Summary
Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho para visualização sub-mm 2D de múltiplas espécies de nutrientes inorgânicos labile e súute contaminante usando gradientes difusivos em filmes finos (DGT) combinados com imagens de espectrometria de massa. A amostragem de soluto e a análise química de alta resolução são descritas em detalhes para mapeamento quantitativo de solutos na rizosfera das plantas terrestres.
Abstract
Descrevemos um método de visualização bidimensional (2D) e quantificação da distribuição de espécies de nutrientes inorgânicos inorgânicos (por exemplo, P, Fe, Mn) e contaminantes (por exemplo, como, cd, pb) espécies solutivas no solo adjacente às raízes vegetais (a 'rizofera') em resolução espacial submilímetro (~100 μm). O método combina a amostragem de soluto à base de sumido pelos gradientes difusivos em filmes finos (DGT) técnica com análise química espacialmente resolvida por ablação a laser indutivamente acoplada espectrometria de massa plasmática (LA-ICP-MS). A técnica DGT baseia-se em hidrogéis finos com fases de ligação analito-seletiva seletivas homogêneas distribuídas. A variedade de fases de ligação disponíveis permite a preparação de diferentes tipos de gel DGT após procedimentos simples de fabricação de gel. Para a implantação do gel DGT na rizosfera, as plantas são cultivadas em recipientes de crescimento planos e transparentes (rizotrons), que permitem acesso invasivo mínimo a um sistema radicular cultivado no solo. Após um período de pré-crescimento, os géis DGT são aplicados em regiões selecionadas de interesse para a amostragem de situ solute na rizofera. Posteriormente, os géis DGT são recuperados e preparados para análise química subsequente dos solutos vinculados usando imagens de varredura de linha LA-ICP-MS. A aplicação da normalização interna utilizando 13C e calibração externa utilizando padrões de gel com parda de matriz permite ainda a quantificação dos fluxos solutos 2D. Este método é único em sua capacidade de gerar imagens 2D quantitativas e sub-mm de fluxos solutos de vários elementos em ambientes de plantas do solo, excedendo substancialmente a resolução espacial alcançável de outros métodos para medir gradientes solutos na rizofera. Apresentamos a aplicação e avaliação do método de imagem múltiplas espécies de soluto cationic e aniônico na rizosfera das plantas terrestres e destacamos a possibilidade de combinar este método com técnicas complementares de imagem soluto.
Introduction
A aquisição de nutrientes pelas plantas agrícolas é um fator-chave na determinação da produtividade das culturas. Os processos que regem a absorção eficiente de nutrientes pelas culturas têm sido estudados intensamente, especialmente os mecanismos que controlam a disponibilidade de nutrientes e a internalização de nutrientes pelas raízes vegetais na interface solo-raiz, a rizofera, são reconhecidos por seu papel na aquisição de nutrientes agrícolas. Processos importantes para a absorção de nutrientes vegetais incluem: transporte de nutrientes para a raiz; equilíbrio de sorpção dinâmica entre espécies dissolvidas na água do solo e espécies ligadas a superfícies sólidas do solo; concorrência microbiana por nutrientes; mineralização microbiana de nutrientes contidos na matéria orgânica do solo; e internalização de nutrientes no símplasma raiz. A absorção de contaminantes de metal de traço inorgânico (oid) é amplamente controlada pelos mesmos mecanismos.
Dependendo da disponibilidade de nutrientes e contaminantes, da demanda vegetal e da difusividade no solo, podem ser observados padrões diferenciais de nutrientes na rizosfera. Para elementos fortemente sorbing com taxas de internalização relativamente altas (por exemplo, P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), esgotamento do labile (ou seja, reversivelmente adsorvida) fração de elemento em comparação com o solo a granel é encontrada, com larguras de zona de esgotamento muitas vezes sendo ≤1 mm, enquanto para mais nutrientes móveis como o NO3-, zonas de esgotamento podem se estender até vários centímetros1. Além disso, o acúmulo de elementos como Al e Cd tem sido observado quando a disponibilidade excede as taxas de absorção da planta2,3.
Dada a importância dos processos da rizosfera no ciclismo de nutrientes e contaminantes, várias técnicas para medir a fração do elemento disponível para plantas em alta resolução espacial foram desenvolvidas4,5. No entanto, medir distribuições de soluto labile de pequena escala provou ser desafiador por várias razões. Uma grande dificuldade é amostrar volumes muito pequenos (de baixa faixa de μL) de solo e/ou água porewater em posições definidas adjacentes às raízes vegetais vivas para resolver os gradientes de nutrientes íngremes na rizofera. Uma abordagem para resolver esse problema é usar copos de microssurretumento para a extração de amostras de água deporosa 6. Com este método, A. Göttlein, A. Heim e E. Matzner7 mediram concentrações de nutrientes de água porosa de solo nas proximidades das raízes de Quercus robur L. a uma resolução espacial de ~1 cm. Uma dificuldade de analisar volumes de μL de solo ou solução de solo é que esses pequenos volumes amostrais, em combinação com as baixas concentrações de todas, exceto as principais espécies de nutrientes, requerem técnicas de análise química altamente sensíveis.
Um sistema alternativo, capaz de resolver gradientes de nutrientes em uma resolução até ~0,5 mm, é cultivar um tapete radicular na superfície de um bloco de solo, com uma fina camada de membrana hidrofílica separando o solo das raízes8,9. Nesta configuração, solutos podem passar pela membrana e as raízes podem pegar nutrientes e contaminantes do solo, enquanto exsudatos radiculares podem difundir no solo. Após o estabelecimento de uma densa camada radicular, o bloco de solo pode ser amostrado e fatiado para amostras de solo obtidas para posterior extração de frações de elementos. Desta forma, nutrientes unidimensionais e gradientes contaminantes, em média em uma área relativamente grande (~100 cm2) podem ser analisados.
Outro desafio é obter amostras da fração de elemento labile, disponível por plantas, uma vez que a maioria das técnicas de extração química do solo operam de forma muito diferente em comparação com os mecanismos pelos quais as plantas captam nutrientes e contaminantes. Em muitos protocolos de extração do solo, o solo é misturado com uma solução extrativista com o objetivo de estabelecer um (pseudo-)equilíbrio entre a fração de elemento dissolvido e sorbed. No entanto, as plantas internalizam continuamente os nutrientes e, portanto, muitas vezes esgotam progressivamente o solo da rizosfera. Embora os protocolos de extração de equilíbrio tenham sido amplamente adotados como testes de solo, pois são fáceis de implementar, a fração de nutrientes extraído muitas vezes não representa a fração de nutrientes disponível para plantas bem10,11,12,13. Métodos de pia que esgotam continuamente o solo amostrado para nutrientes têm sido propostos como métodos vantajosos e podem se assemelhar melhor ao mecanismo de absorção de nutrientes subjacente, imitando os processos de absorção de raízes10,11,14,15.
