Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/61783
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

Summary

يقدم هذا البروتوكول نظاما جديدا وقويا وقابلا للاستنساخ لتوليد وزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد من خلايا الورم الغدي القولون Caco2. تقدم النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.

Abstract

تتميز سرطانات القولون والمستقيم بعدم التجانس ومنظمة هرمية تضم مجموعة من الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) المسؤولة عن تطور الورم وصيانته ومقاومته للأدوية. وبالتالي، فإن الفهم الأفضل لخصائص CSC لاستهدافها المحدد هو شرط مسبق للعلاج الفعال. ومع ذلك، هناك ندرة في النماذج السابقة السريرية المناسبة لإجراء تحقيقات متعمقة. على الرغم من أن خطوط الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد (2D) في المختبر توفر رؤى قيمة في بيولوجيا الورم ، إلا أنها لا تكرر عدم تجانس الورم الظاهري والوراثي. في المقابل، تعالج النماذج ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وتتكاثر تعقيد السرطان شبه الفسيولوجي وتغايرية الخلايا. وكان الهدف من هذا العمل تصميم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قوي وقابل للاستنساخ لدراسة بيولوجيا CSC. تصف المنهجية الحالية تطوير وتحسين الظروف لتوليد كرويدات ثلاثية الأبعاد ، وهي متجانسة في الحجم ، من خلايا الكاكو2 الغدية القولونية ، وهو نموذج يمكن استخدامه للثقافة على المدى الطويل. والأهم من ذلك، داخل كرويدات، الخلايا التي نظمت حول هياكل تشبه التجويف، وتتميز أنماط انتشار الخلايا التفاضلية ووجود CSCs التعبير عن لوحة من علامات. توفر هذه النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج ثلاثي الأبعاد لدراسة تغايرية الخلايا وبيولوجيا CSC ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.

Introduction

سرطان القولون والمستقيم (CRC) لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفيات المرتبطة بالسرطان في العالم1. تطوير لجنة حقوق الطفل هو نتيجة لاكتساب تدريجي وتراكم الطفرات الوراثية و / أو التعديلات اللاجينية2،3، بما في ذلك تفعيل الأورام وتثبيط الجينات المثبطة للورم3،4. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسهم العوامل غير الوراثية (مثل البيئة الدقيقة) في التحول الجيني ومن ثم المشاركة في تطور مراكز مكافحة الأمراض العصبية5. الأهم من ذلك، تتكون CRCs من مجموعات خلايا مختلفة، بما في ذلك CSCs غير المتمايزة والخلايا السرطانية السائبة التي تظهر بعض الصفات التفاضلية، والتي تشكل بنية هرمية تذكرنا بتنظيم الظهارة في سرداب القولون العادي6،7.

تعتبر CSCs مسؤولة عن ظهور الورم8، والحفاظ عليه ونموه ، وقدرته النقيلية ، ومقاومة العلاجات التقليدية6،7. داخل الأورام، والخلايا السرطانية، بما في ذلك CSCs، عرض مستوى عال من التغايرية والتعقيد من حيث ملامحها الطفرة واللاجينية متميزة، والاختلافات المورفولوجية والظاهرية، والتعبير الجيني، والتمثيل الغذائي، ومعدلات الانتشار، والإمكانات النقيلي9. لذلك ، لفهم أفضل بيولوجيا السرطان ، وتطور الورم ، واكتساب المقاومة للعلاج وترجمته إلى علاجات فعالة ، فإن النماذج قبل السريرية البشرية التي تلتقط عدم التجانس والتسلسل الهرمي للسرطان مهمة10،11.

في المختبر 2D خطوط الخلايا السرطانية قد استخدمت لفترة طويلة وتوفير رؤى قيمة في تطور الورم والآليات الكامنة وراء فعالية الجزيئات العلاجية. ومع ذلك ، فإن تقييدها فيما يتعلق بعدم وجود التغايرية الظاهرية والجينية الموجودة في الأورام الأصلية معترف بها الآن على نطاق واسع12. وعلاوة على ذلك، لا يتم استنساخ المواد الغذائية والأوكسجين، وتدرجات الحموضة، والفيروسات الدقيقة الورم، والبيئة الدقيقة كونها مهمة بشكل خاص للحفاظ على أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك CSCs11،12. للتغلب على هذه العيوب الرئيسية، تم تطوير العديد من النماذج ثلاثية الأبعاد لمعالجة وإعادة إنتاج تعقيد وتغاير السرطانات تجريبيا. في الواقع، هذه النماذج تلخيص الورم التغايرية الخلوية، والتفاعلات الخلية الخلية، والهندسة المعمارية المكانية، مماثلة لتلك التي لوحظت في الجسم الحي12،13،14. الأجهزة السرطانية الأولية التي أنشئت من الأورام الطازجة، فضلا عن كرويدات خط الخلية المشتقة، وتستخدم إلى حد كبير15،16.

يمكن استزراع الكرويات بطريقة خالية من السقالات أو السقالات لإجبار الخلايا على التشكل والنمو في مجاميع الخلايا. تستند الطرق الخالية من السقالات على ثقافة الخلايا في ظل ظروف غير ملتزمة (على سبيل المثال ، طريقة الشنق أو لوحات المرفق المنخفضة للغاية) ، في حين تعتمد النماذج القائمة على السقالات على المواد الحيوية الطبيعية أو الاصطناعية أو الهجينة لخلايا الثقافة12و13و14. السقالة القائمة على كرويدات تقديم مساوئ مختلفة كما تشكيل كروية النهائي سوف تعتمد على طبيعة وتكوين المواد (الحيوية) المستخدمة. على الرغم من أن طرق كروية خالية من السقالة المتاحة حتى الآن لا تعتمد على طبيعة الركيزة ، فإنها تولد كرويدات تختلف في الهيكل والحجم17،18.

كان الهدف من هذا العمل تصميم نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قوي وقابل للاستنساخ من الكرويات ، وهي متجانسة في الحجم ، تتكون من خلايا الكاكو2 الغدية القولونية لدراسة بيولوجيا CSC. خلايا Caco2 ذات أهمية خاصة نظرا لقدرتها على التفريق مع مرور الوقت19،20، مما يشير بقوة إلى إمكانات تشبه الجذعية. وبناء على ذلك، كشفت الثقافة طويلة الأجل للشفرات وجود مجموعات مختلفة من CSC مع استجابات مختلفة للعلاج الكيميائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمواد في جدول المواد.

