Summary
Мы представляем микрофлюидную систему для высокой пропускной способности исследований на сложных жизненных механизмов, которая состоит из 1500 единиц культуры, массив расширенных перистальтических насосов и на месте смешивания модуль. Микрофлюидный чип позволяет проводить анализ очень сложных и динамичных микро-экологических условий in vivo.
Abstract
Имитация условий окружающей среды in vivo имеет решающее значение для исследований in vitro по сложному жизненному механизму. Тем не менее, современные методы ориентации живых клеток и органов либо очень дорого, как робототехника, или отсутствие нанолитрового объема и миллисекундной точности времени в жидких манипуляций. Здесь мы представляем дизайн и изготовление микрофлюидной системы, которая состоит из 1500 единиц культуры, массив расширенных перистальтических насосов и на месте смешивания модуль. Для демонстрации возможностей микрофлюидного устройства в предлагаемой системе поддерживаются сферы нервных стволовых клеток (НСК). Мы заметили, что, когда сфера НСК подвергается воздействию CXCL в день 1 и EGF в день 2, круглая конформация в хорошо поддерживается. Изменение порядка ввода 6 препаратов вызывает морфологические изменения в сфере НСК и репрезентативный маркер уровня экспрессии для стволов НСК (т.е. Hes5 и Dcx). Эти результаты свидетельствуют о том, что динамические и сложные условия окружающей среды имеют большое влияние на дифференциацию и самообувечение НСК, а предлагаемое микрофлюидное устройство является подходящей платформой для высокой пропускной способности исследований на сложном жизненном механизме.
Introduction
Высокие методы пропускной способности имеют решающее значение для биомедицинских и клинических исследований. Параллельно проводя миллионы химических, генетических или живых клеток и органоидных тестов, исследователи могут быстро определить гены, которые модулируют био-молекулярный путь, и настроить последовательные ввода наркотиков для своих конкретных потребностей. Робототехника1 и микрофлюидные чипы в сочетании с программой управления устройством позволяют автоматизировать сложные экспериментальные процедуры, охватывающие манипуляции с клетками/тканями, обработку жидкости, визуализацию и обработку/контрольданных 2,3. Таким образом, сотни и тысячи экспериментальных условий могут быть сохранены на одном чипе, в соответствии с желаемойпропускной способностью 4,5.
В этом протоколе мы описали процедуру проектирования и изготовления микрофлюидного устройства, которое состоит из 1500 единиц культуры, массива усовершенствованные перистальтические насосы и на месте смешивания модуль. 2-уровневая камера клеточной культуры предотвращает ненужный слейр во время среднего обмена, что обеспечивает нетронутую культурную среду для долгосрочной визуализации живых клеток. Исследования показывают, что предлагаемое микрофлюидное устройство является подходящей платформой для высокой пропускной способности исследований на сложном жизненном механизме. Кроме того, расширенные характеристики микрофлюидного чипа позволяют автоматически воссоздать очень сложные и динамичные микроэнвиронные условия in vivo, такие как постоянно меняющиеся цитокиныи лиганды композиций 6,7, завершение которых занимает месяцы для обычных платформ, таких как 96-хорошо пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Конструкция микрофлюидных чипов
- Дизайн микрофлюидного мультиплексера, состоящего из 18 входов, каждый из которых управляется отдельным клапаном и перистальтическим насосом. Для увеличения объема жидкости, обусловленной циклом перекачки, перистальтический насос состоит из 3 каналов управления, которые были специально расширены до 200 мкм, и 10 соединенных линий потока.
- Дизайн камеры культуры, свободной от стрижки. Репликация 2-уровня культуры единицы состоит из нижней камеры культуры клеток (400 мкм х 400 мкм х 150 мкм) и более высокий буферный слой (400 мкм х 400 мкм х 75 мкм), который предотвращает нежелательные сляния нагрузки на клетки во время среднегообмена (рисунок 1).
- Дизайн высокой пропускной способности. Дублируйте культурную единицу, чтобы сформировать матричную компоновку размером 30 х 50, занимая площадь размером примерно 7 см на 5 см.
2. Изготовление и эксплуатация чипов
- Изготовление реплики литья с помощью УФ-литографии
ПРИМЕЧАНИЕ: Реплика литья была изготовлена на кремниевой пластины в соответствии со стандартным протоколом фотолитографии8.- Изготовление структур канала
- Спиннинг фоторезистер: Спиновое пальто 5 мл СУ-8 3025 отрицательный фоторезист на кремниевой пластине при 500 об/мин при 10 с и 3000 об/мин за 30 с.
- Мягкая выпечка: Положите на плиту при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 минут, а затем 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, охладить его до комнатной температуры.
- Выравнивание и лечение: Исправить и маски на держатель выравнивателя и включите источник света для 18 с, чтобы вылечить подвергаются фоторезист.
- Предварительная экспозиция поста испечь: Ramp до до 95 градусов по Цельсию при температуре 110 градусов по Цельсию /ч от комнатной температуры и держать его по крайней мере 40 минут до удаления.
- Разработка: Опустите пластину в развивающийся раствор (разработчик СУ-8) и агитизируйте его за 2,5 мин, чтобы смыть лишнего фоторезистера и получить структуру канала высотой 25 мкм.
- Твердый выпекать: Обложка со стеклянной чашкой Петри и выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 минут, а затем нарастить до 160 градусов по Цельсию при температуре 120 градусов по Цельсию / ч и держать его в течение 3 часов.
- Изготовление камеры клеточной культуры с буферным слоем
- Используйте параметры шага 2.1.1.1,1, чтобы вращать пальто 7 мл отрицательной фоторезистерии СУ-8 3075 на вышеуказанной пластине.
- Мягкая выпечка (описанная в шаге 2.1.1.2) и изменить маску, чтобы выровнять хорошо с маркерами на пластине. Затем включите источник света для 24 с, чтобы вылечить подвергаются фоторезистер.
- Опустите пластину в развивающийся раствор (разработчик SU-8) и агитировать его в течение 4 минут и 40 секунд, чтобы смыть избыточный фоторезист и получить 75 мкм высокой структуры слоя, что вокруг 25 мкм-высокой структуры канала сфабрикованы раньше. Твердый выпекать (описанный в шаге 2.1.1.6), чтобы сделать сложную структуру сильнее.
- Повторите шаги 2.1.2.1-2.1.2.3, чтобы сфабриковать структуру камеры высотой 75 мкм, которая укладывается на структуру слоя.
- Изготовление конструкций клапана
- Используя параметр шага 2.1.1.1.1, чтобы вращать пальто 5 мл положительной фоторезистерзиста АЗ 50x на вышеуказанной пластине.
- Мягкая выпечка (описано в шаге 2.1.1.2) и сделать маску выровнены хорошо с маркерами на пластине, а затем сохранить источник света на 20 с и сразу же в течение 30 с. Повторите свет на / выключить процедуру в 5 кругах, чтобы вылечить подвергаются фоторезист.
- Опустите пластину, чтобы соответствовать разработчику и агитировать его в течение 8 минут, чтобы смыть избыточный фоторезистент и получить круглые клапаны, которые перекрываются с каналами управления, чтобы обеспечить хорошее соединение. Твердый выпекать (описанный в шаге 2.1.1.6) узорчатые, чтобы сделать всю модель сильнее.
- Изготовление структур канала
- Производство микрофлюидных чипов с использованием мягкой литографии
- Лечить узорчатые и пустые кремниевые с rimethylchlorosilane в течение 15 мин.
- Приготовьте 3 порции геля PDMS (10:1 соотношения мономер/катализатор), соответствующие 50 г слоя потока, 20 г контрольного слоя 2 и 20 г мембраны соответственно.
- Бросьте 50 г геля PDMS на узорчатую кремниевую пластину и де-газ их в течение 1-2 часов в вакуумной камере при -0.85 MPa для копирования слоя потока.
- Дега 2 порции 20 г PDMS и спина его на узорчатой пластины и пустой кремниевой пластины на 2000-2800 об /мин для 30 с, чтобы подготовить контрольный слой и мембранный слой.
- Поместите, покрытые PDMS, в вентиляционную духовку на 60 минут при температуре 80 градусов по Цельсию для инкубации.
- Выравнивание и связь различных слоев вместе с помощью индивидуального оптического устройства (зум в 100x) и плазмы травления машины. Затем держите его в вентиляционой духовке в течение 2 часов при температуре 80 градусов по Цельсию, чтобы усилить склеивание чипа.
- Удар вход отверстия на чипе, а затем склеить его на PDMS покрытием coverslip и вылечить, по крайней мере 12 часов при 80 градусов по Цельсию перед использованием.
- Чип операции
- Подключите миниатюрные пневматические соленоидные клапаны к контрольному слою чипа и откройте индивидуальный графический пользовательский интерфейсMATLAB 8 для связи и управления коммутатором.
- Установите давление закрытия отжимаемых мембранных клапанов PDMS до 25 пси.
- Доставка динамически изменяющихся комбинаторных/последовательных входов в назначенные камеры(рисунок 2d)путем своевременного выключа клапанов.
3. Генерация динамических входных данных в клеточном микроокантиронии
- Чип лечения и загрузки клеток
- Поддержание стандартных культурных условий (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) на микроскопе в течение не менее 5 часов.
- Заполните чип средой покрытия (т.е. упомянутой в ПРИМЕЧАНИЕ) и инкубировать его в стандартных условиях культуры (описанных в шаге 3.1.1) в течение по крайней мере одного часа.
- Промыть чип фосфат-буфером солевого раствора (PBS) или клеточной культуры среды (Dulbecco в модифицированной иглы среды, DMEM), чтобы построить здоровую культурную среду.
- Клетки сбора урожая на 80% соток и повторное использование клеток с помощью культурных средств массовой информации (DMEM) при плотности 106/мл. Затем загрузите ячейки в чип, давя на клеточный раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование различных клеточных линий на чипе требует соответствующего покрытия среды для лечения камеры клеточной культуры. Как правило, для экспериментов на фибробласте 3Т3 и адептской культуре курицы открыты все клапаны, контролирующие культурные камеры, клетки втекают во все культурные камеры в пределах одной колонки.
- Настройка для высокой пропускной способности живоклеточной визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений использовался перевернутый микроскоп с автоматизированной этапом перевода и цифровая дополнительная полупроводниковая камера с оксидом металла (CMOS). Этап и приобретение изображений контролировались с помощью индивидуального программного обеспечения.- Визуализуйте матрицу культурных камер с помощью 10-х объективных объективов в ярком поле для подтверждения и определения координат расположения каждой камеры матрицы 30 на 50 камер.
- Преобразуй объектив цели в 20x или 40x, затем выберите координаты местоположения нужной камеры и этап перевода перемещается в заданное положение после подтверждения. Тонкая настройка x, y, z фокусной плоскости, чтобы получить оптимальное изображение.
- Оптимальная интенсивность света, время разоблачения и другие изображения определялись индивидуально для каждого канала (т.е. ярко-полевые и флуоресцентные изображения).
- Установите интервал и продолжительность цикла визуализации, сохраните путь, а затем начните визуализацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обычный перистальтический насос на чипе был впервые описан Стивеном Кваке в 2000 году, с помощью которого перистализ был активирован шаблоном 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Число 0 и 1 указывает на "открытое" и "закрытие" 3 горизонтальных линий управления. Исследования с использованием более 3 клапанов (например, пять) также были зарегистрированы11. Несмотря на то, что перисталтический насос, состоящий из 3 линий управления и 3 линий потока обеспечивает точность нанолитров, скорость транспортировки слишком медленно, чтобы кормить 1500 камер культуры. Для решения проблемы мы включаем больше линий потока (т.е. 10 подключенных каналов) для увеличения объема жидкости, управляемой за цикл прокачки (т.е. 101, 100, 110, 010, 011, 001). Таким образом, питательные вещества и препараты могут быть эффективно доставлены в назначенные камеры. Перистальтический насос транспортируется жидкий объем может увеличиться в 16 раз до 50 нанолитров за цикл перекачки. Поскольку массив перистальтических насосов управляется 3 подключенными каналамиуправления (рисунок 1b),решения с каждого входа доставляются одновременно к чипу и позволяют мгновенно смешивать. Таким образом, комбинаторные и последовательные входные данные могут быть сгенерированы путем своевременного ввода входов, подключенных к различным решениям. Используя ту же методологию, можно также сгенерировать динамические различные концентрации цитокинов и лигандов. Например, выбранные комбинации 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 г/л и 4 пустых культурных медиа могут генерировать колебания синусовых волн (от 0 до 0,5 г/л) в концентрации с размерами шагов от 0,0005 до 0,01 г/л.
Для культуры первичных клеток крайне важно поддерживать стабильную микроокнивиронию. Стрижка стресс и истощение условных средних во время среднего обмена повлияет на поведение клеток и клеточнойсудьбы 12. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы проектируем буферный слой, чтобы предотвратить нежелательную нагрузку на клетки во время среднего обмена(рисунок 1c). В отличие от обычных культурных агрегатов, основными преимуществами устройства (т.е. управляемого клапаном) являются их возможности смешивания, доставки и обслуживания независимых условий на месте. На рисунке 2dмы продемонстрировали, что сложное китайское слово может быть создано на чипе с помощью точной доставки жидкостей в назначенные позиции и поддержания незатронутого состояния в отдельных культурных камерах. Возможности активного жидкостного устройства в смешивании на месте иллюстрируются видеоклипом, показывающим динамически изменяющиеся концентрации FITC в культурной камере(рисунок 3c и видео 7:47-7:50), который достигается путем контроля скорости перекачки 2 независимых перисталитических насосов, подключенных к 2 входным12. Численное моделирование позволяет предположить, что, когда среда направляется сверху вниз через камеры культуры, поток стрижки быстро достигает дна культуры хорошо (Видео 4:07-4:25). Силы стрижки могут быть эффективно предотвращены, когда решение направлено слева направо. Даже при скорости входного потока 10 мм/с, ткани размером с клетку или микрометр остаются нетронутыми в нижней части культурного блока.
Как показано на рисунке 3b(1), каждый вход контролируется клапаном, кроме нижнего перистального насоса. Когда один препарат отбирается для доставки в назначенные камеры, вход, подключенный к препарату, открыт и действие массива перистального насоса транспортируется только этим препаратом. Для 2 или нескольких препаратов, мы просто открываем соединенные входы для генерации смеси наркотиков в равном объеме. Мы также интегрируем один независимый перстатический насос, независимый от массива(рисунок 2g), который может работать с разной скоростью перекачки от массива и, следовательно, генерировать различные разбавления. Чтобы имитировать динамические условия окружающей среды In vivo NSC, последовательное и комбинаторное состояние 6 лигандов (т.е. Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF), которая состоит из 720 и 56 различных условий, были созданы с использованием массива перистальтических насосов и доставлены в назначенные камеры. В деталях, последовательные условия могут быть представлены как Sij и «ligand i» добавляется на день jи комбинаторного состояния, как Ci » » лиганд я присутствует », где лиганд я » Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF и J»1,2,3,4,5,6. Ответы клеток и сфер НСК были зафиксированы каждые 2 часа во время культуры и стимуляции.
Сферы НСК поддерживаются в камере 400 мкм на 400 мкм клеточной культуры(рисунок 2e и рисунок 4). Дифференциация и стебель (т.е. самообъемка) стволовых клеток представлены уровнем экспрессии Dcx и Hes5, соответственно. Мы заметили, что, когда сфера НСК подвергается воздействию CXCL в день 1 и EGF в день 2, круглая конформация вполне поддерживается и есть очевидное увеличение размера сферы. NSCs с высоким уровнемэкспрессии Dcx умирают в 3-й день, когда EGF заменяется PACAP, предлагая влияниена дифференцированные клетки 13,14,15,16. Клетки начинают прикрепляться к необработанной поверхности PDMS при стимуляции DLL на4-й день, и разобщаются в отдельные клетки с добавлением PDGF на5-й день и Jagged на 6-й день. Изменения в порядке ввода этих 6 лигандов приносят отличительный статус НСК(рисунок 5). Например, эволюция NSCs резко меняется, когда CXCL переключает положение с PDGF по последовательности(рисунок 5a и 5b). Эти результаты свидетельствуют о том, что динамические различные экологические условия имеют большое влияние на дифференциацию и самообувека НСК, что открывает путь для разработки платформ brain-on-chip для биомедицинских исследований, а также клинических применений.
Рисунок 1: Конструкция микрофлюидного чипа высокой пропускной способности. a. Улучшенный перистальтический насос состоит из нескольких каналов потока и расширенных каналов управления, что приводит к увеличению передаваемого объема жидкости за цикл прокачки. б. Массив перистатических насосов управляется 3 подключенными линиями управления. Таким образом, включение различных входов в запрограммированных точках времени может генерировать комбинаторные, последовательные и динамические различные сигналы ввода. c. Чтобы предотвратить нежелательный поток свяла, мы разработали 2-уровневую культурную единицу. Клетки поддерживаются в нижней части нижнего уровня, который составляет 150 мкм в глубину. д. Каждая культурная камера соединена с 4 каналами, что позволяет использовать решение в верхнем и правом направлениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Изготовление микрофлюидного чипа высокой пропускной способности. a. Микроструктуры слоев управления и потока были в первую очередь узорчаты на кремниевой пластине, на которой PDMS отбрасывается для репликации. б. Слои управления, мембраны и потока выровнены и связаны друг с другом с помощью плазменного офорта и тепловой связи. c-f. Расширенные характеристики чипа демонстрируются с использованием зеленых, синих и желтых пищевых красителей. Мы показываем, что при своевременном выключении клапанов решения точности нанолитров могут быть доставлены в назначенные камеры. g.Массив перистальтических насосов управляется 3 подключенными линиями управления (т.е. Control-1) и одним независимым перистальтическим насосом, контролируемым другими 3 линиями управления (т.е. Control-2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схема, показывающая активное жидкое устройство. Схема, показывающая, что(a)клетки протекают через bypass канал; b)клапаны контролируют вход и перистальтический насос; и c)клеткивтекают в камеры культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения сферы НСК при стимулировании последовательным вводом наркотиков. Яркие поля (верхний ряд), Hes5-GFP (второй ряд), Dcx-Desred(третий ряд) изображения показывают, что при последовательной стимуляции, существенная гибель клеток происходит как среди Dcx-высокихи Hes5-высоких клеток. Появление темной области свидетельствует о гибели стволовых клеток, которые локализуются в основном в основной области. Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Вариации в конформации сферы NSC, уровне выражения Dcx и Hes5, когда они стимулируются различными последовательными входами. Попродемонстрировано, что изменение входного порядка 6 препаратов вызывает изменения в тканях, морфологических и экспрессионистских уровнях сигнальных молекул, что указывает на чувствительность сферы НСК к динамическим условиям окружающей среды. Входные последовательности:(a ) DLL'gt; PACAP-gt; 'gt; EGF'gt; 'gt; CXCL-gt; PDGF'gt; Jagged, (c) DLL (gt;gt; PACAP) Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработаны различные микрофлюидные устройства для выполнения мультиплексированных исложных экспериментов 17,18,19,20. Например, микроуэллы из массива топологических углублений могут ловушку отдельных клеток без использования внешней силы, показывая выгодные символы, включая небольшой размер выборки, параллелизация, более низкая стоимость материала, более быстраяреакция, высокая чувствительность 21,22,23,24. Капля и поверхностное натяжение ограниченной капли устраняют необходимость в вспомогательном оборудовании, таком как микропамп, что делает транспортировку капель более недорогой и экологическидружелюбной 25,26. Капли жидкостей могут быть легко отложены на поверхности micropipettes или опрыскиватель сопла, и после экспериментов, системы могут быть легко обновляется имногоразовые 27,28. Техника slipchip позволяет мультиплексные реакции без участия интегрированных насосов или клапанов, и, следовательно, удобныйдля пользователя и производителя 29,30. Однако эти системы сталкиваются с рядом технических препятствий, таких как хранение нанолитровых растворов в микро скважинах, контроль влажности и ограничения параллельных технологий распределения жидкостей с низким объемом.
В этой статье мы описали протокол для высокой пропускной способности биомедицинских экспериментов с использованием живой клеточной системы визуализации и индивидуального микрофлюидного устройства. Подробно продемонстрированы процедуры изготовления чипов, включая УФ- и мягкую литографию, а также параметры установки для автоматической флуоресцентной визуализации. Результаты показывают, что передовые функциональные особенности (т.е. двухуровневая культурная камера и улучшенный перисталтический насос) предлагаемого микрофлюидного чипа превосходят ранее зарегистрированные устройства и отвечают потребностям проведения тысяч параллельных экспериментов. Мы также описали важнейшие параметры (например, поддержание обусловленной среды), которые необходимо тщательно контролировать для поддержания здоровой окружающей среды для культуры первичных и стволовых клеток.
Биомедицинские эксперименты на клеточной основе, которые включают сложные протоколы и запрограммированное добавление химических веществ, часто считаются трудоемкими и трудоемкими. Например, помимо процедур манипуляции клетками, комбинаторные входы 6 препаратов с почасовой заправкой требуют не менее 250 пипеток в час, а повторение до конца эксперимента. Кроме того, моделирование динамических условий окружающей среды in vivo требует своевременного добавления одного или нескольких цитокинов, лигандов и препаратов с точностью секунд, что невозможно для ручных операций. В настоящем мы демонстрируем, что, соединяя входы чипа с несколькими препаратами, или различными концентрациями одного препарата, комбинаторные, последовательные и динамически изменяемые входные сигналы могут быть сгенерированы и поддерживаться в свободной от стрижки клеточной среде. Морфологические и химические реакции клеток и тканей, которые поддерживаются в параллельно работающих камерах культуры, затем могут контролироваться в режиме реального времени с помощью программного обеспечения коммерческого микроскопа.
С увеличением пропускной способности микрофлюидных устройств и автоматизированного сбора данных во время биовизуаляций, система визуализации живых клеток может генерировать тысячи изображений каждый час. Например, непрерывный запуск 1500-единицы чипа в течение одной недели генерирует 252 000 изображений. Это может занять несколько месяцев, чтобы вручную отслеживать эволюцию тканей и популяций клеток (например, уровень экспрессии флуоресцентно помечены биомолекулы) на уровне одной клетки. Используя настраиваемую программу MATLAB, массивные данные могут быть автоматически отсортированы, отформатированы и проанализированы. Следы, показывающие подвижность, морфологические особенности и уровень экспрессии сигнальных молекул, могут быть извлечены (показано на видео), что позволяет избежать человеческой ошибки и экономит значительное количество времени.
Поэтому методология, которую мы демонстрируем здесь, показывает подходящие протоколы для проведения высокопутных биомедицинских экспериментов с автоматизированными манипуляциями с клетками и тканями, флуоресцентной визуализацией и анализом данных. Выключение мембранных клапанов обеспечивает оптимальный объем жидкости, время и пространственное разрешение для восстановления постоянно меняющихся и сложных условий окружающей среды для in vitro, таких как орган-на-чипе. Несмотря на то, что протокол значительно сложнее по сравнению с переходными биомедицинскими подходами (например, ручные процедуры с использованием пластин 96-колодец), представленный протокол и платформа не ограничиваются исследованиями функций клеток и тканей. Скрининг комбинаторного и последовательного ввода препарата может позволить нам разработать методы лечения для клинического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают техническую поддержку со стороны Чжифэн Чэн из Chansn Instrument (Китай) LTD. Эта работа была поддержана грантами (Национальный фонд естественных наук Китая,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R.
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
