Summary
Presentamos un sistema microfluídico para estudios de alto rendimiento en maquinaria de vida compleja, que consta de 1500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y un módulo de mezcla in situ. El chip microfluídico permite el análisis de las condiciones microambientales altamente complejas y dinámicas in vivo.
Abstract
Imitar condiciones ambientales in vivo es crucial para estudios in vitro sobre maquinaria de vida compleja. Sin embargo, las técnicas actuales dirigidas a células y órganos vivos son altamente costosas, como la robótica, o carecen de volumen de nanolitro y precisión de tiempo de milisegundos en la manipulación de líquidos. Aquí presentamos el diseño y la fabricación de un sistema microfluídico, que consta de 1.500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y un módulo de mezcla in situ. Para demostrar las capacidades del dispositivo microfluídico, las esferas de células madre neuronales (NSC) se mantienen en el sistema propuesto. Observamos que cuando la esfera NSC está expuesta a CXCL en el día 1 y EGF en el día 2, la conformación en forma redonda está bien mantenida. La variación en el orden de entrada de 6 fármacos causa cambios morfológicos en la esfera NSC y el marcador representativo del nivel de expresión para la tallo de NSC (es decir, Hes5 y Dcx). Estos resultados indican que las condiciones ambientales dinámicas y complejas tienen grandes efectos en la diferenciación y la autorre renovación del NSC, y el dispositivo microfluídico propuesto es una plataforma adecuada para estudios de alto rendimiento en la compleja maquinaria de vida.
Introduction
Las técnicas de alto rendimiento son cruciales para los estudios biomédicos y clínicos. Al realizar paralelamente millones de pruebas químicas, genéticas o de células vivas y organoides, los investigadores pueden identificar rápidamente genes que modulan una vía bio-molecular y personalizar la entrada secuencial de fármacos a sus necesidades específicas. La robótica1 y los chips microfluídicos en combinación con un programa de control de dispositivos permiten automatizar procedimientos experimentales complejos, cubriendo la manipulación celular/tisular, manipulación de líquidos, imágenes y procesamiento/control de datos2,3. Por lo tanto, cientos y miles de condiciones experimentales se pueden mantener en un solo chip, de acuerdo con el rendimiento deseado4,5.
En este protocolo, describimos el procedimiento de diseño y fabricación de un dispositivo microfluídico, que consta de 1500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y módulo de mezcla in situ. La cámara de cultivo celular de 2 niveles previene la cizalla innecesaria durante el intercambio medio, lo que garantiza un entorno cultural inalterado para las imágenes de células vivas a largo plazo. Los estudios demuestran que el dispositivo microfluídico propuesto es una plataforma adecuada para estudios de alto rendimiento sobre la compleja maquinaria de vida. Además, las características avanzadas del chip microfluídico permiten la reconstitución automatizada de condiciones microambientales altamente complejas y dinámicas in vivo, como las composiciones de citoquinas y ligandos siempre intercambiadas6,7,la finalización de las cuales toma meses para plataformas convencionales como la placa de 96 pozos.
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Protocol
1. Diseño de chips microfluídicos
- Diseñe el multiplexador microfluídico que consta de 18 entradas, cada una de las cuales está controlada por una válvula individual y una bomba peristáltica. Para aumentar el volumen líquido impulsado por el ciclo de bombeo, haga que la bomba peristáltica se componga de 3 canales de control, que se amplió a propósito a 200 μm, y 10 líneas de flujo conectadas.
- Diseña la cámara de cultura libre de cizalla. La replicación de la unidad de cultivo de 2 niveles está compuesta por una cámara de cultivo celular inferior (400 μm x 400 μm x 150 μm) y una capa de búfer más alta (400 μm x 400 μm x 75 μm), lo que evita la tensión de cizallamiento no deseada en las células durante el intercambio medio(Figura 1).
- Diseñe funciones de alto rendimiento. Duplique la unidad de cultivo para formar un diseño de matriz de 30 x 50, ocupando un área de aproximadamente 7 cm por 5 cm de tamaño.
2. Fabricación y operación de chips
- Fabricación de la moldura de réplica mediante litografía UV
NOTA: La moldura de réplica fue fabricada en oblea de silicio de acuerdo con el protocolo de fotolitografía estándar8.- Fabricación de las estructuras del canal
- Fotorresista giratorio: Capa giratoria 5 ml del fotorresista negativo SU-8 3025 en una oblea de silicio a 500 rpm para 10 s y 3000 rpm durante 30 s.
- Horneado suave: Coloque la oblea sobre una placa caliente a 65 °C durante 2 minutos y luego 95 °C durante 10 minutos, enfríe a temperatura ambiente.
- Alineación y curado: Fije la oblea y la máscara en el soporte del alineador y encienda la fuente de luz durante 18 s para curar al fotoresista expuesto.
- Hornea antes de la exposición: Aumenta la oblea a 95°C a 110°C/h a temperatura ambiente y mantenla al menos 40 minutos hasta que se retire.
- Desarrollar: Sumerja la oblea en la solución en desarrollo (desarrollador su-8) y agitarla durante 2,5 minutos para lavar el fotoresista redundante y obtener la estructura de canal de 25 μm de altura.
- Hornear duro: Cubra la oblea con una placa de Cristal Petri y hornee a 65 °C durante 2 minutos, luego aumente hasta 160 °C a 120 °C/h y guárdela durante 3 horas.
- Fabricación de la cámara de cultivo celular con la capa de búfer
- Utilice los parámetros del paso 2.1.1.1 para girar la capa 7 mL del fotoresista negativo SU-8 3075 en la oblea anterior.
- Hornee suavemente (descrito en el paso 2.1.1.2) la oblea y cambie la máscara para alinearse bien con los marcadores en la oblea. A continuación, encienda la fuente de luz durante 24 s para curar al fotoresista expuesto.
- Sumerja la oblea en la solución en desarrollo (desarrollador su-8) y agitarla durante 4 minutos y 40 segundos para lavar el fotoresista redundante y obtener una estructura de capa de 75 μm de alto que alrededor de la estructura de canal de 25 μm de alto fabricada antes. Hornear duro (descrito en el paso 2.1.1.6) la oblea para hacer la estructura compleja más fuerte.
- Repita los pasos 2.1.2.1-2.1.2.3 para fabricar una estructura de cámara de 75 μm de altura que se apilan en la estructura de capa.
- Fabricación de las estructuras de la válvula
- Utilizando el parámetro del paso 2.1.1.1 para girar la capa 5 mL del fotoresista positivo AZ 50x en la oblea anterior.
- Hornee suavemente (descrito en el paso 2.1.1.2) la oblea y haga que la máscara se alinee bien con marcadores en la oblea, luego mantenga la fuente de luz encendida durante 20 s y apagada inmediatamente durante 30 s. Repita el procedimiento de encendido/apagado de la luz en 5 círculos para curar al fotoresista expuesto.
- Sumerja la oblea para emparejar al desarrollador y agitarla durante unos 8 minutos para lavar el fotoresista redundante y obtener las válvulas de forma redonda que se superponen con los canales de control para garantizar una buena conexión. Hornear duro (descrito en el paso 2.1.1.6) la oblea estampada para hacer todo el modelo más fuerte.
- Fabricación de las estructuras del canal
- Producción de chips microfluídicos mediante litografía suave
- Trate las obleas de silicio estampadas y en blanco con rimethylchlorosilane durante 15 min.
- Preparar 3 porciones de gel PDMS (10:1 de relación monómero/catalizador) correspondientes a 50 g de capa de flujo, 20 g de capa de control 2 y 20 g de membrana, respectivamente.
- Lance 50 g de gel PDMS en la oblea de silicio estampada y desgastese durante 1-2 horas en la cámara de vacío a -0,85 MPa para copiar la capa de flujo.
- Desgastela las 2 porciones de 20 g de PDMS y espírala en la oblea estampada y una oblea de silicio en blanco a 2000-2800 rpm durante 30 s como para preparar una capa de control y una capa de membrana.
- Coloque las obleas cubiertas por PDMS en el horno de ventilación durante 60 minutos a 80 °C para la incubación.
- Alinee y una las diferentes capas a través de un dispositivo óptico personalizado (zoom en 100x) y una máquina de grabado de plasma. A continuación, manténgalo en un horno de ventilación durante 2 horas a 80 °C para mejorar la unión del chip.
- Perforar los orificios de entrada en el chip, y luego unirlo en un clip recubierto de PDMS y curado durante al menos 12 horas a 80 °C antes de su uso.
- Operación de chip
- Conecte las válvulas solenoides neumáticas en miniatura a la capa de control del chip y abra la interfaz gráfica de usuario MATLABpersonalizada 8 para vincular y controlar el interruptor.
- Ajuste las presiones de cierre de las válvulas de membrana PDMS push-up a 25 psi.
- Entregue entradas combinatorias/secuenciales que cambian dinámicamente a las cámaras designadas(Figura 2d)mediante el encendido y apagado oportuno de las válvulas.
3. Generación de insumos dinámicos en microambientes celulares
- Tratamiento de chips y carga celular
- Mantenga las condiciones de cultivo estándar (37 °C, 5% CO2)en el microscopio durante al menos 5 horas.
- Llene el chip con el medio de recubrimiento (es decir, mencionado en el NOTE) e incubarlo en las condiciones de cultivo estándar (descritas en el paso 3.1.1) durante al menos una hora.
- Enjuague el chip por solución salina amortiguada por fosfato (PBS) o medio de cultivo celular (el medio de Dulbecco Modified Eagle, DMEM) para construir un entorno de cultivo saludable.
- Cosecha células al 80% de confluencia, y resuspend las células usando medios de cultivo (DMEM) a una densidad de ~ 106/mL. A continuación, cargue las celdas en el chip presurizando la solución que contiene células.
NOTA: La cultivo de diferentes líneas celulares en el chip requiere el medio de recubrimiento correspondiente para tratar la cámara de cultivo celular. Por lo general, para los experimentos en fibroblasto 3T3 y cultivo adherente de gallina todas las válvulas que controlan las cámaras de cultivo están abiertas, las células fluyen a todas las cámaras de cultivo dentro de la misma columna.
- Configuración para imágenes de células vivas de alto rendimiento
NOTA: Para la adquisición de imágenes, se utilizó un microscopio invertido con una etapa traslacional automatizada y una cámara digital complementaria de semiconductores de óxido metálico (CMOS). La adquisición de etapas e imágenes se controló a través del software personalizado.- Visualice la matriz de cámaras de cultivo utilizando lente objetiva de 10x en campo brillante para afirmar y definir las coordenadas de ubicación de cada cámara de la matriz de cámara de 30 por 50.
- Transforme la lente objetivo a la 20x o 40x y, a continuación, seleccione las coordenadas de ubicación de la cámara deseada y la etapa traslacional se mueve a la posición asignada después de la confirmación. Ajuste el plano focal x, y, z para obtener una imagen óptima.
- La intensidad óptima de la luz, el tiempo de exposición y otros parámetros de imagen se determinaron individualmente para cada canal (es decir, imágenes de campo brillante y fluorescencia).
- Establezca el intervalo y la duración del ciclo de imágenes, guarde la ruta y, a continuación, comience a crear imágenes.
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Representative Results
La bomba peristáltica convencional en chip fue descrita por primera vez por Stephen Quake en 2000, utilizando la cual la peristalsis fue accionada por el patrón 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Los números 0 y 1 indican "abierto" y "cierre" de las 3 líneas de control horizontales. También se han notificado estudios con más de 3 válvulas (por ejemplo, cinco)11. A pesar de que la bomba peristáltica compuesta por 3 líneas de control y 3 líneas de flujo proporciona precisión de nanolitro, la velocidad de transporte es demasiado lenta para alimentar 1.500 cámaras de cultivo. Para resolver el problema, incluimos más líneas de flujo (es decir, los 10 canales conectados) para aumentar el volumen de líquido impulsado por por el ciclo de bombeo (es decir, 101, 100, 110, 010, 011, 001). Por lo tanto, los nutrientes y medicamentos se pueden entregar eficazmente a las cámaras designadas. El volumen de líquido transportado por bomba peristáltica puede aumentar en 16x a ~ 50 nanolitros por ciclo de bombeo. Como la matriz de bombas peristálticas está controlada por 3 canales de control conectados(Figura 1b),las soluciones de cada entrada se entregan simultáneamente al chip y permiten la mezcla instantánea. Por lo tanto, las entradas combinatorias y secuenciales pueden generarse mediante el encendido y apagado oportuno de las entradas conectadas a diferentes soluciones. Utilizando la misma metodología, también se pueden generar concentraciones dinámicas de citoquinas y ligandos. Por ejemplo, las combinaciones seleccionadas de 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 g/L y 4 medios de cultivo en blanco pueden generar una fluctuación de onda sinusoidal (entre 0 y 0,5 g/L) en concentración con tamaños de paso que van de 0,0005 a 0,01 g/L.
Para el cultivo de células primarias, es crucial mantener un microambiente estable. El estrés cizallado y el agotamiento del medio acondicionado durante el intercambio medio afectarán el comportamiento celular y el destino celular12. Para superar estos problemas, diseñamos una capa de búfer para evitar el estrés de cizallamiento no deseado en las células durante el intercambio medio (Figura 1c). A diferencia de las unidades de cultivo convencionales, las principales ventajas del dispositivo (es decir, controladas por válvulas) son sus capacidades de mezcla in situ, entrega y mantenimiento de condiciones independientes. En la Figura 2d,demostramos que se puede crear una palabra china compleja en chip mediante la entrega precisa de líquidos a posiciones designadas y el mantenimiento de una condición no afectada en cámaras de cultivo individuales. Las capacidades del dispositivo fluido activo en la mezcla in situ se ilustran con un clip de vídeo, que muestra las concentraciones fitc dinámicamente cambiantes en una cámara de cultivo(Figura 3c y Video 7:47-7:50), que se logra mediante el control de la velocidad de bombeo de 2 bombas peristálticas independientes conectadas a 2 entradas12. La simulación numérica sugiere que cuando el medio se dirige hacia abajo a través de las cámaras de cultivo, el flujo de cizalladura alcanza rápidamente la parte inferior de la cultura bien (Video 4:07-4:25). Las fuerzas de cizallación se pueden prevenir eficazmente cuando la solución se dirige de izquierda a derecha. Incluso a un caudal de entrada de 10 mm/s, el tejido del tamaño de una célula o micrómetro permanece inalterado en la parte inferior de la unidad de cultivo.
Como se muestra en la Figura 3b(1), cada entrada es controlada por una válvula que no sea la bomba peristáltica inferior. Cuando se selecciona un medicamento para ser entregado en cámaras designadas, la entrada conectada a la droga está abierta y la operación de la matriz de la bomba peristáltica transporta sólo esta droga. Para 2 o múltiples medicamentos, simplemente abrimos las entradas conectadas para generar una mezcla de fármacos a igual volumen. También integramos una bomba peristética independiente de la matriz(Figura 2g),que podría funcionar a una velocidad de bombeo diferente de la matriz y por lo tanto generar diferentes diluciones. Para imitar las condiciones ambientales dinámicas in vivo de NSC, condición secuencial y combinatoria de 6 ligandos (es decir, Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF),que consta de 720 y 56 condiciones diferentes, se generaron utilizando la matriz de bombas peristálticas y se entregaron a las cámaras designadas. En detalle, las condiciones secuenciales se pueden representar como Sij = {ligando i se agrega el día j} y una condición combinatoria como Ci = {ligando i está presente}, donde ligando i = Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF y j= 1,2,3,4,5,6. Las respuestas de las células y esferas del NSC se registraban cada 2 horas durante el cultivo y la estimulación.
Las esferas NSC se mantienen en la cámara de cultivo celular de 400 μm por 400 μm(Figura 2e y Figura 4). La diferenciación y stemness (es decir, la autorretración) de las células madre están representadas por el nivel de expresión de Dcx y Hes5, respectivamente. Observamos que cuando la esfera NSC está expuesta al CXCL en el día 1 y al FEAG en el día 2, la conformación en forma redonda está bien mantenida y hay un aumento evidente en el tamaño de la esfera. NSC con alto nivel de expresióndcx mueren en el día de 3rd cuando EGF es reemplazado por PACAP, lo que sugiere efectos en las células diferenciadas13,14,15,16. Las celdas comienzan a unirse a la superficie PDMS sin tratar tras la estimulación por DLL eldía 4, y se desvinculan en celdas individuales con la adición de PDGF en eldía 5 y Jagged el día6. Los cambios en el orden de entrada de estos 6 ligandos traen el estatus distintivo NSC (Figura 5). Por ejemplo, la evolución de los NSC varía drásticamente cuando los switches CXCL se posicionan con PDGF a lo largo de la secuencia (Figura 5a y 5b). Estos resultados demuestran que las dinámicas condiciones ambientales variables tienen grandes efectos en la diferenciación y la autorre renovación de los NSC, lo que allana el camino para el desarrollo de plataformas de cerebro a chip para estudios biomédicos, así como aplicaciones clínicas.
Figura 1: Diseño del chip microfluídico de alto rendimiento. a. La bomba peristáltica mejorada consta de múltiples canales de flujo y canales de control ampliados, lo que conduce a un aumento en el volumen de líquido transferido por ciclo de bombeo. b. La matriz de bombas peristálticas está controlada por 3 líneas de control conectadas. Por lo tanto, la inclusión de diferentes entradas en los puntos de tiempo programados puede generar señales de entrada variables combinatorias, secuenciales y dinámicas. c. Para evitar el flujo de cizallado no deseado, diseñamos una unidad de cultivo de 2 niveles. Las células se mantienen en la parte inferior del nivel inferior, que es de 150 μm de profundidad. d. Cada cámara de referencia cultural está conectada a 4 canales, lo que permite que la solución se dirija a través de direcciones arriba hacia abajo e izquierda-derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fabricación del chip microfluídico de alto rendimiento. a. Las microestructuras de las capas de control y flujo se modelaron en primer lugar en oblea de silicio, sobre la cual PDMS se lanza para su replicación. b. Las capas de control, membrana y flujo están alineadas y unidas entre sí mediante aguafuerte plasmático y unión térmica. c-f. Las características avanzadas del chip se muestran utilizando colorantes alimentarios verdes, azules y amarillos. Demostramos que al activar oportunamente las válvulas, se pueden entregar soluciones de precisión de nanolitro a las cámaras designadas. g. La matriz de bombas peristálticas está controlada por 3 líneas de control conectadas (es decir, Control-1), y una bomba peristáltica independiente controlada por otras 3 líneas de control (es decir, Control-2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un esquema que muestra el dispositivo fluido activo. Un esquema que muestra que (a) las celdas fluyen a través del canal de derivación; (b) las válvulas controlan la entrada y la bomba peristáltica; y (c) las células fluyen a las cámaras de cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de la esfera NSC cuando se estimula por la entrada secuencial de drogas. Las imágenes de campo brillante (fila superior), Hes5-GFP (segunda fila), Dcx-Desred (tercera fila) muestran que al estimular secuencialmente, se produce una muerte celular sustancial entre células dcx-high y Hes5-high. La aparición de la zona oscura sugiere la muerte de las células madre, que se localizan principalmente en la región central. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Variaciones en la conformación de esferas NSC, nivel de expresión Dcx y Hes5, al ser estimulado por diferentes entradas secuenciales. Se demuestra que la variación en el orden de entrada de 6 fármacos causa cambios en el tejido, morfológico y nivel de expresión de las moléculas de señalización, lo que indica las sensibilidades de la esfera NSC a las condiciones ambientales dinámicas. Las secuencias de entrada: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Jagged,b) DLL>> PACAP >> EGF >> PDGF >> CXCL >> Jagged, (c) DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> Jagged, (d) PDGF >> CXCL >> PACAP >> EGF >> DLL >> Jagged. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para realizar experimentos multiplexados y complejos17,18,19,20. Por ejemplo, los micropos hechos de una matriz de recovecos topológicos pueden atrapar células individuales sin el uso de fuerza externa, mostrando caracteres ventajosos incluyendo pequeño tamaño de muestra, paralelización, menor costo de material, respuesta más rápida, alta sensibilidad21,22,23,24. Gotas y gotas confinadas de tensión superficial eliminan la necesidad de hardware auxiliar como un micropump, haciendo que el transporte de gotas sea más de bajo costo y ecológico25,26. Gotas de líquidos pueden ser fácilmente depositados en la superficie por micropipettes o boquillas pulverizadores, y después de los experimentos, los sistemas pueden ser fácilmente renovados y reutilizables27,28. La técnica slipchip permite reacciones multiplexadas sin la participación de bombas o válvulas integradas, y por lo tanto fáciles de usar y productor29,30. Sin embargo, estos sistemas se enfrentan a una serie de obstáculos técnicos, como almacenar soluciones de nanolitro en micro pozos, controlar la humedad y limitaciones de tecnologías paralelas de dispensación de líquidos de bajo volumen.
En este artículo, describimos un protocolo para experimentos biomédicos de alto rendimiento utilizando un sistema de imágenes de células vivas y un dispositivo microfluídico personalizado. Los procedimientos de fabricación de virutas, incluidos los rayos UV y la litografía suave, y los parámetros de configuración para la toma automática de imágenes fluorescentes se demuestran en detalle. Los resultados muestran que las características funcionales avanzadas (es decir, la cámara de cultivo de 2 niveles y la bomba peristáltica mejorada) del chip microfluídico propuesto superan a los dispositivos reportados anteriormente y satisfacen las necesidades de llevar a cabo miles de experimentos paralelos. También describimos los parámetros cruciales (por ejemplo, el mantenimiento del medio acondicionado) que uno debe controlar cuidadosamente para mantener ambientes saludables para el cultivo de células primarias y madre.
Los experimentos biomédicos basados en células, que incluyen protocolos complejos y la adición programada de productos químicos, a menudo se consideran lentos y laboriosos. Por ejemplo, además de los procedimientos de manipulación celular, los insumos combinatorios de 6 fármacos con recarga por hora requieren al menos 250 pasos de pipeteo por hora, y repetición hasta el final del experimento. Además, modelar condiciones ambientales dinámicas in vivo requiere la adición oportuna de una o múltiples citoquinas, ligandos y fármacos con la precisión de segundos, lo cual es imposible para las operaciones manuales. Aquí demostramos que al conectar las entradas del chip a múltiples fármacos, o diferentes concentraciones de un solo fármaco, se pueden generar y mantener señales de entrada combinatorias, secuenciales y dinámicamente variables en los entornos celulares libres de cizallamiento. Las respuestas morfológicas y químicas de las células y los tejidos, que se mantienen en las cámaras de cultivo que se ejecutan paralelamente, pueden ser monitoreadas en tiempo real utilizando el software de microscopio comercial.
Con el creciente rendimiento de los dispositivos microfluídicos y la recopilación automatizada de datos durante la bioimagen, el sistema de imágenes de células vivas puede generar miles de imágenes cada hora. Por ejemplo, el funcionamiento continuo del chip de 1500 unidades durante una semana genera 252.000 imágenes. Puede tomar meses rastrear manualmente la evolución de los tejidos y las poblaciones celulares (por ejemplo, el nivel de expresión de las biomoléculas etiquetadas fluorescentemente) a nivel de una sola célula. Utilizando un programa MATLAB personalizado, los datos masivos se pueden ordenar, formatear y analizar automáticamente. Los rastros que muestran la movilidad, las características morfológicas y el nivel de expresión de las moléculas de señalización se pueden recuperar (se muestran en el vídeo), lo que evita errores humanos y ahorra una cantidad considerable de tiempo.
Por lo tanto, la metodología que demostramos aquí muestra protocolos adecuados para realizar experimentos biomédicos de alto rendimiento con manipulación automatizada de células y tejidos, imágenes fluorescentes y análisis de datos. El encendido y apagado de las válvulas de membrana proporciona un volumen de líquido óptimo, tiempo y resolución espacial para reconstruir las condiciones ambientales cambiantes y complejas para in vitro como un órgano sobre chip. A pesar de que el protocolo es considerablemente más complejo en comparación con los enfoques biomédicos transitorios (por ejemplo, procedimientos manuales utilizando placas de 96 pozos), el protocolo y la plataforma presentados no se limitan a los estudios sobre las funciones celulares y tisulares. El cribado de insumos combinatorios y secuenciales de fármacos puede permitirnos desarrollar terapias para aplicaciones clínicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo técnico de Zhifeng Cheng de Chansn Instrument (China) LTD. Este trabajo fue apoyado por subvenciones (Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
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