1. تشكيل كروي

  1. وسائط ثقافة كروية
    1. إعداد المتوسط القاعدية التي تتكون من دولبيكو متوسط النسر المعدلة (DMEM) تكملها مع 4 MM L-ألانيل-L-الجلوتامين ديببتيد.
    2. إعداد DMEM المتوسطة كاملة تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين-streptomycin (القلم / ستريب) في المتوسط القاعدي من الخطوة 1.1.1.
    3. إعداد DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة التي تحتوي على 2.5٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي، 10٪ FBS، و 1٪ القلم / ستريب في المتوسط القاعدي من الخطوة 1.1.1.
  2. إعداد لوحات لتشكيل كروي
    1. دافئ القاعدية وDMEM / الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    2. Pretreat الآبار من لوحة 24 جيدا مخصصة لتشكيل كروية بإضافة 500μL من المضادة للالتزام حل الشطف لكل بئر.
      ملاحظة: في هذه اللوحات، يتكون كل بئر من 1200 ميكروويل.
    3. الطرد المركزي لوحة في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق في الدوار دلو يتأرجح مع محولات لوحات.
      ملاحظة: إذا تم استخدام لوحة واحدة فقط، قم بإعداد لوحة قياسية إضافية مملوءة بالماء لموازنة الوزن.
    4. شطف كل بئر مع 2 مل من المتوسط القاعدي الدافئ، وتنشق المتوسطة من الآبار.
    5. مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان أن فقاعات قد أزيلت تماما من microwells. إذا ظلت الفقاعات محاصرة، طارد مركزي مرة أخرى في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق للقضاء على الفقاعات.
    6. كرر الخطوات الشطف 1.2.4-1.2.5.
    7. إضافة 1 مل من DMEM الدافئة / الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة لكل بئر.
  3. جيل من كرويات
    1. تنمو خلايا Caco2 في أحادية 2D في المتوسط DMEM تكملها مع 10٪ FBS و 1٪ القلم / ستريب في 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO2 (يشار إليها فيما بعد باسم 37 درجة مئوية / 5٪ CO2).
      ملاحظة: الحد الأقصى لعدد مقاطع الخلايا التي سيتم استخدامها هو 80.
    2. عندما يتم الوصول إلى 80٪ من التقاء، وغسل الخلايا مع الفوسفات العازلة المالحة (PBS) 1x (5 مل لطبق 10 سم)، إضافة تريبسين-إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك (EDTA) (2 مل لطبق 10 سم)، واحتضان لمدة 2-5 دقيقة في 37 درجة مئوية / 5٪ CO2.
    3. فحص مفرزة الخلية تحت المجهر، وتحييد التريبسين بإضافة 4 مل من DMEM متوسطة كاملة لكل طبق 10 سم.
    4. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم لتحديد العدد الإجمالي للخلايا.
    5. الطرد المركزي تعليق الخلية في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق. تجاهل supernatant، وإعادة إنفاق بيليه في حجم مناسب من DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط.
    6. راجع الجدول 1 لتحديد عدد الخلايا المطلوبة لكل بئر لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا لكل ميكروويل. بدلا من ذلك، حساب عدد الخلايا باستخدام الصيغة التالية للوحة 24 جيدا، مع الأخذ في الاعتبار كل بئر يحتوي على 1200 ميكروويل
      العدد المطلوب من الخلايا لكل بئر = العدد المطلوب من الخلايا لكل ميكروويل × 1200
    7. إضافة الحجم المطلوب من تعليق الخلية إلى كل بئر لتحقيق رقم الخلية المطلوب في حجم النهائي من 1 مل.
    8. إضافة 1 مل من DMEM / الطابق السفلي مصفوفة غشاء المتوسطة لكل بئر للوصول إلى الحجم النهائي من 2 مل لكل بئر (انظر أيضا الخطوة 1.2.7).
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات في microwells.
    9. الطرد المركزي لوحة فورا في 1200 × غرام لمدة 5 دقائق لالتقاط الخلايا في microwells. إذا لزم الأمر، موازنة الطرد المركزي مع لوحة قياسية مليئة بالماء.
    10. مراقبة لوحة تحت المجهر للتحقق من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي بين microwells.
    11. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية / 5 ٪CO2 لمدة 48 ساعة دون إزعاج لوحة.
      ملاحظة: وفقا للبروتوكول الأصلي21، على الرغم من أن العديد من خطوط الخلايا يمكن أن تشكل كرويدات في غضون 24 ساعة ، وبعضها يتطلب وقتا أطول الحضانة. في هذا البروتوكول، 48 ساعة كافية لتشكيل كروي.
  4. حصاد كرويدات من microwells
    1. قم بتدفئة مصفوفة الغشاء القاعدية وDMEM/الطابق السفلي في RT لمدة 20 دقيقة تقريبا.
    2. باستخدام ماصة المصلية، وإزالة نصف المتوسطة الثقافة (1 مل) من كل بئر.
    3. إضافة المتوسطة مرة أخرى على سطح البئر لطرد كرويدات من microwells.
      ملاحظة: لا تلمس أو تريتورات كرويدات.
    4. ضع مصفاة قابلة للعكس 37 ميكرومتر (أو مصفاة قياسية 40 ميكرومتر) على الجزء العلوي من أنبوب مخروطي سعة 15 مل لجمع الكرويات.
      ملاحظة: إذا كنت تستخدم مصفاة قياسية 40 ميكرومتر، ضعها رأسا على عقب.
    5. يستنشق بلطف كرويدات طرد (من الخطوة 1.4.3)، وتمرير تعليق كروي من خلال مصفاة.
      ملاحظة: ستبقى spheroids على عامل التصفية; سوف تتدفق الخلايا المفردة من خلال مع المتوسط.
    6. باستخدام ماصة المصلية، والاستغناء عن 1 مل من المتوسط القاعدي الدافئ عبر كامل سطح البئر لطرد أي كرويدات المتبقية واستردادها على مصفاة.
    7. كرر خطوة الغسيل هذه 1.4.6 مرتين.
    8. مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان أن جميع كرويدات قد أزيلت من microwells. كرر الغسيل إذا لزم الأمر (الخطوات 1.4.6-1.4.7).
    9. عكس مصفاة، ووضعه على أنبوب مخروطي 15 مل جديدة. جمع كرويدات عن طريق غسل مصفاة مع DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط.
      ملاحظة: تكون كرويدات المجموعة جاهزة للتطبيقات والتحليلات المتلقين للمعلومات.
  5. ثقافة كروية طويلة الأمد
    1. إعداد محلول الآغاروز 1.5٪ في الوسط القاعدي، وتعقيمه عن طريق الالاستعباد التلقائي (دورة قياسية).
    2. في حين أن محلول الآغاروز دافئ ولا يزال سائلا ، قم بتغليف آبار أطباق الثقافة القياسية أو الأطباق ، كما هو موضح في الجدول 2.
      ملاحظة: ارتفاع درجة حرارة الطبق / لوحة في الفرن سوف تسهل خطوة الطلاء. يمكن ترك الأطباق المغلفة / الأطباق في RT لمدة تصل إلى 10 أيام في بيئة معقمة ومحمية من الضوء.
    3. بذور كرويدات حصادها (من الخطوة 1.4.9) في لوحات المغلفة agarose، وإضافة DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسطة لتحقيق الحجم النهائي اعتمادا على حجم لوحة.
      ملاحظة: لتجنب المجاميع الكروية، البذور لهم في الكثافة المثلى من 22 كرويات / سم2. لاحظ أن الطلاء ليس مسطحا تماما ، ويرتفع نحو الحافة ، مما يخلق قعقعة خفيفة في وسط اللوحة. إذا كان عدد كرويدات مرتفعة جدا، هم أكثر عرضة للالتزام ببعضها البعض.
    4. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية / 5 ٪CO2 حتى استعادة كرويدات لتحليلاتمحددة.
  6. علاج كرويات مع أدوية العلاج الكيميائي
    1. كرويات اللوحة من الخطوة 1.5.4، وتنمو لهم لمدة 2 أيام. بدءا من اليوم الثالث (د3)، عالجهم ب FOLFIRI (5-Fluorouracil، 50 ميكروغرام/مل؛ إيرينوتيكا، 100 ميكروغرام/مل؛ ليوكورين، 25 ميكروغرام/مل) أو مع فولفFOX (5-فلوراسيل، 50 ميكروغرام/مل؛ أوكساليبلاتين، 10 ميكروغرام/مل؛ Leucovorin, 25 ميكروغرام / مل) تركيبات نظام العلاج الكيميائي تستخدم بشكل روتيني لعلاج المرضى CRC22,23,24,25, أو الحفاظ عليها في (السيطرة) غير المعالجة (NT) حالة.
    2. جمع كرويدات بعد 3 أيام من العلاج باستخدام ماصة مع قطع طرف (1000 ميكرولتر تلميح)، وضمان أن يتم تمثيل كل شرط من قبل ما لا يقل عن ثلاثة يكرر. طاردة مركزية لهم في 1000 × غرام لمدة 3 دقائق، ومن ثم إزالة supernatant.
    3. إصلاح الكريات في 2٪ بارافورمالديهايد (PFA) للتحليل النسيجي (انظر القسم 3)، أو استخدام الكريات لاستخراج الحمض النووي الريبي (انظر القسم 4).
    4. لتحليل موت الخلية، واحتضان كرويدات من الخطوة 1.6.1 في لوحات آبار الثقافة السوداء في DMEM / الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط لمدة 30 دقيقة مع وصمة عار حمض النوى (1:5000 التخفيف) التي لا تتخلل الخلايا الحية، ولكن تخترق الأغشية للخطر من الخلايا الميتة26. قياس تراكم الفلورسينس مع قارئ microplate.