Além dos métodos descritos acima, aplicações genuínas de imagem, capazes de medir mapas de parâmetros contínuos com resoluções ≤ 100 μm entre campos de visão de vários cm2 foram desenvolvidos para elementos específicos e parâmetros químicos do solo(bio)5. A autordiografia pode ser usada para a imagem da distribuição do elemento na rizofera, desde que os radioisótopos adequados estejam disponíveis16. Os optodes planares permitem a visualização de parâmetros químicos importantes do solo, como pH e pO217,18,19, e a atividade enzimática ou distribuições totais de proteínas podem ser mapeadas utilizando técnicas de imagem de indicadores fluorescentes como a zimografia do solo20,21,22,23 e/ou métodos de mancha de raiz24. Enquanto a zymografia e a autoradiografia são limitadas à medição de um único parâmetro de cada vez, a imagem pH e pO2 usando optodes planar pode ser feita simultaneamente. As técnicas mais tradicionais do tapete radicular fornecem apenas informações 1D, enquanto as micro ventos fornecem medidas de ponto ou informações 2D de baixa resolução, porém ambas as abordagens permitem a análise de vários elementos. Mais recentemente, P. D. Ilhardt, et al.25 apresentaram uma nova abordagem usando espectroscopia de colapso induzida por laser (LIBS) para mapear distribuições totais de múltiplos elementos 2D em uma resolução de ~100 μm em amostras de núcleo raiz do solo onde a distribuição de elementos naturais foi preservada por uma cuidadosa preparação de amostras.
A única técnica capaz de amostragem 2D direcionada de múltiplos nutrientes e solutos contaminantes em alta resolução espacial são os gradientes difusivos na técnica de filmes finos (DGT), um método de amostragem baseado em pia que imobiliza espécies de metal de traço labile (loid) in situ em um material de ligação embutido em uma camada de hidrogel26,27. O DGT foi introduzido como uma técnica de especiação química para medir solutos labile em sedimentos e águas, e logo foi adotado para seu uso em solos28. Permite imagens solutos de escala submm, que foi inicialmente demonstrada em um sedimento do rio29,e foi desenvolvida ainda mais para sua aplicação nas rizoferas vegetais30,31,32,33.
Para a amostragem DGT, uma folha de gel de aproximadamente 3 cm x 5 cm é aplicada em uma única raiz vegetal que está crescendo na camada superficial de um bloco de solo, com uma membrana hidrofílica separando o gel do solo. Durante o tempo de contato, nutrientes labile e/ou contaminantes se difundem em direção ao gel e são amarrados imediatamente pelo material de ligação incorporado no gel. Desta forma, um gradiente de concentração e, portanto, um fluxo líquido contínuo em direção ao gel é estabelecido e prevaleceu durante o tempo de amostragem. Após a amostragem, o hidrogel pode ser removido e analisado utilizando uma técnica química analítica que permite uma análise espacialmente resolvida. Uma técnica altamente especializada e frequentemente utilizada para este fim é a ablação a laser indutivamente acoplada à espectrometria de massa plasmática (LA-ICP-MS). Em alguns estudos iniciais, a emissão de raios-X induzida por micro partículas (PIXE) também foi utilizada29. A amostragem DGT combinada com a análise LA-ICP-MS permite imagens químicas de vários elementos a uma resolução espacial de ~100 μm. Se forem empregadas técnicas de ICP-MS altamente sensíveis (por exemplo, iCP-MS de campo setorial), podem ser alcançados limites excepcionalmente baixos de detecção. Em um estudo sobre o efeito da liming em Zn e Captação de Cd por milho15,conseguimos mapear o Cd labile na rizofera do milho em solo não contaminado com um limite de detecção de 38 pg cm-2 de Cd por área de gel. DGT, optodes planar e zymografia dependem da difusão do elemento alvo do solo em uma camada de gel, que pode ser explorada para aplicação combinada desses métodos, a fim de, simultaneamente, ou consecutivamente, imagem um grande número de parâmetros relevantes para o nutriente vegetal e absorção de contaminantes. Informações detalhadas sobre aspectos químicos analíticos da imagem DGT, sobre o potencial de combinação de DGT e outros métodos de imagem, e em suas aplicações são amplamente revisadas no ref.34,35.
Neste artigo descrevemos como realizar um experimento de imagem soluto usando a técnica DGT sobre raízes de plantas terrestres em um ambiente de solo insaturado, incluindo cultivo de plantas, fabricação de gel, aplicação de gel, análise de gel e geração de imagens. Todas as etapas são elaboradas detalhadamente, incluindo notas sobre etapas críticas e alternativas experimentais.
Protocol
1. Fabricação de géis DGT
NOTA: Vários tipos de gel DGT estão disponíveis para imagens 2D de espécies de súto labile em alta resolução espacial (submm)35. Aqui, a fabricação de três géis de ligação de alta resolução (HR)-DGT bem caracterizados usados em aplicações de imagem soluto é brevemente resumida. Procedimentos laboratoriais para análise de elementos de rastreamento, bem como procedimentos detalhados de fabricação de todos os géis HR-DGT apresentados estão descritos nas seções de Informações de Suporte (SI) S1 e S2.
- ânion misto à base de poluretano e gel de ligação de cáção (HR-MBG; SI S2.1)31
- Prepare uma suspensão de gel de poliuretano com fases de cloróxido de zircônio (IV) e iminodiacetato (IDA) homogeneamente dispersos.
- Cubra a suspensão do gel em uma película fina em uma placa de vidro e inicie a formação de gel por evaporação de solvente para obter um ânion misto de 0,1 mm fino, à prova de lágrimas e gel de ligação de cátion (HR-MBG).
- Gel de ligação de ânion poliacrilamida-zirconia (HR-ABG; SI S2.2)36
- Fabricar um gel de poliacrilamida transversal (APA) de 0,4 mm de espessura, seguindo os procedimentos estabelecidos de fundição de gel37 (ver SI S2.4 para um protocolo detalhado da fabricação da APA).
- Precipitar fases de hidróxido de zircônio (IV) no gel APA pré-moldado para obter um gel de ligação de ânion de 0,4 mm de espessura (HR-ABG).
- Poliacrilamida-iminodiacetato gel de ligação de cation (HR-CBG; SI S2.3)38
- Prepare uma suspensão de gel de poliacrilamida com fases IDA dispersas homogêneas.
- Lance o gel entre duas placas de vidro e inicie a reação de polimerização para obter um gel de ligação de cáção fino de 0,4 mm (HR-CBG) onde as fases IDA são instaladas em um lado do gel.
2. Cultivo de plantas
NOTA: O sistema experimental usa rizotrons4 (Figura 1) para cultivar plantas em solo insaturado para imagem de soluto. Primeiro, o enchimento e rega do solo rizotron são descritos, em seguida, detalhes sobre o crescimento experimental da planta são dados. Detalhes sobre o design do rizotron e a preparação do substrato do solo antes de encher o rizotron são apresentados na seção SI S3.
Figura 1: Design de rizotron (não para escalar). (A) Visão explodida de um recipiente de crescimento de rizotron. (B) Rizotron montado durante o crescimento da planta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Enchimento do solo de rizotron
- Antes de encher o rizotron com solo pré-umedecido (teor de água gravimétrica,
é conhecido; ver SI S3.2), feche os orifícios de rega na parte de trás do rizotron usando fita adesiva e remova a placa frontal e seus trilhos de fixação e parafusos. - Pesar o rizotron vazio (excluindo a placa dianteira, trilhos e parafusos), oito placas de acrílico de 5 cm x 11 cm e 16 grampos(Tabela de Materiais) e registrar a soma dos pesos.
- Coloque uma pequena placa de acrílico na parte inferior do rizotron usando dois grampos de cada lado, com a pressão dos grampos direcionados para o quadro rizotron, para que a placa não se dobre para dentro e o volume seja constante.
- Incline o rizotron ligeiramente em direção à pequena placa de plástico e encha com solo pré-umedecido até uma altura de ~4 cm(Figura 2A). Distribua o solo dentro do rizotron agitando o rizotron ligeiramente e gentilmente comprimindo o solo por alguns mm (dependendo das características específicas do solo) com uma ferramenta de compactação(Figura 2B).
- Repita 2.1.3 - 2.1.4 até que o rizotron esteja cheio de solo(Figura 2C). Deixe uma lacuna de ~3 cm na parte superior para o plantio subsequente de mudas no rizotron.
- Pesar o rizotron cheio de solo (incluindo 8 placas pequenas e 16 grampos) e registrar o peso. A partir disso, subtraia o peso rizotron vazio obtido em 2.1.2 e registra a diferença de peso, ou seja, a massa de solo úmido,
(g), no rizotron. - Calcule a massa de solo seco no rizotron,
(g), de acordo com Eq. 1, e calcule a densidade a granel seca do solo, 
(g cm-3), no rizotron segundo Eq. 2.
Aqui,
(cm3) é o volume interno total do rizotron.
NOTA: Os valores típicos no rizotron estão entre 1,0-1,4 g cm-3. Não exceda 1,5 g cm-3, pois o crescimento da raiz pode ser impedido acima desse valor. - Coloque o rizotron cheio de solo em uma caixa de suporte e remova todos os grampos e pequenas placas do rizotron(Figura 2D). Limpe cuidadosamente a estrutura do rizotron (ou seja, bordas) usando papel de tecido, pois partículas remanescentes do solo na estrutura podem causar vazamentos.
NOTA: A superfície exposta do solo deve ser homogênea e nivelada com a estrutura do rizotron sem quaisquer rachaduras ou lacunas. Caso não, esvazie o rizotron e repita 2.1.2 - 2.1.8. - Corte duas peças de politetrafluoroetileno (PTFE)(Tabela de Materiais) para 22 cm x 13 cm cada. Além disso, corte um pedaço de papel alumínio para 46 cm x 15 cm. Registo a soma de PTFE e pesos de papel alumínio. Coloque a primeira peça de folha PTFE na metade superior da superfície exposta do solo no rizotron, estendendo-se ~1 cm sobre o nível do solo na parte superior do rizotron.
- Fixar cuidadosamente a folha PTFE no quadro rizotron usando fita adesiva(Figura 2E). Comece fixando um canto no topo do rizotron primeiro, seguido por seu canto oposto e finalmente os dois cantos mais abaixo do rizotron. Aplique tensão ao fixar os cantos 2-4 para garantir uma superfície de papel alumínio plana. Se as dobras surgirem, abra e rearreje a fita em cantos individuais (nem todos de uma vez) até que todas as dobras sejam removidas e a folha PTFE seja plana e contígua com a superfície do solo.
- Coloque a segunda peça de folha PTFE na extremidade inferior do rizotron, sobrepondo a peça de folha ptfe superior em ~1 cm. Repita 2.1.10 para fixar a segunda folha PTFE ao rizotron.
- Coloque a folha de plástico (46 cm x 15 cm) sobre as folhas PTFE. Fixar a folha de plástico usando o procedimento de fixação conforme detalhado em 2.1.10.
- Coloque uma placa frontal no rizotron cheio de solo e coberto de papel alumínio. Coloque um trilho em torno de cada lado do rizotron e aperte os parafusos à mão para fixar os trilhos e, assim, a placa dianteira para o rizotron. Os parafusos estão posicionados em direção ao lado fechado do rizotron, ou seja, o lado com os orifícios de rega(Figura 1A).
- Antes de encher o rizotron com solo pré-umedecido (teor de água gravimétrica,
é conhecido; ver SI S3.2), feche os orifícios de rega na parte de trás do rizotron usando fita adesiva e remova a placa frontal e seus trilhos de fixação e parafusos.
(g), no rizotron.
(g), de acordo com Eq. 1, e calcule a densidade a granel seca do solo, 
(g cm-3), no rizotron segundo Eq. 2.
(cm3) é o volume interno total do rizotron.
Figura 2: Montagem de rizotron e enchimento para cultivar plantas no solo para imagem de soluto na rizosfera. (A)Enchimento do solo no rizotron. (B) Compactação do solo preenchido utilizando uma ferramenta de compactação. (C) Rizotron cheio de solo com pequenas placas de acrílico e grampos. (D) Rizotron cheio de solo com superfície exposta do solo. (E) Rizotron cheio de solo parcialmente coberto com uma folha de PTFE protetora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Manuseio de rizotron e aplicação de gel DGT. (A) Rega do solo usando pontas de pipeta de 10 mL nos orifícios de rega na parte de trás do rizotron. (B) Plantio de mudas (indicadas como manchas verdes) no rizotron cheio de solo e fechado. (C) Rizotron plantado com estacas Salix smithiana e placa frontal removida e tampa de papel alumínio. (D) Retire cuidadosamente a tampa da folha PTFE antes da aplicação do gel DGT. (E) Foto de alta resolução do ROI interface solo-raiz. (F) Aplicação da placa frontal equipada com o gel DGT sobre o rizotron. (G) Foto do ROI com o gel DGT aplicado durante a amostragem de soluto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Regando o solo
- Determine a capacidade de retenção de água (WHC) do solo experimental no rizotron. Para isso, fabricar dois rizotrons com fundo aberto e enchê-los com solo conforme especificado na seção 2.1. Saturar totalmente esses rizotrons abertos e cheios de solo por imersão em um recipiente de água por 16 h e drenar os rizotrons por 8h.
- Pegue uma amostra de solo composto de ~50 g de locais aleatórios nos rizotrons de fundo aberto e seque a amostra a 105 °C para determinar de acordo com Eq. S1. O determinado corresponde ao WHC do solo e é, portanto, expresso como
(g-1). - Defina o alvo no rizotron experimental. Durante a fase de crescimento, defina um de 60 % do WHC (ou seja, o fator
WHC) para fornecer às plantas uma quantidade adequada de água, evitando condições anoxidas no rizotron. - Calcule a massa total de água a ser adicionada,
(g), para irrigar o solo no rizotron no alvo de acordo com Eq. 3. Conta a massa de água presente no solo no rizotron, 
(g).
- Divida pelo número de orifícios de rega de rizotron (aqui 14) para obter a massa de água a ser adicionada em cada orifício de rega. Adicione água empurrando pontas de pipeta de 10 mL para os orifícios de rega e deixando a água fluir para o solo por gravidade(Figura 3A).
- Crescimento da planta
- Sementes pré-germinadas da planta experimental (por exemplo, em papel filtro molhado) de acordo com os requisitos específicos de germinação de sementes até que o radículo surja (até 1 cm de comprimento).
- Plante até duas mudas no rizotron, conforme indicado na Figura 3B. No plantio, adicione ~5 mL de água diretamente às mudas para apoiar seu crescimento. Cubra a abertura superior do rizotron para os primeiros ~dois dias após o plantio com um filme transparente e retendo umidade(Tabela de Materiais). Enrole o rizotron em papel alumínio para evitar o crescimento microfítico.
NOTA: Além das mudas, as estacas de plantas também podem ser cultivadas em rizotrons. - Transfira o rizotron plantado para uma sala de crescimento, com condições ambientais (ou seja, temperatura, umidade, intensidade de luz) definidas para as exigências específicas da planta. Incline o rizotron a 25°-35° para garantir o desenvolvimento da raiz ao lado da placa frontal via gravitropismo.
- Durante o crescimento da planta, mantenha gravimetricamente o teor de água alvo no rizotron, regando periodicamente a cada 2-4 dias usando os orifícios de rega de rizotron, conforme detalhado em 2.2.5. Mantenha a superfície do solo na abertura superior úmida por adições regulares de ~5 mL de água.
NOTA: Se as plantas forem cultivadas por longos períodos e a biomassa vegetal diminuir substancialmente a quantidade de água adicionada ao rizotron pelo método proposto, responda pelo peso da biomassa vegetal, cultivando plantas em réplicas de rizotron separadas e colhendo e pesando os tecidos vegetais em intervalos definidos. - Uma vez que as raízes atinjam um local adequado ao longo da placa frontal, preferencialmente no centro do rizotron, aplique géis DGT para amostragem da distribuição de soluto rizosférico.
(g-1).
WHC) para fornecer às plantas uma quantidade adequada de água, evitando condições anoxidas no rizotron.
(g), para irrigar o solo no rizotron no alvo 
(g).
3. Amostragem da distribuição soluto
- Aplicação de gel
- Aumento do rizotron de 60 % para 80 % 24 h antes da aplicação do gel conforme detalhado em 2.2.4.-2.2.5. Isso garante um bom contato solo-gel e permite a difusão soluto no gel, evitando condições anoxilicas do solo durante a amostragem de soluto.
- Pegue uma nova placa frontal limpa a ácido, alinhe-a no rizotron usado para amostragem e marque as regiões de interesse (ROIs) na placa. Transfira a placa para um banco de fluxo laminar ou qualquer outro ambiente sem poeira e metal, desmarcado de frente para cima.
- Corte o gel de ligação DGT em um suporte acrílico ao tamanho retangular necessário correspondente ao ROI, geralmente em torno de 3 cm × 5 cm, usando lâminas de barbear revestidas de PTFE. Corte o gel pressionando ao invés de deslizar a lâmina de barbear para garantir um corte claro. Coloque a peça de gel retangular no lado não marcado da placa no local marcado do ROI.
NOTA: Se o HR-MBG for usado, uma folha espaçadora de 100 μm fina pode ser adicionada sob o gel para garantir que o gel esteja em bom contato com o sistema de raiz do solo. - Corte uma membrana de policarbonato de 10 μm fina (tamanho de poros de 0,2 μm; Tabela de Materiais) a um tamanho que estende o tamanho do gel em ≥1 cm em cada lado e coloque a membrana sobre o gel. Aplique um pouco de água para remover bolhas de ar da pilha.
- Fixar a membrana ao longo das quatro bordas usando fita elétrica de vinil(Tabela de Materiais). No processo, remova cuidadosamente as bolhas de ar presas entre o gel e a membrana usando pinças plásticas. A fita só deve entrar em contato com a membrana e não com o gel.
NOTA: Se a fita entrar em contato com o gel, as bolhas de ar ficam presas entre o gel e a membrana, ou a superfície final da membrana mostra dobras, a pilha de gel/membrana precisa ser remontada, pois o fluxo difuso de solutos no gel pode ser prejudicado35 (repita 3.1.3 - 3.1.5). - Coloque o rizotron em um suporte, retire os trilhos e retire cuidadosamente a placa frontal(Figura 3C). Retire a folha de plástico, corte a folha ptfe nas bordas do rizotron e retire lentamente a folha ptfe para evitar a perturbação do sistema terra-raiz(Figura 3D).
- Tire uma foto ortogonal do ROI usando uma câmera digital de reflexo de lente única (DSLR)parafacilitar a interpretação e apresentação da distribuição soluto com base na estrutura do solo e morfologia radicular(Figura 3E). Use um suporte de câmera e, se disponível, uma lente macro. Alinhe a câmera para que o centro da foto corresponda ao centro do ROI, e o plano de foco da câmera é paralelo à superfície do solo. Inclua uma barra de escala (por exemplo, uma régua) na foto.
- Conecte a placa equipada com a pilha de gel/membrana ao rizotron aberto(Figura 3F). Portanto, alinhe uma borda da placa com uma borda do rizotron e gentilmente 'dobre' a placa em direção ao solo. Este modo de aplicação ajuda a evitar bolhas de ar entre a pilha de gel/membrana e o sistema de raiz do solo. Fixar a placa frontal usando os trilhos e parafusos.
NOTA: Este passo é crítico e precisa ser realizado com cuidado. A placa não pode ser movida após estabelecer contato entre a pilha de gel/membrana e o sistema de raiz do solo sem deslocar o solo e as raízes. - Regissua o tempo exato de partida da implantação do gel e tire uma foto do gel implantado no ROI conforme dado em 3.1.7 (Figura 3G). Enrole o rizotron em papel alumínio e transfira para a sala de crescimento até o final do período de amostragem soluto (muitas vezes 24 h).
- Aumento
- Recuperação de gel
- Coloque o rizotron em uma caixa de suporte, retire cuidadosamente a placa frontal e enxágue a pilha de gel/membrana na placa com água para lavar partículas de adesão(Figura 4A). Regisso tempo final exato de implantação de gel. Amostra de solo do ROI para determinar osolo wreal no rizotron de acordo com Eq. S1.
- Transfira a placa frontal para o banco de fluxo laminar, a pilha de gel/membrana virada para cima. Recupere o gel da placa frontal removendo cuidadosamente a fita ao longo de todas as quatro bordas e, em seguida, a membrana de policarbonato que cobre o gel(Figura 4B). Aplique água para ajudar o gel a flutuar livremente em uma fina película de água na placa com o lado de contato do solo voltado para cima.
NOTA: É fundamental acompanhar a orientação do gel. O lado do gel exposto ao solo e às raízes deve sempre enfrentar para cima (em direção ao usuário).
- Secagem de gel
- Corte um pedaço retangular de papel de gel(Tabela de Materiais)e coloque um pedaço ligeiramente menor de uma membrana polieethersulfone (tamanho de poros de 0,45 μm; Tabela de Materiais) em cima.
- Transfira o gel da placa para a pilha de papel/membrana de gel borrando usando pinças plásticas, lado do contato do solo voltado para cima. O gel deve ser relaxado (ou seja, não esticado) e completamente plano, sem bolhas de ar entre gel e membrana. Aplique um pouco de água na pilha de papel/membrana de gel para facilitar a transferência e posicionamento do gel.
- Cubra completamente a pilha de papel/membrana/gel de gel com um pedaço de papel alumínio e rotule a amostra de gel e sua orientação sobre a folha de plástico(Figura 4C). Coloque a pilha de papel/membrana/gel/papel plástico em uma pilha de gel a vácuo(Tabela de Materiais)e seque até que a pilha esteja totalmente dessecada (tipicamente 48-72 h). Para HR-MBG, defina a temperatura para 50-55 °C, para HR-ABG e HR-CBG melhor seca em temperatura ambiente.
- Remova o papel de gel da pilha seca e transfira o gel, que agora é inseparavelmente fundido com a membrana polieethersulfone, em um saco zip. A tampa de papel alumínio permanece no gel até pouco antes da análise LA-ICP-MS.
- Inclua uma peça de gel da folha de gel original como um método em branco, que não fica exposto ao solo. Processe o método em gel em branco idêntico ao gel de amostra após 3.3.2 - 3.3.4.
Figura 4: Recuperação de gel DGT e preparação para secagem após amostragem de soluto. (A) Placa com o gel DGT e rizotron logo após a amostragem de soluto. (B) Recuperação do gel DGT da placa em um banco de fluxo laminar. (C) Pilha de papel de gel/membrana de polietófone/tampa de gel/papel plástico DGT para secagem de gel. Note que o gel é ligeiramente colorido após sua implantação no solo da rizofera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Análise química do gel de ligação DGT
NOTA: Neste protocolo, a análise da distribuição soluto no gel de ligação DGT é realizada pelo LA-ICP-MS utilizando um sistema de excimer LA de 193 nm de nanosegundos de 193 nm equipado com uma célula de ablação de dois volumes acoplada a um quadrupole ICP-MS(Figura 5). Todos os instrumentos estão listados na Tabela de Materiais. Alternativamente, nanossegundos 213 nm ou 266 nm sistemas LA de estado sólido podem ser aplicados36,39,40,41,42,43. Se for necessária uma sensibilidade ou resolução de massa aprimorada, o campo setorial ICP-MS é uma alternativa ao quadrupole ICP-MS15,44. Detalhes sobre a elaboração das normas de gel DGT para calibração externa e acoplamento do sistema LA ao quadrupole ICP-MS são apresentados nas seções SI S4 e S5.
Figura 5: Configuração LA-ICP-MS para análise de gel DGT. (A) Nanosegundo 193 nm Sistema de excimer LA ArF e quadrupole ICP-MS. (B) Géis secos montados em placas de vidro e fixados no estágio de amostra de LA prontos para introdução na célula de ablação. (C) Gás nebulizador (Ar) do ICP-MS e gás transportador de aerossol (He ou Ar) da célula de ablação conectada à ICP através de um encaixe de adaptador Y-splitr bidiretivo e tocha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Preparação da amostra para LA-ICP-MS
- Transfira as amostras de gel seco, os padrões e os espaços em branco do método (que são mesclados com o suporte à membrana poliethersulfone) para pedaços individuais de fita adesiva de dois lados(Tabela de Materiais),do lado do gel voltado para cima. Crop peças de fita em excesso para economizar espaço na célula de ablação.
- Monte os géis secos em placas de vidro. Use placas de vidro individuais para cada amostra de gel, série padrão ou método em branco para permitir o arranjo flexível no estágio de amostra de LA (tamanho típico de 10 cm × 10 cm). Use um cortador de vidro para ajustar o tamanho da placa de vidro conforme necessário. Fixar as placas de vidro com os géis no estágio da amostra de LA(Figura 5B)utilizando plasticina(Tabela de Materiais). Nivele a superfície do gel ajustando o piso do palco e bloqueie o estágio da amostra na célula de ablação.
- Análise de varredura de linha LA-ICP-MS
- Acople o sistema LA ao ICP-MS conforme especificado na seção SI S5. No software LA(Tabela de Materiais),ajuste as configurações de luz da câmera (ou seja, 'Anel', 'Coax' e 'Transmitido') para iluminar a superfície do gel na célula de ablação e se concentre na superfície do gel ajustando a distância do eixo Z. Mova-se para locais aleatórios em toda a célula para garantir que todas as superfícies de gel estejam em foco.
- Defina os parâmetros de LA na janela 'Configuração a laser' do software LA. As configurações típicas utilizadas na análise de varredura de linha LA-ICP-MS dos géis DGT são: modo contínuo; produção de energia 20-30%; taxa de repetição de 10-20 Hz; diâmetro da mancha 100-200 μm; velocidade de varredura 150-250 μm s-1.
NOTA: Os parâmetros precisam ser otimizados para o tipo de gel utilizado e podem variar. Os parâmetros também podem ser aprimorados para aumentar a relação sinal/ruído, resolução espacial ou reduzir os tempos de aquisição, dependendo da configuração experimental e instrumental. Use uma produção de energia relativamente baixa (≤40 %) e taxa de repetição (≤25 Hz) para evitar penetrar através dos géis nos materiais de apoio39. Certifique-se de que a velocidade de varredura a laser está ≤ o diâmetro da mancha dividido pela duração total do ciclo de varredura ICP-MS (ver 4.2.6) para evitar a compressão dos pontos de dados e, portanto, uma perda de resolução na direção de varredura45. Por exemplo, ao definir um diâmetro de ponto de 200 μm e uma duração total do ciclo de varredura ICP-MS de 0,25 s, a velocidade de varredura deve ser de ≤800 μm s-1. - Selecione a ferramenta de linha e desenhe um padrão de linha de ~1 mm de comprimento através de um padrão de gel. Clique com o botão direito do mouse no padrão de linha na janela 'Padrões de varredura' e verifique se os parâmetros de LA definidos em 4.2.3. foram adotados. Use a ferramenta 'Duplicate Scans' para duplicar esta linha quatro vezes, com uma distância interline (distância entre o centro da linha) maior que o diâmetro da mancha(Figura 6). Esta abordagem oferece um total de cinco linhas paralelas por padrão gel (n = 5). Repita esta etapa para cada padrão de gel, calibração em branco e método em branco.
- Mova-se para a amostra de gel e desenhe uma única linha ao longo da borda superior da área retangular a ser analisada. Duplicar a linha para criar linhas paralelas para toda a área de amostra, conforme especificado em 4.2.3. Use uma distância interline de 300-400 μm. Certifique-se de que o foco (distância do eixo z) está definido corretamente para cada ponto inicial e final de cada linha.
NOTA: A resolução espacial da análise é maior ao longo da direção de varredura em comparação com a distância interline. Portanto, os pontos de partida e extremidade das linhas podem seguir melhor a direção dos gradientes de analito. Para gradientes de rizofera, este é geralmente perpendicular ao eixo raiz(Figura 6). - No software ICP-MS(Tabela de Materiais),configure um método 'Data Only' resolvido no método 'Método', selecione um ou mais isótopo(s) adequado para cada analito e inclua 13C como padrão de normalização interna31,36,40,41,42. Verifique se a detecção dos isótopos não está prejudicada pelas interferências46.
- Defina a duração total do ciclo de varredura do método ICP-MS ('Est. Reading Time') para ≤0,5 s com tempos de moradia apropriados por isótopo (tipicamente entre 10-50 ms). Defina as leituras 'leituras' ICP-MS ' para 1 e altere o valor 'Leituras/Réplica' para definir o tempo total de medição por amostra ('Est. Tempo de Amostragem'), ou seja, por linha de ablação individual. Isso depende dos parâmetros específicos de LA e das distâncias de linha definidas em 4.2.2 - 4.2.4.
- Para relatórios de dados, use um modo de coleta de dados de intensidade versus tempo e defina a 'Opção de gravação de arquivo' para ' New PerSample' para criar um arquivo de dados individual (aqui .xl) para cada linha de ablação.
- Configure uma sequência de amostra 'Batch' na tela ICP-MS 'Sample', com cada entrada de amostra correspondente a uma linha de ablação individual definida em 4.2.3 - 4.2.4.
- Clique em 'Analisar o lote' para iniciar a sequência de amostra no ICP-MS, que aguardará com a aquisição de dados até que seja acionado pelo primeiro pulso de laser (consulte SI S5 para obter detalhes sobre a configuração do gatilho).
- No software LA, selecione todas as linhas a serem analisadas e verifique se o método ICP-MS ('Est. Sampling Time', ver 4.2.6.) corresponde à duração das ablações de linha individual, que é tipicamente diferente para amostras de gel, padrões e em branco de método. Repita 4.2.6. para ajustar o método ICP-MS, se necessário.
- Clique em 'Emissão' na janela 'Laser Energy' para recarregar a cabeça laser e, em seguida, clique em 'Executar' para abrir a janela 'Executar experimento'. Aqui, selecione 'Padrões Selecionados Apenas', defina o 'Atraso de lavagem' para 20-30 s, marque a caixa 'Habilitar laser durante varreduras' e defina o 'Laser Warmup Time' para 10 s.
- Clique em 'Executar' na janela 'Executar experimento' para iniciar a análise de varredura de linha e monitorar a intensidade bruta do sinal em contagens por segundo (cps) para cada isótopo no ICP-MS em tempo real. Cada linha deve iniciar ('Laser Warmup Time', 10 s) e terminar ('Washout Delay', 20-30 s) com um gás em branco.
- Monitore a fluência a laser (J cm-2) durante a análise para avaliar a estabilidade do laser. Se a fluência variar em grande parte, aborte a análise e verifique se a fonte de laser e/ou seu sistema espelho estão totalmente funcionais.
- Após a análise, pare o plasma ICP-MS e defina a taxa de fluxo de gás transportador no sistema la para 0 mL min-1. Remova os géis da célula de ablação e armazene em sacos zip para uso posterior.
Figura 6: Esquema do projeto experimental DGT LA-ICP-MS (não para escalar). A ilustração retrata a amostragem in situ solute baseada em DGT na rizosfera e o mapeamento LA-ICP-MS da distribuição de soluto na superfície do gel, incluindo um close-up mostrando dimensões e parâmetros exemplares de varredura de linha. Observe que o gel DGT é horizontalmente virado quando transferido do solo da rizosfera para a placa de vidro, conforme indicado pela posição do retângulo no canto inferior do gel DGT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Processamento e calibração de dados
- Importar o arquivo de dados brutos (.xl) para cada linha ablada em software de planilha(Tabela de Materiais). A tabela de dados brutos mostra as leituras ICP-MS (pontos de dados) para cada isótopo em cps e os pontos de tempo correspondentes em s. Liste todas as linhas umas das outras em colunas diferentes.
- Avalie os dados de varredura de linha para estabilidade de sinal do padrão interno (13C) e tempos adequados de lavagem.
- Calcule um gás em branco médio para cada isótopo de todos os valores em branco de gás registrados antes das ablações da linha (ou seja, durante o tempo de aquecimento do laser) e subtraia o gás médio em branco das intensidades brutas correspondentes para cada isótopo para corrigir para o sinal de fundo.
- Aplique a normalização interna dividindo a intensidade do sinal de cada isótopo (cps) pela intensidade do sinal do padrão interno (cps) para cada ponto de dados para corrigir as variações na quantidade de material ablado e deriva instrumental.
- Lavo os dados antes do início e após o fim de cada linha ablada para remover o sinal de fundo. Transponha a tabela de dados para obter uma matriz de grade onde cada linha corresponde a uma linha ablada e cada coluna a um valor de intensidade de isótopos normalizado. Separe as matrizes de cada isótopo em planilhas individuais.
- Calcule a razão média de intensidade de sinal normalizada por isótopo para os padrões de calibração e calibração em branco e calcule a função de calibração (y = ax + b) utilizando um modelo de regressão linear com os carregamentos de analito padrão gel (μg cm-2; ver SI S4) como x-valores. Avalie a função de calibração de cada isótopo para linearidade47.
- Aplique a função de calibração na matriz de dados da amostra. Converta as razões de intensidade de sinal normalizada,
para carregamentos de analitos de gel, 
(μg cm-2), e posteriormente para fluxos solúcidas medianos de tempo, 
(pg cm-2 s-1), para cada isótopo e ponto de dados de acordo com Eq. 4 e Eq. 5:
Aqui, a é a inclinação da linha de calibração, b é a interceptação da linha de calibração, e t (s) é o tempo de implantação do gel durante a amostragem soluto. - Salve a matriz de dados de amostra calibrada para cada analito como arquivo txt.
- Geração de imagens
NOTA: Certifique-se de evitar qualquer operação de interpolação de pixels durante todas as etapas da geração de imagens, pois isso pode levar a gradientes de fluxo soluto artificialmente suavizada nas imagens resultantes.- Importar a matriz de dados de amostra calibrada (.txt) como imagem de texto no software de análise de imagem(Tabela de Materiais).
- Calcule a distância por pixel na direção x (ou seja, resolução lateral) multiplicando a velocidade de varredura a laser com a duração total do ciclo de varredura ICP-MS (por exemplo, assumindo uma velocidade de varredura de 200 μm s-1 e uma duração total do ciclo de varredura de 0,25 s, a resolução lateral equivale a 50 μm). A distância por pixel na direção y equivale à distância interline(Figura 6).
- Calcule o fator de correção da proporção da imagem. Portanto, divida a distância por pixel na direção y (por exemplo, 300 μm) pela distância por pixel na x-direção (por exemplo, 50 μm). Aplique o fator de correção y/x obtido (neste exemplo 6) em 'Escala'. Aplique a distância por pixel (em μm ou mm) na direção x como escala em 'Escala de conjunto'.
- Aplique uma escala de 'Look Up Table'ou seja, pseudocoloração para melhor visualização de gradientes químicos na imagem solute e ajuste a imagem 'balance de cor' para controlar os limites inferiores/superiores da faixa de exibição. Adicione uma'barra de calibração' e salve a imagem solute como arquivo de tiff.
- Copie a imagem solute usando o comando 'Copiar para Sistema' no software de análise de imagem e colar em software de publicação de desktop(Tabela de Materiais). Dimension-match, alinhar e compor a imagem soluto com a foto do ROI obtida em 3.1.7.
NOTA: Antes de copiar, redimensione a imagem soluto por exemplo, fator 10 através da aplicação de uma 'Escala X' de 10 e uma 'Escala Y' de 10 em 'Escala de conjunto' para garantir pixels suficientes para publicação de alta resolução.
para carregamentos de analitos de gel, 
(μg cm-2), e posteriormente para fluxos solúcidas medianos de tempo, 
(pg cm-2 s-1), para cada isótopo e ponto de dados de acordo com Eq. 4 e Eq. 5:
| Fabricação de gel DGT | Cultivo de plantas | Amostragem de solute in situ | Mapeamento de fluxo de solute LA-ICP-MS |
| HR-MBG 1 semana |
Preparação do solo 1 semana |
Aplicação de gel 1 hora por gel |
Preparação da amostra 1 hora por gel |
| HR-ABG 3 dias |
Montagem de rizotron 2 horas por réplica |
Período amostral de soluto variável, tipicamente 24 horas |
Análise LA-ICP-MS 1 dia por gel |
| HR-CBG 3 dias |
Crescimento da planta dependente do estudo |
Recuperação de gel 1 hora por gel |
processamento de dados 4 horas por gel |
| Secagem de gel 2-3 dias |
Geração de imagens 10 min por imagem |
Tabela 1: Tempos aproximados para etapas gerais da técnica DGT LA-ICP-MS.
Representative Results
Para demonstrar a capacidade e os detalhes dos dados do método de imagem DGT, compilamos a distribuição submm, fluxo 2D de múltiplas espécies de nutrientes labile e solute contaminante no solo adjacente às raízes de Fagopyrum esculentum e Salix smithiana (Figura 7). Os tempos aproximados para as etapas processuais gerais do protocolo são apresentados na Tabela 1.
As imagens solutas na Figura 7 foram geradas em três estudos diferentes utilizando géis de ligação HR-MBG ou HR-CBG. As imagens químicas mostram a distribuição do fluxo soluto 2D a uma resolução espacial de 82-120 μm ao longo do eixo x e 300-400 μm ao longo do eixo y, dependendo dos parâmetros LA-ICP-MS utilizados. Como nenhuma interpolação foi aplicada durante a calibração e redimensionamento de imagens, pixels únicos representam pontos de dados medidos. O alinhamento das imagens solutas com uma imagem fotográfica do ROI revela que a distribuição de fluxo soluto sub-mm e 2D de diferentes elementos é altamente variável de acordo com a estrutura do solo e a morfologia radicular. Isso pode ser atribuído ao comportamento biogeoquímico diferencial dos elementos no sistema solo-rizofera-planta, e sua interação com a matriz do solo e as raízes vegetais.
Na Figura 7A labile inorgânico Mg, Al, P, Mn e Fe foram visualizados em torno de uma raiz f. esculentum jovem cultivada em solo livre de carbonato fertilizado com NH4NO3. A distribuição de soluto submm mostrou zonas de diminuição dos fluxos de Al, P e Fe ao lado de seções radiculares mais antigas devido à absorção de raízes, e fluxos de Mg, Al, P, Mn e Fe no ápice raiz devido aos processos localizados de mobilização P da raiz F. esculentum. Note que a ponta raiz está localizada um pouco atrás da superfície do solo e, portanto, dificilmente visível na imagem fotográfica. A Figura 7B mostra a distribuição de metais de traço labil, incluindo Mn, Fe, Zn, Cd e Pb em torno de uma raiz de S. smithiana tolerante a metal cultivada em um solo moderadamente contaminado com Zn, Cd e Pb. As imagens solutivas visualizaram o esgotamento distinto particularmente de Zn, Cd e Pb na posição raiz imediata, mostrando que as raízes de S. smithiana atuam como uma pia localizada para metais de traço labile em solo contaminado. Além disso, podem ser observados aumentos localizados de Zn, Cd e Pb, indicando acúmulo desses metais de traço na interface solo-raiz imediata.
Além da imagem soluto multi elementar, o método apresentado também pode ser combinado com técnicas complementares de imagem baseadas em difusão, como optodes planar34. Isso é demonstrado na Figura 7C,onde a distribuição de metais de traço labile na rizofera de S. smithiana foi co-localizada com a distribuição de pH usando um gel de ligação de planar de uma camada únicacombinado 33. O substrato do solo foi fertilizado com (NH4)2SO4, levando a uma diminuição do pH ao longo dos eixos radiculares em ~1 unidade em comparação com o solo a granel. As reduções de pH foram co-localizadas com o aumento dos fluxos solutos de Mn, Fe, Co, Ni, e Pb, sugerindo solubilização metálica induzida por pH.
Além disso, esses resultados de exemplo mostram alguns dos potenciais artefatos de imagem que podem ser obtidos. Por exemplo, as inhomogeneidades estruturais do solo, por exemplo, observadas como uma linha horizontal no terço inferior da imagem do ROI da Figura 7A,podem causar descontinuidades de contato solo-gel, resultando em difusão limitada neste local para o gel de ligação. Por outro lado, a compactação excessiva do solo no rizotron pode levar à má porosidade, resultando em uma mudança artificial do status de redox do solo em direção à anoxia. Isso é ilustrado na Figura 7B,onde extensas áreas de fluxos Mn e Fe altamente elevados nas imagens solutos visualmente combinadas com uma densa camada de solo na imagem do ROI. Isso sugere uma diminuição do potencial de redox do solo devido à alta compactação do solo, resultando em dissolução redutiva e solubilização dos elementos altamente sensíveis à redox. Recomenda-se, portanto, um preenchimento cuidadoso e a inspeção visual da superfície do solo diretamente após o enchimento.
Figura 7: Distribuição submm 2D de nutrientes labile e espécies de soluto contaminante em diferentes interfaces terra-raiz. (A) Distribuição de P aniônico e mg cátônico, Al, Mn e Fe solutos em torno de uma raiz f. esculentum jovem. A amostragem co-localizada de solutos aniônicos e cônicos foi obtida utilizando-se HR-MBG por 24 h em uma saturação de água do solo de ~75% de WHC. As imagens De Al, P e Mn são exibidas como valores fDGT calibrados (pg cm-2 s-1), enquanto as imagens mg e fe mostram intensidades normalizadas em 13C. A barra de escala representa 1 cm. Este valor é adaptado do árbitro48. (B) A distribuição de Mn, Fe, Zn, Cd e Pb em torno de uma raiz de S. smithiana cultivada no solo moderadamente contaminada com Zn, Cd e Pb. Foram amostradas solutos metálicos de traço cationic utilizando-se HR-CBG por 20 h em uma saturação de água do solo de ~80 % WHC. Todas as imagens são exibidas como valores fDGT calibrados (pg cm-2 s-1). A barra de escala representa 0,5 cm. Este valor é adaptado do árbitro3. (C) A distribuição de pH e solutos cáticos múltiplos em torno de raízes de S. smithiana cultivadas no solo cravado com Cd. A co-localização da dinâmica pH e solute foi alcançada utilizando-se uma modificação do protocolo HR-MBG, permitindo a amostragem simultânea de soluto e imagem de optode planar33. As imagens Mn,, Zn e Cd são exibidas como valores fDGT calibrados (pg cm-2 s-1), enquanto as imagens fe, co, ni e pb mostram intensidades normalizadas de 13C. A barra de escala representa 1 cm. Este valor é adaptado do árbitro33. Os números apresentados são reproduzidos a partir dos artigos citados3,33,48 licenciados pela CC BY. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
O protocolo de imagem soluto apresentado aqui é um método versátil para visualizar e quantificar fluxos de nutrientes e contaminantes 2D em ambientes de solo-planta. É único em sua capacidade de gerar imagens multi-elementos em escala submm de espécies solutos labile na interface solo-raiz, excedendo a resolução espacial alcançável de métodos alternativos para medir gradientes solutos na rizofera substancialmente4. A abordagem amostral in situ direcionada do DGT, em combinação com um método de análise química altamente sensível, como o LA-ICP-MS, facilita a investigação detalhada da dinâmica do fluxo soluto em torno de raízes de plantas individuais cultivadas no solo ou substratos similares. Devido ao processo de amostragem baseado em pia, as imagens obtidas refletem a capacidade dos solutos visualizados e, portanto, são uma estimativa de sua disponibilidade vegetal10. Embora a medição inerente ao método de fluxos solutos tenha vantagens consideráveis como a interpretação como frações de nutrientes disponíveis pelas plantas, as medidas de fluxo são muito menos diretas para entender do que as medidas de concentração de água de poros. A geometria de amostragem padrão DGT em aplicações de solo a granel (especificamente os géis de difusão de 0,8 mm de espessura utilizados nessa configuração) permite comparar a concentração real de água porosa, csoln, e uma estimativa de concentração de água de porosa média por uma medição de DGT a granel, cDGT, e para a interpretação desses parâmetros em relação à dinâmica de reabastecimento de uma espécie de solute. No entanto, essa comparação não pode ser feita com base na aplicação DGT de imagem com camadas de difusão muito finas, uma vez que os valores cDGT derivados são irrealistamente pequenos34. Os resultados de imagem DGT nem sempre são simples e rápidos de interpretar e muitas vezes não são diretamente comparáveis às medições mais convencionais de concentração de água de poros.
Ao aplicar o método, algumas etapas críticas precisam ser cuidadosamente consideradas, principalmente relacionadas ao enchimento e rega dos recipientes de crescimento de rizotron. Durante o enchimento do solo no rizotron, é muito importante evitar compactar demais o solo, pois as raízes da planta não podem penetrar fortemente o solo compactado e o crescimento das raízes será inibido. Observamos raízes evitando solo fortemente compactado e crescendo ao longo das bordas internas do recipiente de crescimento de rizotron, onde o solo é geralmente menos compactado. Neste caso, raízes individuais localizadas no centro dos rizotrons, onde os géis DGT podem ser aplicados convenientemente, podem não se desenvolver de forma alguma, inibindo efetivamente a aplicação bem sucedida do gel. Em nosso laboratório, a experiência mostrou que as densidades a granel do solo seco de 1,0-1,4 g cm-3 permitem o desenvolvimento de raízes sem obstáculos. Além disso, a compactação excessiva do solo também é uma fonte potencial de artefatos sobre a solubilidade de elementos sensíveis ao redox e espécies biogeoquímicas associadas. Como o volume total dos poros é reduzido e a distribuição do diâmetro dos poros é deslocada para diâmetros mais baixos em solo altamente compactado, está disponível menos volume de poros de diâmetro maior, o que pode levar a condições redutivas localmente. Consequentemente, os óxidos MnIII/IV- e FeIIIpodem ser reduzidos, levando ao aumento dos fluxos Mn2+ e Fe2+. A dissolução de óxidos fe, que são importantes locais de sorção, por exemplo, para fosfato e micronutrientes, pode liberar espécies sorbed e/ou co-precipitadas e, assim, causar fluxos artificialmente elevados das espécies biogeoquimicamente associadas. Um problema semelhante pode surgir se os recipientes de crescimento forem regados demais. A evaporação através da pequena área de superfície do solo no topo do recipiente de crescimento é baixa e o solo pode permanecer saturado de água por até várias semanas após o plantio, o que também pode causar artefatos redox.
Outra consideração importante é a funcionalidade química do gel de ligação HR-DGT fabricado. Seguindo o protocolo, são obtidos géis finos com distribuição homogênea das fases de ligação. Se os géis tiverem áreas de distribuição de material inhomogêneo (por exemplo, buracos no gel ou agregados de fases de ligação) essas áreas precisam ser removidas ou, se muito extensas, o protocolo de fabricação de gel precisa ser repetido. Se preparado corretamente, o gel deve ser capaz de ligar as espécies solutos alvo que se difundem no gel imediatamente e quantitativamente27, o que é determinado pela capacidade de ligação de gel específica de analito. Embora exceder a capacidade do gel seja menos problemático em solos não contaminados, deve ser considerado em solos contaminados por metais e ambientes de solo salino. A saturação das fases de ligação de gel não só prejudicará a amostra quantitativa de soluto, mas também resultará em difusão lateral de solutos entre fases de ligação no gel, levando a uma localização indefinida de características de fluxo de soluto em pequena escala. Assim, se forem esperadas quantidades muito altas de espécies de nutrientes/contaminantes labile no ambiente do solo alvo, devem ser realizados testes preliminares. Para estimar os carregamentos DGT esperados, a amostragem do pistão DGT do solo a granel seguida de elução de gel e análise química úmida pode ser aplicada15,49. Se necessário, os tempos de implantação do DGT podem ser ajustados para reduzir o tempo de contato do gel e, assim, evitar a saturação do gel acima dos limites de capacidade. Por outro lado, testes preliminares também podem ser úteis para identificar os tempos de contato de gel necessários e/ou sensibilidades LA-ICP-MS se forem esperados carregamentos solutos muito baixos, o que pode ser importante para mapear os pontos de rastreamento dos elementos de rastreamento nos níveis naturais de fundo do solo15. Além disso, o funcionamento correto do gel DGT deve ser verificado antes de sua aplicação experimental através do carregamento controlado de géis na preparação das normas de calibração DGT LA-ICP-MS. O padrão de gel fornece um carregamento de analito de gel de referência compatível com matriz que pode ser usado para avaliar se o carregamento de gel de amostra determinado por LA-ICP-MS está dentro do alcance esperado. Se não conseguir obter um sinal diferente do ruído de fundo em branco do gás e do método, o operador deve garantir que os procedimentos laboratoriais para análise de elementos de rastreamento sejam implementados e todas as etapas do protocolo sejam executadas corretamente. Às vezes, o gel DGT é acidentalmente virado após amostragem soluto com o lado carregado do solo voltado para a placa de vidro em vez do raio laser, resultando em baixas intensidades de sinal e características erroneamente viradas nas imagens finais de fluxo soluto.
Durante a análise LA-ICP-MS, uma grande quantidade de dados é gerada, o que leva um tempo considerável para ser avaliado. Em nosso laboratório, usamos scripts internos de avaliação de dados adaptados para nosso formato de saída de dados de destino usando software de planilha padrão. Após classificação e calibração semi-automatizadas, a plotagem de imagens é realizada utilizando ferramentas de análise de imagem de acesso aberto e de código aberto (ImageJ, Fiji50). Essa abordagem permite o controle total sobre a classificação, avaliação e apresentação de dados, o que é essencial porque os dados coletados correspondem a pixels retangulares, e não quadráticos, que precisam ser exibidos adequadamente nos mapas soluto gerados. Além disso, durante o processamento de dados, qualquer interpolação de pixels deve ser cuidadosamente evitada. A interpolação de pixels leva a gradientes suavizados nas imagens químicas, resultando em recursos de distribuição de elementos amolecidos, muitas vezes circulares e, portanto, é uma alteração indesejável dos dados originais. A interpolação de pixels é um procedimento padrão em operações de redimensionamento e re-formatação em muitos produtos de software de processamento de imagens, mas pode ser desmarcada normalmente.
Em conclusão, o método descrito é um avanço significativo para a compreensão da dinâmica de nutrientes e contaminantes em sistemas naturais de solo-rizosfera-planta. Além das aplicações somente DGT, o método pode ser combinado com outras técnicas de imagem baseadas em difusão, como planar optodes3,33,42,43,48,51 e zymografia20,21,22,23,24, e pode ser desenvolvido ainda mais para incluir elementos adicionais e parâmetros do solo.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi co-financiado pelo Fundo Austríaco de Ciência (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) e o Fundo Austríaco de Ciência (FWF) e o Estado Federal da Baixa Áustria: P27571-BBL (Jakob Santner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
| Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
| Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
| Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
| Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
| Clamp | Local warehouse | n/a | |
| Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
| DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
| DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
| Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
| Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
| Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
| Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
| Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
| High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
| HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
| Horizontal shaker | GFL | 305 | |
| HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
| ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
| Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
| Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
| LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
| LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
| Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
| Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
| Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
| Overhead shaker | GFL | 3040 | |
| Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
| pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
| pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
| Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
| Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
| Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
| Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
| Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
| PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
| PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
| PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
| PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
| Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
| Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
| Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
| Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
| Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
| Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
| Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
| Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
| Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
| ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |
References
- Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
- Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
- Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
- Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
- Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
- Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
- Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
- Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
- Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
- Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
- Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
- Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
- Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
- Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738 (2020).
- Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
- Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
- Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
- Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
- Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
- Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
- Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
- Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
- Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820 (2020).
- Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
- Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
- Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
- Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
- Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
- Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
- Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
- Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
- Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
- Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
- Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
- Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
- Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
- Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369 (2017).
- Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
- Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
- May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
- Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
- Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
- Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122 (2020).
