Summary
هنا، ونحن نصف، مقارنة، وعلى النقيض من اثنين من تقنيات مختلفة لعد جريب دقيقة من أنسجة المبيض الماوس الثابتة.
Abstract
ولدت الثدييات الإناث استنساخ جنسيا مع كامل إمداداتها مدى الحياة من البويضات. توجد البويضات غير الناضجة والكئيبة داخل بصيلات بدائية ، وحدة تخزين الجرثومة الأنثوية. وهي غير قابلة للتجديد، وبالتالي فإن عددها عند الولادة ومعدل الخسارة اللاحق يملي إلى حد كبير عمر الخصوبة للإناث. يعد التحديد الكمي الدقيق لأعداد الجريبات البدائية لدى النساء والحيوانات أمرا ضروريا لتحديد تأثير الأدوية والمواد السامة على احتياطي المبيض. كما أنه ضروري لتقييم الحاجة إلى تقنيات حفظ الخصوبة القائمة والناشئة ونجاحها. حاليا، لا توجد طرق لقياس بدقة عدد بصيلات البدائية التي تتألف من احتياطي المبيض لدى النساء. وعلاوة على ذلك، فإن الحصول على أنسجة المبيض من الحيوانات الكبيرة أو الأنواع المهددة بالانقراض للتجارب غالبا ما يكون غير ممكن. وهكذا، أصبحت الفئران نموذجا أساسيا لمثل هذه الدراسات، والقدرة على تقييم أعداد الجريبات البدائية في مبايض الفئران بأكملها هي أداة حاسمة. ومع ذلك، فإن التقارير عن الأرقام المطلقة للجريب في مبايض الفئران في الأدبيات متغيرة للغاية، مما يجعل من الصعب مقارنة و/أو تكرار البيانات. ويرجع ذلك إلى عدد من العوامل بما في ذلك الإجهاد والعمر والمجموعات العلاجية، فضلا عن الاختلافات التقنية في أساليب العد المستخدمة. في هذه المقالة، نقدم دليل تعليمي خطوة بخطوة لإعداد المقاطع النسيجية والعد بصيلات بدائية في مبايض الفئران باستخدام طريقتين مختلفتين: [1] علم التجسيم، الذي يعتمد على تقنية التشريح/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية التشريح الجزئي/البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيمات/ التجسيم البصري؛ [1] التجسيمات الأنسجةية؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم/ التجريب البصري؛ و [2] تقنية العد المباشر. وسيتم تسليط الضوء على بعض المزايا والعيوب الرئيسية لكل طريقة بحيث يمكن تحسين القابلية للاستنساخ في هذا المجال وتمكين الباحثين من اختيار الطريقة الأنسب لدراساتهم.
Introduction
البويضات غير الناضجة الموقوفة من الناحية العضلية المخزنة داخل بصيلات بدائية في المبيض هي وحدة تخزين الجرثومة الأنثوية وتشكل احتياطي المبيض مدى الحياة للفرد. أعداد الجريبات البدائية تنخفض بشكل طبيعي مع سن1، أو بدلا من ذلك ، يمكن أن تستنفد قبل الأوان بعد التعرض للمواد الكيميائية الخارجية ، بما في ذلك بعض المستحضرات الصيدلانية والمواد السامة البيئية في الهواء والغذاء والماء2. وبالنظر إلى أن عدد الجريبات البدائية محدود ، فإن كمية ونوعية الجريبات الموجودة داخل المبيض تحدد إلى حد كبير خصوبة الإناث وصحة النسل. وبالتالي، فإن التحديد الكمي الدقيق لعدد الجريبات البدائية لدى النساء أمر ضروري لتقييم الآثار غير المستهدفة للإهانات الخارجية على احتياطي المبيض.
في النساء، تحليل المبيض كله غير ممكن عموما، وبالتالي يجب استخدام التدابير البديلة غير الغازية لاحتياطي المبيض في بيئة سريرية. هرمون مكافحة Mϋllerian (AMH) هو العلامة الحيوية البديلة الأكثر استخداماسريريا 3. غالبا ما تقاس مستويات الأمصال لدى النساء في سن الأمومة المتقدمة، أو قبل وبعد علاج السرطان، مثل العلاج الكيميائي. ومع ذلك، يتم إنتاج AMH عن طريق زراعة بصيلات وليس عن طريق بصيلات بدائية، وبالتالي، مستويات المصل لا تبلغ عن عدد جريب البدائية المطلقة.
مع عدم وجود طرق لتحديد بدقة عدد الجريبات البدائية في النساء في الموقع، فإن عد بصيلات المبيض في نماذج الحيوانات الصغيرة ، مثل القوارض ، يبقى أداة بحثية أساسية لتقييم الدرجة التي تؤثر بها الإهانات الخارجية على الجريبات البدائية وبالتالي الخصوبة. للأسف على الرغم من, تقارير في جميع أنحاء الأدب من أعداد بصيلات البدائية في نماذج القوارض هي متغير للغاية4. ومن الأسباب الرئيسية لذلك الاختلافات التقنية المبلغ عنها على نطاق واسع في طريقة العد المستخدمة. في الغالب ، هناك تقنيتان مختلفتان موضحتان في الأدبيات لتعداد الجريبات البدائية في الفئران. وتشمل هذه المجسمة، التي تستخدم طريقة التشريح البصري الكسري، وتهم المسام المباشرة.
يعتبر علم المجسمة على نطاق واسع معيار الذهب لأنه يستخدم منهجية موحدة أخذالعينات العشوائية 5، مما يجعلها الطريقة الأكثر دقة لتحديد عدد المسام البدائية في الماوس كله ، أو المبيضين الفئران4،6،7. الستيرولوجيا غير متحيزة ، لأنها تمثل بنية ثلاثية الأبعاد للكائن المثير للاهتمام8. باستخدام طريقة تشريح بصري / كسر ، يتم تطبيق ثلاثة مستويات من أخذ العينات لتحديد الجريبات البدائية باستخدام أقسام الأنسجة السميكة (على سبيل المثال ، 20 ميكرومتر) ضمن جزء معروف من إجمالي مبيض الماوس. أولا، يتم اختيار الفاصل الزمني لأخذ العينات (على سبيل المثال، كل قسم 3rd) في بداية عشوائية (أخذ العينات كسر 1، و1)4. ثم يتم أخذ عينات من الأقسام بطريقة منهجية وموحدة من هذه النقطة من خلال المبيض بأكمله. ثم، يتم فرض إطار عد غير متحيزة على قسم المبيض وتحرك تدريجيا على طول شبكة عد محددة وعشوائية (أخذ العينات كسر 2، و2)8. وأخيرا، يتم أخذ عينات بصرية من جزء معروف من سمك القسم (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر) ويتم احتساب الجريبات داخل هذه المنطقة (أخذ عينات الكسر 3، و3)4. يتم ضرب عدد الجريبات الخام في عكس هذه الكسور أخذ العينات للحصول على القيمة النهائية. تتطلب هذه الطريقة تدريب الخبراء والمعدات، بما في ذلك المجهر مع مرحلة الآلية التي يقودها البرمجيات stereological. وينبغي الحفاظ على الأنسجة في المثبتة بوين المتخصصة، وجزءا لا يتجزأ من راتنج غليكولميثاكريلات للسماح لقطع أقسام الأنسجة السميكة باستخدام ميكروتوم راتنج غليكولميتهاكريلات مع سكين زجاجية. تم تصميم هذه الطريقة لحساب انكماش الأنسجة وتشوه، للحفاظ على أفضل بنية مورفولوجية ثلاثية الأبعاد للمبيض وبصيلات9.
عد الجريبات المباشر هو الطريقة الأكثر استخداما لعد بصيلات10. يمكن استخدام مثبتات أكثر شيوعا (أي الفورماتين) ، يليها تضمين شمع البارافين والقسم التسلسلي الشامل باستخدام ميكروتوم قياسي بسماكة تتراوح بين 4-6 ميكرومتر. يتم احتساب الجريبات بشكل منهجي في قسم الأنسجة بأكمله على فاصل زمني محدد ، ثم تضرب في عكس الفاصل الزمني لأخذ العينات للحصول على تقدير الجريب الكلي. هذه الطريقة سريعة وسهلة ، ويمكن القيام بها باستخدام الأنسجة المؤرشفة ، وإعدادها باستخدام تقنيات الأنسجة القياسية. لا يتطلب سوى مجهر خفيف مع قدرات التصوير القياسية. ومع ذلك ، على الرغم من هذه المزايا ، فإن العد المباشر للجريب يفتقر إلى الدقة والمعلمات العد الصارمة للتسريو ، مما يجعله أكثر عرضة لتحيز المحقق. بالإضافة إلى ذلك ، قد تخضع الأنسجة للانكماش والتشوه أثناء المعالجة ، مما يعطل سلامة المبيض ومورفولوجياه ، وبالتالي يجعل تصنيف الجريبات وتحديد كميتها أمرا صعبا.
الهدف من هذه المقالة هو وصف طريقتين شائعتي الاستخدام لتقييم عدد الجريبات البدائية كميا في مبايض الماوس: الستيرولوجيا والعد المباشر للجريب. وسوف نقدم بروتوكولات مفصلة لهذين الأسلوبين وتسليط الضوء على بعض نقاط القوة والضعف، من أجل تعزيز الاستنساخ في مجالنا والسماح للباحثين لاتخاذ قرار مستنير من طريقة العد الأنسب لدراساتهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع المبيضين من الفئران C57BL6J الإناث. تم إجراء جميع الإجراءات والتجارب الحيوانية وفقا لمدونة ممارسات NHMRC الأسترالية لرعاية الحيوانات واستخدامها ووافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان منصة موناش للأبحاث الحيوانية.
ملاحظة: تم استخدام عامل العلاج الكيميائي الذي ثبت أنه يستنفد البويضات البصيلة البدائية ، كما تم تحديده باستخدام الستيرولوجيا11 والتعداد المباشر12،13 في هذا التقرير لمقارنة طريقتي العد في نفس الحيوان. أنثى، 8 أسابيع من العمر (الشباب البالغين) الفئران كانت تزن قبل حقن واحد داخل الصفاق من 75 ملغ / كجم / وزن الجسم من السيكلوفوسفاميد، أو التحكم في السيارة المالحة (ن = 5/group). وقد ثبت أن هذه الجرعة تسبب استنفاد حوالي 50٪ من بصيلات البدائية، ولكن لم يبلغ عن تسبب المراضة أو الوفيات في الفئران14. تم حصاد المبيضين بعد 48 ساعة من العلاج. تم إصلاح مبيض واحد من كل في حل 10٪ (v/v) المحايد العازلة الفورمالين لمدة 24 ساعة، والآخر ثابت في حل بوين لمدة 24 ساعة. ثم تم تضمين الأنسجة إما في راتنج غليكولميثاكريلات وقسمت بشكل متسلسل في 20 ميكرومتر، أو في البارافين ومقسمة بشكل متسلسل في 5 ميكرومتر. كانت جميع الأنسجة ملطخة بالحمض الدوري شيف والهيماتوكسيلين.
1. إعداد النسيج: التثبيت والمعالجة والتضمين وتقسم مبايض الفئران
- تشريح المبيضين الماوس عن طريق تقليم oviduct وجميع الدهون المحيطة بها، دون الإضرار أو قطع المبيض نفسه. إذا لزم الأمر، استخدم مجهر تشريح وشفرة دقيقة لهذه الخطوة(الشكل 1A).
- إصلاح الأنسجة على الفور عن طريق وضع في أنبوب صغير وصفت تحتوي إما على تثبيت بوين (مجسمة)، أو مثبتة الشكلية (التهم المباشرة) لمدة 24 ساعة(الشكل 1B)،قبل نقل الأنسجة إلى الإيثانول 70٪.
ملاحظة: يتم الحفاظ على مورفولوجيا الجريبات بشكل أفضل داخل أنسجة المبيض الثابتة لبوان، المضمنة في راتنج غليكولميثاكريلات(الشكل 2). - معالجة المبايض الثابتة بالكامل ثم تضمينها في راتنج غليكولميثاكريلات للجسم(ملف تكميلي 1)،أو شمع البارافين للتعداد المباشر باستخدام بروتوكول النسيج القياسي.
تنبيه: الراتنج سام، لذا تأكد من تنفيذ جميع خطوات معالجة الأنسجة في غطاء الدخان ويتم ارتداء القفازات في جميع الأوقات. - استخدام الراتنج المتخصصة ميثاكريلات ميكروتوم(الشكل 1C)مزودة سكين زجاجية (الشكل 1D) لقطع شامل سميكة glycolmethacrylate أقسام الراتنج (على سبيل المثال، 20 ميكرومتر). جمع المقاطع على فترات منتظمة (على سبيل المثال، كل قسم 3rd) على شرائح المجهر الزجاجي للجسم.
- استخدم ميكروتوم قياسي لقطع أجزاء البارافين الرقيقة (على سبيل المثال، 4-6 ميكرومتر). جمع أقسام الأنسجة على فترات منتظمة (على سبيل المثال، كل 9 القسم) علىشريحة المجهر الزجاجي لأعداد الجريبات المباشرة.
- وصمة عار الشرائح مع شيف حمض الدوري والهيماتوكسيلين (ملف التكميلية 2).
- Coverslip مع DPX القياسية لأقسام البارافين، أو DPX سميكة لأقسام راتنج غليكولميثاكريلات(الشكل 1E).
تنبيه: غليكولميثاكريلات الراتنج DPX أمر خطير، لذلك تنفيذ هذه الخطوة في لغطاء محرك السيارة الدخان.
ملاحظة: راتنج غليكولميثاكريلات DPX لزج للغاية. يجب الالتزام قطعة الزجاج بحزم عن طريق الضغط عليه مع ملعقة لضمان DPX هو موزعة بالتساوي ورقيقة، وليس هناك فقاعات الهواء موجودة تحت غطاء(الشكل 1F).
2. تقدير Stereological لعدد بصيلات البدائية باستخدام الكسر البصري
- قم بتشغيل الكمبيوتر ووحدة التحكم المتعدد والكاميرا ومصدر الضوء في إعداد المجسمة وحدد هدف المجهر إلى تكبير منخفض (على سبيل المثال، 10x).
- افتح برنامج الاستريوولوجيا.
- وضع الشريحة الأولى بشكل آمن على مرحلة المجهر.
- ضبط التعرض للضوء عن طريق التحقق من التلقائي تحت التعرض في لوحة إعدادات الكاميرا ( الشكلالتكميلي 1A). بدلا من ذلك، ضبط التعرض للضوء يدويا.
- استخدم عصا التحكم لتحديد موقع عينة الأنسجة الأولى ووضع العينة في بؤرة التركيز.
- ضبط توازن اللون الأبيض، إما عن طريق النقر على المزيد من الإعدادات (الموجود أسفل يمين لوحة إعدادات الكاميرا)، ثم انقر فوق توازن اللون الأبيض وانقر على تلقائي (الشكل التكميلي 1B). بدلا من ذلك، انقر فوق الزر توازن اللون الأبيض المجاور لزر إعدادات أكثر (أو حدد منطقة في إعدادات أكثر)،لتعيين توازن اللون الأبيض يدويا عن طريق تحديد منطقة بيضاء في القسم.
- انتقل إلى القائمة المنسدلة Probes وانقر على سير عمل الكسر البصري. ثم انقر فوق بدء مشروع جديد ثم انقر فوق موافق.
- إذا تم حفظ تكوين أخذ عينات موجود، ضمن معلمات أخذ العينات انقر فوق نعم | ... وحدد تكوين أخذ العينات المطلوب.
- إذا لم يكن كذلك، انقر فوق لا وأدخل يدويا معلومات المقطع التسلسلي(الشكل التكميلي 1C)وحدد تكوين التحقيق في الخطوة 2.13.
- انقر على التالي، تعيين المجهر إلى التكبير منخفضة واختيار التكبير 10x من القائمة المنسدلة.
- انقر على التالي، ثم تتبع حول قسم المبيض بأكمله - ابدأ بالنقر على اليسار حول القسم وفي النهاية ، انقر بزر الماوس الأيمن واختر إغلاق كفاف.
- انقر على التالي، تعيين المجهر إلى التكبير عالية واختيار 100x التكبير النفط من القائمة المنسدلة.
- ضع قطرة زيت على قسم الأنسجة على الشريحة وحرك هدف المجهر إلى تكبير 100x.
- ضبط التعرض للضوء (كما هو الحال في الخطوة 2.4) وانقر فوق التالي.
- إعداد معلمات أخذ العينات لتعريف تكوين المسبار. هنا، تم تعيين إطار العد إلى 47.5 ميكرومتر × 47.5 ميكرومتر (2,256.25 ميكرومتر2)وتم تعيين طول الخطوة إلى 100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر (10,000 ميكرومتر2) (الشكل التكميلي 2). بمجرد إنشاء معلمات أخذ العينات، احفظ القالب ثم أعيد فتحه أثناء جلسات التحليل اللاحقة في الخطوة 2.7.
- انقر على بدء العد ( الشكلالتكميلي 1D). التركيز إلى أعلى العينة، انقر فوق موافق وابدأ العد.
- استخدام مقبض التركيز للتحرك من خلال عمق أخذ العينات 10 ميكرومتر والعد أي بصيلات البدائية التي نواة البويضات يأتي في التركيز. انقر فوق التالي للانتقال إلى المنطقة التالية.
- تصنيف بصيلات كما البدائية إذا كانت تحيط البويضات من قبل الحرشفية (بالارض) الخلايا الحبيبية، ولكن لا خلايا الحبيبية التكعيبية (الشكل 2A).
ملاحظة: بصيلات البدائية متميزة عن بصيلات المتوسطة / الانتقالية، والتي تتألف من مزيج من الخلايا الجرانولوزا التكعيبية والحوازشفية (الشكل 2B)،وبصيلات الأولية، والتي تحيط بها في الغالب خلايا الحبيبية التكعيبية (الشكل 2C). وينبغي قياس هذه الفئات المسام بشكل منفصل. - عد فقط بصيلات التي نواة البويضات مرئية. يجب أن تظهر نواة البويضات داخل إطار العد أو لمس خطوط التضمين الخضراء للإطار العد(الشكل التكميلي 1E، F).
- إذا كانت نواة البويضات تقع خارج إطار العد(الشكل التكميلي 1G)أو تلامس خطوط الاستبعاد الحمراء للإطار العد، لا تحسب هذه المسام.
- عند تقييم استنفاد الجريبات البدائية استجابة للمواد الكيميائية الخارجية (مثل العلاج الكيميائي) ، تأكد من أن جميع الجريبات التي تم عدها صحية وبالتالي يكون لها مورفولوجيا طبيعية(الشكل 2). عد أي بصيلات غير طبيعية أو غير طبيعية بشكل منفصل. في كثير من الأحيان ، يتم الحصول على موت الجريب عن طريق الشتائم مثل العلاج الكيميائي ، وينبغي الحصول على تحديد كمي للبصيلات اللاهوتية بشكل منفصل من أجل التمييز بين الجريبات الصحية والحرية ، حيث أن الجريبات الصحية فقط هي التي تتألف من احتياطي المبيض15.
- تصنيف بصيلات كما البدائية إذا كانت تحيط البويضات من قبل الحرشفية (بالارض) الخلايا الحبيبية، ولكن لا خلايا الحبيبية التكعيبية (الشكل 2A).
- بمجرد اكتمال العد في هذا القسم، قم بأحد ما يلي:
- انقر فوق إضافة قسم جديد، ثم قم بالعودة إلى الخطوة 2.3 لإعداد القسم التالي للعد.
- انقر فوق لقد انتهيت من العد لإنهاء الجلسة. عودة الهدف إلى 10x ، والخروج من برنامج مجسمة وإيقاف مصدر الضوء ، والكاميرا ، وحدة متعددة التحكم والكمبيوتر.
- الحصول على مجموع عدد بصيلات الخام (س) من كل قسم الأنسجة عينات من المبيض بأكمله، ثم باستخدام جدول البيانات، واستخدام المعادلة أدناه للحصول على القيمة النهائية من كل تكرار (N)4.
أين:
N = العدد الإجمالي المقدر للبصيلات داخل المبيض.
س = عدد الجريبات البدائية الخام.
f1 = الفاصل الزمني لأخذ العينات. تم أخذ عينات من كل قسم3 rd وبالتالي
.
f2 = العلاقة بين إطار الجرد (منطقة العينة) والسهوب، محسوبة على أنها
. وبما أن منطقة العينة كانت 2256 ميكرومتر2 (47.5 ميكرومتر × 47.5 ميكرومتر) وكانت منطقة السائر 10000 ميكرومتر2 (100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر)، 
.
و3 = جزء من قسم المبيض عينات. منذ 10 ميكرومتر من المقطع 20 ميكرومتر تم أخذ عينات،
.
لذلك،
.
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول كيفية تطبيق مبادئ التحليلات الستيريولوجية هذه باستخدام برنامج مجسمة يستشهد به على نطاق واسع(جدول المواد)؛ ومع ذلك ، تتوفر برامج أخرى ستيريولوجية. المبادئ المطبقة خلال التحليلات التريولوجية لبصيلات المبيض هي نفسها، بغض النظر عن البرامج المستخدمة لإعداد المعلمات. علم المجسمة هو الأكثر دقة عندما يتم احتساب 100 أو أكثر من الكائنات في المبيض الماوس الكبار4، وهذا يعطي معامل الخطأ لتقدير أقل من 10 ٪16. تم تحسين معلمات أخذ العينات الموضحة هنا لضمان إمكانية حساب ما لا يقل عن 100 جسم (أي بصيلات بدائية وانتقالية وأولى) في مبايض C57BL6J البرية للبالغين. يمكن إجراء دراسة تجريبية تتضمن حجم عينة صغيرة لتحديد معلمات أخذ العينات المثلى، مثل الفاصل الزمني وعدد الأقسام التي سيتم تحليلها وعدد المشرحات البصرية داخل الأقسام التي تم أخذ عينات منها17.
أين:
.
. وبما أن منطقة العينة كانت 2256 ميكرومتر2 (47.5 ميكرومتر × 47.5 ميكرومتر) وكانت منطقة السائر 10000 ميكرومتر2 (100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر)، 
.
.
.3. تقدير عدد الجريبات البدائية عن طريق تعداد بصيلات المبيض المباشرة
- ضع شريحة المجهر بأمان تحت مجهر ضوء قياسي واجر عمليات عد مباشرة للحصول على عدد جريب بدائي خام.
- تصنيف بصيلات كما البدائية إذا كانت البويضات واضحة للعيان وتحيط بها الحرشفية (بالارض) خلايا الجرانولوزا، ولكن لا خلايا الحبيبية التكعيبية(الشكل 2D).
ملاحظة: بصيلات البدائية متميزة عن بصيلات المتوسطة / الانتقالية، والتي تتألف من مزيج من الخلايا الجرانولوزات التكعيبية والحوافر(الشكل 2E)،وبصيلات الأولية، والتي تحيط بها في الغالب خلايا الحبيبية التكعيبية (الشكل 2F). وينبغي قياس هذه الفئات المسام بشكل منفصل. - تأكد من أن جميع الجريبات التي تم عدها صحية وبالتالي يكون لها مورفولوجيا طبيعية(الشكل 2). عد أي بصيلات غير طبيعية أو أحلام بشكل منفصل، كما بصيلات صحية فقط تشكل احتياطي المبيض.
- تصنيف بصيلات كما البدائية إذا كانت البويضات واضحة للعيان وتحيط بها الحرشفية (بالارض) خلايا الجرانولوزا، ولكن لا خلايا الحبيبية التكعيبية(الشكل 2D).
- بدلا من ذلك، خذ عدة، أو مخيط عالية الطاقة (على سبيل المثال، 20x) التصوير الضوئي لقسم أنسجة المبيض بأكمله لإجراء عمليات العد عن طريق فتح ملف الصورة (صور). يمكن القيام بذلك يدويا، أو باستخدام ماسح ضوئي تلقائي للشرائح.
- الحصول على مجموع عدد جريب الخام (س) من كل قسم الأنسجة عينات من المبيض بأكمله في الفاصل الزمني المحدد سلفا. ضرب هذا الرقم معكوس كسر أخذ العينات للحصول على القيمة النهائية لكل متماثل (N)، وذلك باستخدام المعادلة أدناه.
أين:
N = العدد الإجمالي المقدر للبصيلات داخل المبيض.
س = عدد المسام الخام (من كل نوع على حدة، محسوبة بشكل منفصل).
f1 = الفاصل الزمني لأخذ العينات. كل 9 تم أخذ عينات من القسمTH وبالتالي
.
لذلك،
.
أين:
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واستخدم نموذج جيد الخصائص لاستنفاد الجريبات، حيث أعطيت الفئران الشابة البالغة جرعة واحدة من العلاج الكيميائي للسيكلوفوسفاميد، أو التحكم في المركبات المالحة (n=5/group) وتم حصاد المبيضين من كل بعد 48 ساعة. تم إعداد مبيض واحد لكل كما هو موضح في الخطوة 1 لكل من الطريقتين: التجسم أو العد المباشر. تم تعيين المبيض الأيسر والأييم من كل عشوائيا لكل مجموعة. وتبين هذه البيانات أنه عند استخدام علم المجسمة، يمكن الكشف عن استنفاد كبير من بصيلات الماوس البدائية بعد العلاج الكيميائي (387 ± 11 بصيلات)، مقابل السيطرة (1043 ± 149؛ ص = 0.0024) (الشكل 3). في المقابل ، باستخدام المبيضين العكسيين من نفس الحيوانات ، فشلت أعداد الجريبات المباشرة في اكتشاف انخفاض كبير في احتياطي المبيض بعد العلاج الكيميائي (490 ± 40) ، بالمقارنة مع التحكم (752 ± 139 ؛ p = 0.1063) (الشكل 3). وتجدر الإشارة إلى أنه من الواضح أن عدد الجريبات البدائية في صغار الحيوانات البرية البالغة متغير ، لأن توزيع الحيوانات المعالجة المالحة أوسع ، مقارنة بمجموعات السيكلوفوسفاميد ، حتى عندما تم إجراء العد باستخدام علم المجسمة(الشكل 3).
الشكل 1: التحضير النسيجي للمبيضين المثبتين في بوين والمدمجين في راتنج غليكولميتاكريلات للتحليل الارتزاري. أ)تم تشذيب مبيض فأر بالغ (دائرة، سهم) عن كثب من جميع الدهون ومبيض الماوس باستخدام شفرة ريشة. ب)تم تشريح مبايض الماوس العكسي (الدائرة، السهم) من نفس الأنثى البالغة، قلصت، ثم إما ثابتة في التثبيت بوين (اليسار) للتجسم، أو formalin للتعداد المباشر (يمين). ج)تم استخدام الراتنج المتخصصة ميثاكريلات ميكروتوم D) مزودة سكين زجاجي (السهم) لقطع شامل كتل راتنج غليكولميثاكريلات إلى أقسام 20 ميكرومتر، التي تم جمعها على الشرائح المجهر الزجاجي. ه) تم غمس أقسام أنسجة المبيض الدورية الملطخة بالأحماض Schiff على شرائح المجهر الزجاجي (الأسهم) في الهستولين الطازج (الحاوية الخضراء) في غطاء الدخان ، ثم تمت إضافة غطاء زجاجي فوق قطرات GMA DPX. تم استخدام ملعقة لإزالة DPX الزائدة وفقاعات الهواء. كانت الشرائح مجففة الهواء في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصنيف الجريبات البدائية. صور تمثيلية لبصيلات بدائية وانتقالية وابتدائية في أقسام المبيض المدمجة في راتنج غليكولميتهاكريلات(A-C)والبارافين المضمن(D-F). أ: بصيلات بدائية محاطة بخلايا الغرانولوزا الحرشفية (السهم). شريط = 10 ميكرومتر ب: بصيلات الانتقالية محاطة كل من الحرشفية (السهم) وخلايا الحبيبية (رأس السهم) التكعيبية. شريط = 10 ميكرومتر مئوية: بصيلات الأولية محاطة الخلايا الحبيبية (رأس السهم) التكعيبية. شريط = 25 ميكرومتر. د: بصيلات بدائية محاطة بخلايا الغرانولوزا الحرشفية (السهم). شريط = 10 ميكرومتر E: جريب الانتقالية محاطة كل من الحرشفية (السهم) و cuboidal (رأس السهم) خلايا الجرانولوزا. شريط = 10 ميكرومتر فهرنهايت: بصيلات الأولية محاطة الخلايا الحبيبية (رأس السهم) التكعيبية. شريط = 25 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة المجزئ البصري وطرق العد المباشر لتقييم بصيلات الماوس البدائية. تم استخدام نموذج راسخ لاستنفاد الجريبات كنموذج ، حيث تم علاج فئران C57BL6J الأنثوية البالغة من العمر 8 أسابيع بشكل غير مباشر بالمحلول الملحي ، أو جرعة 75 ملغ / كجم / وزن الجسم من العلاج الكيميائي ، سيكلوفوسفاميد (n = 6 / group). وقد مكن ذلك من مقارنة طريقتي عد الجريبات للكشف عن التغيرات في احتياطي المبيض. وفي نفس الفوج من الحيوانات، فشلت تقديرات الجريبات الإجمالية في الكشف عن استنفاد كبير للجريب، على النقيض من الستيريوولوجيا التي كشفت عن استنفاد أكبر وكبير لمحمية المبيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نقاط القوه | الضعف | |
| علم الستيرولوجيا | الطريقة الأكثر دقة لتقدير الجريبات | تستغرق وقتا طويلا ومكلفة |
| يستخدم العديد من معلمات أخذ العينات، مما يجعلها قوية إحصائيا | يتطلب معدات وبرامج خبراء | |
| حساسة للغاية، يمكن الكشف عن تغييرات أصغر في أعداد الجريبات البدائية | يجب إعداد العينات باستخدام تقنيات هسولوجية متخصصة ومحددة | |
| يتم الحفاظ على بنية الجريب بشكل أفضل أثناء معالجة الأنسجة | ||
| القواعد الموحدة التي يمكن تطبيقها من قبل مختلف المحققين، وبالتالي الحد من التحيز | ||
| الأعداد المباشرة | الوقت والتكلفة الفعالة | أقل دقة وحساسية من الستيرولوجيا |
| يتطلب معدات مختبرية قياسية، مثل المجهر الخفيف | معلمة أخذ عينات واحدة فقط مستخدمة، مما يجعلها أقل فعالية في اكتشاف التغيرات الصغيرة في أعداد الجريبات | |
| الاحتفاظ بأقسام المبيض التي يمكن استخدامها في التحليلات المناعية أو غيرها من التحليلات | الأنسجة أكثر عرضة للتغيرات في الحجم وهيكل الجريب أثناء المعالجة | |
| لا توجد مجموعة موحدة من القواعد التي يمكن تطبيقها ، وبالتالي أكثر عرضة للتحيز من المحقق |
الجدول 1: مقارنة نقاط القوة والضعف في أساليب عد الجريبات: الستيرولوجيا مقابل العد المباشر.
الشكل التكميلي 1: لقطات شاشة لبروتوكول برنامج الاستريوولوجيا. أ)ضبط التعرض عن طريق وضع علامة تلقائية (مربع أحمر) تحت التعرض في لوحة إعدادات الكاميرا (مربع أبيض). ب)تعيين توازن اللون الأبيض أولا بالنقر فوق رمز إعدادات أكثر ضمن أخرى في لوحة إعدادات الكاميرا. ثم حدد توازن اللون الأبيض وانقر فوق تلقائي (المربع الأحمر). ج)إذا لم يتم تعيين تكوين أخذ عينات موجود، فانقر فوق لا (المربع الأحمر) وأدخل معلومات المقطع التسلسلي (المربع الأخضر). D) لبدء العد، انقر فوق بدء العد (السهم الأبيض). E)إذا كانت نواة بصيلات بدائية مرئية داخل إطار العد، يتم احتساب هذه المسام (دائرة منقط أبيض). F)إذا كانت نواة بصيلات بدائية لمس خطوط إدراج الخضراء للإطار العد، يتم احتساب هذه المسام أيضا (دائرة منقط أبيض). G)إذا كانت نواة جريب بدائية غير مرئية داخل إطار العد أو لمس خطوط الاستبعاد الحمراء من إطار العد، لا يتم احتساب هذه المسام (دائرة منقط أبيض). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: إعداد معلمات أخذ العينات. اتبع الخطوات التسلسلية في اللوحة اليسرى لتحديد تكوين Probe. أ)قياس سمك شنت. تأكد من إلغاء تحديد "إعادة التركيز إلى أعلى القسم في كل موقع شبكة" (المربع الأحمر). ضع علامة "أدخل متوسط سمك المركبة يدويا" (المربع الأخضر). أدخل متوسط سمك المركبة كما 20.00 ميكرومتر (مربع أزرق). ب)تحديد حجم إطار الجرد. ضمن عرض إطار العد، حدد "فرض أن تكون شاشة إطار الجرد مربعة" و"مركز على الصورة المباشرة" (المربع الأحمر). تحت حجم إطار العد، أدخل 47.5 ميكرومتر ل X و Y (المربع الأخضر). ج)تعريف تخطيط شبكة SRS. أدخل حجم الشبكة يدويا ك 110 ل X و Y (المربع الأحمر). D) تحديد خيارات تشريح. لارتفاع منطقة الحراسة العلوية، أدخل 1.00 ميكرومتر (المربع الأحمر). لارتفاع تشريح البصرية، أدخل 10 ميكرومتر (مربع أخضر). ضمن أسلوب التركيز، حدد "التركيز اليدوي" (المربع الأزرق). ه) حفظ معلمات أخذ العينات. لحفظ هذه الإعدادات، أدخل الاسم والتعليق ثم انقر فوق "حفظ الإعدادات الحالية" (السهم الأبيض). F)ضمن إعدادات المعلمة Sampling الحالي، تأكد من تطابق الإعدادات مع تلك المعروضة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لتقنية معيار الذهب تعداد بصيلات الماوس الأولية، مجسمة، وطريقة أكثر شيوعا المستخدمة من الجريبات المباشرة العد. تم استخدام العلاج الكيميائي لمقارنة وتباين النتائج التي تم الحصول عليها من هاتين الطريقتين المختلفتين داخل المبيض الأيسر والأيمي من نفس الحيوان. وكشفت كلتا الطريقتين عن تباين كبير بين الحيوانات في أعداد الجريبات البدائية. تم تسجيل استنفاد كبير لاحتياطي المبيض باستخدام علم المجسمة ، ولكن العد المباشر فشل في اكتشاف انخفاض كبير في عدد الجريبات البدائية بعد إدارة العلاج الكيميائي مقابل التحكم.
وتجدر الإشارة إلى أنه من الواضح أنه حتى في سلالة أصيلة من الفئران ، مثل C57BL6J ، يتم توزيع احتياطي المبيض في النوع البري للبالغين الصغار (التحكم) على نطاق واسع ، كما هو الحال في البشر. العوامل التي تؤثر على ذلك وتسهم في إنشاء احتياطي المبيض لا تزال قيد التحقيق18. التباين العالي بين الدراسات من وظيفة المبيض الماوس يطرح العديد من التحديات للمجال لمقارنة، أو تكرار البيانات والنهوض الترجمة السريرية للعلاجات الرواية لحماية عدد البويضات ونوعية4. ومن المرجح أن يعزى هذا التباين إلى عدد من العوامل، بما في ذلك ليس فقط طرق العد المستخدمة، ولكن عوامل إضافية مثل الاختلافات بين السلالة الحيوانية والعمر؛ وكذلك أنظمة العلاج، مثل الجرعة والتوقيت. ويجب أن تؤخذ هذه العوامل في الاعتبار عند مقارنة البيانات المستقاة من دراسات مختلفة. وبغض النظر عن ذلك، فإن نموذج استنفاد الجريبات المستخدم في هذه الدراسة يسلط الضوء بشكل عام على الطبيعة الدقيقة والحساسة لبروتوكول الاستريوولوجيا، بينما يثبت أيضا أن طريقة العد المباشر المبلغ عنها على نطاق واسع غير قادرة على اكتشاف استنفاد كبير معروف للجريب البدائي.
هناك نقاط قوة وقيود لكل طريقة عد مفصلة في هذه المقالة(الجدول 1). يعتبر علم المجسمة الطريقة القياسية الذهبية نظرا لدقتها عند استخدامها لتحديد عدد الخلايا في مجموعة متنوعة من الأجهزة المختلفة5. غير أن عيوب هذه التقنية تشمل الوقت والتكلفة الي ينطويان عليها، فضلا عن الحاجة إلى معدات وخبرات متخصصة. وقد حد ذلك معا من استخدام هذا الإجراء على نطاق واسع للحصول على البيانات الأكثر حساسية.
في المقابل ، فإن طريقة العد المباشر سريعة وسهلة ، ويمكن القيام به باستخدام الأنسجة المؤرشفة ، وإعدادها باستخدام تقنيات النسيج القياسية. لا يتطلب سوى مجهر خفيف مع قدرات التصوير القياسية. ومع ذلك ، فإنه لا يفسر تغيرات الحجم الناجمة عن المعالجة النسيجية ، والتي قد تعطل البنية ثلاثية الأبعاد للمبيض. وبالتالي، لا يتم الحفاظ على مورفولوجيا الجريبات دائما بشكل كاف، مما يجعل تحديد الهوية ودقة العد أمرا صعبا، خاصة بالنسبة للمحققين عديمي الخبرة. في حين أن الفورمالين كان المثبت المستخدم في العد المباشر في هذه الدراسة ، يمكن تضمين أنسجة بوين الثابتة في البارافين وهذا قد يوفر مورفولوجيا أفضل ويساعد الباحثين على تحديد الجريبات البدائية بسهولة أكبر. وعلاوة على ذلك، ضمن الأدبيات، تختلف كسور أخذ العينات لطريقة العد المباشر بشكل كبير، بدءا من كل 3rd إلى كل 10th 5 ميكرومتر البارافين القسم19،والتي قد تسهم في اختلافات كبيرة في عدد الجريبات بين الدراسات. وبالنظر إلى أن أقسام شمع البارافين رقيقة جدا ، فإن عد كل قسم9 يساعد على منع الإفراط في الاختزال والعد غير الضروري.
طرق إضافية غير مبينة في هذا الدليل، ولكن عادة ما يتم الإبلاغ عنها في الأدبيات، يتم عدها في قسم مركزي واحد فقط من المبيض بأكمله، والنظر في أن هذا يمثل المبيض بأكمله، أو كثافة الجريب. هذه الطريقة الأولى هي إشكالية للغاية ، حيث لا يتم توزيع الجريبات البدائية بالتساوي في المبيض ويمكن العثور عليها في مجموعات. وهذا يعني أن قسما واحدا، أو حتى بضعة أقسام من المبيض، لا تمثل الجهاز بأكمله، مما يجعل أخذ العينات بشكل منهجي مكونا أساسيا لأي طريقة عد. كثافة الجريب ينطوي على عد بصيلات في عينة أنسجة المبيض، ثم التعبير عن التهم لكل منطقة من الأنسجة. نظرا للقيود المفروضة على الحصول على الأنسجة البشرية الأولية ، غالبا ما تستخدم كثافة الجريبات كمقياس بديل لعدد الجريبات المطلق في المبيض البشري ، على الرغم من أن التقارير في الفئران شائعة أيضا. ومع ذلك، فإن طريقة القياس الكمي هذه لا تفسر التوزيع غير المتكافئ للبصيلات في جميع أنحاء المبيض، أو التقلبات في حجم المبيض، والتي تحدث بشكل روتيني طوال دورة الغدد الصماء المبيضية (اللوتال). وهذا أمر مهم لأن قياس دقيق للكثافة بين العينات يعتمد على منطقة الأنسجة المحفوظة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة غالبا ما عينات خزعة صغيرة أو جزء صغير من المبيض عند تحليل الأنسجة البشرية، وبالتالي لا تمثل المبيض بأكمله. كثافة الجريبات تفتقر إلى الدقة التي يمكن تحقيقها مع الستيرولوجيا. حتى باستخدام نفس المبيض كله ، لم تتوافق المقاييس المقارنة لقياس كمي الجريبات بعد التحليل القياري ، مع كثافة الجريبات ، في مبايض الفئران20.
على الرغم من أنه هو الحيوان التجريبي الأكثر استخداما، والفأر هو نوع نموذج واحد فقط. الحصول على المبيضين من الأنواع الأكبر، بما في ذلك الحيوانات الأليفة أو الرئيسيات غير البشرية، ممكن، وبالتالي يمكن إنجاز تعداد الجريبات من عينات المبيض كله باستخدام بروتوكول stereological معدلة21،22. وأخيرا، في حين أن القدرة على تحليل عدد الجريبات في المبيضين البشري كله هو في الواقع من الصعب جدا، ومع ذلك يمكن القيام به عندما تتوفر عينات، وذلك باستخدام بروتوكول stereological تعديل23،24،25.
وقد تشمل الاتجاهات المستقبلية في هذا المجال توسيع نطاق التقنيات الجديدة واستيعابها. على سبيل المثال، تم وصف منهجية جديدة للكشف الآلي والعد للبويضات بصيلات البدائية26. تستخدم هذه الطريقة شبكات عصبية ملتوية مدفوعة بمجموعات بيانات موسومة خوارزمية إطار منزلقة لتحديد بيانات الاختبار. ومع ذلك ، تم اختبار هذه الخوارزمية فقط على المبيضين ولا يزال يتعين تحديد الإقبال على نطاق واسع. بدلا من ذلك، سمحت التطورات الأخيرة في إزالة الأنسجة البصرية ومجهر ورقة الضوء تحليل شامل للأنسجة سليمة وبعض الدراسات قد حققت في هذا لعد الجريب في المبيض الماوس27،28.
في الختام ، في حين أن العد المباشر للجريب هو طريقة سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لتعداد الجريبات البدائية داخل المبيض ، قد تفتقر هذه التقنية إلى الحساسية والدقة وتكون عرضة لتحيز المحقق. لذلك ، على الرغم من عيوبه ، لا يزال الستيرولوجيا أفضل تقنية متاحة لتحديد أعداد الجريبات البدائية بدقة واستنساخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد أمكن هذا العمل من خلال دعم الهياكل الأساسية التشغيلية لحكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية NHMRC IRIISS وبدعم من تمويل من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (ALW #1120300) ومجلس البحوث الأسترالي (KJH #FT190100265). ويود المؤلفون الاعتراف بالدعم التقني لمنصة موناش لأبحاث الحيوانات ومنصة موناش لعلم الأنسجة ومنشأة موناش للتصوير الدقيق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