2. رصد نمو كروية

  1. باستخدام المجهر المقلوب، والحصول على صور تمثيلية من كرويدات الحفاظ عليها في ظل ظروف مختلفة طوال الأيام في الثقافة.
  2. تحليل الصور عن طريق قياس ثلاثة أقطار تمثيلية مختلفة من كل كروية باستخدام البرامج المناسبة.
  3. استخدم الصيغة التالية للحصول على حجم المجال المقدر.
    Equation 1

    ملاحظة: المصطلحات d1 d2 و d3 هي ثلاثة أقطار من كروية.

3. الفلورة المناعية (IF) وتلطيخ النسيجية

  1. التثبيت وتضمين البارافين
    1. جمع كرويدات في نقاط زمنية محددة باستخدام ماصة مع تلميح قطع كما هو موضح في الخطوة 1.6.2، وإصلاحها لمدة 30 دقيقة في RT في 2٪ PFA.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، تخزين العينات في هذه الخطوة عند 4 درجة مئوية حتى استخدامها.
    2. لتضمين البارافين، اغسل كرويدات 3x مع برنامج تلفزيوني 1x، وإعادة إنفاقها في الإيثانول 70٪. بعد إدراج البارافين وتقسمه، قم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&.E) للتحليل النسيجي.
  2. الاعتلاء المناعي لأقسام البارافين
    ملاحظة: استخدم مقاطع سمكها 5 ميكرومتر لاحتواء المناعة بشكل غير مباشر.
    1. احتضان الشرائح في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإذابة الشمع وتحسين إزالة البارافينين.
    2. غسل الشرائح مرتين لمدة 3 دقائق في ميثيلسيكلوهيكسان.
    3. غسل الشرائح لمدة 3 دقائق في 1:1 ميثيلسيكلوهيكسان: الإيثانول 100٪.
    4. غسل الشرائح مرتين لمدة 3 دقائق في الإيثانول 100٪.
      ملاحظة: تنفيذ كافة عمليات التلاعب للخطوة 3.2.2 إلى الخطوة 3.2.4 في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    5. غسل الشرائح لمدة 3 دقائق في الإيثانول 90٪.
    6. غسل الشرائح لمدة 3 دقائق في الإيثانول 75٪.
    7. غسل الشرائح لمدة 3 دقائق في الإيثانول 50٪.
    8. غسل الشرائح تحت مياه الصنبور.
    9. إعادة ترطيب الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
    10. إعداد 700 مل من 0.01 متر سيترات العازلة، درجة الحموضة 6.0، وإضافته إلى حاوية مناسبة (العرض: 11.5 سم، طول: 17 سم، الارتفاع: 7 سم)؛ غمر الشرائح فيه. سخني الحاوية في الميكروويف لمدة 9-10 دقائق بسرعة 700 واط، وعندما يبدأ الغليان، قللي الطاقة إلى 400-450 واط.
    11. دع الشرائح تبرد في المخزن المؤقت إلى RT لمدة 30-40 دقيقة تقريبا.
    12. غسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    13. رسم دائرة حول المقاطع بقلم علامة لإنشاء حاجز للسوائل المطبقة على المقاطع.
    14. احتضان كل قسم مع 50 ميكروغرام من العازلة حجب (10٪ مصل الماعز العادي، 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA)، و 0.02٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT.
    15. إزالة العازلة حجب، وإضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في العازلة حضانة (1٪ مصل الماعز العادي، 0.1٪ BSA، و 0.02٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني). حضانة لمدة 2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    16. إزالة الأجسام المضادة الأساسية، وغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    17. احتضان الشرائح مع 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المخففة في العازلة حضانة لمدة 1 ساعة في RT.
    18. إزالة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    19. إضافة 50 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole إلى كل قسم, ووضع غطاء الزجاج على القسم.

4. استخراج الحمض النووي الريبي، النسخ العكسي-البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (RT-PCR)، والكمية RT-PCR (qRT-PCR)

  1. جمع كرويدات في نقاط زمنية مختلفة، كل نقطة ممثلة بثلاث نسخ متماثلة على الأقل. طاردة مركزية لهم في 1000 × غرام لمدة 3 دقائق، ومن ثم إزالة supernatant.
    ملاحظة: الكريات يمكن استخدامها مباشرة لاستخراج الحمض النووي الريبي أو تخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
  2. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام عدة العزل الجيش الملكي النيبالي التجارية، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. عكس نسخ 500 نانوغرام من كل عينة الحمض النووي الريبي في الحمض النووي التكميلي (cDNA) مع عدة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. بعد النسخ العكسي، قم بإجراء تحليل PCR على 1 ميكرولتر من cDNA لتضخيم جين التدبير المنزلي مع التمهيديات الموجودة في exons مختلفة.
    ملاحظة: تمكن هذه الخطوة من التحقق من عدم وجود أي تلوث الحمض النووي الجينومي في الاستعدادات الحمض النووي الريبي. لهذا البروتوكول، تم استخدام البرايمرات peptidylprolyl ايزوميراز B(PPIB).
  5. إجراء تضخيم qPCR على 4 ميكرولتر من cDNA المخفف سابقا (1:10 في الماء المقطر المزدوج الخالي من RNAse) باستخدام التمهيديات المحددة للجينات ذات الاهتمام. في كل عينة، تحديد تعبير مرنا محددة باستخدام طريقة ΔΔCt والقيم تطبيع ضد مستويات الجينات التدبير المنزلي.
    ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم تحديد β-actin(ACTB). يتم سرد التمهيديات المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وبما أن عدم وجود تجانس في حجم كرويات هو واحد من العيوب الرئيسية المتاحة حاليا أنظمة ثقافة كروية 3D13، وكان الهدف من هذا العمل لاقامة بروتوكول موثوق بها وقابلة للاستنساخ للحصول على كرويدات متجانسة. أولا، لتهيئة ظروف عمل مثالية، تم اختبار أعداد مختلفة من خلايا كاكو2، تتراوح بين 50 إلى 2000 خلية لكل ميكروويل/كروية باستخدام لوحات مخصصة(الجدول 1). في الواقع ، يحتوي كل بئر في هذه اللوحات على 1200 ميكروويل ، مما يتيح تكوين نفس العدد من الكرويات لكل بئر ، والأهم من ذلك ، تشكيل كروي واحد لكل ميكروويل21. بعد يومين من الثقافة، نمت الآبار التي تحتوي على 2000 خلية لكل كروية كطاجنة، و 50 خلية لكل كروية أدت إلى كرويات صغيرة وغير متجانسة(الشكل 1A). ولذلك استبعد هذان الشرطان من إجراء مزيد من التحليلات. ولإقامة ثقافات طويلة الأجل، تم حصاد الكرويات من الحيوانات الدقيقة وزرعها في ظروف غير معتنقة في أطباق مغلفة بالأغاروز الطازجة. ثم تم رصد نمو كروية طوال الدورة الزمنية التجريبية عن طريق قياس التغير في الحجم. ولأخذ الشكل غير الكروي في الاعتبار، تم قياس ثلاثة أقطار مختلفة لكل كروي، وتم تطبيق صيغة الحجم27 (الشكل 1B). وحافظت الشفرات التي تم توليدها من 100 و200 خلية على حجمها الأولي على مدار التجربة بأكملها، في حين أن تلك التي تحتوي على 1000 خلية تفككت أثناء الحصاد بسبب حجمها الكبير، وبالتالي قدمت المزيد من التباين في حجمها. لذلك ، كما أظهرت كرويدات الناشئة عن 500 خلية الزيادة الأكثر تجانسا في الحجم على مدى الدورة الزمنية التجريبية ، تم استخدام هذا العدد من الخلايا لتشكيل كروية.

ثانيا، إلى جانب 500 خلية لكل كروية، تمت دراسة أعداد خلايا إضافية تتراوح بين 300 و800 خلية. وعلاوة على ذلك، ولتحسين الظروف غير المنضمة، تم تعديل البروتوكول الأصلي عن طريق المعالجة المسبقة لل آبار مرتين بدلا من تطبيق غسل واحد فقط. ولوحظ تحسن في التجانس والاكتناق الكروي مع هذه التغييرات(الشكل 2A). تم قياس حجم كرويدات في كل حالة في وقت الحصاد(الشكل 2B)،ورصد نموها على المدى الطويل على مدار الأيام في الثقافة في أطباق مغلفة agarose(الشكل 2C). واستنادا إلى النتائج، تم تأكيد 500 و 600 خلية/كروية كظروف مثالية تسفر عن نمو جيد وتقلب منخفض. ونظرا لتجانس ملامح النمو في جميع مراحل الدورة الزمنية التجريبية والهياكل المدمجة التي تشكلت، تم اختيار 600 خلية لكل كروية كعدد خلايا للتجارب اللاحقة. وأخيرا، لمزيد من تحسين البروتوكول، تم استكمال المتوسطة كاملة DMEM مع 2.5٪ من مصفوفة غشاء الطابق السفلي، والذي يحتوي على عوامل نمو إضافية ولوحة كبيرة من البروتينات مصفوفة خارج الخلية28. في الواقع ، يمكن أن يكون الشكل متعدد الفصيصات للكرويدات بسبب عدم وجود إشارات من البيئة الدقيقة التي قد أثرت على استقطاب الخلايا29،30. إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي تعزيز نمو كروي وتحسين تجانسها(الشكل 2D). ويمكن رؤية مثال على هذا التحسن ل500 خلية لكل كروية. في غياب مصفوفة غشاء الطابق السفلي(الشكل 1B)، كان حجم كرويدات أكثر غير متجانسة ، وتضاعف من D3 إلى D7 ثم وصل إلى هضبة. ومع ذلك ، في وجود مصفوفة غشاء الطابق السفلي(الشكل 2C)، كان حجم كرويدات في كل نقطة زمنية أكثر تجانسا ، وزيادة متناسبة مع مرور الوقت.

