica. Il nastro deve entrare in contatto solo con la membrana e non con il gel.
      NOTA: Se il nastro entra in contatto con il gel, le bolle d'aria sono intrappolate tra il gel e la membrana, o la superficie finale della membrana mostra pieghe, la pila gel / membrana deve essere riassemblata poiché il flusso diffusivo di soluti nel gel può esserecompromesso 35 (ripetere 3.1.3 - 3.1.5).
    6. Posizionare il rizotrone su un supporto, rimuovere le rotaie e sollevare con cura la piastra anteriore (Figura 3C). Rimuovere il foglio di plastica, tagliare il foglio PTFE ai bordi del rizotrone e staccare lentamente il foglio PTFE per evitare disturbi del sistema di radici del suolo(Figura 3D).
    7. Scatta una foto ortogonale del ROI utilizzando una fotocamera digitale reflex a obiettivo singolo (DSLR)(Table of Materials)per facilitare l'interpretazione e la presentazione della distribuzione del soluto in base alla struttura del suolo e alla morfologia delle radici(Figura 3E). Utilizzare un supporto per fotocamere e, se disponibile, un obiettivo macro. Allineare la fotocamera in modo che il centro della foto corrisponda al centro del ROI e il piano di messa a fuoco della fotocamera sia parallelo alla superficie del suolo. Includi una barra di scala (ad esempio, un righello) nella foto.
    8. Attaccare la piastra dotata della pila gel/membrana al rizotrone aperto (Figura 3F). Pertanto, allineare un bordo della piastra con un bordo del rizotrone e "piegare" delicatamente la piastra verso il terreno. Questa modalità di applicazione aiuta ad evitare bolle d'aria tra la pila gel / membrana e il sistema di radici del suolo. Fissare la piastra anteriore utilizzando le rotaie e le viti.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale e deve essere eseguito con attenzione. La piastra non può essere spostata dopo aver stabilito il contatto tra la pila gel /membrana e il sistema di radici del suolo senza spostare terreno e radici.
    9. Registrare l'ora di inizio esatta della distribuzione del gel e scattare una foto del gel distribuito al ROI, come indicato nella 3.1.7 (Figura 3G). Avvolgere il rizotrone in un foglio di alluminio e trasferirlo nella sala di crescita fino alla fine del periodo di campionamento del soluto (spesso 24 ore).
  2. Recupero gel
    1. Posizionare il rizotrone su una scatola di supporto, sollevare con cura la piastra anteriore e risciacquare la pila gel/membrana sulla piastra con acqua per lavare via le particelle aderenti(Figura 4A). Registrare l'ora di fine esatta della distribuzione del gel. Campionare il terreno dal ROI per determinare il terreno w effettivo nel rizotrone secondo Eq. S1.
    2. Trasferire la piastra anteriore nella panca di flusso laminare, pila gel/membrana rivolta verso l'alto. Recuperare il gel dalla piastra frontale rimuovendo con cura prima il nastro lungo tutti e quattro i bordi e poi la membrana in policarbonato che copre il gel (Figura 4B). Applicare acqua per aiutare il gel a galleggiare liberamente su un sottile film d'acqua sulla piastra con il lato di contatto del terreno rivolto verso l'alto.
      NOTA: È fondamentale tenere traccia dell'orientamento del gel. Il lato gel esposto al terreno e alle radici deve sempre affrontare (verso l'utente).
  3. Essiccazione del gel
    1. Tagliare un pezzo rettangolare di carta assorbente in gel(Table of Materials)e posizionare un pezzo leggermente più piccolo di una membrana di polieteresolfone (dimensione del poro di 0,45 μm; Tavola dei materiali) sopra.
    2. Trasferire il gel dalla piastra sulla pila di carta/membrana di soffiatura in gel utilizzando pinzette di plastica, lato di contatto con il suolo rivolto verso l'alto. Il gel deve essere rilassato (cioè non allungato) e completamente piatto, senza bolle d'aria tra gel e membrana. Applicare un po 'd'acqua sulla pila di carta e membrana gel blotting per facilitare il trasferimento e il posizionamento del gel.
    3. Coprire completamente la pila di carta/membrana/gel di gel in gel con un foglio di plastica ed etichettare il campione di gel e il suo orientamento sulla lamina di plastica (Figura 4C). Posizionare la pila di carta/membrana/gel/lamina di plastica in un essiccatore di gel sottovuoto(Table of Materials)e asciugare fino a quando la pila non è completamente essiccata (in genere 48-72 h). Per HR-MBG, impostare la temperatura a 50-55 °C, per HR-ABG e HR-CBG meglio asciutti a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere la carta assorbente in gel dalla pila essiccata e trasferire il gel, che ora è inseparabilmente fuso con la membrana in polieteresolfone, in un sacchetto con zip. Il coperchio in lamina di plastica rimane sul gel fino a poco prima dell'analisi LA-ICP-MS.
    5. Includere un pezzo di gel dal foglio di gel originale come un metodo vuoto, che non viene esposto al terreno. Elaborare il gel vuoto del metodo identico al gel campione dopo 3.3.2 - 3.3.4.

Figure 4
Figura 4: Recupero e preparazione del gel DGT per l'essiccazione al momento del campionamento del soluto. (A) Piatto con gel DGT e rizotrone subito dopo il campionamento del soluto. (B) Recupero del gel DGT dalla piastra in un banco di flusso laminare. (C) Pila di carta soffiante in gel/membrana di polietersolfone/gel DGT/coperchio in lamina di plastica per l'essiccazione del gel. Si noti che il gel è leggermente colorato dopo il suo dispiegamento sul suolo della rizosfera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Analisi chimica del gel legante DGT

NOTA: In questo protocollo, l'analisi della distribuzione del soluto sul gel legante DGT viene effettuata da LA-ICP-MS utilizzando un sistema DI eccimeri ArF da 193 nm nanosecondo dotato di una cella di ablazione a due volumi accoppiata a un PIC-MS quadrupolo (Figura 5). Tutti gli strumenti sono elencati nella tabella dei materiali. In alternativa, i sistemi LA a stato solido nanosecondi da 213 nm o 266 nm possonoessere applicati 36,39,40,41,42,43. Se è richiesta una maggiore sensibilità o risoluzione di massa, il campo di settore ICP-MS è un'alternativa al quadrupolo ICP-MS15,44. I dettagli sulla preparazione degli standard gel DGT per la taratura esterna e l'accoppiamento del sistema LA al quadrupolo ICP-MS sono presentati nelle sezioni SI S4 e S5.

Figure 5
Figura 5: Configurazione LA-ICP-MS per l'analisi del gel DGT. (A) Nanosecondo 193 nm ArF excimer LA system e quadrupole ICP-MS. (B)Gel essiccati montati su lastre di vetro e fissati sullo stadio del campione di LA pronti per l'introduzione nella cella di ablazione. (C) Gas nebulizzatore (Ar) da ICP-MS e gas vettore aerosol (He o Ar) da cella di ablazione collegata al PIC tramite uno splitter Y a due vie e un adattatore per torcia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Preparazione di esempio per LA-ICP-MS
    1. Trasferire i campioni di gel essiccati, gli standard e gli spazi vuoti del metodo (che vengono uniti al supporto della membrana in polieteresolfone) su singoli pezzi di nastro adesivo a doppia aspetto(Tavolo dei materiali),lato gel rivolto verso l'alto. Ritagliare le parti del nastro in eccesso per risparmiare spazio nella cella di ablazione.
    2. Montare i gel essiccati su lastre di vetro. Utilizzare singole lastre di vetro per ogni campione di gel, serie standard o vuoto del metodo per consentire una disposizione flessibile sullo stadio del campione di Los Angeles (dimensioni tipiche di 10 cm × 10 cm). Utilizzare un taglia vetro per regolare le dimensioni della piastra di vetro in base alle esigenze. Fissare le lastre di vetro con i gel sullo stadio del campione LA (Figura 5B) utilizzando la plastilina(Tabella dei materiali). Livellare la superficie del gel regolando il pavimento del palco e bloccare lo stadio del campione nella cella di ablazione.
  2. Analisi della scansione di linea LA-ICP-MS
    1. Accoppiare il sistema LA all'ICP-MS come specificato nella sezione SI S5. Nel software LA (Table of Materials), impostare le impostazioni della luce della fotocamera (ad esempio, 'Ring', 'Coax' e 'Transmitted') per illuminare la superficie del gel nella cella di ablazione e mettere a fuoco la superficie del gel regolando la distanza dell'asse Z. Spostarsi in posizioni casuali all'interno della cella per assicurarsi che tutte le superfici del gel siano a fuoco.
    2. Impostare i parametri LA nella finestra 'Laser Setup' del software LA. Le impostazioni tipiche utilizzate nell'analisi line-scan LA-ICP-MS dei gel DGT sono: modalità continua; produzione di energia 20-30%; frequenza di ripetizione 10-20 Hz; diametro spot 100-200 μm; velocità di scansione 150-250 μm s-1.
      NOTA: I parametri devono essere ottimizzati per il tipo di gel utilizzato e possono variare. I parametri possono anche essere migliorati per aumentare il rapporto segnale/rumore, la risoluzione spaziale o ridurre i tempi di acquisizione a seconda della configurazione sperimentale e strumentale. Utilizzare una produzione di energia relativamente bassa (≤40 %) e velocità di ripetizione (≤25 Hz) per evitare di penetrare attraverso i gel nei materiali di supporto39. Assicurarsi che la velocità di scansione laser sia nel diametro dello spot diviso ≤ per la durata totale del ciclo di scansione ICP-MS (vedere 4.2.6) per evitare la compressione dei punti dati e quindi una perdita di risoluzione nella direzione di scansione45. Ad esempio, quando si imposta un diametro spot di 200 μm e una durata totale del ciclo di scansione ICP-MS di 0,25 s, la velocità di scansione deve essere di ≤800 μm s-1.
    3. Selezionate l'utensile di linea e disegnate un singolo motivo a linea lungo ~1 mm su uno standard gel. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul modello di linea nella finestra 'Scan Patterns' e verificare che i parametri LA impostati in 4.2.3. sono stati adottati. Utilizzare lo strumento 'Scansioni duplicate' per duplicare questa linea quattro volte, con una distanza interlinea (distanza tra il centro linea) maggiore del diametro spot (Figura 6). Questo approccio offre un totale di cinque linee parallele per gel standard (n = 5). Ripetere questo passaggio per ogni standard gel, vuoto di calibrazione e vuoto del metodo.
    4. Spostati sul campione di gel e disegna una singola linea lungo il bordo superiore dell'area rettangolare da analizzare. Duplicare la linea per creare linee parallele per l'intera area campione come specificato nella 4.2.3. Utilizzare una distanza interlinea di 300-400 μm. Assicurarsi che lo stato attivo (distanza dell'asse Z) sia impostato correttamente per ogni punto iniziale e finale di ogni linea.
      NOTA: La risoluzione spaziale dell'analisi è più alta lungo la direzione di scansione rispetto alla distanza interlinea. Pertanto, i punti iniziale e finale delle linee possono seguire al meglio la direzione delle sfumature dell'alita. Per i gradienti della rizosfera, questo è in genere perpendicolare all'asse radicale (Figura 6).
    5. Nel software ICP-MS (Table of Materials), impostare un metodo ' DataOnly' risolto nel tempo nella schermata 'Metodo', selezionare uno o più isotopi adatti per ogni alita e includere 13C come standard di normalizzazione interna31,36,40,41,42. Verificare che il rilevamento degli isotopi non sia compromesso da interferenze46.
    6. Impostare la durata totale del ciclo di scansione del metodo ICP-MS ('Est. Reading Time') su ≤0,5 s con tempi di soffermazione appropriati per isotopo (in genere tra 10-50 ms). Impostate le 'Letture' ICP-MS su 1 e modificate il valore 'Letture/Replica' per impostare il tempo di misurazione totale per campione ('Est. Sampling Time'), cioè per singola linea di ablazione. Ciò dipende dai parametri LA specifici e dalle distanze di linea impostate in 4.2.2 - 4.2.4.
    7. Per la creazione di report sui dati utilizzare una modalità di raccolta dati intensità rispetto al tempo e impostare l' opzione 'File Write Option' su ' New Per Sample 'percreare un singolo file di dati (qui .xl) per ogni riga di ablazione.
    8. Impostate una sequenzadi campionamento' Batch ' nella schermata ICP-MS 'Sample', con ogni voce campione corrispondente ad una singola linea di ablazione impostata in 4.2.3 - 4.2.4.
    9. Fare clic su 'Analizza batch' per avviare la sequenza di campionamento sull'ICP-MS, che attenderà con l'acquisizione dei dati fino a quando non viene attivata dal primo impulso laser (vedere SI S5 per i dettagli sulla configurazione del trigger).
    10. Nel software LA, selezionare tutte le righe da analizzare e verificare che il metodo ICP-MS ('Est. Sampling Time', vedere 4.2.6.) corrisponda alla durata delle singole ablazioni di linea, che in genere è diversa per campioni di gel, standard e spazi vuoti del metodo. Ripetere 4.2.6. per regolare il metodo ICP-MS, se necessario.
    11. Fate clic su 'Emissione' nella finestra 'Energia Laser' per ricaricare la testa del laser, quindi fate clic su 'Run' per aprire la finestra ' RunExperiment'. Qui, selezionate 'Solo motivi selezionati', impostate il ' Ritardowashout' su 20-30 s, spuntate la casella 'Enable Laser During Scans', e impostate il ' LaserWarmup Time' su 10 s.
    12. Fate clic su 'Esegui' nella finestra 'Esegui esperimento' per avviare l'analisi della scansione di linea e monitorare l'intensità del segnale grezzo nei conteggi al secondo (cps) per ogni isotopo sull'ICP-MS in tempo reale. Ogni linea dovrebbe iniziare ('Laser Warmup Time', 10 s) e terminare ('Washout Delay', 20-30 s) con un vuoto di gas.
    13. Monitorare la fluenza laser (J cm-2) durante l'analisi per valutare la stabilità del laser. Se la fluenza varia in gran parte, interrompere l'analisi e verificare che la sorgente laser e/o il suo sistema a specchio siano completamente funzionanti.
    14. Dopo l'analisi, arrestare il plasma ICP-MS e impostare la portata del gas vettore sul sistema LA su 0 mL min-1. Rimuovere i gel dalla cella di ablazione e conservare in sacchetti zip per un ulteriore utilizzo.

Figure 6
Figura 6: Schema della progettazione sperimentale DGT LA-ICP-MS (da non scalare). L'illustrazione mostra il campionamento del soluto in situ basato su DGT nella rizosfera e la mappatura LA-ICP-MS della distribuzione del soluto sulla superficie del gel, incluso un primo piano che mostra dimensioni e parametri esemplari della scansione della linea. Si noti che il gel DGT viene capovolto orizzontalmente quando viene trasferito dal terreno della rizosfera sulla piastra di vetro, come indicato dalla posizione del rettangolo nell'angolo inferiore del gel DGT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Elaborazione e taratura dei dati
    1. Importare il file di dati non elaborati (xl) per ogni riga nonlata nel software del foglio di calcolo (Table of Materials). La tabella dati non elaborati mostra le letture ICP-MS (punti dati) per ogni isotopo in cps e i corrispondenti punti di tempo in s. Elencare tutte le righe l'una accanto all'altra in colonne diverse.
    2. Valutare i dati di scansione della linea per la stabilità del segnale dello standard interno(13C) e tempi di lavaggio adeguati.
    3. Calcolare un vuoto di gas medio per ogni isotopo da tutti i valori di gas vuoto registrati prima delle ablazioni di linea (cioè durante il tempo di riscaldamento laser) e sottrarre il vuoto medio di gas dalle corrispondenti intensità grezze per ogni isotopo per correggere il segnale di fondo.
    4. Applicare la normalizzazione interna dividendo l'intensità del segnale di ogni isotopo (cps) per l'intensità del segnale dello standard interno (cps) per ogni punto dati per correggere le variazioni nella quantità di materiale ablato e deriva strumentale.
    5. Ritagliare i dati prima dell'inizio e dopo la fine di ogni linea ablata per rimuovere il segnale di sfondo. Trasporre la tabella dati per ottenere una matrice di griglia in cui ogni riga corrisponde a una linea ablata e ogni colonna a un valore di intensità isotopica normalizzato. Separare le matrici per ogni isotopo in singoli fogli di lavoro.
    6. Calcolare il rapporto medio di intensità del segnale normalizzato per isotopo per gli standard di calibrazione e il vuoto di taratura e calcolare la funzione di calibrazione (y = ax + b) utilizzando un modello di regressione lineare con i carichi di aliti standard gel (μg cm-2; vedi SI S4) come valori x. Valutare la funzione di calibrazione di ogni isotopo per lalinearità 47.
    7. Applicare la funzione di calibrazione alla matrice di dati del campione. Convertire i rapporti di intensità del segnale normalizzati, Equation 15 , in carichi di aliti gel, Equation 15 (μg cm-2), e successivamente in flussi di soluto medi nel tempo, Equation 17 (pg cm-2 s-1), per ogni isotopo e punto dati secondo Eq. 4 ed Eq. 5:
      Equation 4
      Equation 05
      Ecco, a è la pendenza della linea di calibrazione, b è l'intercetta della linea di calibrazione, e t (s) è il tempo di distribuzione del gel durante il campionamento del soluto.
    8. Salvare la matrice di dati di esempio calibrata per ogni alita come file txt.
  2. Generazione di immagini
    NOTA: assicurati di evitare qualsiasi operazione di interpolazione dei pixel durante tutte le fasi della generazione dell'immagine, in quanto ciò può portare a gradienti di flusso del soluto levigati artificialmente nelle immagini risultanti.
    1. Importare la matrice di dati di esempio calibrata (.txt) come immagine di testo nel software di analisi delle immagini (Table of Materials).
    2. Calcola la distanza per pixel in direzione x (cioè la risoluzione laterale) moltiplicando la velocità di scansione laser con la durata totale del ciclo di scansione ICP-MS (ad esempio, assumendo una velocità di scansione di 200 μm s-1 e una durata totale del ciclo di scansione di 0,25 s, la risoluzione laterale equivale a 50 μm). La distanza per pixel in direzione y equivale alla distanza interlinea (Figura 6).
    3. Calcolare il fattore di correzione delle proporzioni dell'immagine. Pertanto, dividere la distanza per pixel in direzione y (ad esempio, 300 μm) per la distanza per pixel in direzione x (ad esempio, 50 μm). Applicare il fattore di correzione y/x ottenuto (in questo esempio 6) in 'Scala'. Applicate la distanza per pixel (in μm o mm) in direzione x come ridimensionamento in 'Imposta scala'.
    4. Applicare una 'Look Up Table', o cioè una scala pseudo-colore per una migliore visualizzazione dei gradienti chimici nell'immagine del soluto e regolare il "bilanciamento del colore" dell'immagine per controllare i limiti inferiore/superiore dell'intervallo di visualizzazione. Aggiungete una 'barra di calibrazione' e salvate l'immagine del soluto come file tiff.
    5. Copiare l'immagine del soluto utilizzando il comando ' Copia nelsistema' nel software di analisi delle immagini e incollarlo nel software di desktop publishing ( Tableof Materials). Abbinare in scala, allineare e comporre l'immagine del soluto con la foto del ROI ottenuta in 3.1.7.
      NOTA: Prima di copiare, ridimensionare l'immagine del soluto ad esempio, fattore 10 applicando una 'Scala X' di 10 e una 'Scala Y' di 10 sotto 'Scala impostata' per garantire pixel sufficienti per la pubblicazione ad alta risoluzione.
Fabbricazione di gel DGT Coltivazione vegetale Campionamento del soluto in situ Mappatura del flusso di soluto LA-ICP-MS
HR-MBG
1 settimana 		Preparazione del suolo
1 settimana 		Applicazione gel
1 ora per gel 		Preparazione del campione
1 ora per gel
HR-ABG
3 giorni 		Assemblaggio del rizotrone
2 ore per replica 		Periodo di campionamento del soluto
variabile, in genere 24 ore 		Analisi LA-ICP-MS
1 giorno per gel
HR-CBG
3 giorni 		Crescita delle piante
dipendente dallo studio 		Recupero gel
1 ora per gel 		elaborazione dati
4 ore per gel
Essiccazione del gel
2-3 giorni 		Generazione di immagini
10 min per immagine

Tabella 1: Tempi approssimativi per le fasi generali della tecnica DGT LA-ICP-MS.

Representative Results

Per dimostrare la capacità e i dettagli dei dati del metodo di imaging DGT, abbiamo compilato la distribuzione del flusso 2D sub-mm di più specie di nutrienti labili e soluti contaminanti nel terreno adiacente alle radici di Fagopyrum esculentum e Salix smithiana (Figura 7). I tempi approssimativi per le fasi procedurali generali del protocollo sono presentati nella tabella 1.

Le immagini solute nella figura 7 sono state generate in tre diversi studi utilizzando gel di legame HR-MBG o HR-CBG. Le immagini chimiche mostrano la distribuzione del flusso di soluto 2D ad una risoluzione spaziale di 82-120 μm lungo l'asse x e 300-400 μm lungo l'asse y, a seconda dei parametri LA-ICP-MS utilizzati. Poiché non è stata applicata alcuna interpolazione durante la calibrazione e il ridimensionamento dell'immagine, i singoli pixel rappresentano i punti dati misurati. L'allineamento delle immagini del soluto con un'immagine fotografica del ROI rivela che la distribuzione del flusso di soluto 2D sub-mm di diversi elementi è altamente variabile in base alla struttura del suolo e alla morfologia delle radici. Questo può essere attribuito al comportamento biogeochimico differenziale degli elementi nel sistema suolo-rizosfera-pianta, e alla loro interazione con la matrice del suolo e le radici delle piante.

Nella figura 7A i flussi inorganici labili mg, al, p, mn e fe soluto sono stati visualizzati attorno a una giovane radice di F. esculentum coltivata in terreno privo di carbonato fertilizzato con NH4NO3. La distribuzione del soluto sub-mm ha mostrato zone di diminuzione dei flussi di Al, P e Fe insieme alle sezioni delle radici più vecchie a causa dell'assorbimento delle radici e flussi di Mg, Al, P, Mn e Fe altamente aumentati all'apice della radice a causa dei processi di mobilitazione P localizzati della radice di F. esculentum. Si noti che la punta della radice si trova un po 'dietro la superficie del suolo e quindi difficilmente visibile nell'immagine fotografica. La figura 7B mostra la distribuzione di metalli traccia labili, tra cui Mn, Fe, Zn, Cd e Pb attorno a una radice di S. smithiana tollerante al metallo coltivata in un terreno moderatamente contaminato da Zn, Cd e Pb. Le immagini del soluto visualizzavano un netto esaurimento in particolare di Zn, Cd e Pb nella posizione immediata della radice, mostrando che le radici di S. smithiana fungono da lavandino localizzato per i metalli traccia labili nel terreno contaminato. Inoltre, si possono osservare aumenti localizzati del flusso di Zn, Cd e Pb, indicando l'accumulo di questi metalli traccia all'interfaccia immediatamente suolo-radice.

Oltre all'imaging di soluto multi-elementale, il metodo presentato può anche essere combinato con tecniche di imaging complementari basate sulla diffusione come gli optodi planari34. Ciò è dimostrato nella figura 7C, dove la distribuzione di metalli traccia labili nella rizosfera di S. smithiana è stata co-localizzata con la distribuzione del pH utilizzando un gel combinato di legame di optode-DGT planare a stratosingolo 33. Il substrato del suolo è stato fecondato con (NH4)2SO4, portando a una diminuzione del pH lungo gli assi delle radici di ~ 1 unità rispetto al terreno sfuso. Le diminuzioni del pH sono state co-localizzate con l'aumento dei flussi di soluto di Mn, Fe, Co, Ni, Cu e Pb, suggerendo la solubilizzazione del metallo indotta dal pH.

Inoltre, questi risultati di esempio mostrano alcuni dei potenziali artefatti di imaging che possono essere ottenuti. Ad esempio, le disomogeneità strutturali del suolo, ad esempio osservate come linea orizzontale nel terzo inferiore dell'immagine del ROI della Figura 7A, possono causare discontinuità di contatto suolo-gel con conseguente diffusione limitata in questa posizione nel gel legante. Al contrario, un'eccessiva compattazione del suolo nel rizotrone può portare a una scarsa porosità con conseguente spostamento artificiale dello stato redox del suolo verso l'anossia. Ciò è illustrato nella figura 7B, dove vaste aree di flussi Mn e Fe altamente elevati nelle immagini del soluto corrispondono visivamente a un denso strato di terreno nell'immagine del ROI. Ciò suggerisce una diminuzione del potenziale redox del suolo a causa dell'elevata compattazione del suolo, con conseguente dissoluzione riduttiva e solubilizzazione degli elementi altamente sensibili al redox. Si raccomanda pertanto un attento riempimento del rizotrone e l'ispezione visiva della superficie del suolo direttamente dopo il riempimento.

Figure 7
Figura 7: Distribuzione 2D sub-mm di nutrienti labili e specie di soluti contaminanti attraverso diverse interfacce suolo-radice. (A) Distribuzione di P anionici e soluti di Mg, Al, Mn e Fe anionici attorno a una giovane radice di F. esculentum. Il campionamento co-localizzato di soluti anionici e cationici è stato ottenuto utilizzando HR-MBG per 24 ore ad una saturazione dell'acqua del suolo di ~ 75% WHC. Le immagini Al, P e Mn vengono visualizzate come valori fDGT calibrati (pg cm-2 s-1), mentre le immagini Mg e Fe mostrano intensità normalizzate a 13C. La barra di scala rappresenta 1 cm. Questa cifra è adattata dalrif. (B) La distribuzione di Mn, Fe, Zn, Cd e Pb attorno a una radice di S. smithiana coltivata in terreni moderatamente contaminati da soluti metallici traccia cationici Zn, Cd e Pb. Tutte le immagini vengono visualizzate come valori fDGT calibrati (pg cm-2 s-1). La barra di scala rappresenta 0,5 cm. Questa cifra è adattata dalrif. (C) La distribuzione del pH e dei soluti cationici multipli attorno alle radici di S. smithiana coltivate nel suolo inchiodato con Cd. Le immagini Mn, Cu, Zn e Cd vengono visualizzate come valori fDGT calibrati (pg cm-2 s-1), mentre le immagini Fe, Co, Ni e Pb mostrano 13intensità normalizzate in C. La barra di scala rappresenta 1 cm. Questa cifra è adattata dalrif. Le cifre presentate sono riprodotte dagliarticoli3,33,48 citati con licenza CC BY. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo di imaging del soluto qui presentato è un metodo versatile per visualizzare e quantificare i flussi di nutrienti e contaminanti 2D negli ambienti suolo-pianta. È unico nella sua capacità di generare immagini multi-elemento su scala sub-mm di specie di soluto labile all'interfaccia suolo-radice, superando l'ottenibile risoluzione spaziale di metodi alternativi per misurare i gradienti di soluto nella rizosfera sostanzialmente4. L'approccio mirato di campionamento in situ della DGT, in combinazione con un metodo di analisi chimica altamente sensibile come LA-ICP-MS, facilita lo studio dettagliato della dinamica del flusso di soluto attorno alle singole radici vegetali coltivate nel suolo o in substrati simili. A causa del processo di campionamento a base di lavandino, le immagini ottenute riflettono la labilità dei soluti visualizzati, e quindi sono una stima della lorodisponibilità dell'impianto 10. Sebbene la misurazione dei flussi di soluto inerente al metodo ofmichi notevoli vantaggi come l'interpretabilità come frazioni nutritive disponibili per le piante, le misurazioni del flusso sono molto meno dirette da comprendere rispetto alle misurazioni della concentrazione di acqua porewater. La geometria di campionamento DGT standard nelle applicazioni del suolo sfuso (in particolare i gel di diffusione spessi 0,8 mm utilizzati in tale configurazione) consente di confrontare l'effettiva concentrazione di acqua poro, csolne una stima della concentrazione di acqua di poro media nel tempo mediante una misurazione DGT alla rinfusa, cDGT, e per l'interpretazione di questi parametri per quanto riguarda la dinamica di rifornimento di una specie di soluto. Tuttavia, tale confronto non può essere fatto sulla base di applicazioni DGT di imaging con strati di diffusione molto sottili, poiché i valori cDGT derivati sono irrealisticamente piccoli34. I risultati dell'imaging DGT non sono quindi sempre semplici e rapidi da interpretare e spesso non sono direttamente paragonabili alle misurazioni più convenzionali della concentrazione di acqua di poro.

Quando si applica il metodo, alcuni passaggi critici devono essere attentamente considerati, principalmente relativi al riempimento e all'irrigazione dei contenitori di crescita del rizotrone. Durante il riempimento del terreno nel rizotrone, è molto importante evitare di compattare troppo il terreno, poiché le radici delle piante non possono penetrare terreno fortemente compattato e la crescita delle radici sarà inibita. Abbiamo osservato radici evitando terreno fortemente compattato e crescendo lungo i bordi interni del contenitore di crescita del rizotrone, dove il terreno è solitamente meno compattato. In questo caso, le singole radici situate al centro dei rizotroni, dove i gel DGT possono essere applicati comodamente, potrebbero non svilupparsi affatto, inibendo efficacemente l'applicazione di gel di successo. Nel nostro laboratorio, l'esperienza ha dimostrato che densità di massa del suolo secco di 1,0-1,4 g cm-3 consentono uno sviluppo delle radici senza ostacoli. Inoltre, un'eccessiva compattazione del suolo è anche una potenziale fonte di manufatti per quanto riguarda la solubilità degli elementi sensibili ai redox e delle specie associate biogeochimicamente. Poiché il volume totale dei pori viene ridotto e la distribuzione del diametro dei pori viene spostata verso diametri inferiori in terreni altamente compattati, è disponibile meno volume di pori di diametro maggiore riempito d'aria, il che può portare a condizioni riduttive localmente. Di conseguenza, gli ossidi MnIII/IV- e FeIII- possono essere ridotti, portando ad un aumento dei flussi Mn2+ e Fe2+. La dissoluzione degli ossidi di Fe, che sono importanti siti di assorbimento, ad esempio per fosfati e micronutrienti, può liberare le specie assorbite e/o co-precipitate e quindi causare flussi artificialmente elevati delle specie associate biochimicamente. Un problema simile può sorgere se i contenitori di crescita vengono annaffiati troppo. L'evaporazione attraverso la piccola superficie del suolo nella parte superiore del contenitore di crescita è bassa e il terreno può rimanere saturo d'acqua fino a diverse settimane dopo la semina, il che può anche causare manufatti redox.

Un'altra considerazione importante è la funzionalità chimica del gel legante HR-DGT fabbricato. Seguendo il protocollo, si ottengono gel sottili con una distribuzione omogenea delle fasi di legame. Se i gel hanno aree di distribuzione di materiale disomogeneo (ad esempio, fori nel gel o aggregati di fasi di legame) queste aree devono essere rimosse o, se troppo estese, il protocollo di fabbricazione del gel deve essere ripetuto. Se preparato correttamente, il gel deve essere in grado di legare le specie bersaglio di soluto che si diffondono nel gel immediatamente e quantitativamente27, che è determinato dalla capacità di legame del gel specifico dell'aalita. Sebbene il superamento della capacità del gel sia meno problematico nei terreni incontaminati, dovrebbe essere considerato nei terreni contaminati da metalli e negli ambienti del suolo salino. La saturazione delle fasi di legame del gel non solo comprometterà il campionamento quantitativo del soluto, ma si tradurrà anche in una diffusione laterale dei soluti tra le fasi di legame nel gel, portando a una localizzazione indefinita delle caratteristiche del flusso di soluto su piccola scala. Pertanto, se nell'ambiente del suolo bersaglio sono previste quantità molto elevate di specie di nutrienti/contaminanti labili, devono essere effettuate prove preliminari. Per la stima dei carichi DGT previsti, è possibile applicare il campionamento del pistone DGT del suolo sfuso seguito dall'eluizione del gel e dall'analisichimico-umida 15,49. Se necessario, i tempi di implementazione della DGT possono essere regolati per ridurre il tempo di contatto del gel ed evitare così la saturazione del gel al di sopra delle soglie di capacità. Al contrario, i test preliminari possono anche essere utili per identificare i tempi di contatto del gel richiesti e/o le sensibilità LA-ICP-MS se sono previsti carichi di soluti molto bassi, il che può essere importante per la mappatura dei soluti degli oligoelementi ai livelli di fondo naturalidel suolo 15. Inoltre, il corretto funzionamento del gel DGT deve essere verificato prima della sua applicazione sperimentale attraverso il caricamento controllato dei gel nella preparazione degli standard di calibrazione DGT LA-ICP-MS. Lo standard gel fornisce un caricamento dell'alita di gel di riferimento abbinato a matrice che può essere utilizzato per valutare se il caricamento del gel campione determinato da LA-ICP-MS rientra nell'intervallo previsto. Se non è in grado di ottenere un segnale diverso dal rumore di fondo vuoto del gas e del metodo, l'operatore deve assicurarsi che siano state implementate le procedure di laboratorio per l'analisi degli oligoelementi e che tutte le fasi del protocollo siano state eseguite correttamente. A volte, il gel DGT viene accidentalmente capovolto dopo il campionamento del soluto con il lato carico esposto al suolo rivolto verso la piastra di vetro piuttosto che verso il raggio laser, con conseguente bassa intensità del segnale e caratteristiche erroneamente capovolte nelle immagini finali del flusso di soluto.

Durante l'analisi LA-ICP-MS, viene generata una grande quantità di dati, che richiede molto tempo per essere valutata. Nel nostro laboratorio, utilizziamo script di valutazione dei dati internamente su misura per il nostro formato di output dei dati di destinazione utilizzando un software standard per fogli di calcolo. Dopo l'ordinamento e la calibrazione semi-automatizzati, il plottaggio delle immagini viene condotto utilizzando strumenti open source di analisi delle immagini ad accesso aperto (ImageJ, Fiji50). Questo approccio consente il pieno controllo sull'ordinamento, la valutazione e la presentazione dei dati, il che è essenziale perché i dati raccolti corrispondono a pixel rettangolari e non quadratici, che devono essere visualizzati correttamente nelle mappe del soluto generate. Inoltre, durante l'elaborazione dei dati, qualsiasi interpolazione di pixel dovrebbe essere accuratamente evitata. L'interpolazione dei pixel porta a gradienti smussati nelle immagini chimiche, con conseguente ammorbidimento delle caratteristiche di distribuzione degli elementi spesso circolari ed è quindi un'alterazione indesiderata dei dati originali. L'interpolazione dei pixel è una procedura standard per ridimensionare e ri-formattare le operazioni in molti prodotti software di elaborazione delle immagini, ma può essere deselezionata di solito.

In conclusione, il metodo descritto è un progresso significativo per comprendere la dinamica dei nutrienti e dei contaminanti nei sistemi naturali suolo-rizosfera-pianta. Oltre alle applicazioni solo DGT, il metodo può essere combinato con altre tecniche di imaging basate sulla diffusione come optodi planari3,33,42,43,48,51 e zimografia20,21,22,23,24e può essere ulteriormente sviluppato per includere elementi aggiuntivi e parametri del suolo.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato cofinanziato dal Fondo scientifico austriaco (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) e dal Fondo scientifico austriaco (FWF) e dallo Stato federale della Bassa Austria: P27571-BBL (Jakob Santner).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) VWR 21300.260 ≥98.0%, analytical reagent
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M8250-100G ≥99.5%
Acrylamide solution Sigma-Aldrich A4058-100ML 40%, for electrophoresis
Analyte salts n/a n/a Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher
Buechner funnel VWR 511-0065 13 cm plate diameter
Chemical equilibrium modelling software KTH Sweden n/a Visual MINTEQ
Clamp Local warehouse n/a
Desktop publishing software Adobe Inc. n/a InDesign CS6
DGT cross-linker DGT Research Ltd n/a 2%, agarose derivative
DGT piston sampler DGT Research Ltd n/a 2 cm diameter exposure window
Digital single-lens reflex (DSLR) camera Canon Inc. n/a Canon EOS 1000D
Dispersion device IKA 3737000 Ultra-Turrax T10 Basic
Double-sided adhesive tape Tesa 56171
Ethanol Sigma-Aldrich 34923 Puriss. p.a., absolute, ≥99.8%
Gel blotting paper Whatman 10426981 Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness
Gel drier UniEquip n/a UNIGELDRYER 3545
High-pressure microwave system Anton Paar n/a Multiwave 3000
HNO3 VWR 1.00456.2500P 65%, ISO for analysis
Horizontal shaker GFL 305
HydroMed D4 AdvanSource Biomaterials Corp. n/a Ether-based hydrophilic urethane
ICP-MS software Perkin Elmer n/a Syngistix
Image analysis software National Institutes of Health (NIH) n/a ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/
Knife-coating device BYK 5561 Single Bar 6″, 0.5 mils
LA software Elemental Scientific Lasers n/a ActiveView
LA system Elemental Scientific Lasers n/a NWR193
Laminar flow bench Telstar Laboratory Equipment B.V. n/a Class II biological safety cabinet
Magnetic stirrer IKA 0003582400 C-MAG MS 7
Moisture-retaining film Bemis Company, Inc. PM999 Parafilm M, 4" x 250'
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-50ML BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99%
NaNO3 Sigma-Aldrich 229938-10G 99.995% trace metals basis
NaOH Sigma-Aldrich 1064980500 Pellets for analysis
Overhead shaker GFL 3040
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials Savillex 200-015-20 15 mL Standard Vial, Rounded Interior
pH meter Thermo Scientific 13-644-928 Orion 3-Star Benchtop pH Meter
pH probe Thermo Scientific 8157BNUMD Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Plastic cutter DGT Research Ltd n/a Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd
Plastic tweezers Semadeni 602
Plasticine Local stationary shop n/a non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents
Polycarbonate membrane discs Whatman 110606 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polycarbonate membrane sheet Whatman 113506 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polyethersulfone membrane discs Pall Corporation 60172 Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
Polyethersulfone membrane sheet Pall Corporation 60179 Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
PTFE foil Haberkorn n/a 50 µm thickness
PTFE spacer Haberkorn n/a Variable thicknesses available
PTFE-coated razor blades Personna GEM 62-0178 Stainless steel single edge blades (coated)
PTFE-coated Tygon tubing S-prep GmbH SP8180 0.32 cm inner diameter
Quadrupole ICP-MS Perkin Elmer N8150044 NexION 2000B
Quantitative filter paper, 454 VWR 516-0854 Particle retention 12-15 µm
Spreadsheet software Microsoft Corporation n/a Microsoft Excel 2016 (v16.0)
Stainless-steel cutter Local locksmithery n/a 2.5 cm diameter
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) Teledyne CETAC Technologies n/a 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension
Transistor-transistor logic (TTL) cable n/a n/a Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument
Two-volume cell Elemental Scientific Lasers n/a Two-volume cell 1
Vinyl electrical tape 3M n/a Scotch Super 33+
Water purification system Termo Electron LED GmbH n/a TKA-GenPure
ZrOCl2 × 8H2O Alfa Aesar 86108.30 99.9 %, metals basis

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References

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Visualizzazione bidimensionale e quantificazione di labile, nutrienti vegetali inorganici e contaminanti nel suolo
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Wagner, S., Hoefer, C., Prohaska, T., Santner, J. Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil. J. Vis. Exp. (163), e61661, doi:10.3791/61661 (2020).

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