Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

التصور ثنائي الأبعاد والتخصيص الكمي للمغذيات النباتية غير العضوية والملوثات في التربة

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61661
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

Summary

يقدم هذا البروتوكول سير عمل للتصور 2D الفرعية من متعدد المغذيات غير العضوية الملوثات والملوثات الأنواع باستخدام التدرجات الناشرة في الأفلام رقيقة (DGT) جنبا إلى جنب مع التصوير الطيفي الشامل. ويرد وصف تفصيلي لأخذ العينات المذابة والتحليل الكيميائي العالي الدقة من أجل رسم خرائط كمية للسولوتات في الغلاف الريزوسفيري للنباتات الأرضية.

Abstract

نحن وصف طريقة لتصور ثنائي الأبعاد (2D) وتكميم توزيع اشرح (أي، عكسي الممتزة) المغذيات غير العضوية (على سبيل المثال، P، Fe، Mn) والملوثات (على سبيل المثال، كما، CD، Pb) الأنواع المذابة في التربة المتاخمة لجذور النبات ('rhizosphere') في شبه ملليمتر (~ 100 ميكرومتر) تحليل المكاني. وتجمع هذه الطريقة بين أخذ العينات المذابة المستندة إلى بالوعة بواسطة التدرجات الناشرية في تقنية الأفلام الرقيقة (DGT) مع التحليل الكيميائي الذي تم حله مكانياً عن طريق الاستئصال بالليزر مقروناً بالحث لقياس الطيف الكتلي الكتلي (LA-ICP-MS). تعتمد تقنية DGT على الهيدروجيلات الرقيقة مع مراحل الربط التحليلية الانتقائية الموزعة بشكل متجانس. مجموعة متنوعة من مراحل الربط المتاحة يسمح لإعداد أنواع هلام DGT مختلفة بعد إجراءات بسيطة تصنيع هلام. لنشر هلام DGT في رهيزوفير، تزرع النباتات في حاويات نمو مسطحة وشفافة (rhizotrons)، والتي تمكن من الحد الأدنى من الوصول الغازية إلى نظام الجذر التربة المزروعة. بعد فترة ما قبل النمو، يتم تطبيق المواد الهلامية DGT على مناطق مختارة من الفائدة لأخذ العينات في الموقع في ريزوسفير. بعد ذلك، يتم استرداد المواد الهلامية DGT وإعدادها للتحليل الكيميائي اللاحق لل solutes ملزمة باستخدام LA-ICP-MS خط التصوير المسح الضوئي. تطبيق التطبيع الداخلي باستخدام 13C والمعايرة الخارجية باستخدام المصفوفة مطابقة هلام المعايير يسمح كذلك لتكميم التدفقات 2D. وهذه الطريقة فريدة من نوعها في قدرتها على توليد صور كمية، دون مم، 2D من التدفقات المذابة متعددة العناصر في بيئات التربة النباتية، متجاوزة درجة الدقة المكانية القابلة للتحقيق للأساليب الأخرى لقياس التدرجات المذابة في الغلاف الريزوسفيري بشكل كبير. نقدم تطبيق وتقييم طريقة تصوير الأنواع المتعددة المذابة واليونية في رهيزوفير النباتات الأرضية ونسلط الضوء على إمكانية الجمع بين هذه الطريقة وتقنيات التصوير المذابة التكميلية.

Introduction

10 - يشكل اقتناء المغذيات بواسطة النباتات المحصولية عاملاً رئيسياً في تحديد إنتاجية المحاصيل. وقد تمت دراسة العمليات التي تحكم كفاءة امتصاص المحاصيل للمغذيات، ولا سيما الآليات التي تتحكم في توافر المغذيات إلى الجذور النباتية في الواجهة البينية للتربة - الجذر، وهي رهيزوفير، التي تم الاعتراف بها لدورها في الحصول على مغذيات المحاصيل. وتشمل العمليات الهامة لمحتوى المغذيات النباتية ما يلي: نقل المغذيات نحو الجذر؛ ومدى المغذيات موازين الضم الديناميكية بين الأنواع المذابة في مياه التربة والأنواع المربوطة بأسطح التربة الصلبة؛ المنافسة الميكروبية على المواد الغذائية؛ تمعدن ميكروبي للمغذيات الموجودة في المواد العضوية في التربة؛ و المغذيات الداخلة في تكافل الجذر. يتم التحكم إلى حد كبير في امتصاص الملوثات المعدنية النزرة غير العضوية (oid) من خلال نفس الآليات.

ويمكن ملاحظة أنماط المغذيات المختلفة في طبقة الريزوسفير، وذلك اعتماداً على توافر المغذيات والملوثات والطلب على النباتات والانتفاض في التربة. لعناصر الخربة بقوة مع معدلات استيعاب عالية نسبيا (على سبيل المثال، P، Fe، Mn، ZN، AS، CD، Pb)، نضوب من الكسر العنصر (أي، مدمة عكسي) مقارنة بالتربة السائبة، مع عرض منطقة النضوب غالبا ما يجري ≤1 ملم، في حين أن لمزيد من المواد الغذائية المتنقلة مثل NO3-، يمكن أن تمتد مناطق النضوب تصل إلى عدة سنتيمترات1. وعلاوة على ذلك، لوحظ تراكم عناصر مثل Al وCD عندما يتجاوز توافر معدلات امتصاص النباتات2،3.

ونظرا لأهمية عمليات ريزوسفير في المغذيات والملوثات الدراجات ، وقد وضعت عدة تقنيات لقياس جزء العنصر النباتي المتاحة في دقة المكانية العالية4،5. ومع ذلك، فإن قياس التوزيعات الصغيرة الحجم في اللبوليات قد ثبت أنها صعبة لعدة أسباب. وتقابل صعوبة كبيرة في ذلك أخذ عينات من كميات صغيرة جداً (نطاق ميكرولتر منخفض) من التربة و/أو المسام في مواقع محددة متوازِقة لجذور النباتات الحية لحل تدرجات المغذيات الحادة في الغلاف الريزوسفيري. أحد النهج لمعالجة هذه المشكلة هو استخدام أكواب الشفط الجزئي لاستخراج عينات المسام6. بهذه الطريقة، قام A. Göttlein و A. Heim و E. Matzner7 بقياس تركيزات المغذيات المسامية للتربة في محيط جذور Quercus robur L. بدقة مكانية تبلغ حوالي 1 سم. ومن الصعوبة في تحليل كميات الميكL من التربة أو محلول التربة، أن هذه الأحجام الصغيرة للعينات، بالإضافة إلى التركيزات المنخفضة لجميع الأنواع الغذائية الرئيسية، تتطلب تقنيات تحليل كيميائية شديدة الحساسية.

نظام بديل، قادرة على حل التدرجات المغذيات في قرار وصولا الى ~ 0.5 ملم، هو أن تنمو حصيرة الجذر على سطح كتلة التربة، مع طبقة رقيقة غشاء هيدروفيلي يفصل التربة من الجذور8،9. في هذا التكوين، يمكن أن تمر الملوثات من خلال الغشاء والجذور يمكن أن يستغرق المواد الغذائية والملوثات من التربة في حين exudates الجذر يمكن أن تنتشر في التربة. بعد إنشاء طبقة جذر كثيفة، يمكن أخذ عينات من كتلة التربة وشرائحها للحصول على عينات التربة لاستخراج الكسور اللاحقة من العناصر. وبهذه الطريقة، يمكن تحليل المغذيات أحادية البعد، والتدرجات الملوثة، متوسط عبر مساحة كبيرة نسبيا (~ 100 سم2).

وثمة تحد آخر يتمثل في الحصول على عينات من جزء العناصر المُتَرَض، الذي يتوفر في النبات، لأن معظم تقنيات استخراج التربة الكيميائية تعمل بشكل مختلف جدا مقارنة بالآليات التي تأخذ بها النباتات المغذيات والملوثات. في العديد من بروتوكولات استخراج التربة، يتم خلط التربة مع محلول مستخرج بهدف إقامة توازن (زائف) بين جزء العنصر المذاب والكسر المُرَكَّب. ومع ذلك، فإن النباتات تُستوعب المغذيات بشكل مستمر، وبالتالي، غالباً ما تستنفد تدريجياً تربة ريزوسفير. على الرغم من أن بروتوكولات استخراج التوازن قد اعتمدت على نطاق واسع كما اختبارات التربة كما هي سهلة لتنفيذ, الكسر المغذيات المستخرجة غالبا لا يمثل الكسر المغذيات المتاحة للنبات جيدا10,11,12,13. وقد اقترحت أساليب بالوعة التي تستنفد باستمرار التربة العينة للمغذيات كأساليب مفيدة وربما تشبه أفضل آلية امتصاص المغذيات الأساسية من خلال محاكاة عمليات امتصاص الجذر10،11،14،15.

بالإضافة إلى الطرق المذكورة أعلاه، تم تطوير تطبيقات التصوير الأصلية، قادرة على قياس خرائط المعلمة المستمرة مع قرارات ≤100 ميكرومتر عبر مجالات الرؤية من عدة سم2 عناصر محددة والتربة (الحيوي) المعلمات الكيميائية5. يمكن استخدام التصوير الذاتي لتصوير توزيع العنصر في ريزوسفير شريطة أن النظائر المشعة المناسبة متوفرة16. يمكن تحديد optodes planar تصور المعلمات الكيميائية الهامة للتربة مثل درجة PH و pO217،18،19، ويمكن تعيين نشاط الإنزيم أو توزيعات البروتين الكلي باستخدام تقنيات التصوير مؤشر الفلورسنت مثل zymography التربة20،21،22،23 و / أو طرق النشاف الجذر24. بينما يقتصر التصوير الزموغرافي والرادوغرافيا التلقائي على قياس معلمة واحدة في وقت واحد، يمكن إجراء التصوير pO2 و pO باستخدام optodes الألواح الألواح في وقت واحد. توفر تقنيات حصيرة الجذر التقليدية معلومات 1D فقط ، في حين توفر أكواب الشفط الجزئي قياسات نقطة أو معلومات 2D منخفضة الدقة ، ولكن كلا النهجين يسمحان بتحليل العناصر المتعددة. وفي الآونة الأخيرة، قدم P. D. Ilhardt، وآخرون25 نهجا جديدا باستخدام التحليل الطيفي للانهيار المستحث بالليزر (LIBS) لرسم خريطة توزيعات متعددة العناصر 2D الكلية بدقة تبلغ ~ 100 ميكرومتر في عينات أساسية من جذور التربة حيث تم الحفاظ على توزيع العناصر الطبيعية عن طريق إعداد العينة بعناية.

التقنية الوحيدة القادرة على أخذ العينات المستهدفة 2D من الملوثات الغذائية المتعددة والملوثات في القرار المكاني العالي هو التدرجات الناشرية في الأفلام الرقيقة (DGT) تقنية، طريقة أخذ العينات المستندة إلى بالوعة أن يشل اللبل تتبع المعادن (loid) الأنواع في الموقع على مادة ملزمة جزءا لا يتجزأ من طبقة هيدروجيل26،27. تم إدخال DGT كتقنية تحديد دقيق للمواد الكيميائية لقياس اللواتات اللطيفية في الرواسب والمياه ، وسرعان ما تم اعتماده لاستخدامه في التربة28. فإنه يتيح دون ملم حجم التصوير الملتهب متعددة العناصر، والتي أظهرت في البداية في رواسب النهر29، وقد تم تطويرها أكثر لتطبيقها في رهيزوفيرس النباتية30،31،32،33.

وبالنسبة لأخذ عينات DGT، يتم تطبيق ورقة هلامية بحجم 3 سم × 5 سم تقريبًا على جذر نباتي واحد ينمو في الطبقة السطحية من كتلة التربة، مع غشاء هيدروفيلي يفصل الجل عن التربة. خلال وقت الاتصال، تنتشر العناصر الغذائية اللملية و/أو الملوثات نحو الجل وترتبط على الفور بالمواد الملزمة المدرجة في الجل. وبهذه الطريقة، يتم تأسيس تدرج تركيز، وبالتالي تدفق صافي مستمر نحو الجل وتغلب خلال وقت أخذ العينات. بعد أخذ العينات، يمكن إزالة الهيدروجيل وتحليله باستخدام تقنية كيميائية تحليلية تسمح بتحليل مكاني. وهناك تقنية متخصصة للغاية وتستخدم كثيرا لهذا الغرض هو الليزر الاجتثاث موحى يقترن البلازما الطيفي كتلة (LA-ICP-MS). وفي بعض الدراسات المبكرة، استخدمت أيضاً انبعاثات الأشعة السينية الناجمة عن الجسيمات الدقيقة (PIXE)29. يسمح أخذ العينات DGT مع تحليل LA-ICP-MS للتصوير الكيميائي متعدد العناصر بدقة مكانية تبلغ حوالي 100 ميكرومتر. وإذا استخدمت تقنيات شديدة الحساسية من نوع ICP-MS (مثل مجال القطاع ICP-MS) يمكن تحقيق حدود منخفضة للغاية للكشف. في دراسة حول تأثير liming على Zn وامتصاص CD من الذرة15، تمكنا من رسم خريطة القرص المضغوط في الذرة rhizosphere في التربة غير الملوثة مع حد من الكشف عن 38 pg سم-2 من القرص المضغوط في منطقة هلام. DGT، optodes بلا تخطيطي، وzymography تعتمد على انتشار العنصر المستهدف من التربة إلى طبقة هلام، والتي يمكن استغلالها لتطبيق مجتمعة من هذه الأساليب من أجل صورة في وقت واحد، أو على التوالي، صورة عدد كبير من المعلمات ذات الصلة للمغذيات النباتية وامتصاص الملوثات. معلومات مفصلة عن الجوانب الكيميائية التحليلية للتصوير DGT، حول إمكانية الجمع بين DGT وطرق التصوير الأخرى، وعلى تطبيقاتها يتم استعراض شامل في المرجع34،35.

في هذه المقالة وصف كيفية تنفيذ تجربة التصوير المذاب باستخدام تقنية DGT على جذور النباتات الأرضية في بيئة التربة غير المشبعة، بما في ذلك زراعة النباتات، وتصنيع الجل، وتطبيق هلام، وتحليل هلام وتوليد الصورة. وقد تم تفصيل جميع الخطوات بالتفصيل، بما في ذلك ملاحظات عن الخطوات الحاسمة والبدائل التجريبية.

Protocol

1. تلفيق من هلام DGT

ملاحظة: تتوفر عدة أنواع هلام DGT للتصوير 2D من الأنواع المذابة في عالية (دون مم) دقة المكانية35. هنا ، تلفيق ثلاثة ذات دقة عالية (HR) - DGT الهلام الربط المستخدمة في تطبيقات التصوير المذاب بإيجاز. الإجراءات المختبرية لتحليل العناصر النزرة، وكذلك إجراءات التصنيع التفصيلية لجميع المواد الهلامية HR-DGT المعروضة موضحة في قسمي المعلومات الداعمة (SI) S1 و S2.

  1. البولي يوريثين القائم على أنيون مختلطة و هلام ربط الموجبة (HR-MBG; SI S2.1)31
    1. إعداد تعليق هلام البولي يوريثين مع الزركونيوم (الرابع) المتفرقة متجانساً الهيدروكسيد و iminodiacetate (IDA) مراحل.
    2. معطف تعليق هلام في طبقة رقيقة على لوحة زجاجية وبدء تشكيل هلام عن طريق تبخر المذيبات للحصول على 0.1 مم رقيقة، المسيل للدموع واقية من أنيون ودل ملزمة الموجبة (HR-MBG).
  2. Polyacrylamide-zirconia anion ملزم هلام (HR-ABG; SI S2.2)36
    1. تلفيق 0.4 مم رقيقة agarose عبر ربط هلام polyacrylamide (APA) بعد تحديد الجل الصب الإجراءات37 (انظر SI S2.4 لبروتوكول مفصل من تصنيع APA).
    2. يترسب الزركونيوم (IV) الهيدروكسيد مراحل في هلام APA مسبق الصب للحصول على 0.4 ملم رقيقة anion ملزمة هلام (HR-ABG).
  3. Polyacrylamide-iminodiacetate ربط هلام (HR-CBG; SI S2.3)38
    1. إعداد تعليق هلام polyacrylamide مع مراحل مشتتة متجانسا المؤسسة الدولية للتنمية.
    2. يلقي الجل بين اثنين من لوحات الزجاج وبدء تفاعل البلمرة للحصول على 0.4 مم رقيقة ربط هلام (HR-CBG) حيث تستقر مراحل المؤسسة الدولية للتنمية إلى جانب واحد من هلام.

2- زراعة النباتات

ملاحظة: يستخدم النظام التجريبيرهيزوترونات 4 (الشكل 1)لزراعة النباتات في التربة غير المشبعة للتصوير المذاب. أولا، يتم وصف رهيزوترون التربة ملء وسقي، ثم تعطى تفاصيل عن نمو النباتات التجريبية. وترد تفاصيل عن تصميم rhizotron وإعداد الركيزة التربة قبل ملء في rhizotron في قسم SI S3.

Figure 1
الشكل 1: تصميم Rhizotron (وليس على نطاق واسع). (A) عرض انفجرت من حاوية النمو rhizotron. (ب) تجميع rhizotron خلال نمو النبات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. حشوة التربة Rhizotron
    1. قبل ملء rhizotron مع التربة قبل ترطيب (محتوى المياه gravimetric, Equation 6 , ومن المعروف; انظر SI S3.2), إغلاق ثقوب سقي في الجزء الخلفي من rhizotron باستخدام شريط لاصق وإزالة لوحة أمامية والقضبان التثبيت ومسامير.
    2. وزن رهيزوترون فارغة (باستثناء لوحة الجبهة، والقضبان، ومسامير)، ثمانية 5 سم × 11 سم ألواح الاكريليك و 16 المشابك(جدول المواد)وتسجيل مجموع الأوزان.
    3. نعلق على لوحة واحدة صغيرة الاكريليك في الجزء السفلي من rhizotron باستخدام اثنين من المشابك على كل جانب، مع ضغط المشابك الموجهة إلى إطار rhizotron، وبالتالي فإن لوحة لا ينحني إلى الداخل وحجم ثابت.
    4. اِن نميل رهيزوترون قليلاً نحو لوحة بلاستيكية صغيرة وملئها بتربة مرطبة قبلاً تصل إلى ارتفاع 4 سم(الشكل 2A). توزيع التربة داخل rhizotron عن طريق تهييج rhizotron قليلا وبلطف ضغط التربة من قبل بضعة مم (اعتمادا على خصائص التربة المحددة) مع أداة ضغط (الشكل 2B).
    5. كرر 2.1.3 - 2.1.4 حتى يتم تعبئة rhizotron مع التربة (الشكل 2C). ترك فجوة من ~ 3 سم في الجزء العلوي لزراعة لاحقة من الشتلات في rhizotron.
    6. وزن rhizotron المملوءة التربة (بما في ذلك 8 لوحات صغيرة و 16 المشابك) وتسجيل الوزن. من هذا، طرح الوزن رهيزوترون فارغة حصل في 2.1.2 وتسجيل الفرق الوزن، أي، كتلة التربة الرطبة، Equation 7 (ز)، في rhizotron.
    7. حساب كتلة التربة الجافة في رهيزوترون، Equation 8 (ز)، وفقا لEq. 1، ومن ثم حساب كثافة الجزء الأكبر من التربة الجافة، Equation 9 (ز سم-3)،في rhizotron وفقا لEq.
      Equation 1
      Equation 2
      هنا، Equation 10 (سم3)هو الحجم الداخلي الإجمالي للرهيزوترون.
      ملاحظة: القيم النموذجية Equation 9 في الريزوترون هي بين 1.0-1.4 غرام سم-3. لا تتجاوز 1.5 سمز -3 كما قد يعوق نمو الجذر فوق هذه القيمة.
    8. ضع الريزوترون المملوء بالتربة على صندوق دعم وأزل جميع المشابك واللوحات الصغيرة من rhizotron (الشكل 2D). تنظيف بعناية إطار rhizotron (أي الحواف) باستخدام ورقة الأنسجة، كما جزيئات التربة المتبقية على الإطار يمكن أن يسبب تسرب.
      ملاحظة: يجب أن يكون سطح التربة المكشوف متجانسًا ومستويًا بإطار الريزوترون بدون أي شقوق أو فجوات. إذا لم يكن كذلك، إفراغ rhizotron وكرر 2.1.2 - 2.1.8.
    9. قطع قطعتين من البوليtetrafluoro ايثيلين (PTFE) (جدول المواد)احباط إلى 22 سم × 13 سم لكل منهما. وبالإضافة إلى ذلك، قطع قطعة من رقائق بلاستيكية إلى 46 سم × 15 سم. سجل مجموع PTFE والأوزان احباط البلاستيك. ضع أول قطعة من رقائق PTFE على النصف العلوي من سطح التربة المكشوفة في الريزوترون، وتمتد ~ 1 سم على مستوى التربة في الجزء العلوي من rhizotron.
    10. إصلاح بعناية احباط PTFE إلى إطار rhizotron باستخدام شريط لاصق (الشكل 2E). تبدأ من خلال تحديد زاوية واحدة في الجزء العلوي من rhizotron الأولى، تليها الزاوية المعاكسة وأخيرا زوايا اثنين مزيد أسفل rhizotron. تطبيق التوتر عند تحديد زوايا 2-4 لضمان سطح احباط مسطحة. إذا ظهرت الطيات، فتح وإعادة إصلاح الشريط في الزوايا الفردية (وليس في كل مرة) حتى تتم إزالة جميع طيات واحباط PTFE هو شقة ومتجاورة مع سطح التربة.
    11. ضع القطعة الثانية من احباط PTFE على الطرف السفلي من rhizotron، وتداخل الجزء العلوي من احباط PTFE من قبل ~ 1 سم. كرر 2.1.10 لتحديد احباط PTFE الثاني إلى rhizotron.
    12. ضع الرقاقة البلاستيكية (46 سم × 15 سم) على رقائق PTFE. إصلاح احباط البلاستيك باستخدام إجراء التثبيت كما هو مفصل في 2.1.10.
    13. ضع لوحة أمامية على ريزونون المملوء بالتربة والمغطى بورائق التعبئة. وضع واحد السكك الحديدية حول كل جانب من rhizotron وتشديد مسامير باليد لإصلاح القضبان، وبالتالي، لوحة أمام لrizotron. يتم وضع مسامير نحو الجانب المغلق من rhizotron، أي، الجانب مع ثقوب سقي (الشكل 1A).