لتحليل الميزات طويلة الأجل للشفرات ، تم استردادها في نقاط زمنية مختلفة بعد الثقافة في أطباق مغلفة بال أغاروز للتحليلات الهسولوجية والايافية التفصيلية على أقسام البارافين. أظهر تلطيخ H &؛ E أن الخلايا داخل كرويات خضع تغييرات في تنظيمها وشكلها مع مرور الوقت. في الواقع ، تم ترتيب الخلايا بكثافة في طبقات متعددة في D3 ، في حين أن الخلايا المسطحة مرتبة في طبقات أحادية كانت مرئية بوضوح في D10. ومن المثير للاهتمام ، كما هو مبين في خطوط منقط أسود في الصور ، ظهرت في lumen كرويدات من D5 فصاعدا(الشكل 3). في موازاة ذلك، تم تحليل انتشار الخلايا وموت الخلايا المبرمج من قبل IF باستخدام علامة الانتشار، مستضد الخلايا النووية المنتشرة (PCNA)، وعلامة موت الخلية، caspase تنشيط 3. كشف وضع العلامات لPCNA أن الخلايا المنتشرة كانت موجودة في كثير من الأحيان على السطح الخارجي للفكاويات ، وأحيانا في هياكل تشبه سرداب أو تشبه برعم تذكرنا الثقافات العضوية15. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت زيادة واضحة في الخلايا الإيجابية PCNA في D5 و D7 التي انخفضت من قبل D10(الشكل 4،لوحات اليسار). والمثير للدهشة، لوحظ caspase تنشيط 3 في عدد قليل جدا من الخلايا في كرويدات في كل من D3 و D5(الشكل 4،لوحات اليسار) وعلى مدى فترات أطول من الزمن (البيانات غير مبين). كما تم تقييم نمط التعبير عن β كاتينين في أقسام البارافين. ومن المثير للاهتمام، لوحظت مستويات عالية من التعبير β-catenin في كل نقطة زمنية مع واضحة غشاء ملزمة وتلطيخ السيتوبلازمية(الشكل 4،لوحات الحق). تجدر الإشارة إلى أن الغشاء ملزمة β كاتينين يشارك في الالتصاق الخلية الخلية عن طريق ربط إلى E-cadherin31. ولوحظ وجود مستوى عال من وضع العلامات على الكاتينين في مجموعات من الخلايا في جميع النقاط الزمنية. في بعض الحالات، الخلايا أيضا عرض ترجمة ß-catenin النووية واضحة (الشكل 4، لوحات الحق). ومن المعروف Caco2 الخلايا للتمييز في المختبر في 2D أساسا في enterocytes19،32. ومع ذلك، كان التعبير عن علامات التمايز، مثل كروموجرانين A (خلايا الغدد الصماء المعوية)، الليسوزيمي (خلايا بانيث) أو موسين 2 (MUC 2، خلايا الكؤوس)، غير قابل للكشف في هذه الكرويات من قبل IF (البيانات غير مبينة). ومع ذلك، تم تأكيد إمكانية التفريق إلى enterocytes، بالنظر إلى أن كرويدات أعرب ALPI (الفوسفاتاز القلوية) والأسرة الناقل المذاب 2، نسخة البديل 2(SLC2A5)/نقل الجلوكوز 5 (GLUT5) mRNAs (الشكل 5). زادت هذه المستويات مرنا في D5 و D7، ولكن الفرق كان إما غير كبير(ALPI)أو هامشية فقط كبيرة(SLC2A5)مقارنة بمستويات في D3.

مع الهدف النهائي لتحديد ما إذا كانت الكرويات التي تم إنشاؤها وتثقفها استنادا إلى هذه الطريقة الجديدة هي أداة موثوقة لدراسة CSCs ، تم تحليل التعبير عن علامات CSC من قبل IF و qRT-PCR. CD133 و CD44 تميز مجموعات الخلايا السرطانية بما في ذلك CSCs7,33,34 ويتم التعبير عنها أيضا من قبل SCs في الأمعاء العادية والقولون33,34,35. مجموعات من الخلايا الإيجابية CD133 كانت موضعية أساسا على السطح الخارجي للسفيرات في كل نقطة زمنية(الشكل 6A، لوحات اليسار). كانت الخلايا الإيجابية CD44 أقل تكرارا ، ولكنها كانت دائما مرتبطة بخلايا إيجابية CD133(الشكل 6A، اللوحات اليمنى) ، مما يشير إلى وجود مجموعة من خلايا CD133/CD44 المزدوجة الإيجابية الشبيهة ب CSC والسكان الذين يعبرون عن CD133 فقط. فحص أولفاكتوميدين 4 (OLFM4) وموزاشي 1 (MSI1) كعلامات SC/CSC؛ يتم التعبير عن هذه العلامات بطريقة محدودة جدا في سرداب القولون36،37 وأيضا في مجموعات خلايا متميزة35،38. لوحظت فقط عدد قليل من الخلايا الإيجابية MSI1 في كل نقطة زمنية(الشكل 7)،في حين ظلت OLFM4 غير قابلة للكشف (البيانات غير مبينة). ومع ذلك، وكما لوحظ بالنسبة للCD44 وCD133، كانت الخلايا المسماة MSI1 موجودة على السطح الخارجي للفكويدات في هياكل تشبه سرداب أو تشبه برعم. كما تم تحليل نفس العلامات على مستوى الحمض النووي الريبي في نفس النقاط الزمنية بعد الثقافة في الأطباق المغلفة بال أغاروز. كما تم تضمين ألدهيد ديهيدروجيناز 1 (ALDH1a1)، وهو علامة مميزة جيدا من CSCs3940، في الدراسة (الشكل 8). تحليل برومينين-1(PROM1 ترميز لCD133) وCD44 mRNAs أكد التعبير عن كل علامات في كرويدات في جميع النقاط الزمنية تحليلها. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه في حين كانت مستويات بروم1 ميرنا متشابهة تماما مع مرور الوقت في الثقافة، انخفضت مستويات CD44 من D3 فصاعدا. غير أن الفرق كان كبيرا بشكل هامشي عند مقارنة مستويات الحمض النووي الريبي D10 وD3.

وأكد تحليل MSI1 مرنا تعبيره في كرويات في كل نقطة زمنية، مع مستويات أعلى بكثير في D3 و D5 مقارنة مع تلك الموجودة في D7 أو D10 (الشكل 8)، في حين لم يكن OLFM4 مرنا للكشف (لم يظهر). وأخيرا، تم التعبير عن ALDH1a1 مرنا في كرويات في كل نقطة زمنية وأظهرت لمحة التعبير التي انخفضت في D10، ومستويات يجري فقط هامشية كبيرة بالمقارنة مع تلك الموجودة في D3 (الشكل 8). للتحقق من صحة النموذج الجديد لدراسة بيولوجيا الخلايا السرطانية، تم تحليل الاستجابة للعلاج الكيميائي في كرويدات تعامل مع FOLFOX أو FOLFIRI، والعلاجات المركبة تدار بشكل روتيني لمرضى لجنة حقوق الطفل22،23،24،25. أولا ، تم فحص فعالية العلاجات في تحفيز موت الخلايا عن طريق احتضان كرويدات مع وصمة عار الحمض النووي الفلورية التي تدخل على وجه التحديد في الخلايا الميتة26. بالمقارنة مع شرط NT السيطرة، والعلاج مع كل من الأدوية تسبب موت خلية كبيرة تقاس بتراكم الفلورية(الشكل 9A). كما تم تأكيد هذه الملاحظة على المستوى المورفولوجي باستخدام المجهر الحي، والتي أظهرت أن العلاجات أثرت بشدة على حجم ومظهر الكرويات(الشكل 9B). وأخيرا، تم تحليل التعبير عن علامات SC/CSC بواسطة qRT-PCR في كرويات تحت نفس الشروط(الشكل 9C). ومن المثير للاهتمام، لوحظ انخفاض كبير في مستويات بروم1 ميرنا تحت كل من ظروف FOLFOX و FOLFIRI بالمقارنة مع مستويات السيطرة، في حين لم تتأثر مستويات MSI1 بالعلاجات. وعلاوة على ذلك، في حين لم يكن ل FOLFOX أي تأثير على التعبير ALDH1a1 مرنا مقارنة مع السيطرة، والعلاج مع FOLFIRI زيادة كبيرة في مستوياتها. لم يتم الكشف عن OLFM4 مرنا، وكانت مستويات الحمض النووي الريبي CD44 منخفضة للغاية (البيانات غير مبينة).

Figure 1
الشكل 1: إعداد الثقافات الكروية. (أ)تشكيل كروي بدأت من التركيزات المشار إليها من خلايا Caco2 per كروية / ميكروويل. تعرض اللوحة العلوية صورة تمثيلية للوحة ثقافة كاملة بعد يومين من الثقافة. تعرض اللوحة السفلية صورا ل لويلات دقيقة مختارة لكل حالة. تم التقاط الصور في التكبير 4x (حجم microwell: 400 ميكرومتر). أشرطة المقياس: التكبير المنخفض، 100 ميكرومتر؛ التكبير العالي، 30 ميكرومتر. (ب)خصائص النمو للكرويدات المتولدة من عدد مختلف من الخلايا لكل ميكروويل وتحليلها في نقاط زمنية مختلفة. لاحظ أن الأيام المشار إليها تشمل اليومين الأولين من الثقافة في microwells والثقافة اللاحقة للكرويدات المحصودة في لوحات مغلفة بال أغاروز. تظهر المدرجات التكرارية متوسط الانحراف المعياري ±، n = 4-6. تظهر الدوائر السوداء قيم كرويات فردية. تظهر صيغة الحجم المقدر في الجزء العلوي من اللوحة، حيث تشير D1 و d2 و d3 إلى الأقطار الثلاثة التي تقاس لكل كروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحسين ظروف تشكيل الكروية والثقافة. (أ)صور تمثيلية من كرويدات في D7 بعد شفائهم من microwells (2 أيام) والثقافة في أطباق المغلفة agarose (5 أيام)، وذلك باستخدام إعداد جيد جديد والثقافة الظروف المتوسطة. شريط المقياس: 30 ميكرومتر. (ب)الحجم التقديري للكرويدات الطازجة بعد يومين من بدء زراعة الخلايا في microwells. تظهر المدرجات التكرارية متوسط الانحراف المعياري ± (SD)، n = 4-6. تشير الدوائر السوداء إلى حجم كرويات فردية. (ج)الحجم المقدر للسفيرات في الثقافة طويلة الأجل على أساس الشروط المختارة حديثا. تظهر الرسوم البيانية خصائص نمو كرويات الخلايا المتولدة من عدد مختلف من الخلايا لكل كروية ويتم تحليلها في نقاط زمنية مختلفة بعد حصادها، كما هو مبين. تظهر المدرجات البيانية يعني ± SD، n = 6-10. تشير الدوائر السوداء إلى حجم كرويات فردية. (D) صور تمثيلية للخلايا المختارة 600 لكل حالة كروية على مدى الدورة الزمنية التجريبية (لوحات الحق) وداخل microwells (اللوحة اليسرى). تم التقاط الصور في التكبير 4x. أشرطة المقياس: التكبير المنخفض، 100 ميكرومتر؛ التكبير العالي، 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:توصيف الهستولوجية للشفرات. الهستولوجية هيماتوكسيلين واليوسين (H &؛ E) تلطيخ أقسام البارافين. صور تمثيلية للشفرات الكروية في النقاط الزمنية المشار إليها بعد الحصاد، كما هو مبين. خطوط منقط أسود في كل مجموعة تكبير عالية تعيين التجويف داخل spheroids. أشرطة المقياس: التكبير المنخفض، 30 ميكرومتر؛ تكبير عالي، 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:توصيف كروي Caco2 عن طريق التوسيل المناعي. التئاس المناعي للشفرات لعلامة الانتشار، مستضد الخلايا النووية المنتشرة (PCNA، الأحمر)، وعلامة موت الخلية، caspase تنشيط 3 (الأخضر) (الألواح اليسرى) وبالنسبة β كاتينين (الأحمر) (لوحات الحق) في الأوقات المشار إليها. تظهر الصور الوسم المدمج ل PCNA (الأحمر) ، والكاسباس المنشط 3 (الأخضر) ، والنوى (الأزرق) أو β-catenin (الأحمر) والنوى (الأزرق). تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا أو مجموعات من الخلايا تعبر عن مستويات عالية من β كاتينين. تم التقاط الصور بهدف 20x. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليل علامات التمايز enterocyte بواسطة QRT-PCR. تحليل ALPI وSLC2A5 ترميز الفوسفاتاز القلوية والبروتينات GLUT5، على التوالي. تظهر المدرجات التكرارية متوسط الانحراف المعياري ±، n = 3، بعد التطبيع ضد ACTB. يتم تمثيل البيانات كتغيير طية نسبة إلى الغشاء المخاطي للقولون العادي (الخط الأحمر = 1). NS: ليست كبيرة; MS: كبيرة بشكل هامشي مقارنة D3 بواسطة الطالب غير المدفوعةر-اختبار. المختصرات: qRT-PCR = تفاعل متسلسل كمي للنسخ العكسي-بوليمريز؛ GLUT5 = ناقل الجلوكوز 5; SLC2A5 = عائلة الناقل المذاب 2، البديل نسخة 2؛ ACTB = β-أكتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التعبير غير المتجانس لعلامات الخلايا الجذعية، CD44 و CD133، في كرويدات. 1- الاحتواء المناعي لعلامات الخلايا الجذعية CD133 و CD44 في الأوقات المشار إليها. تظهر الصور في اللوحات اليسرى وضع علامات مدمجة على CD133 (أخضر) ونوى (أزرق)؛ تظهر نفس الصور في اللوحات اليمنى وضع علامات مدمجة على CD44 (أحمر) ونوى (أزرق). تشير الأسهم الخضراء في اللوحات اليسرى إلى الخلايا المعبرة عن CD133، وتشير الأسهم البيضاء في كلا اللوحتين إلى خلايا أو مجموعات من الخلايا تعبر عن CD44 وCD133. تم الحصول على الصور بهدف 20x. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التعبير غير المتجانس لعلامة الخلايا الجذعية، MSI1، في كرويدات. 1- الاحتواء المناعي لعلامة الخلايا الجذعية MSI1 (أحمر) في الأوقات المشار إليها. تظهر الصور وضع علامات مدمجة على MSI1 (أحمر) ونوى (أزرق). خطوط منقط أبيض التأكيد على بعض الهياكل مثل سرداب حيث الخلايا إيجابية لMSI1 المناعة. تم التقاط الصور في التكبير 20x. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. اختصار = MSI1 = موساشي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8:تحليل علامات الخلايا الجذعية بواسطة qRT-PCR. تم إجراء القياس الكمي لمستويات PROM1و CD44 و MSI1 و ALDH1a1 على مرنا من كرويدات في الأوقات المشار إليها. تظهر المدرجات التكرارية متوسط الانحراف المعياري ±، n = 3، بعد التطبيع ضد ACTB. يتم تمثيل البيانات كتغيير طية نسبة إلى الغشاء المخاطي للقولون العادي (الخط الأحمر = 1). NS: ليست كبيرة; MS: هام بشكل هامشي مقارنة D3، وذلك باستخدام غيرمدفوعة الأجر الطالب ر-اختبار. *: P < 0.05 مقارنة D3 أو D5، وذلك باستخدام غيرمدفوعة الأجر الطالب ر-اختبار. المختصرات: qRT-PCR = تفاعل متسلسل كمي للنسخ العكسي-بوليمريز؛ PROM1 = برومينين-1; MSI1 = موساشي 1; ALDH1α1 = ألدهيد ديهيدروجيناز 1 ألفا; ACTB = β-أكتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: تأثير العلاج الكيميائي على كرويات. بعد الحصاد من microwells ، تم استزراع كرويدات في لوحات مغلفة بالgarose وعولجت لمدة 3 أيام مع FOLFOX أو FOLFIRI أو تم الحفاظ عليها في حالة (التحكم) غير المعالجة (NT). (أ)تحليل الفلورسينس بسبب وضع العلامات على الحمض النووي في الخلايا الميتة. تظهر المدرجات التكرارية متوسط الانحراف المعياري ± (SD)، n = 4. (ب) السمات المورفولوجية للشفرات التي يتم الحفاظ عليها في ظروف ثقافية مختلفة. تم التقاط الصور مع هدف 4X. شريط المقياس: 400 ميكرومتر. (ج)القياس الكمي ل PROM1 وMSI1 و ALDH1a1 mRNAs بواسطة qRT-PCR. تظهر المدرجات البيانية يعني ± SD، n = 4، بعد التطبيع ضد ACTB. *: NS: ليست مهمة؛ ف < 0.05؛ **: P < 0.01؛ P < 0.001 مقارنة بشرط عنصر التحكم (NT) باستخدام اختبار t-الطالبغير المدفوع. الاختصارات: FOLFOX = 5-فلوروراسيل، 50 ميكروغرام/مل؛ أوكساليبلاتين، 10 ميكروغرام/مل؛ ليوكوفورين, 25 ميكروغرام / مل ; FOLFIRI = 5-فلوروراسيل، 50 ميكروغرام/مل؛ إيرينوتيكا، 100 ميكروغرام/مل؛ ليوكوفورين، 25 ميكروغرام/مل؛ qRT-PCR = النسخ العكسي الكمي-البوليميراز سلسلة من ردود الفعل; PROM1 = برومينين-1; MSI1 = موساشي 1; ALDH1α1 = ألدهيد ديهيدروجيناز 1 ألفا; ACTB = β-أكتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العدد المطلوب من الخلايا لكل كروية العدد المطلوب من الخلايا لكل بئر
50 6 × 104
100 1.2 × 105
200 2.4 × 105
300 3.6 × 105
400 4.8 × 105
500 6 × 105
600 7.2 × 105
700 8.4 × 105
800 9.6 × 105
1000 1.2 × 106
2000 2.4 × 106

الجدول 1: ملخص لتشكيل كروي وبذر الخلية.

أطباق 10 مم 6 لوحات الآبار 12 لوحة بئر 24 لوحة بئر 96 لوحة بئر
حجم الطلاء 4 مل 300 ميكرولتر 250 ميكرولتر 150 ميكرولتر 50 ميكرولتر (لأسفل وأعلى)

الجدول 2: كميات من محلول الآغاروز لطلاء لوحات مختلفة / أطباق.

جينات الاشعال تسلسل طول المنتج
علامات التمايز ألبي أمامي CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA 81
عكس ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT
SLC2A5 أمامي TAC CCA TAC TGG AAG غات الجمعية العامة 94
عكس AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG
علامات الخلايا الجذعية ALDH1a1 أمامي مجلس التعاون الخليجي TTC ACA GGA TCA ACA GAG 147
عكس TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC
MSI1 أمامي AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA 131
عكس TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG
PROM1 أمامي GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG 131
عكس مجلس التعاون الخليجي TTG TCC TTG GTA GTG TTG
CD44 أمامي TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC 160
عكس TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT
OLFM4 أمامي TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC 118
عكس ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT
جينات التدبير المنزلي ACTB أمامي كاك القط TGG CAA TGA GCG GTT C 134
عكس AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T
مؤشر أسعار المنتجين أمامي ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT 100
عكس مجلس التعاون الخليجي CGT AGT GCT TCA GTT TG

الجدول 3: التمهيديات المستخدمة في النسخ العكسي الكمي - البوليميراز سلسلة من ردود الفعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في المختبر نماذج 3D التغلب على العيوب التجريبية الرئيسية من ثقافات الخلايا السرطانية 2D، كما يبدو أنها أكثر موثوقية في تلخيص الميزات السرطانية النموذجية بما في ذلك البيئة الدقيقة وتغايرية الخلايا. النماذج ثلاثية الأبعاد الشائعة الاستخدام للكرويدات خالية من السقالات (مثقفة في ظروف منخفضة التعلق) أو تعتمد على السقالة (باستخدام المواد الحيوية لخلايا الثقافة). هذه الأساليب تقدم مساوئ مختلفة لأنها تعتمد على طبيعة السقالة المستخدمة أو تؤدي إلى كرويدات متغيرة في الهيكل والحجم.

يقدم البروتوكول الحالي تقارير عن الظروف المحسنة لإنتاج كرويدات متجانسة من خط خلايا الورم الغدي القولوني ، Caco2 ، باستخدام طريقة خالية من السقالات. يتم حصادها بسهولة كرويدات وخلافا لدراسة ذكرت سابقا41، فإنها تنمو بنجاح وخصائص نموها خلال الفترة في الثقافة ويمكن أيضا تحليلها. وعلاوة على ذلك، مع هذه الطريقة الجديدة، فإن كرويدات (أ) تتكاثر بنشاط، (ب) تقدم معدل منخفض جدا من موت الخلايا، (ج) تنظيم لتشكيل التجويف داخل المجالات، و (د) تظهر قدرة التمايز من الخلايا المكونة. وبالنظر إلى أن الهدف النهائي للنهج الجديد هو استخدامه للدراسات المتعلقة ببيولوجيا لجنة الدراسات العليا، فقد تم تحليل التعبير عن علامات مختلفة لمراكز الدراسة المغلقة. ومن المثير للاهتمام أن العلامات قدمت نمط تعبير ديناميكي اعتمادا على النقطة الزمنية وحددت مجموعات سكانية مختلفة من CSC.

من الأهمية بمكان ، يمكن استخدام كرويدات ولدت من خلال هذا البروتوكول لتحليل الأدوية ذات الصلة للتطبيقات السريرية مثل أنظمة العلاج الكيميائي ، FOLFOX وFOLFIRI. تؤكد النتائج أيضا استجابة غير متجانسة للخلايا للأدوية اعتمادا على علامة CSC التي تم تحليلها. هذه الملاحظة تتفق مع الرأي الحالي بأن مجموعات الخلايا غير المتجانسة والمتعددة الشبيهة ب CSC داخل الأورام تظهر خصائص متنوعة للحساسية الكيميائية / العلاج الكيميائي42،43. هذه النتيجة قوية قوية انطباق هذه الطريقة الجديدة للفحص على نطاق واسع. بالإضافة إلى التطبيقات المبلغ عنها في هذه الدراسة، يمكن استخدام البروتوكول الجديد أيضا لمجموعة أوسع من التحليلات (مثل الحمض النووي الريبي و/أو استخراج الحمض النووي الريبي والتحليلات واسعة النطاق، والنشاف الغربي، وفلورية المناعة). في الواقع ، يمكن تحديد حجم كرويات وخصائص النمو بسهولة من خلال تطبيق صيغة حجم الكرة التي ، إذا لزم الأمر ، تأخذ في الاعتبار أيضا أقطار مختلفة لموازنة الانحرافات عن شكل كروي تماما. ومع ذلك، يجب تحسين معلمات معينة استنادا إلى نوع الخلية (خط الخلية أو الثقافات الأساسية الجديدة) وقدرة النمو مثل وقت النسخ المتماثل. ومع ذلك، يشير البروتوكول إلى خطوات حاسمة يمكن تعديلها بسهولة.

بعض النقاط التي تثير القلق تحتاج إلى النظر عند تنفيذ جيل كروي وصفها في هذه المقالة. أولا، ينبغي تنفيذ عدة خطوات غسل مع حل الشطف المضادة للالتزام لتعزيز تجانس وضغط المجالات. في هذه الحالة، كان من الضروري غسل اثنين. ثانيا، يجب إزالة الفقاعات من microwells لأن هذا يمكن أن يزعج التكوين الصحيح للكرويدات. ثالثا، بمجرد أن تزرع الخلايا في كل ميكروويل بعد خطوة الطرد المركزي، يجب أن تبقى اللوحة دون عائق لمدة يومين. هناك حاجة إلى اعتبارات إضافية وتغييرات في البروتوكول عند دراسة الخطوات المبكرة لتشكيل كروية ، وربما بما في ذلك نظام التصور والتصوير الآلي. رابعا، تغيير الوسط دون إزعاج كرويات، نظرا لأنها في تعليق، يمكن أن يكون تحديا. ومن ثم، فمن المستحسن تغيير نصف وحدة التخزين فقط في كل مرة. خامسا، عند حصاد كرويدات، من المهم الحفاظ على هيكلها. ومن ثم ، ينصح باستخدام ماصة المصل أو micropipettes مع نصائح قطع لجميع خطوات الاستغناء بعد الشطف في المتوسطة التي تحتوي على المصل أو برنامج تلفزيوني لمنع كرويدات من التمسك نصائح.

قد تواجه بعض القيود أيضا عند استخدام هذا البروتوكول. أولا، ليس كل خطوط الخلايا أو أنواع الخلايا لها نفس معلمات الثقافة؛ في بعض الحالات، قد يؤثر عدم تجانس الخلايا وعدد المقاطع/ شيخوخة الخلايا أيضا على القدرة على تكوين كرويات. ثانيا، خلافا ل organoids، قد يكون من الصعب الحفاظ على كرويدات لفترة طويلة جدا في الثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تكرارها عن طريق تجزئة بسيطة من خلال طرف micropipette15. ثالثا، لا يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحليل أحادية كروية لأن استرداد كرويات يدويا واحدا تلو الآخر يمكن أن يكون صعبا. هذه التقنية هي أكثر ملاءمة للحصول على كميات عالية من كرويات متجانسة في نفس الوقت. وأخيرا، بالنسبة للدراسات التي تبحث في آثار عوامل النمو الناشئة عن أنواع الخلايا الأخرى أو تحليل أهمية البيئة الدقيقة، سيكون من المهم إثراء النموذج وإجراء تجارب الثقافة المشتركة.

في الختام، تصف المنهجية الحالية بروتوكولا جديدا لتوليد واستزراع كرويدات من خلايا Caco2 بكفاءة. وتبين النتائج أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على دراسة عدم تجانس الورم وتحليل CSCs. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لفحص الأدوية عالية الإنتاجية ودراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية في السرطان والخلايا غير السرطانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

Acknowledgments

نحن نعترف بمنصات التصوير ومنصات علم الأنسجة Anipath (CRCL، CLB). نحن مدينون لصيدلية مستشفى سنتر ليون بيرارد (CLB) لهدية من نوع FOLFOX وFOLFIRI. كما نشكر بريجيت مانشيب على القراءة النقدية للمخطوطة. تم دعم العمل من قبل FRM (Equipes FRM 2018 و DEQ20181039598) والإنكا (PLBIO19-289). وتلقت مجموعة MVG وLC الدعم من FRM وCF تلقى الدعم من مؤسسة ARC ومركز ليون بيرارد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 µm Reversible Strainer, Large  STEMCELL Technologies 27250 To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) - stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose  Sigma A9539
Aggrewell 400 24-well plates STEMCELL Technologies 34411 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit Cell Signaling 9661 dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat eBioscience/Thermo Fisher 14-9896-82 dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL STEMCELL Technologies 07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat Invitrogen 14-133-82 dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit Abcam ab157107 dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse Dako M0879 dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse Santa Cruz Biotechnology sc-7963 dilution 1:50
Black multiwell plates Thermo Fisher Scientific 237108
Citric Acid Monohydrate Sigma C1909
CLARIOstar apparatus  BMG Labtech microplate reader
Dako pen marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21202 dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A10037 dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21206 dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A10042 dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Gibco 10569010
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI Interchim FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11077 dilution 1:1000
ImageJ software Spheroid image analysis
Irinotecan  Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase  Bio-Rad 1708891
Leucovorin Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit Macherey-Nagel 740902 .250
Oxaliplatin Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin Gibco 15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco 14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) Takara RR420B
SYTOX- Green Thermo Fisher Scientific S7020 nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %) Gibco 25300062
Zeiss-Axiovert microscope inverted microscope for acquiring images of spheroids

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
  3. Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
  4. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
  5. Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
  6. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  7. Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
  8. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  9. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  10. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
  11. Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
  12. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  13. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  14. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  16. Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  17. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  18. Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
  19. Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
  20. Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
  21. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
  22. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  23. Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
  24. Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
  25. Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
  26. Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
  27. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  28. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  29. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
  30. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  31. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  32. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
  33. Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
  34. van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
  35. Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
  36. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  37. Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
  38. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  39. Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
  40. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  41. Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
  42. Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
  43. Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 167، خلايا كاكو2، الخلايا الجذعية السرطانية، انتشار الخلايا، سرطان القولون، المستعمرات، نمو المستعمرات
نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Giolito, M. V., Claret, L., Frau,… More

Giolito, M. V., Claret, L., Frau, C., Plateroti, M. A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells. J. Vis. Exp. (167), e61783, doi:10.3791/61783 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter