Summary
우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.
Abstract
생체 내 환경 조건을 모방하는 것은 복잡한 생명 기계에 대한 시험관 내 연구에 매우 중요합니다. 그러나 살아있는 세포와 장기를 대상으로 하는 현재 기술은 로봇 공학과 같이 비용이 많이 들거나 나노리터 부피와 액체 조작의 밀리초 시간 정확도가 부족합니다. 당사는 1,500개의 배양 장치, 향상된 연동 펌프 및 현장 믹싱 계수로 구성된 미세 유체 시스템의 설계 및 제조를 소개합니다. 미세 유체 장치의 용량을 입증하기 위해 신경 줄기 세포 (NSC) 구는 제안 된 시스템에서 유지됩니다. 우리는 NSC 구가 1일째에 CXCL에 노출되고 2일째EGF에 노출되면 둥근 모양의 형태가 잘 유지되는 것을 관찰했습니다. 6개의 약물의 입력 순서의 변화는 NSC 스템니스(즉, Hes5 및 Dcx)에 대한 NSC 구및 발현 수준 대표 마커에 대한 형태학적 변화를 일으킨다. 이러한 결과는 동적 및 복잡한 환경 조건이 NSC 분화 및 자체 갱신에 큰 영향을 미치는 것을 나타내며, 제안된 미세 유체 장치는 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를 위한 적합한 플랫폼입니다.
Introduction
높은 처리량 기술은 생물 의학 및 임상 연구에 매우 중요합니다. 수백만 개의 화학, 유전 적 또는 살아있는 세포 및 오르가노이드 테스트를 병렬로 수행함으로써 연구원은 생체 분자 경로를 조절하는 유전자를 신속하게 식별하고 특정 요구에 순차적인 약물 입력을 사용자 정의 할 수 있습니다. 로봇공학 1 및 마이크로 유체 칩은 장치 제어 프로그램과 결합하여 세포/조직 조작, 액체 처리, 이미징 및 데이터 처리/제어2,3을포함하는 복잡한 실험 절차를 자동화할 수 있도록 합니다. 따라서 원하는 처리량4,5에따라 수백 및 수천 개의 실험 조건을 단일 칩으로 유지할 수 있다.
이 프로토콜에서, 우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프및 현장 믹싱 계수로 구성된 미세 유체 장치의 설계 및 제조 절차를 설명했습니다. 2 단계 세포 배양 챔버는 중간 교환 중에 불필요한 전단을 방지하여 장기적인 살아있는 세포 이미징을위한 방해받지 않는 배양 환경을 보장합니다. 연구 결과는 제안된 미세 유체 장치가 복잡한 생활 기계에 높은 처리량 연구를 위한 적당한 플랫폼이다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 미세 유체 칩의 고급 기능은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건의 자동 재구성을 허용, 끊임없이 변화하는 사이토카인과 리간드 조성물6,7,96 웰 플레이트와 같은 기존의 플랫폼에 대한 수개월이 걸리는 완료.
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Protocol
1. 미세 유체 칩 설계
- 개별 밸브와 연동 펌프에 의해 제어되는 18개의 입구로 구성된 미세 유체 멀티플렉터를 설계합니다. 펌핑 사이클당 구동되는 액체 부피를 증가시키기 위해, 연동 펌프는 의도적으로 200 μm, 10개의 연결된 유동선으로 확대된 3개의 제어 채널로 구성된다.
- 전단이 없는 문화실을 디자인합니다. 2단계 배양장치의 복제는 낮은 세포 배양 챔버(400 μm x 400 μm x 150 μm x 150 μm)와 더 높은 완충층(400 μm x 400 μm x 75 μm)으로 구성되어 중간 교환 시 세포에 원치 않는 전단 응을 방지한다(도1).
- 높은 처리량 기능을 설계합니다. 배양 장치를 복제하여 30 x 50 매트릭스 레이아웃을 형성하여 약 7cm x 5cm 크기의 영역을 차지합니다.
2. 칩 제작 및 작동
- UV 리소그래피를 사용하여 복제 성형 제작
참고: 표준 광석 촬영 프로토콜8에따라 실리콘 웨이퍼에서 복제 성형이 제작되었습니다.- 채널 구조 제작
- 스피닝 포토레지스트: 30s용 10s, 3000rpm의 실리콘 웨이퍼에 SU-8 3025 네거티브 포토레지스트의 스핀 코트 5mL.
- 소프트 베이크: 웨이퍼를 65°C에서 2분 동안 핫플레이트에 올려 놓은 다음 95°C를 10분간 식히고 실온으로 식힙니다.
- 정렬 및 경화: 웨이퍼와 마스크를 정렬기 홀더에 고정하고 노출된 포토레지스트를 치료하기 위해 18s의 광원을 켭니다.
- 사전 노출 굽기: 실온에서 110°C/h에서 웨이퍼를 95°C로 늘리고 제거할 때까지 최소 40분 간 유지합니다.
- 개발: 개발 솔루션(SU-8 개발자)에서 웨이퍼를 찍어 2.5분 동안 교반하여 중복 광저항을 씻어내고 25 μm 높이의 채널 구조를 얻습니다.
- 하드 베이킹: 웨이퍼를 유리 페트리 접시로 덮고 65°C에서 2분간 굽은 다음 120°C/h에서 최대 160°C까지 올라가 3시간 동안 보관하십시오.
- 완충층을 가진 세포 배양챔버의 제조
- 상기 웨이퍼에 SU-8 3075 네거티브 포토레지스트의 7mL을 회전시키기 위해 2.1.1.1 단계의 파라미터를 사용한다.
- 부드러운 베이킹 (단계 2.1.1.2에 설명) 웨이퍼와 웨이퍼의 마커와 잘 정렬마스크를 변경합니다. 그런 다음 24s의 광원을 켜서 노출된 포토레지스트를 치료합니다.
- 웨이퍼를 개발 솔루션(SU-8 개발자)에 찍어 4분 40초 동안 교반하여 중복 광저항을 씻어내고 이전에 제작된 25μm 높이의 채널 구조 주변의 75μm 높이의 층 구조를 얻습니다. 하드 베이크 (단계 2.1.1.6에 설명) 웨이퍼는 복잡한 구조를 강하게합니다.
- 2.1.2.1-2.1.2.3을 반복하여 층 구조에 쌓이는 75 μm 높이의 챔버 구조를 제작한다.
- 밸브 구조의 제조
- 상기 웨이퍼에 AZ 50x 양성 포토레지스트의 5mL를 회전하는 단계 2.1.1.1의 파라미터를 이용하여.
- 부드러운 베이킹 (단계 2.1.1.2에 설명) 웨이퍼와 마스크를 웨이퍼의 마커와 잘 정렬 한 다음 광원을 20 s에 넣고 30 s를 즉시 꺼두십시오. 노출 된 포토 레지스트를 치료하기 위해 5 원에서 조명 켜기 / 오프 절차를 반복합니다.
- 웨이퍼를 찍어 개발자와 일치시키고 약 8분 동안 교반하여 중복 광저항을 씻어내고 좋은 연결을 보장하기 위해 제어 채널과 겹치는 둥근 모양의 밸브를 얻습니다. 하드 베이크 (단계 2.1.1.6에 설명) 패턴 웨이퍼는 전체 모델을 강하게합니다.
- 채널 구조 제작
- 소프트 리소그래피를 이용한 미세 유체 칩 생산
- 패턴 및 빈 실리콘 웨이퍼를 리메틸클로로실레인으로 15분 동안 처리합니다.
- 유동층 50g, 제어층 20g, 멤브레인 20g에 해당하는 PDMS 젤(단량/촉매 비 10:1)의 3부분을 각각 준비한다.
- 패턴 실리콘 웨이퍼에 PDMS 젤 50g을 캐스팅하고- 0.85 MPa에서 진공 챔버에서 1-2 시간 동안 그들을 제가스하여 유동층을 복사한다.
- PDMS 20g의 2부분을 탈착시키고 30s에 대한 패턴 웨이퍼 및 빈 실리콘 웨이퍼에 스핀하여 30s에 대한 제어 층 및 멤브레인 층을 준비한다.
- PDMS 로 덮여 웨이퍼를 80 °C에서 60 분 동안 환기 오븐에 넣고 배양하십시오.
- 맞춤형 광학 장치(100x 확대 줌) 및 플라즈마 에칭 기계를 통해 서로 다른 레이어를 정렬하고 결합합니다. 그런 다음 칩의 결합을 향상시키기 위해 80 °C에서 2 시간 동안 환기 오븐에 보관하십시오.
- 칩의 입구 구멍을 펀치한 다음 PDMS 코팅 커버슬립에 결합한 다음 사용하기 전에 80°C에서 최소 12시간 동안 경화합니다.
- 칩 작동
- 소형 공압 솔레노이드 밸브를 칩의 제어 레이어에 연결하고 맞춤형 MATLAB 그래픽 사용자 인터페이스8을 열어 스위치를 연결하고 제어합니다.
- 푸시업 PDMS 멤브레인 밸브의 닫는 압력을 25 psi로 설정합니다.
- 밸브의 적시 온오프로 지정된 챔버(도2d)에동적으로 변화하는 조합/순차 입력을 전달합니다.
3. 셀룰러 마이크로 환경에서 동적 입력의 생성
- 칩 처리 및 셀 로딩
- 현미경에서 표준 배양 조건(37°C, 5%CO2)을최소 5시간 동안 유지한다.
- 칩에 코팅 매체(즉, NOTE에 언급된)로 칩을 채우고 표준 배양 조건(3.1.1 단계에서 설명)에서 적어도 한 시간 동안 배양한다.
- 건강한 배양 환경을 구축하기 위해 인산염 완충식염(PBS) 또는 세포 배양 배지(덜벡코의 변형 독수리의 매체, DMEM)에 의해 칩을 플러시한다.
- 80% 수렴성으로 세포를 수확하고, ~ 10 6/mL의 밀도로 배양매체(DMEM)를 사용하여 세포를 재보선한다. 그런 다음 셀 함유 용액을 가압하여 셀을 칩에 로드합니다.
참고: 칩상상상에서 상이한 세포주를 배양하려면 세포 배양 챔버를 처리하기 위해 대응하는 코팅 배지가 필요합니다. 전형적으로, 3T3 섬유아세포 및 암탉의 부착배양에 대한 실험의 경우 배양챔버를 제어하는 모든 판막이 개방되고, 세포는 동일한 컬럼 내의 모든 배양실로 흐른다.
- 높은 처리량 라이브 셀 이미징을 위한 설정
참고: 이미지 수집의 경우 자동화된 번역 단계와 디지털 보완 금속 산화물 반도체(CMOS) 카메라가 있는 반전 된 현미경이 사용되었습니다. 단계 및 이미지 수집은 사용자 정의 소프트웨어를 통해 제어되었습니다.- 밝은 분야에서 10x 객관적렌즈를 사용하여 배양 챔버의 매트릭스를 시각화하여 30 x 50 챔버 매트릭스의 각 챔버의 위치 좌표를 확인하고 정의합니다.
- 목표 렌즈를 20배 또는 40x로 변환한 다음 원하는 챔버의 위치 좌표를 선택하고 번역 스테이지는 확인 후 할당된 위치로 이동합니다. 최적의 이미지를 얻기 위해 x, y, z 초점 평면을 미세 조정합니다.
- 빛 강도, 노출 시간 및 기타 이미지 매개 변수를 각 채널(즉, 밝은 필드 및 형광 이미징)에 대해 개별적으로 결정하였다.
- 이미징 주기의 간격과 지속 시간을 설정하고 경로를 저장한 다음 이미징을 시작합니다.
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Representative Results
종래의 온칩 연동 펌프는 2000년 스티븐 퀘이크(Stephen Quake)에 의해 처음 설명되었으며, 이 펌프는 패턴 101, 100, 010, 011, 011, 001 8,10에의해 연동이 작동되었다. 숫자 0과 1은 3개의 수평 제어선의 "열기" 및 "닫기"를 나타냅니다. 3개 이상의 밸브(예: 5개)를 사용한 연구도11개보고되었다. 3개의 제어라인과 3개의 유동선으로 구성된 연동 펌프가 나노리터 정확도를 제공하지만, 수송 속도가 너무 느려서 1,500개의 배양챔버를 공급합니다. 문제를 해결하기 위해 펌핑 사이클당 구동되는 액체 부피를 증가시키는 더 많은 흐름선(즉, 10개의 연결된 채널)을 포함합니다(예: 101, 100, 110, 010, 011, 011, 001). 따라서, 영양소와 약물은 지정된 챔버에 효과적으로 전달될 수 있다. 연동 펌프 수송 액체 부피는 펌핑 사이클당 ~ 50 나노리터로 16배 증가될 수 있습니다. 연동 펌프의 배열이 3개의 연결된 제어채널(도 1b)에의해 제어되기 때문에 각 입구의 솔루션이 동시에 칩에 전달되어 즉시 혼합할 수 있습니다. 따라서 조합 및 순차 입력은 서로 다른 솔루션에 연결된 입구의 적시에 온오프하여 생성될 수 있습니다. 동일한 방법론을 사용하여, 동적 변화하는 사이토카인 및 리간드 농도도 생성될 수 있다. 예를 들어, 선택한 조합 1, 0.9, 0.2, 0.05, 0.01 g/L 및 4개의 빈 배양 매체는 0.0005에서 0.01 g/L에 이르는 단계 크기로 농도가 있는 사내 파 변동(0~0.5g/L 사이)을 생성할 수 있다.
1 차 적인 세포의 배양에 대 한, 안정적인 미세 환경을 유지 하는 것이 중요 하다. 중간 교환 시 조건된 매체의 전단 응력 및 피로는 세포 행동 및 세포운명(12)에영향을 미칩니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 우리는 중간 교환 동안 세포에 원치 않는 전단 응을 방지하기 위해 버퍼 레이어를 설계(도 1c). 기존의 배양 장치와 달리, 장치(즉, 밸브 제어)의 주요 장점은 현장 혼합, 납품 및 독립적인 조건의 유지 보수 기능입니다. 도 2d에서,우리는 개별 문화실에서 영향을 받지 않는 상태의 지정된 위치 및 유지 보수에 액체를 정밀하게 전달하여 칩에 복잡한 중국어 단어를 만들 수 있음을 입증했습니다. 현장 믹싱에서 활성 유체 장치의 기능은 비디오 클립과 함께 도시되며, 2inlets12에연결된 2개의 독립적인 연동 펌프의 펌핑 속도를 제어하여 달성되는 배양챔버(도 3c 및 비디오 7:47-7:50)에서 FITC 농도를 동적으로 변화시키는 모습을 보여줍니다. 수치 시뮬레이션에 따르면 배지가 배양 챔버를 통해 하향식으로 향할 때 전단 흐름이 문화 최하위에 빠르게 도달한다는 것을 알 수 있습니다(비디오 4:07-4:25). 솔루션이 왼쪽에서 오른쪽으로 향할 때 전단 력을 효과적으로 방지할 수 있습니다. 10mm/s의 입력 유량에서도 세포 또는 마이크로미터 크기의 조직은 배양 장치의 바닥에 방해받지 않고 남아 있습니다.
도3b(1)에 도시된 바와 같이, 각 입구는 하부 연동 펌프 이외의 밸브에 의해 제어된다. 하나의 약물이 지정된 챔버로 전달하도록 선택되면, 약물에 연결된 입구가 열려 있으며 연동 펌프의 배열의 동작은 이 약만 을 운반합니다. 2 또는 다중 약물의 경우 연결된 입구를 열어 동일한 부피로 약물의 혼합물을 생성합니다. 또한 어레이(그림2g)와는 별개로 독립적인 정립펌프 1개를 통합하여 어레이와 다른 펌핑 속도로 작동하여 다른 희석을 생성할 수 있습니다. 생체 내 NSC 동적 환경 조건을 모방하기 위해, 720 및 56개의 상이한 조건으로 구성된 6개의 리간드(즉, 들쭉날쭉한, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF)의순차적 및 조합 조건은 연동 펌프의 배열을 이용하여 생성되어 지정된 챔버로 전달되었다. 상세하게, 순차적 조건은 Sij = {ligand i가 일 j}및 Ci = {ligand i가 존재하는}로 결합 조건으로 추가될 수 있으며, 여기서 리간드 i = 들쭉날쭉한, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF 및 j=1,2,3,4,5,6으로 표현될 수 있다. NSC 세포와 구체의 반응은 배양과 자극 중에 매 2시간마다 기록되었다.
NSC 구체는 400 μm에서 400 μm 세포 배양챔버(도2e 및 도 4)로유지된다. 줄기 세포의 분화 및 줄기 (즉, 자기 갱신)는 각각 Dcx 및 Hes5의 발현 수준으로 표현된다. 우리는 NSC 구가 1일째에 CXCL에 노출되고 2일째EGF에 노출될 때, 둥근 모양의 형태가 잘 유지되고 구체 크기가 명백히 증가하는 것을 관찰했습니다. EGF가 PACAP로 대체될 때3일째에 높은Dcx 발현 수준을 가진 NSC는분화세포(13,14,15,16)에미치는 영향을 시사한다. 세포는4일째 DLL에 의해 자극시 처리되지 않은 PDMS 표면에 부착하기 시작하고,5일째에 PDGF를 첨가하고6일째에 들쭉날쭉하게 하여 개별 세포로 해리한다. 이들 6리간드의 입력 순서의 변화는 독특한 NSC상태(그림 5)를가져온다. 예를 들어, CXCL이 시퀀스를 따라 PDGF로 위치를 전환할 때 NSC의 진화는 극적으로 변화한다(도5a 및 5b). 이러한 결과는 역동적인 다양한 환경 조건이 NSC 분화 및 자체 갱신에 큰 영향을 미치는 것으로 입증되며, 이는 생체 의학 연구뿐만 아니라 임상 응용 프로그램을 위한 뇌-온 칩 플랫폼 개발의 길을 열어줍니다.
그림 1: 고처리량 미세 유체 칩의 설계. 향상된 연동 펌프는 여러 유량 채널과 확장된 제어 채널로 구성되어 있어 펌핑 사이클당 전송된 액체 부피가 증가합니다. b. 연동 펌프의 배열은 3 개의 연결된 제어 라인에 의해 제어됩니다. 따라서 프로그래밍된 시간 점에 다른 입구를 포함하면 조합, 순차적 및 동적 다양한 입력 신호를 생성할 수 있습니다. c. 원치 않는 전단 흐름을 방지하기 위해 2 단계 배양 장치를 설계했습니다. 셀은 깊이 150 μm인 하부 레벨의 하단에서 유지됩니다. d. 각 배양 챔버는 4개의 채널에 연결되어 있어 하향식 및 좌우 방향을 통해 솔루션을 지시할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 고처리량 미세 유체 칩의 제조. 제어 및 유동 층의 미세 구조는 먼저 복제를 위해 PDMS를 캐스팅하는 실리콘 웨이퍼에 패턴화되었습니다. b. 제어, 멤브레인 및 유량 층은 플라즈마 에칭 및 열 접합을 사용하여 함께 정렬되고 결합됩니다. c-f. 칩의 고급 기능은 녹색, 파란색 및 노란색 식품 염료를 사용하여 입증됩니다. 우리는 밸브의 적시 온 오프에 의해, 나노 리터 정확도의 용액이 지정된 챔버에 전달 될 수 있음을 보여줍니다. g.연동 펌프의 배열은 3개의 연결된 제어 라인(즉, Control-1)에 의해 제어되며, 다른 3개의 제어 라인(즉, Control-2)에 의해 제어되는 하나의 독립적인 연동 펌프에 의해 제어됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 활성 유체 장치를 보여주는 회로도. (a)세포가 바이패스 채널을 통해 흐르는 것을 보여주는 회로도; (b)밸브는 입구와 연동 펌프를 제어; 및(c)세포는 배양 챔버로 흐르고 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 순차적인 약물 입력에 의해 자극될 때 NSC 구의 대표적인 이미지. 밝은 필드(위쪽 행), Hes5-GFP(두 번째 행), Dcx-Desred(세 번째 행) 이미지는 순차적 자극시 Dcx-high및 Hes5-high 세포 사이에서 상당한 세포 죽음이 발생한다는 것을 보여줍니다. 어두운 영역의 출현은 줄기 세포의 죽음을 시사, 이는 주로 핵심 영역에서 국한. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 다른 순차입력에 의해 자극될 때 NSC 구 형태, Dcx 및 Hes5 식 레벨의 변형. 6개의 약물의 입력 순서의 변이가 조직, 형태학적 및 신호 분자의 발현 수준에 변화를 일으키고, 이는 NSC 구의 민감도를 역동적인 환경 조건으로 나타낸다는 것을 입증한다. 입력 시퀀스:(a)DLL>> PACAP>gt; EGF> CXCL>gt; PDGF>gt; Jagged,(b)DLL>gt; PACAP > EGF > PDGF > CXCL >> 들쭉날쭉한,(c)DLL > GT; GT> PDGF > CXCL > CXCL > Gt> 들쭉날쭉한, (d) PDGF >gt; GT> 들쭉날쭉한,(d)PDGF > [GT> 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다양한 미세유체 장치는 멀티플렉스 및 복합 실험을 수행하기 위해 개발되었다17,18,19,20. 예를 들어, 위상 오목의 배열로 만들어진 마이크로웰은 외부의 힘을 사용하지 않고 개별 세포를 트랩할 수 있으며, 작은 샘플 크기, 병렬화, 낮은 재료 비용, 빠른 반응, 고감도21,22,23,24를포함한 유리한 문자를 보여 줍니다. 방울과 표면 장력 제한 액적 물방울은 마이크로 펌프와 같은 보조 하드웨어의 필요성을 제거하여 방울의 운송을 보다 저렴한 비용과 친환경25,26로만듭니다. 액체방울은 마이크로피펫 이나 분무기 노즐에 의해 표면에 쉽게 증착될 수 있으며, 실험 후, 시스템은 용이하게 새로 고침및 재사용 가능 할 수있다27,28. 슬립칩 기법은 통합 펌프 나 밸브의 개입없이 멀티 플렉스 반응을 허용하므로 사용자 및 생산자 친화적 인29,30. 그러나 이러한 시스템은 마이크로 웰에 나노리터 솔루션을 저장하고 습도를 제어하며 병렬 저용량 액체 분배 기술의 한계와 같은 여러 가지 기술적 장애물에 직면해 있습니다.
이 논문에서, 우리는 살아있는 세포 화상 진찰 시스템 및 사용자 정의 된 미세 유체 장치를 사용하여 높은 처리량 생물 의학 실험을 위한 프로토콜을 기술했습니다. UV 및 소프트 리소그래피를 포함한 칩 제조 절차및 자동 형광 이미징을 위한 설치 파라미터가 자세히 설명되어 있습니다. 그 결과 제안된 미세 유체 칩의 고급 기능 기능 기능(즉, 2단계 배양 챔버 및 향상된 연동 펌프)이 이전에 보고된 장치를 능가하고 수천 개의 병렬 실험을 수행해야 하는 필요성을 충족시키는 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 1 차및 줄기 세포의 배양을 위한 건강한 환경을 유지하기 위하여 신중하게 통제해야 하는 중요한 매개 변수 (예를 들면, 조건화된 매체의 유지)를 기술했습니다.
복잡한 프로토콜과 화학 물질의 프로그래밍 된 추가를 포함하는 세포 기반 생체 의학 실험은 종종 시간이 많이 걸리고 힘든 것으로 간주됩니다. 예를 들어, 세포 조작 절차 외에도 시간당 리필이 있는 6개의 약물의 조합 입력은 시간당 적어도 250개의 파이펫팅 단계를 필요로 하며, 실험이 끝날 때까지 반복한다. 또한 생체 내에서 동적 환경 조건을 모델링하려면 수동 작동이 불가능한 초 단위로 하나 또는 다중 사이토카인, 리간드 및 약물을 적시에 첨가해야 합니다. 본 명세서에서는 칩의 입구를 다중 약물, 또는 단일 약물의 상이한 농도에 연결함으로써, 결합, 순차적 및 동적으로 변화하는 입력 신호를 전단없는 세포 환경에서 생성 및 유지될 수 있음을 입증한다. 병렬로 실행되는 배양 챔버에서 유지되는 세포 및 조직의 형태학적 및 화학 적 반응은 상용 현미경 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.
생체 이미징 중 미세 유체 장치의 처리량이 증가하고 자동화된 데이터 수집이 증가함에 따라 라이브 셀 이미징 시스템은 매시간 수천 개의 이미지를 생성할 수 있습니다. 예를 들어 1500단위 칩을 1주일 동안 연속 실행하면 252,000개의 이미지가 생성됩니다. 단일 세포 수준에서 조직 및 세포 집단(예를 들어 형광태그 생체 분자의 발현 수준)의 진화를 수동으로 추적하는 데 몇 달이 걸릴 수 있다. 사용자 지정된 MATLAB 프로그램을 사용하여 대규모 데이터를 자동으로 정렬, 서식 및 분석할 수 있습니다. 이동성, 형태학적 특징 및 신호 분자의 발현 수준을 보여주는 추적은 인간의 오류를 방지하고 상당한 시간을 절약하는 (비디오에 표시됨)를 검색할 수 있습니다.
따라서, 여기서 입증된 방법론은 자동화된 세포 및 조직 조작, 형광 화상 진찰 및 데이터 분석을 통한 높은 처리량 생물 의학 실험을 수행하기 위한 적합한 프로토콜을 보여줍니다. 멤브레인 밸브의 온-오프 스위칭은 최적의 액체 부피, 시간 및 공간 해상도를 제공하여 장기 온 칩과 같은 시험관 내의 끊임없이 변화하는 복잡한 환경 조건을 재구성합니다. 프로토콜은 과도기 생물 의학 접근 (예를 들어, 96-well 플레이트를 사용하여 수동 절차)에 비해 상당히 복잡하더라도, 제시 된 프로토콜 및 플랫폼은 세포 및 조직 기능에 대한 연구에 국한되지 않습니다. 조합 및 순차적 약물 입력의 검열은 우리가 임상 응용을 위한 치료를 개발하는 것을 허용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 찬센 악기 (중국) LTD의 Zhifeng Cheng의 기술 지원을 인정합니다. 이 작품은 보조금에 의해 지원되었다 (중국의 국립 자연 과학 재단,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
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