Figure 2
الشكل 2: الجمعية وملء Rhizotron لزراعة النباتات في التربة للتصوير المذاب في رهيزوفير. (أ) تعبئة التربة في رهيزوترون. (ب) ضغط التربة المملوءة باستخدام أداة ضغط. (ج)رهيزوترون مملوءة بالتربة مع ألواح الاكريليك الصغيرة والمشابك. (د)رهيزوترون مملوءة بالتربة مع سطح التربة المكشوفة. (E) رهيزوترون مملوءة بالتربة مغطاة جزئيا مع احباط PTFE واقية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: معالجة Rhizotron وتطبيق هلام DGT. (أ) سقي التربة باستخدام 10 مل نصائح ماصة في سقي الثقوب في الجزء الخلفي من rhizotron. (ب) زراعة الشتلات (المشار إليها على أنها بقع خضراء) في رهيزوترون المليئة بالتربة والمغلقة. (C)Rhizotron زرعت مع قصاصات ساليك سميثيانا وإزالة اللوحة الأمامية وغطاء احباط البلاستيك. (D) تقشير بعناية قبالة غطاء احباط PTFE قبل تطبيق هلام DGT. (E) صورة عالية الدقة لواجهة التربة الجذر ROI. (F) تطبيق لوحة الجبهة مجهزة هلام DGT على rhizotron. (G) صورة من العائد على الاستثمار مع هلام DGT تطبيقها أثناء أخذ العينات المذاب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. سقي التربة
    1. تحديد قدرة الاحتفاظ بالماء (WHC) للتربة التجريبية في rhizotron. وتحقيقا لهذه الغاية، تصنيع رهيزوترون اثنين مع قاع مفتوح وملئها بالتربة على النحو المحدد في القسم 2-1. تشبع تماما هذه مفتوحة، والريزونات التربة مليئة عن طريق الغمر في وعاء المياه لمدة 16 ساعة واستنزاف rhizotrons لمدة 8 ساعة.
    2. أخذ عينة تربة مركب من ~ 50 غرام من مواقع عشوائية في رهيزوترونات مفتوحة القاع وتجفيف العينة في 105 درجة مئوية لتحديد Equation 6 وفقا لEq. S1. يتفق العزم Equation 6 مع WHC للتربة، وبالتالي، يتم التعبير عنه على أنه Equation 11 (ز-1).
    3. تحديد الهدف Equation 6 في rhizotron التجريبية. خلال مرحلة النمو، تعيين Equation 6 60٪ من WHC (أي عامل WHC، Equation 12 ) لتزويد النباتات مع كمية كافية من الماء مع تجنب الظروف anoxic في rhizotron.
    4. حساب الكتلة الكلية للمياه التي يجب إضافتها، Equation 13 (ز)، لري التربة في الريزوترون عند الهدف Equation 6 وفقاً للمقرح 3. حساب كتلة المياه الموجودة في التربة في رهيزوترون، Equation 14 (ز).
      Equation 3
    5. تقسيم Equation 13 عدد من ثقوب الري (هنا 14) للحصول على كتلة من الماء الذي يمكن إضافته في كل حفرة سقي. إضافة الماء عن طريق دفع 10 مل نصائح ماصة في سقي الثقوب والسماح لتدفق المياه في التربة عن طريق الجاذبية (الشكل 3A).
  2. نمو النبات
    1. بذور ما قبل الإنبات من النبات التجريبي (على سبيل المثال، على ورقة الترشيح الرطب) وفقا لمتطلبات الإنبات البذور محددة حتى يظهر الشعاع (يصل إلى 1 سم طويلة).
    2. النبات ما يصل إلى اثنين من الشتلات في rhizotron كما هو مبين في الشكل 3B. في زراعة، إضافة ~ 5 مل من الماء مباشرة إلى الشتلات لدعم نموها. تغطية افتتاح أعلى من rhizotron لأول ~ يومين بعد زرع شفافة ، ورطوبة الاحتفاظ فيلم (جدول المواد). التفاف rhizotron في رقائق الألومنيوم لمنع النمو microphytic.
      ملاحظة: وبصرف النظر عن الشتلات، يمكن أيضا أن تزرع قصاصات النباتات في rhizotrons.
    3. نقل رهيزوترون المزروعة إلى غرفة النمو، مع الظروف البيئية (أي، درجة الحرارة والرطوبة وكثافة الضوء) تعيين لمتطلبات النبات محددة. اِنحني الرهيزوترون عند 25°-35° لضمان التطور الجذري إلى جانب اللوحة الأمامية عبر gravitropism.
    4. خلال نمو النبات، والحفاظ على gravimetrically محتوى المياه المستهدفة في rhizotron عن طريق سقي دورية كل 2-4 أيام باستخدام ثقوب الري سقي الريزوترون كما هو مفصل في 2.2.5. الحفاظ على سطح التربة في فتح أعلى رطبة من الإضافات العادية من ~ 5 مل من الماء.
      ملاحظة: إذا كانت النباتات تزرع لفترات طويلة وكان من المتوقع أن تقلل الكتلة الحيوية النباتية بشكل كبير من كمية المياه المضافة إلى الريزوترون بواسطة الطريقة المقترحة، حساب وزن الكتلة الحيوية النباتية من خلال زراعة النباتات في تكرارات رهيزوترون منفصلة وجني وزن أنسجة النبات على فترات محددة.
    5. مرة واحدة جذور تصل إلى موقع مناسب على طول لوحة الجبهة، بشكل تفضيلي في وسط rhizotron، وتطبيق المواد الهلامية DGT لأخذ عينات من توزيع رهيزوفيري المذاب.

3. أخذ عينات من توزيع المذاب

  1. تطبيق جل
    1. زيادة Equation 6 في rhizotron من 60 ٪ Equation 11 إلى 80 ٪ Equation 11 24 ح قبل تطبيق هلام كما هو مفصل في 2.2.4.-2.2.5. وهذا يضمن جيدة اتصال التربة هلام ويسمح نشر مذاب في هلام مع تجنب ظروف التربة anoxic أثناء أخذ العينات المذاب.
    2. خذ لوحة أمامية جديدة ونظيفة من الحمض، ومحاذاتها على rhizotron المستخدمة لأخذ العينات، ووضع علامة على المناطق ذات الأهمية (ROIs) على اللوحة. نقل لوحة في مقعد تدفق لارينار أو أي بيئة أخرى خالية من الغبار والمعادن، والجانب غير ملحوظ تواجه لأعلى.
    3. قطع هلام ربط DGT على دعم الاكريليك إلى حجم مستطيلة المطلوبة المقابلة لعائد الاستثمار، وعادة حول 3 سم × 5 سم، وذلك باستخدام شفرات الحلاقة المغلفة PTFE. قطع هلام عن طريق الضغط بدلا من انزلاق شفرة الحلاقة لضمان قطع واضح. ضع قطعة الجل المستطيل على الجانب غير المميز من اللوحة في الموقع المميز لعائد الاستثمار.
      ملاحظة: إذا تم استخدام HR-MBG، يمكن إضافة رقائق 100 ميكرومتر رقيقة تحت الجل للتأكد من أن الجل على اتصال جيد مع نظام جذر التربة.
    4. قطع 10 ميكرومتر رقيقة غشاء البولي (0.2 μm المسام حجم; جدول المواد) إلى حجم الذي يمتد حجم هلام من قبل ≥1 سم في كل جانب ووضع الغشاء على هلام. تطبيق بعض الماء لإزالة فقاعات الهواء من المكدس.
    5. إصلاح الغشاء على طول جميع الحواف الأربعة باستخدام الشريط الكهربائي الفينيل(جدول المواد). في هذه العملية، وإزالة بعناية فقاعات الهواء المحاصرين بين الجل والغشاء باستخدام ملاقط من البلاستيك. الشريط يجب أن تحصل فقط في اتصال مع الغشاء وليس مع هلام.
      ملاحظة: إذا كان الشريط يأتي في اتصال مع هلام، يتم المحاصرين فقاعات الهواء بين الجل والغشاء، أو سطح الغشاء النهائي يظهر طيات، كومة هلام / غشاء يحتاج إلى إعادة تجميعها كما يمكن أن يضعف تدفق نشرية من solutes في هلام35 (كرر 3.1.3 - 3.1.5).
    6. وضع rhizotron على موقف، وإزالة القضبان ورفع بعناية قبالة لوحة أمامية (الشكل 3C). إزالة احباط من البلاستيك، وقطع احباط PTFE في حواف rhizotron وقشر ببطء قبالة احباط PTFE لتجنب اضطراب نظام التربة الجذر (الشكل 3D).
    7. التقاط صورة متعامد من العائد على الاستثمار باستخدام الرقمية عدسة واحدة منعكس (DSLR) الكاميرا(جدول المواد)لتسهيل تفسير وعرض التوزيع المذاب على أساس بنية التربة ومورفولوجيا الجذر (الشكل 3E). استخدم حامل الكاميرا، وإذا كان ذلك متاحًا، عدسة ماكرو. محاذاة الكاميرا بحيث يتوافق مركز الصورة مع مركز عائد الاستثمار ، ومواصفة سطح الكاميرا التركيز على سطح التربة. قم بتضمين شريط مقياس (على سبيل المثال، مسطرة) في الصورة.
    8. إرفاق لوحة مجهزة هلام / غشاء كومة إلى rhizotron مفتوحة (الشكل 3F). لذلك، محاذاة حافة واحدة من لوحة مع حافة rhizotron ولطف 'ثني' لوحة نحو التربة. هذا النمط من التطبيق يساعد على تجنب فقاعات الهواء بين كومة هلام / غشاء ونظام التربة الجذر. إصلاح لوحة الجبهة باستخدام القضبان ومسامير.
      ملاحظة: هذه الخطوة هامة ويجب تنفيذها بعناية. لا يمكن نقل اللوحة بعد إقامة اتصال بين كومة الجل / الغشاء ونظام جذر التربة دون إزاحة التربة والجذور.
    9. تسجيل وقت البدء الدقيق لنشر هلام واتخاذ صورة من هلام نشر في العائد على الاستثمار كما هو محدد في 3.1.7(الشكل 3G). التفاف rhizotron في رقائق الألومنيوم ونقلها إلى غرفة النمو حتى نهاية فترة أخذ العينات المذاب (غالبا 24 ح).
  2. جل استرجاع
    1. وضع rhizotron على مربع الدعم، ورفع بعناية قبالة لوحة أمام وشطف كومة هلام / غشاء على لوحة بالماء لغسل قبالة الجسيمات التمسك (الشكل 4A). سجل وقت الانتهاء الدقيق لنشر هلام. عينة التربة من العائد على الاستثمار لتحديدالتربة ثالفعلية في rhizotron وفقا لEq.
    2. نقل لوحة أمامية في مقاعد البدلاء تدفق لارينار، هلام / غشاء المكدس التي تواجه. استرداد الجل من لوحة أمامية عن طريق إزالة بعناية الشريط الأول على طول جميع حواف أربعة ومن ثم الغشاء البولي تغطي الجل (الشكل 4B). تطبيق الماء لمساعدة هلام لتعويم بحرية على طبقة رقيقة من الماء على لوحة مع الجانب التربة ملامسة تواجه ما يصل.
      ملاحظة: من المهم جداً تتبع اتجاه الجل. يجب أن يواجه جانب الجل المعرض للتربة والجذور دائمًا (تجاه المستخدم).
  3. جل تجفيف
    1. قطع قطعة مستطيلة من ورقة هلام النشاف (جدول المواد) ووضع قطعة أصغر قليلا من غشاء بوليثرسولفون (0.45 ميكرومتر المسام حجم؛ جدول المواد) على القمة.
    2. نقل هلام من لوحة على هلام النشاف ورقة / كومة الغشاء باستخدام ملاقط من البلاستيك، الجانب التربة الاتصال التي تواجه ما يصل. يجب أن يكون الجل استرخاء (أي، لا تمتد) ومسطحة تماما، دون أي فقاعات الهواء بين هلام والغشاء. تطبيق بعض الماء على هلام النشاف ورقة / غشاء كومة لتسهيل نقل هلام وتحديد المواقع.
    3. تغطية هلام نقّال الورق / الغشاء / هلام كومة تماما مع قطعة من رقائق البلاستيك وتسمية عينة هلام واتجاهها على احباط البلاستيك (الشكل 4C). وضع هلام نقس الورق / غشاء / هلام / البلاستيك احباط المكدس في فراغ هلام مجفف(جدول المواد)وجافة حتى يتم تجفيفها تماما كومة (عادة 48-72 ح). بالنسبة إلى HR-MBG، حدد درجة الحرارة إلى 50-55 درجة مئوية، لـ HR-ABG و HR-CBG أفضل جاف في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة ورقة هلام النشاف من المكدس المجفف ونقل هلام، الذي هو الآن دمج لا ينفصم مع غشاء بوليثرسولفون، في كيس الرمز البريدي. يبقى غطاء الرقائق البلاستيكية على الجل حتى قبل وقت قصير من تحليل LA-ICP-MS.
    5. وتشمل قطعة هلام من ورقة هلام الأصلي كوسيلة فارغة، والتي لا تحصل على التعرض للتربة. معالجة طريقة هلام فارغة مماثلة لجل عينة بعد 3.3.2 - 3.3.4.

Figure 4
الشكل 4: استرجاع وتجفيف هلام DGT عند أخذ عينات من المذاب. (A) لوحة مع هلام DGT وrizotron مباشرة بعد أخذ العينات المذاب. (ب) استرجاع هلام DGT من لوحة في مقعد تدفق laminar. (C) كومة من هلام النشاف ورقة / غشاء polyethersulfone / DGT هلام / غطاء احباط البلاستيك لتجفيف هلام. لاحظ أن الجل هو ملونة قليلا بعد انتشاره على التربة rhizosphere. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. التحليل الكيميائي للجل ملزمة DGT

ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم إنجاز تحليل توزيع المذاب على هلام الربط DGT بواسطة LA-ICP-MS باستخدام نظام 193 نانوثاني ArF excimer LA مجهز بخلية اجتثاث من مجلدين مقرونة بـ QUADrupole ICP-MS(الشكل 5). جميع الصكوك مدرجة في جدول المواد. بدلا من ذلك، نانو ثانية 213 نانومتر أو 266 نانومتر الصلبة الدولة نظم LA يمكنتطبيقها 36،39،40،41،42،43. إذا كان هناك حاجة إلى حساسية معززة أو دقة كبيرة، فإن مجال القطاع ICP-MS هو بديل لـ quadrupole ICP-MS15،44. وترد تفاصيل عن إعداد معايير هلام DGT للمعايرة الخارجية واقتران نظام LA إلى رباعية ICP-MS في أقسام SI S4 و S5.

Figure 5
الشكل 5: LA-ICP-MS الإعداد لتحليل هلام DGT. (أ)نانو ثانية 193 نانومتر ArF excimer لوس انجليس نظام و quadrupole ICP-MS. (ب) المواد الهلامية المجففة التي شنت على لوحات زجاجية وثابتة على مرحلة عينة LA جاهزة لإدخالها في خلية الاستئصال. (C) غاز البخاخات (Ar) من ICP-MS والغاز الناقل للهباء الجوي (هو أو Ar) من خلية الاستئصال المتصلة ببرنامج المقارنات الدولية عبر مُنصف Y-splitter ومحول الشعلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إعداد العينة لLA-ICP-MS
    1. نقل عينات هلام المجففة، والمعايير، وفراغات الأسلوب (التي يتم دمجها مع دعم غشاء polyethersulfone) على قطع فردية من الشريط اللاصق على الوجهين(جدول المواد)،جانب هلام تواجه ما يصل. قص أجزاء الشريط الزائد لتوفير مساحة في خلية الاستئصال.
    2. جبل المواد الهلامية المجففة على لوحات زجاجية. استخدام لوحات زجاجية فردية لكل عينة هلام، سلسلة قياسية، أو طريقة فارغة للسماح لترتيب مرنة على مرحلة عينة LA (الحجم النموذجي من 10 سم × 10 سم). استخدام glasscutter لضبط حجم لوحة الزجاج حسب الحاجة. إصلاح لوحات الزجاج مع المواد الهلامية على مرحلة عينة لوس انجليس (الشكل 5B) باستخدام البلاستيك (جدول المواد). مستوى سطح هلام عن طريق ضبط أرضية المرحلة وتأمين مرحلة العينة في خلية الاستئصال.
  2. تحليل مسح خط LA-ICP-MS
    1. زوجين نظام LA إلى MS برنامج المقارنات الدولية كما هو محدد في قسم SI S5. في برنامج LA (جدول المواد)، قم بضبط إعدادات ضوء الكاميرا (أي، 'Ring'و 'Coax'و 'transmitted') لإلقاء الضوء على سطح الجل في خلية الاستئصال والتركيز على سطح الجل عن طريق ضبط مسافة محور z. الانتقال إلى مواقع عشوائية عبر الخلية لضمان أن جميع الأسطح هلام في التركيز.
    2. تعيين معلمات LA في إطار'الإعداد ليزر'من برنامج لوس انجليس. الإعدادات النموذجية المستخدمة في تحليل خط مسح خط LA-ICP-MS للجل DGT: وضع مستمر; انتاج الطاقة 20-30٪ معدل التكرار 10-20 هرتز؛ قطر بقعة 100-200 μm؛ سرعة المسح الضوئي 150-250 μm s-1.
      ملاحظة: يجب تحسين المعلمات لنوع الجل المستخدم وقد تختلف. ويمكن أيضا تحسين المعلمات لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، والاستبانة المكانية، أو تقليل أوقات الاكتساب اعتمادا على الإعداد التجريبي والناقلي. استخدام ناتج طاقة منخفض نسبياً (≤40٪) ومعدل التكرار (≤25 هرتز) لتجنب اختراق من خلال المواد الهلامية في المواد الداعمة39. تأكد من أن سرعة المسح الضوئي بالليزر ≤ قطر البقعة مقسوما على مجموع ICP-MS دورة دورة المسح (انظر 4.2.6) لتجنب ضغط نقاط البيانات وبالتالي فقدان الدقة في اتجاه المسح45. على سبيل المثال، عند تحديد قطر بقعة 200 ميكرومتر ومجموع دورة المسح الضوئي ICP-MS مدة 0.25 ثانية، يجب أن تكون سرعة المسح الضوئي ≤800 ميكرومترs -1.
    3. حدد أداة الخط وارسم نمط خط واحد طوله 1 مم تقريبًا عبر معيار جل. انقر بزر الماوس الأيمن فوق نمط الخط في نافذة"Scan Patterns"وتحقق من تعيين معلمات LA في 4.2.3. وقد اعتمدت. استخدام'تكرار أداة المسح الضوئي'لتكرار هذا الخط أربع مرات، مع مسافة بين خط (المسافة بين خط الوسط) أكبر من قطر بقعة(الشكل 6). يوفر هذا النهج ما مجموعه خمسة خطوط متوازية لكل معيار هلام(n = 5). كرر هذه الخطوة لكل هلام القياسية والمعايرة فارغة وطريقة فارغة.
    4. الانتقال إلى عينة هلام ورسم خط واحد على طول الحافة العليا من منطقة مستطيلة ليتم تحليلها. تكرار الخط لإنشاء خطوط متوازية لمنطقة العينة بأكملها كما هو محدد في 4.2.3. استخدام مسافة بين خطين من 300-400 ميكرومتر. تأكد من أن التركيز (المسافة محور ع) تم تعيين بشكل صحيح لكل نقطة بداية ونهاية لكل خط.
      ملاحظة: الدقة المكانية للتحليل أعلى على طول اتجاه المسح مقارنة بالمسافة بين الأسطر. لذلك، قد أفضل تتبع نقاط البدء والانتهاء من الخطوط اتجاه التدرجات التحليل. بالنسبة لتدرجات رهيزوفير، عادة ما يكون هذا عموديًا على محور الجذر(الشكل 6).
    5. في برنامج ICP-MS (جدول المواد) ، قم بإعداد طريقة حل الوقت 'Data Only' في شاشة 'Method' ، حدد نظيرًا أو أكثر مناسبًا لكل تحليل وتشمل 13C كمعيار داخليللتطبيع 31و36و40و41و42. التحقق من أن الكشف عن النظائر لا يضعف بسببالتداخلات 46.
    6. تعيين إجمالي مدة دورة المسح الضوئي لأسلوب ICP-MS ('Est. وقت القراءة') إلى ≤0.5 s مع أوقات الإقامة المناسبة لكل نظير (عادة ما بين 10-50 مللي ثانية). تعيينقراءات' MS ICP-MS ' إلى 1 وتغيير قيمة'القراءات / تكرار'لتعيين وقت القياس الكلي لكل عينة ('Est. Sampling Time')، أي، لكل خط الاجتثاث الفردي. وهذا يعتمد على المعلمات LA محددة ومسافات الخط في 4.2.2 - 4.2.4.
    7. لإعداد تقارير البيانات استخدم وضع تجميع البيانات كثافة مقابل وقت وتعيين'خيار كتابة الملفات'إلى'جديد لكل عينة'لإنشاء ملف بيانات فردي (هنا .xl) لكل خط الاستئصال.
    8. قم بإعداد تسلسل عينة'دفعة'في شاشةعينةICP-MS ' ، مع كل إدخال عينة يقابل خط الاستئصال الفردية المحددة في 4.2.3 - 4.2.4.
    9. انقر فوق "تحليل الدفعة" لبدء تسلسل العينة على ICP-MS ، والتي ستنتظر مع الحصول على البيانات حتى يتم تشغيلها بواسطة نبض الليزر الأول (انظر SI S5 للحصول على تفاصيل حول تكوين الزناد).
    10. في برنامج LA، حدد جميع الخطوط لتحليلها والتحقق من أن أسلوب ICP-MS ('Est. Sampling Time'، انظر 4.2.6.) يطابق مدة عمليات الاجتثاث الفردية للخط، والتي تختلف عادة عن عينات هلامية ومقاييس وفراغات الأسلوب. كرر 4.2.6. لضبط أسلوب ICP-MS إذا لزم الأمر.
    11. انقر فوق 'الانبعاثات' في نافذة'ليزر الطاقة'لإعادة شحن رأس الليزر، ثم انقر فوق 'تشغيل' لفتح'تشغيل التجربة'نافذة. هنا، حدد "أنماط مختارة فقط" ، تعيين'تأخير الاغتسال' إلى 20-30 s ، وضع علامة على 'تمكين الليزر أثناء المسح الضوئي' مربع ، وتعيين'ليزر وقت الاحماء'إلى 10 ق.
    12. انقر على 'تشغيل' في 'تشغيل التجربة' نافذة لبدء تحليل خط المسح الضوئي ورصد كثافة إشارة الخام في العد في الثانية (cps) لكل نظير على ICP-MS في الوقت الحقيقي. كل خط يجب أن تبدأ ('الليزر الاحماء الوقت'، 10 ق) وتنتهي ('تأخير الاغتسال'، 20-30 ق) مع الغاز فارغة.
    13. مراقبة فلونس الليزر (J سم-2) أثناء التحليل لتقييم استقرار الليزر. إذا كان فلونس يختلف إلى حد كبير، إحباط التحليل، والتحقق من أن مصدر الليزر و / أو نظام المرآة الخاصة به تعمل بكامل طاقتها.
    14. بعد التحليل، ووقف البلازما ICP-MS وتعيين معدل تدفق الغاز الناقل على نظام لوس انجليس إلى 0 مل دقيقة-1. إزالة المواد الهلامية من خلية الاستئصال وتخزينها في أكياس الرمز البريدي لمزيد من الاستخدام.

Figure 6
الشكل 6: التخطيط التصميم التجريبي DGT LA-ICP-MS (ليس على نطاق واسع). ويصور الرسم الإيضاحي أخذ العينات الموضعية القائمة على DGT في الغلاف الريزوسفيري ورسم الخرائط لـ LA-ICP-MS للتوزيع المذاب على سطح الجل، بما في ذلك رسمة عن قرب تظهر أبعاد وبارامترات مسح الخطوط النموذجية. لاحظ أن هلام DGT يتم انعكاسه أفقياً عند نقله من تربة ريزوسفير إلى اللوحة الزجاجية، كما هو مبين في موضع المستطيل في الزاوية السفلية من هلام DGT. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. معالجة البيانات والمعايرة
    1. استيراد ملف البيانات الخام (.xl) لكل خط مُضَن في برنامج جداول البيانات(جدول المواد). ويبين جدول البيانات الخام قراءات برنامج المقارنات الدولية -MS (نقاط البيانات) لكل نظائر في النيابة العامة ونقاط الوقت المقابلة في الـ s. سرد كافة الأسطر بجانب بعضها البعض في أعمدة مختلفة.
    2. تقييم بيانات مسح الخط لثبات الإشارة من المعيار الداخلي(13C) وأوقات الاغتسال المناسبة.
    3. حساب متوسط الغاز فارغة لكل نظائر من جميع القيم الفارغة الغاز المسجلة قبل الاجتثاث خط (أي، خلال الليزر الاحماء الوقت) وطرح الغاز متوسط فارغة من كثافة الخام المقابلة لكل نظير لتصحيح للإشارة الخلفية.
    4. تطبيق التطبيع الداخلي عن طريق تقسيم كثافة الإشارة لكل نظير (cps) على كثافة الإشارة من المعيار الداخلي (cps) لكل نقطة بيانات لتصحيح التغيرات في كمية المواد المدبّح والناجر مفيدة.
    5. قم بحصد البيانات قبل البدء وبعد نهاية كل خط مُضجر لإزالة إشارة الخلفية. نقل جدول البيانات للحصول على مصفوفة شبكة حيث كل صف يتوافق مع خط مُبَطَّف وكل عمود إلى قيمة كثافة نظائرية طبيعية. فصل المصفوفات لكل نظائر في أوراق عمل فردية.
    6. حساب متوسط نسبة كثافة الإشارة العادية لكل نظير للمعايير المعايرة والمعايرة فارغة وحساب وظيفة المعايرة(ص = ax + b)باستخدام نموذج انحدار خطي مع الأحمال التحليلية القياسية هلام (μg سم-2؛ انظر SI S4) كقيم س. تقييم وظيفة المعايرة لكل نظير من النظائر لـ47.
    7. تطبيق دالة المعايرة على نموذج مصفوفة البيانات. تحويل نسب كثافة الإشارة المُطَوَّلة، Equation 15 إلى أحمال جللليت ، Equation 15 (ميكروغرام سم-2)،ولاحقًا إلى التدفقات المُذابة متوسطة الزمن ، Equation 17 (pg cm-2 s-1) ، لكل نظير ونقطة بيانات وفقًا لـ Eq. 4 وEq 5:
      Equation 4
      Equation 05
      هنا، a هو المنحدر من خط المعايرة، b هو اعتراض خط المعايرة، و t (ق) هو وقت نشر هلام أثناء أخذ العينات المذاب.
    8. حفظ مصفوفة بيانات العينة معايرة لكل تحليل كملف txt.
  2. توليد الصورة
    ملاحظة: تأكد من تجنب أي عملية الاستيفاء بكسل أثناء كافة خطوات إنشاء الصورة، لأن هذا قد يؤدي إلى التدرجات تدفق ممهدة بشكل مصطنع في الصور الناتجة.
    1. استيراد عينة البيانات مصفوفة معايرة (.txt) كصورة النص في برنامج تحليل الصور (جدول المواد).
    2. حساب المسافة لكل بكسل في الاتجاه x (أي الدقة الطرفية) عن طريق ضرب سرعة المسح الضوئي بالليزر مع إجمالي مدة دورة المسح الضوئي ICP-MS (على سبيل المثال، على افتراض سرعة مسح 200 ميكرومترs-1 ومدة دورة المسح الكلي 0.25 s، تعادل الدقة الجانبي إلى 50 ميكرومتر). المسافة لكل بكسل في y-الاتجاه تساوي المسافة بين الأسطر(الشكل 6).
    3. حساب عامل تصحيح نسبة العرض إلى الارتفاع للصورة. ولذلك، قم بتقسيم المسافة لكل بكسل في اتجاه y (على سبيل المثال، 300 ميكرومتر) على المسافة لكل بكسل في الاتجاه x (على سبيل المثال، 50 ميكرومتر). تطبيق عامل التصحيح y/x الذي تم الحصول عليه (في هذا المثال 6) ضمن 'مقياس' . تطبيق المسافة لكل بكسل (في μm أو مم) في الاتجاه س كتحجيم تحت 'تعيين مقياس'.
    4. تطبيق'البحث عن الجدول' أي، مقياس اللون الزائف لتصور أفضل من التدرجات الكيميائية في الصورة المذابة وضبط الصورة 'توازن اللون' للسيطرة على الحدود السفلى / العليا من نطاق العرض. إضافة 'شريط المعايرة' وحفظ الصورة المذابة كملف tiff.
    5. نسخ الصورة المذابة باستخدام'نسخ إلى النظام' الأمر في برنامج تحليل الصور ولصق في برامج النشر المكتبي (جدول المواد). مقياس المباراة ، محاذاة وتؤلف صورة مع صورة من العائد على الاستثمار التي تم الحصول عليها في 3.1.7.
      ملاحظة: قبل النسخ، قم بتغيير حجم الصورة المذابة على سبيل المثال، العامل 10 عبر تطبيق مقياسX' من 10 و 'Y Scale' من 10 تحت 'مقياس تعيين' لضمان بكسل كافية للنشر عالي الدقة.
DGT جل تصنيع زراعة النباتات أخذ العينات في الموقع LA-ICP-MS رسم خرائط تدفق مذاب
HR-MBG
أسبوع 		إعداد التربة
أسبوع 		تطبيق جل
1 ساعة لكل هلام 		إعداد العينة
1 ساعة لكل هلام
الموارد البشرية -ABG
3 أيام 		جمعية رهيزوترون
2 ساعة لكل نسخة متماثلة 		فترة أخذ العينات من المذاب
متغير، عادة 24 ساعة 		تحليل LA-ICP-MS
1 يوم لكل هلام
HR-CBG
3 أيام 		نمو النبات
تعتمد على الدراسة 		جل استرجاع
1 ساعة لكل هلام 		معالجة البيانات
4 ساعات لكل هلام
جل تجفيف
2-3 أيام 		توليد الصورة
10 دقيقة لكل صورة

الجدول 1: الأوقات التقريبية للخطوات العامة لتقنية DGT LA-ICP-MS.

Representative Results

لإثبات القدرة والبيانات من التفصيل طريقة التصوير DGT، قمنا بتجميع دون ملم، 2D توزيع تدفق المغذيات المتعددة الملوثات والأنواع المنقولة في التربة المتاخمة لجذور فاكروم إسكونتوموم وSalix smithiana (الشكل 7). 1- تُعرض في الجدول 1الأوقات التقريبية للخطوات الإجرائية العامة للبروتوكول.

تم إنشاء الصور المذابة في الشكل 7 في ثلاث دراسات مختلفة باستخدام إما المواد الهلامية المتخصصة في الموارد البشرية أو الجمارك البشرية CBG. تُظهر الصور الكيميائية توزيع تدفق الـ 2D المُذاب بدقة مكانية تبلغ 82-120 ميكرومتر على طول المحور س و300-400 ميكرومتر على طول المحور الصادي، وذلك اعتمادًا على معلمات LA-ICP-MS المستخدمة. لأنه لم يتم تطبيق أي عملية تحليل أثناء معايرة الصورة وتغيير حجمها، تمثل وحدات البكسل المفرد نقاط بيانات مُقاسة. محاذاة الصور المذاب مع صورة فوتوغرافية من العائد على الاستثمار يكشف أن دون ملم، 2D توزيع تدفق مذاب من عناصر مختلفة متغير للغاية وفقا لبنية التربة ومورفولوجيا الجذر. ويمكن أن يعزى ذلك إلى السلوك الكيميائي الجيولوجي الحيوي التفاضلي للعناصر في نظام النباتات بين التربة والريزفير، وتفاعلها مع مصفوفة التربة وجذور النبات.

في الشكل 7A لمبل ملغ، آل، P، Mn وFe تدفق المنمق كان تصور حول جذر F. esculentum الشباب نمت في التربة خالية من الكربونات المخصبة مع NH4NO3. وأظهرت التوزيع المذاب دون مم مناطق من انخفاض التدفقات من التدفقات من الـ Al وP وFe إلى جانب أقسام الجذر القديمة بسبب امتصاص الجذر ، وتدفقات Mg و Al و P و Mn و Fe في قمة الجذر بسبب عمليات التعبئة المحلية P من جذر F. esculentum. لاحظ أن رأس الجذر يقع إلى حد ما خلف سطح التربة وبالتالي لا يكاد يكون مرئيًا في الصورة الفوتوغرافية. ويبين الشكل 7ب توزيع المعادن النزرة التي لا تلى، بما في ذلك Mn، Fe، Zn، Cd و Pb حول جذر S. smithiana المتسامح مع المعادن التي تزرع في تربة ملوثة بشكل معتدل بـ Zn وCD وPN. صور مذاب تصور استنزاف متميزة لا سيما من زن، CD ونبل في موقف الجذر الفوري، مما يدل على أن جذور S. smithiana بمثابة بالوعة محلية للمعادن التتبع لبلايل في التربة الملوثة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظة زيادات تدفق التدفقات المحلية من نوع Zn وCD وBP، مما يشير إلى تراكم هذه المعادن النزرة عند الواجهة المباشرة للتربة والجذر.

بالإضافة إلى التصوير متعدد العناصر، يمكن أيضًا الجمع بين الطريقة المعروضة وتقنيات التصوير التكميلية القائمة على الانتشار مثل optodes34. وقد تجلى ذلك في الشكل 7C، حيث كان توزيع المعادن النزرة في ريزوسفير S. smithiana مشترك مع توزيع الرقم المغنطيسي باستخدام الجمع بين طبقة واحدة، أحادية الطبقات أوبتودي- DGT الموجبة الربط هلام33. تم تخصيب الركيزة التربة مع (NH4)2SO4، مما يؤدي إلى انخفاض درجة اله PH على طول محاور الجذر بمقدار 1 وحدة مقارنة بالتربة السائبة. وقد شارك في تحديد موضعية انخفاضات في عدد المواد PH مع زيادة تدفق المنهمة من Mn، Fe، Co، Ni، Cu و Pb، مما يشير إلى ال solubilization المعادن الناجمة عن ارتفاع الحابسة.

وعلاوة على ذلك، تظهر هذه النتائج التي يمكن أن تظهر بعض القطع التصويرية التي يمكن الحصول عليها. على سبيل المثال، يمكن أن يسبب عدم فهم التربة الهيكلية، على سبيل المثال، كخط أفقي في الثلث السفلي من صورة عائد الاستثمار من الشكل 7A، انقطاعات الاتصال بالتربة هلام مما يؤدي إلى انتشار محدود في هذا الموقع في هلام الربط. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن يؤدي ضغط التربة المفرط في الريزوترون إلى ضعف المسامية مما يؤدي إلى تحول اصطناعي لحالة الأكسدة الحمراء للتربة نحو الانوكسيا. ويتضح ذلك في الشكل 7B، حيث مساحات واسعة من Mn مرتفعة للغاية وتدفقات Fe في الصور المذابة المتطابقة بصريا مع طبقة كثيفة من التربة في صورة ROI. وهذا يشير إلى انخفاض احتمالية الأكسدة الحمراء للتربة بسبب ضغط التربة العالية، مما يؤدي إلى انحلال اختزالي و solubilization من العناصر الحساسة للغاية ريدوكسي. ينصح بتعبئة rhizotron الدقيق والفحص البصري لسطح التربة مباشرة بعد الملء.

Figure 7
الشكل 7: التوزيع 2D دون ملم لمغذيات الشبل وأنواع المذاب الملوثة عبر مختلف واجهات جذور التربة. (A) توزيع anionic P و cationic Mg، Al، Mn، و Fe حول جذر F. esculentum الشباب. تم أخذ عينات ذات الموقع المشترك من الساكوتات الأيونية والواتية باستخدام HR-MBG لمدة 24 ساعة عند تشبع مياه التربة بنسبة 75٪ تقريبًا WHC. يتم عرض صور Al و P و Mn كقيمdGT (pgcm-2 s-1)،في حين تظهر صور Mg و Fe 13شدة C-تطبيع. شريط مقياس يمثل 1 سم. وهذا الرقم مقتبس من المرجع٤٨. (B) توزيع Mn، Fe، Zn، Cd و Pb حول جذر S. smithiana التي تزرع في التربة ملوثة بشكل معتدل مع Zn، Cd و Pb. تم أخذ عينات من المعادن التتبع Edsic باستخدام HR-CBG لمدة 20 ساعة في تشبع مياه التربة من ~ 80٪ WHC. يتم عرض كافة الصور كقيمDGT (pgسم-2 s -1). شريط مقياس يمثل 0.5 سم. وهذا الرقم مقتبس من المرجع٣. (C) توزيع درجة حُكم الدم واللصوص الموجبة المتعددة حول جذور S. smithiana التي نمت في التربة التي ارتفعت مع CD. تم تحقيق التعريب المشترك للدوكول للدوكول المغناطيسي وديناميات المذاب باستخدام تعديل بروتوكول HR-MBG، مما يسمح بأخذ العينات في وقت واحد ولتصوير optode33. يتم عرض صور Mn وCu وZn والأقراص المضغوطة كقيم DGT (pg cm-2 s -1) ، في حين تظهر صور Fe و Co و Ni و Pb 13شدة C-تطبيع. شريط مقياس يمثل 1 سم. وهذا الرقم مقتبس من المرجع٣٣. وترد الأرقام المعروضة من الموادالمذكورة 3،33،48 مرخصة بموجب CC BY. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف إضافي 1. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

بروتوكول التصوير المذاب المقدم هنا هو طريقة متعددة الاستخدامات لتصور وقياس تدفقات المغذيات والملوثات 2D في بيئات النباتات التربة. وهي فريدة من نوعها في قدرتها على توليد صور متعددة العناصر دون ملم من الأنواع المذابة في الواجهة التربة الجذر، متجاوزاً الدقة المكانية القابلة للتحقيق للأساليب البديلة لقياس التدرجات المذابة في الغلاف الريزوسفيري بشكل كبير4. وييسر نهج أخذ العينات في الموقع الذي يستخدم في الموقع، بالإضافة إلى طريقة تحليل كيميائية شديدة الحساسية مثل LA-ICP-MS، إجراء تحقيق مفصل لديناميات التدفق المذاب حول جذور النباتات الفردية التي تزرع في التربة أو ركائز مماثلة. ونظرا لعملية أخذ العينات المستندة إلى بالوعة، فإن الصور التي تم الحصول عليها تعكس قابلية solutes التصور، وبالتالي هي تقدير لتوافر النباتات الخاصة بهم10. وعلى الرغم من أن قياس التدفقات المذابة المتأصلة في الأسلوب ينطوي على مزايا كبيرة مثل قابلية التفسير ككسور مغذيات متاحة للنباتات، فإن قياسات التدفق أقل استقامة بكثير لفهمها من قياسات تركيز المسام. هندسة أخذ العينات DGT القياسية في تطبيقات التربة السائبة (على وجه التحديد 0.8 ملم سميكة هلام الانتشار المستخدمة في هذا الإعداد) يسمح لمقارنة تركيز المسام الفعلية، جسولان،وتقدير تركيز المسام متوسط الوقت من قبل قياس DGT السائبة، cDGT، وللتفسير هذه المعلمات فيما يتعلق بديناميات إعادة التموين من الأنواع المذابة. ومع ذلك ، لا يمكن إجراء مثل هذه المقارنة بناءً على تطبيق التصوير DGT مع طبقات انتشار رقيقة جدًا ، حيث أن قيم cDGT المشتقة هي صغيرة بشكل غير واقعي34. ولذلك فإن نتائج التصوير DGT ليست دائما بسيطة وسريعة في التفسير وغالبا ما تكون غير قابلة للمقارنة مباشرة مع قياسات تركيزات المسام التقليدية.

عند تطبيق هذه الطريقة، يجب النظر بعناية في بعض الخطوات الحاسمة، التي تتعلق بشكل رئيسي بملء وسقي حاويات النمو rhizotron. أثناء ملء التربة في رهيزوترون، من المهم جدا تجنب ضغط التربة أكثر من اللازم، كما جذور النبات لا يمكن اختراق التربة المضغوطة بقوة وسيتم تثبيط نمو الجذر. لاحظنا جذور تجنب التربة المضغوطة بقوة وتنمو على طول الحواف الداخلية للحاوية نمو rhizotron، حيث التربة عادة أقل ضغط. في هذه الحالة، قد جذور الفردية تقع في وسط rhizotrons، حيث يمكن تطبيق المواد الهلامية DGT مريح، لا تتطور على الإطلاق، مما يحول بشكل فعال تطبيق هلام ناجحة. في مختبرنا، أظهرت التجربة أن الكثافات السائبة في التربة الجافة من 1.0-1.4 غرام سم-3 تسمح بتطوير الجذور دون عوائق. وعلاوة على ذلك، فإن ضغط التربة المفرط هو أيضا مصدر محتمل للتحف المتعلقة بذوبان العناصر الحساسة لل الأكسدة والأنواع المرتبطة بها بيولوجيا. ومع انخفاض حجم المسام الكلي وتحول توزيع قطر المسام نحو أقطار أقل في التربة شديدة الضغط، يتوفر حجم مسام أكبر قطراً أقل مملوءاً بالهواء، مما قد يؤدي إلى ظروف اختزالية محلياً. وبالتالي، يمكن تقليل MnIII/IV- و FeIII-أكاسيد، مما يؤدي إلى زيادة Mn2+ و Fe2+ fluxs. وقد يؤدي ذوبان أكاسيد Fe-oxides، التي هي مواقع هامة للفوسفات والمغذيات الدقيقة، مثلاً إلى تحرير أنواع مُرَكَّب و/أو مُركَّب لها، وبالتالي تُسبِّب تدفقات مرتفعة اصطناعياً للأنواع المرتبطة بالجيوكيميائية الأحيائية. وقد تنشأ مسألة مماثلة إذا كانت حاويات النمو تسقي أكثر من اللازم. التبخر عبر مساحة سطح التربة الصغيرة في الجزء العلوي من حاوية النمو منخفض وقد تظل التربة مشبعة بالماء لمدة تصل إلى عدة أسابيع بعد الزراعة ، مما قد يسبب أيضًا مصنوعات الأكسدة.

وثمة اعتبار آخر مهم هو وظيفة الكيميائية من جل ملزم HR-DGT ملفقة. باتباع البروتوكول، يتم الحصول على المواد الهلامية الرقيقة مع توزيع متجانس لمراحل الربط. إذا كان للجل مناطق توزيع المواد غير المتجانسة (على سبيل المثال، ثقوب في الجل أو مجاميع من مراحل الربط) هذه المناطق تحتاج إلى إزالة أو، إذا كانت واسعة جدا، بروتوكول تصنيع هلام يحتاج إلى تكرار. إذا أعدت بشكل صحيح، يجب أن يكون الجل قادرا على ربط الأنواع المذابة المستهدفة التي تنتشر في هلام على الفور وكميا27، والتي يتم تحديدها من قبل قدرة الجل الجل محددة محددة. وفي حين أن تجاوز سعة الجل أقل إشكالية في التربة غير الملوثة، فإنه ينبغي النظر في التربة الملوثة بالمعادن وبيئات التربة المالحة. إن تشبع مراحل الربط الهلامي لن يضعف فقط أخذ العينات الكمية المذابة، بل سيؤدي أيضاً إلى الانتشار الجانبي للسولات بين مراحل الربط في الجل، مما يؤدي إلى توطين غير محدد لخصائص تدفق المذاب على نطاق صغير. وهكذا، إذا كان من المتوقع وجود كميات عالية جداً من أنواع المغذيات/الملوثات في بيئة التربة المستهدفة، ينبغي إجراء اختبارات أولية. لتقدير الأحمال DGT المتوقعة، والتربة السائبة DGT المكبس أخذ العينات تليها elution هلام وتحليل المواد الكيميائية الرطب يمكنتطبيقها 15،49. إذا لزم الأمر، قد يتم تعديل أوقات نشر DGT لتقليل وقت الاتصال هلام وبالتالي تجنب تشبع هلام فوق عتبات القدرة. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تكون الاختبارات الأولية مفيدة أيضاً لتحديد أوقات الاتصال المطلوبة من الجل و/أو حساسيات LA-ICP-MS إذا كان من المتوقع أن تكون التحميلات المذابة منخفضة جداً، والتي قد تكون مهمة لرسم خرائط العناصر النزرة في مستويات خلفية التربة الطبيعية15. إلى جانب ذلك، ينبغي التحقق من أداء هلام DGT الصحيح قبل تطبيقه التجريبي عن طريق تحميل المواد الهلامية الخاضعة للرقابة في إعداد معايير معايرة DGT LA-ICP-MS. يوفر معيار الجل تحميل جل التحليلات المرجعية المتطابقة بالمصفوفة والتي يمكن استخدامها لتقييم ما إذا كان تحميل هلام العينة الذي يحدده LA-ICP-MS ضمن النطاق المتوقع. وإذا لم يتمكن المشغل من الحصول على إشارة تختلف عن ضجيج الخلفية الفارغة للغاز والطريقة، فيجب على المشغل أن يتأكد من تنفيذ الإجراءات المختبرية لتحليل العناصر النزرة وأن جميع خطوات البروتوكول قد تم تنفيذها بشكل صحيح. في بعض الأحيان، يتم قلب هلام DGT بطريق الخطأ بعد أخذ العينات المذابة مع الجانب المحرض للتربة، والمحملة التي تواجه نحو لوحة زجاجية بدلا من شعاع الليزر، مما أدى إلى انخفاض كثافة الإشارة وملامح انقلبت خطأ في الصور تدفق مذاب النهائي.

أثناء تحليل LA-ICP-MS، يتم إنشاء كمية كبيرة من البيانات، الأمر الذي يستغرق وقتاً طويلاً لتقييم. في مختبرنا، نستخدم برامج تقييم البيانات الداخلية المصممة لتنسيق إخراج البيانات المستهدف باستخدام برامج جداول البيانات القياسية. بعد الفرز شبه الآلي والمعايرة، يتم إجراء رسم الصورة باستخدام المصدر المفتوح، فتح أدوات تحليل الصور الوصول (ImageJ، فيجي50). يسمح هذا النهج بالتحكم الكامل في فرز البيانات وتقييمها وعرضها، وهو أمر ضروري لأن البيانات التي تم جمعها تتوافق مع وحدات البكسل المستطيلة، وليس التربيعية، والتي يجب عرضها بشكل صحيح في الخرائط المُولّعة. وعلاوة على ذلك، أثناء معالجة البيانات، ينبغي تجنب أي الاستيفاء بكسل بعناية. يؤدي الاستيفاء بكسل إلى التدرجات الممهدة في الصور الكيميائية، مما يؤدي إلى تليين، وغالبا ما تكون دورية ميزات توزيع العناصر وبالتالي هو تغيير غير مرغوب فيه من البيانات الأصلية. الاستيفاء بكسل هو إجراء قياسي في عمليات إعادة التحجيم وإعادة التنسيق في العديد من منتجات برامج معالجة الصور ولكن يمكن إلغاء تحديدها عادة.

وفي الختام، فإن الطريقة الموصوفة هي تقدم كبير في فهم المغذيات وديناميات الملوثات في النظم الطبيعية للنباتات بين التربة والريازفير. بالإضافة إلى تطبيقات DGT فقط، يمكن الجمع بين الأسلوب مع تقنيات التصوير الأخرى القائمة على الانتشار مثل optodes3و33و42و43و48و51 و zymography20و21و22و23و24، ويمكن تطويرها بشكل أكبر لإدراج عناصر إضافية ومعلمات التربة.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

شارك في تمويل هذه الدراسة صندوق العلوم النمساوي (FWF): P30085-N28 (توماس بروهاسكا) وصندوق العلوم النمساوي (FWF) والدولة الاتحادية للنمسا السفلى: P27571-BBL (جاكوب سانتنر).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) VWR 21300.260 ≥98.0%, analytical reagent
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich M8250-100G ≥99.5%
Acrylamide solution Sigma-Aldrich A4058-100ML 40%, for electrophoresis
Analyte salts n/a n/a Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher
Buechner funnel VWR 511-0065 13 cm plate diameter
Chemical equilibrium modelling software KTH Sweden n/a Visual MINTEQ
Clamp Local warehouse n/a
Desktop publishing software Adobe Inc. n/a InDesign CS6
DGT cross-linker DGT Research Ltd n/a 2%, agarose derivative
DGT piston sampler DGT Research Ltd n/a 2 cm diameter exposure window
Digital single-lens reflex (DSLR) camera Canon Inc. n/a Canon EOS 1000D
Dispersion device IKA 3737000 Ultra-Turrax T10 Basic
Double-sided adhesive tape Tesa 56171
Ethanol Sigma-Aldrich 34923 Puriss. p.a., absolute, ≥99.8%
Gel blotting paper Whatman 10426981 Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness
Gel drier UniEquip n/a UNIGELDRYER 3545
High-pressure microwave system Anton Paar n/a Multiwave 3000
HNO3 VWR 1.00456.2500P 65%, ISO for analysis
Horizontal shaker GFL 305
HydroMed D4 AdvanSource Biomaterials Corp. n/a Ether-based hydrophilic urethane
ICP-MS software Perkin Elmer n/a Syngistix
Image analysis software National Institutes of Health (NIH) n/a ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/
Knife-coating device BYK 5561 Single Bar 6″, 0.5 mils
LA software Elemental Scientific Lasers n/a ActiveView
LA system Elemental Scientific Lasers n/a NWR193
Laminar flow bench Telstar Laboratory Equipment B.V. n/a Class II biological safety cabinet
Magnetic stirrer IKA 0003582400 C-MAG MS 7
Moisture-retaining film Bemis Company, Inc. PM999 Parafilm M, 4" x 250'
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281-50ML BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99%
NaNO3 Sigma-Aldrich 229938-10G 99.995% trace metals basis
NaOH Sigma-Aldrich 1064980500 Pellets for analysis
Overhead shaker GFL 3040
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials Savillex 200-015-20 15 mL Standard Vial, Rounded Interior
pH meter Thermo Scientific 13-644-928 Orion 3-Star Benchtop pH Meter
pH probe Thermo Scientific 8157BNUMD Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Plastic cutter DGT Research Ltd n/a Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd
Plastic tweezers Semadeni 602
Plasticine Local stationary shop n/a non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents
Polycarbonate membrane discs Whatman 110606 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polycarbonate membrane sheet Whatman 113506 Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness
Polyethersulfone membrane discs Pall Corporation 60172 Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
Polyethersulfone membrane sheet Pall Corporation 60179 Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness
PTFE foil Haberkorn n/a 50 µm thickness
PTFE spacer Haberkorn n/a Variable thicknesses available
PTFE-coated razor blades Personna GEM 62-0178 Stainless steel single edge blades (coated)
PTFE-coated Tygon tubing S-prep GmbH SP8180 0.32 cm inner diameter
Quadrupole ICP-MS Perkin Elmer N8150044 NexION 2000B
Quantitative filter paper, 454 VWR 516-0854 Particle retention 12-15 µm
Spreadsheet software Microsoft Corporation n/a Microsoft Excel 2016 (v16.0)
Stainless-steel cutter Local locksmithery n/a 2.5 cm diameter
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) Teledyne CETAC Technologies n/a 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension
Transistor-transistor logic (TTL) cable n/a n/a Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument
Two-volume cell Elemental Scientific Lasers n/a Two-volume cell 1
Vinyl electrical tape 3M n/a Scotch Super 33+
Water purification system Termo Electron LED GmbH n/a TKA-GenPure
ZrOCl2 × 8H2O Alfa Aesar 86108.30 99.9 %, metals basis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hinsinger, P., Gobran, G. R., Gregory, P. J., Wenzel, W. W. Rhizosphere geometry and heterogeneity arising from root-mediated physical and chemical processes. New Phytologist. 168 (2), 293-303 (2005).
  2. Jungk, A. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. ch35 587-616 (2002).
  3. Hoefer, C., Santner, J., Puschenreiter, M., Wenzel, W. W. Localized metal solubilization in the rhizosphere of Salix smithiana upon sulfur application. Environmental Science & Technology. 49 (7), 4522-4529 (2015).
  4. Luster, J., Göttlein, A., Nowack, B., Sarret, G. Sampling, defining, characterising and modeling the rhizosphere-the soil science tool box. Plant and Soil. 321 (1), 457-482 (2009).
  5. Oburger, E., Schmidt, H. New Methods To Unravel Rhizosphere Processes. Trends in Plant Science. 21 (3), 243-255 (2016).
  6. Göttlein, A., Hell, U., Blasek, R. A system for microscale tensiometry and lysimetry. Geoderma. 69 (1), 147-156 (1996).
  7. Göttlein, A., Heim, A., Matzner, E. Mobilization of aluminium in the rhizosphere soil solution of growing tree roots in an acidic soil. Plant and Soil. 211 (1), 41-49 (1999).
  8. Hinsinger, P., Gilkes, R. J. Dissolution of phosphate rock in the rhizosphere of five plant species grown in an acid, P-fixing mineral substrate. Geoderma. 75 (3), 231-249 (1997).
  9. Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
  10. Degryse, F., Smolders, E., Zhang, H., Davison, W. Predicting availability of mineral elements to plants with the DGT technique: a review of experimental data and interpretation by modelling. Environmental Chemistry. 6 (3), 198-218 (2009).
  11. Mason, S., McNeill, A., McLaughlin, M. J., Zhang, H. Prediction of wheat response to an application of phosphorus under field conditions using diffusive gradients in thin-films (DGT) and extraction methods. Plant and Soil. 337 (1), 243-258 (2010).
  12. Six, L., Smolders, E., Merckx, R. The performance of DGT versus conventional soil phosphorus tests in tropical soils-maize and rice responses to P application. Plant and Soil. 366 (1), 49-66 (2013).
  13. Mason, S. D., McLaughlin, M. J., Johnston, C., McNeill, A. Soil test measures of available P (Colwell, resin and DGT) compared with plant P uptake using isotope dilution. Plant and Soil. 373 (1), 711-722 (2013).
  14. Freese, D., Lookman, R., Merckx, R., van Riemsdijk, W. H. New Method for Assessment of Long-Term Phosphate Desorption from Soils. Soil Science Society of America Journal. 59 (5), 1295-1300 (1995).
  15. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of The Total Environment. , 738 (2020).
  16. Bhat, K. K. S., Nye, P. H. Diffusion of phosphate to plant roots in soil. Plant and Soil. 38 (1), 161-175 (1973).
  17. Glud, R. N., Ramsing, N. B., Gundersen, J. K., Klimant, I. Planar optrodes: a new tool for fine scale measurements of two-dimensional O2 distribution in benthic communities. Marine Ecology Progress Series. 140, 217-226 (1996).
  18. Blossfeld, S., Gansert, D. A novel non-invasive optical method for quantitative visualization of pH dynamics in the rhizosphere of plants. Plant, Cell & Environment. 30 (2), 176-186 (2007).
  19. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: application to oxygen and pH sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  20. Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
  21. Spohn, M., Kuzyakov, Y. Spatial and temporal dynamics of hotspots of enzyme activity in soil as affected by living and dead roots-a soil zymography analysis. Plant and Soil. 379 (1), 67-77 (2014).
  22. Heitkötter, J., Marschner, B. Soil zymography as a powerful tool for exploring hotspots and substrate limitation in undisturbed subsoil. Soil Biology and Biochemistry. 124, 210-217 (2018).
  23. Guber, A. K., Kravchenko, A. N., Razavi, B. S., Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. Calibration of 2-D soil zymography for correct analysis of enzyme distribution. European Journal of Soil Science. 70 (4), 715-726 (2019).
  24. Lin, V. S., et al. Non-destructive spatial analysis of phosphatase activity and total protein distribution in the rhizosphere using a root blotting method. Soil Biology and Biochemistry. 146, 107820 (2020).
  25. Ilhardt, P. D., et al. High-resolution elemental mapping of the root-rhizosphere-soil continuum using laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS). Soil Biology and Biochemistry. 131, 119-132 (2019).
  26. Davison, W., Zhang, H. In situ speciation measurements of trace components in natural waters using thin-film gels. Nature. 367 (6463), 546-548 (1994).
  27. Davison, W. Diffusive Gradients in Thin-Films for Environmental Measurements. , Cambridge University Press. (2016).
  28. Zhang, H., Davison, W., Knight, B., McGrath, S. In Situ Measurements of Solution Concentrations and Fluxes of Trace Metals in Soils Using DGT. Environmental Science & Technology. 32 (5), 704-710 (1998).
  29. Davison, W., Fones, G. R., Grime, G. W. Dissolved metals in surface sediment and a microbial mat at 100-μm resolution. Nature. 387 (6636), 885-888 (1997).
  30. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  31. Kreuzeder, A., Santner, J., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Gel for simultaneous chemical imaging of anionic and cationic solutes using diffusive gradients in thin films. Analytical Chemistry. 85 (24), 12028-12036 (2013).
  32. Kreuzeder, A., Santner, J., Zhang, H., Prohaska, T., Wenzel, W. W. Uncertainty evaluation of the diffusive gradients in thin films technique. Environmental Science and Technology. 49 (3), 1594-1602 (2015).
  33. Hoefer, C., Santner, J., Borisov, S. M., Wenzel, W. W., Puschenreiter, M. Integrating chemical imaging of cationic trace metal solutes and pH into a single hydrogel layer. Analytica Chimica Acta. 950, 88-97 (2017).
  34. Santner, J., Larsen, M., Kreuzeder, A., Glud, R. N. Two decades of chemical imaging of solutes in sediments and soils--a review. Analytica Chimica Acta. 878, 9-42 (2015).
  35. Santner, J., Williams, P. N. Diffusive Gradients In Thin-Films For Environmental Measurements. Davison, W. , Cambridge University Press. Ch. 8 174-215 (2016).
  36. Guan, D. X., et al. Novel Precipitated Zirconia-Based DGT Technique for High-Resolution Imaging of Oxyanions in Waters and Sediments. Environmental Science & Technology. 49 (6), 3653-3661 (2015).
  37. Zhang, H., Davison, W. Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Analytical Chemistry. 67 (19), 3391-3400 (1995).
  38. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Performance characteristics of suspended particulate reagent-iminodiacetate as a binding agent for diffusive gradients in thin films. Analytica Chimica Acta. 508 (1), 41-51 (2004).
  39. Warnken, K. W., Zhang, H., Davison, W. Analysis of Polyacrylamide Gels for Trace Metals Using Diffusive Gradients in Thin Films and Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 76 (20), 6077-6084 (2004).
  40. Gao, Y., Lehto, N. A simple laser ablation ICPMS method for the determination of trace metals in a resin gel. Talanta. 92, Supplement C 78-83 (2012).
  41. Lehto, N. J., Davison, W., Zhang, H. The use of ultra-thin diffusive gradients in thin-films (DGT) devices for the analysis of trace metal dynamics in soils and sediments: a measurement and modelling approach. Environmental Chemistry. 9 (4), 415-423 (2012).
  42. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environmental Science & Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  43. Lehto, N. J., Larsen, M., Zhang, H., Glud, R. N., Davison, W. A mesocosm study of oxygen and trace metal dynamics in sediment microniches of reactive organic material. Scientific Reports. 7 (1), 11369 (2017).
  44. Zitek, A., Aléon, J., Prohaska, T. Sector Field Mass Spectrometry for Elemental and Isotopic Analysis. , The Royal Society of Chemistry. 152-182 (2015).
  45. Lear, J., Hare, D., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27 (1), 159-164 (2012).
  46. May, T. W., Wiedmeyer, R. H. A table of polyatomic interferences in ICP-MS. Atomic Spectroscopy. 19 (5), 150-155 (1998).
  47. Raposo, F. Evaluation of analytical calibration based on least-squares linear regression for instrumental techniques: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 77, 167-185 (2016).
  48. Kreuzeder, A., et al. In situ observation of localized, sub-mm scale changes of phosphorus biogeochemistry in the rhizosphere. Plant and Soil. 424 (1), 573-589 (2018).
  49. Hooda, P. S., Zhang, H., Davison, W., Edwards, A. C. Measuring bioavailable trace metals by diffusive gradients in thin films (DGT): soil moisture effects on its performance in soils. European Journal of Soil Science. 50 (2), 285-294 (1999).
  50. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  51. Wagner, S., et al. Arsenic redox transformations and cycling in the rhizosphere of Pteris vittata and Pteris quadriaurita. Environmental and Experimental Botany. 177, 104122 (2020).

Tags

العلوم البيئية، العدد 163، التصوير الكيميائي، rhizosphere، التدرجات الناشرية في الأفلام الرقيقة، الاجتثاث الليزري مقرونة بشكل حثائي قياس الطيف الكتلي البلازما، عنصر التتبع، التغذية النباتية
التصور ثنائي الأبعاد والتخصيص الكمي للمغذيات النباتية غير العضوية والملوثات في التربة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, S., Hoefer, C., Prohaska,… More

Wagner, S., Hoefer, C., Prohaska, T., Santner, J. Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil. J. Vis. Exp. (163), e61661, doi:10.3791/61661 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter