Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En tredimensionell modell av sfäroider för att studera tjocktarmscancerstamceller

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/61783
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

Summary

Detta protokoll presenterar ett nytt, robust och reproducerbart odlingssystem för att generera och odla tredimensionella sfäroider från Caco2 kolon adenocarcinom celler. Resultaten ger det första proof-of-concept för lämpligheten av detta tillvägagångssätt för att studera cancer stamcellsbiologi, inklusive svaret på kemoterapi.

Abstract

Kolorektal cancer kännetecknas av heterogenitet och en hierarkisk organisation som består av en population av cancerstamceller (CSCs) som ansvarar för tumörutveckling, underhåll och resistens mot läkemedel. En bättre förståelse för CSC egenskaper för deras specifika inriktning är därför en pre-nödvändiga för effektiv terapi. Det finns dock en brist på lämpliga prekliniska modeller för djupgående undersökningar. Även om in vitro tvådimensionella (2D) cancer cellinjer ger värdefulla insikter i tumör biologi, replikerar de inte fenotypiska och genetiska tumör heterogenitet. Däremot adresserar och reproducerar tredimensionella (3D) modeller nära fysiologisk cancerkomplexitet och cell heterogenitet. Syftet med detta arbete var att utforma ett robust och reproducerbart 3D-odlingssystem för att studera CSC-biologi. Den nuvarande metoden beskriver utveckling och optimering av villkor för att generera 3D-sfäroider, som är homogena i storlek, från Caco2 kolon adenocarcinom celler, en modell som kan användas för långsiktig kultur. Viktigt, inom sfäroiderna, cellerna som var organiserade runt lumen-liknande strukturer, kännetecknades av differentiella cell spridning mönster och av förekomsten av CSCs uttrycker en panel av markörer. Dessa resultat ger det första proof-of-concept för lämpligheten av denna 3D-metod för att studera cell heterogenitet och CSC biologi, inklusive svaret på kemoterapi.

Introduction

Kolorektal cancer (CRC) är fortfarande den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i världen1. Utvecklingen av CRC är resultatet av ett progressivt förvärv och ackumulering av genetiska mutationer och/eller epigenetiska förändringar2,3, inklusive aktivering av onkogenes och inaktivering av tumör suppressor gener3,4. Dessutom kan icke-genetiska faktorer (t.ex. mikromiljön) bidra till och främja onkogen omvandling och därmed delta i utvecklingen av CRC5. Viktigt är att CRC består av olika cellpopulationer, inklusive odifferentierade CSC och bulktumörceller som uppvisar vissa differentieringsegenskaper, som utgör en hierarkisk struktur som påminner om epitelens organisation i en normal kolonkryp6,7.

CSCs anses vara ansvariga för tumör utseende8,dess underhåll och tillväxt, ögonbevarande kapacitet och resistens mot konventionella terapier6,7. Inom tumörer uppvisar cancerceller, inklusive CSCs, en hög nivå av heterogenitet och komplexitet när det gäller deras distinkta mutations- och epigenetiska profiler, morfologiska och fenotypiska skillnader, genuttryck, metabolism, spridningshastigheter och metastaserad potential9. Därför, för att bättre förstå cancerbiologi, tumörprogression och förvärv av resistens mot terapi och dess översättning till effektiva behandlingar, är mänskliga prekliniska modeller som fångar denna cancer heterogenitet ochhierarki viktiga 10,11.

In vitro 2D-cancercelllinjer har använts under lång tid och ger värdefulla insikter om tumörutveckling och de mekanismer som ligger till grund för effekten av terapeutiska molekyler. Deras begränsning med avseende på bristen på fenotypisk och genetisk heterogenitet som finns i de ursprungliga tumörerna är nu allmänt erkänd12. Dessutom reproduceras inte näringsämnen, syre, pH-gradienter och tumörmikromiljön, mikromiljön är särskilt viktig för upprätthållandet av olika celltyper inklusive CSCs11,12. För att övervinna dessa huvudsakliga nackdelar har flera 3D-modeller utvecklats för att experimentellt ta itu med och reproducera cancerns komplexitet och heterogenitet. I själva verket rekapitulerar dessa modeller tumörcellulär heterogenitet, cellcellsinteraktioner och rumslig arkitektur, liknande de som observerats in vivo12,13,14. Primära tumör organoider etablerade från färska tumörer, liksom cellinje-härledda sfäroider, används tillstor del 15,16.

Sfäroider kan odlas på ett byggnadsställningsfritt eller byggnadsställningsbaserat sätt för att tvinga cellerna att bildas och växa i cellaggregat. Byggnadsställningar-fria metoder är baserade på odling av celler under icke-vidhäftande förhållanden (t.ex. hängande droppe-metoden eller ultralåga fästplattor), medan byggnadsställningsbaserade modeller förlitar sig på naturliga, syntetiska eller hybridbiomaterial till odlingsceller12,13,14. Byggnadsställningsbaserade sfäroider uppvisar olika nackdelar eftersom den slutliga sfäroidbildningen beror på arten och sammansättningen av det (bio)material som används. Även om de byggnadsställningsfria sfäroidmetoderna som hittills finns tillgängliga inte förlitar sig på substratets natur, genererar de sfäroider som varierar i struktur och storlek17,18.

Detta arbete syftade till att utforma ett robust och reproducerbart 3D-odlingssystem av sfäroider, som är homogena i storlek, bestående av Caco2 kolon adenocarcinom celler för att studera CSC biologi. Caco2 celler är av särskilt intresse på grund av deras förmåga att skilja övertid 19,20, starkt tyder på en stamliknande potential. Följaktligen visade långsiktiga kultur av sfäroider förekomsten av olika CSC populationer med olika svar på kemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Uppgifterna om alla reagenser och material anges i materialförteckningen.

1. Sfäroidbildning

  1. Sfäroid kultur media
    1. Förbered basalt medium bestående av Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 4 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid.
    2. Förbered DMEM komplett medium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (Penna/Strep) i basal medium från steg 1.1.1.
    3. Förbered DMEM/ källarmembranmatrismedium som innehåller 2,5% källarmembranmatris, 10% FBS och 1% Penna / Strep i basalt medium från steg 1.1.1.
  2. Beredning av plattor för sfäroidbildning
    1. Varm basal och DMEM/källarmembranmatrismedium vid rumstemperatur (RT) i ca 20 min.
    2. Förbehandla brunnarna på en 24-brunnsplatta avsedd för sfäroidbildning genom att tillsätta 500 μL anti-adherence sköljlösning till varje brunn.
      OBS: I dessa plattor består varje brunn av 1 200 mikrobrunnar.
    3. Centrifugera plattan på 1 200 × g i 5 min i en svängande skopanrotor med adaptrar för plattor.
      OBS: Om endast en platta används, förbered ytterligare en standardplatta fylld med vatten för att balansera vikten.
    4. Skölj varje brunn med 2 ml varmt basalt medium och aspirera mediet från brunnarna.
    5. Observera plattan under mikroskopet för att säkerställa att bubblorna har avlägsnats helt från mikrobrunnarna. Om bubblor förblir fångade, centrifug igen vid 1200 × g i 5 minuter för att eliminera bubblorna.
    6. Upprepa sköljstegen 1.2.4-1.2.5.
    7. Tillsätt 1 ml varmt DMEM/källarmembranmatrismedel till varje brunn.
  3. Generering av sfäroider
    1. Odla Caco2-cellerna i ett 2D-monoskikt i DMEM-medium kompletterat med 10% FBS och 1% Penna/Strep vid 37 °C i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO2 (nedan kallad 37 °C/5% CO2).
      OBS: Det maximala antalet cellpassager som ska användas är 80.
    2. När 80% av sammanflödet uppnås, tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 1x (5 ml för en 10 cm skål), tillsätt trypsin-etylendiamintetraättikasyra (EDTA) (2 ml för en 10 cm skål) och inkubera i 2-5 min vid 37 °C/5% CO2.
    3. Kontrollera cellavlossningen under mikroskopet och neutralisera trypsin genom att tillsätta 4 ml DMEM komplett medium per 10 cm skål.
    4. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer för att bestämma det totala antalet celler.
    5. Centrifugera cellupphängningen vid 1 200 × g i 5 minuter. Kassera supernatanten och återanvänd pelleten i en lämplig volym DMEM/källarmembranmatrismedium.
    6. Se tabell 1 för att bestämma antalet celler som krävs per brunn för att uppnå önskat antal celler per mikrobrunn. Alternativt kan du beräkna antalet celler med hjälp av följande formel för en 24-brunnsplatta, med tanke på att varje brunn innehåller 1 200 mikrobrunnar
      Önskat antal celler per brunn = Önskat antal celler per mikrobrunn × 1 200
    7. Tillsätt önskad volym för cellupphängningen till varje brunn för att uppnå önskat cellnummer i en slutlig volym på 1 ml.
    8. Tillsätt 1 ml DMEM/källarmembranmatrismedel till varje brunn för att nå den slutliga volymen på 2 ml per brunn (se även steg 1.2.7).
      OBS: Var försiktig så att du inte för in bubblor i mikrobrunnarna.
    9. Centrifugera plattan omedelbart på 1 200 × g i 5 minuter för att fånga cellerna i mikrobrunnarna. Motvikta vid behov centrifugen med en standardplatta fylld med vatten.
    10. Observera plattan under mikroskopet för att kontrollera att cellerna är jämnt fördelade mellan mikrobrunnarna.
    11. Inkubera plattan vid 37 °C/5% CO2 i 48 timmar utan att störa plattan.
      OBS: Enligt det ursprungliga protokollet21, även om många cellinjer kan bilda sfäroider inom 24 timmar, kräver vissa en längre inkubationstid. I detta protokoll är 48 h tillräckliga för sfäroidbildning.
  4. Skörda sfäroiderna från mikrobrunnarna
    1. Värm basal- och DMEM/källarmembranmatrismediet på RT i cirka 20 min.
    2. Använd en serologisk pipett, ta bort hälften av odlingsmediet (1 ml) från varje brunn.
    3. Tillsätt mediet tillbaka på brunnens yta för att lossa sfäroiderna från mikrobrunnarna.
      OBS: Rör eller triturera inte sfäroiderna.
    4. Placera en vändbar sil på 37 μm (eller en 40 μm standardsil) ovanpå ett koniskt rör på 15 ml för att samla upp sfäroiderna.
      OBS: Om du använder en 40 μm standardsil, placera den upp och ner.
    5. Aspirera försiktigt de rubbade sfäroiderna (från steg 1.4.3) och passera den sfäroida suspensionen genom silen.
      OBS: Sfäroiderna kommer att finnas kvar på filtret; enstaka celler kommer att flöda igenom med mediet.
    6. Använd en serologisk pipett, dispensera 1 ml av det varma basala mediet över hela brunnens yta för att lossa eventuella återstående sfäroider och återställa dem på silen.
    7. Upprepa detta tvättsteg 1.4.6 två gånger.
    8. Observera plattan under mikroskopet för att säkerställa att alla sfäroider har avlägsnats från mikrobrunnarna. Upprepa tvätten om det behövs (steg 1.4.6-1.4.7).
    9. Vänd silen och placera den på ett nytt 15 ml koniskt rör. Samla sfäroiderna genom att tvätta silen med DMEM / källarmembranmatrismedel.
      OBS: De insamlade sfäroiderna är redo för nedströmsapplikationer och analyser.
  5. Långsiktig kultur av sfäroider
    1. Förbered 1,5% agaroslösning i basalt medium och sterilisera den genom autoklavering (standardcykel).
    2. Medan agaroslösningen är varm och fortfarande flytande, täck brunnarna på vanliga odlingstallrikar eller rätter, enligt beskrivningen i tabell 2.
      OBS: Uppvärmning av skålen/plattan i ugnen underlättar beläggningssteget. Belagda tallrikar/tallrikar kan lämnas på RT i upp till 10 dagar i steril miljö och skyddas mot ljuset.
    3. Frö de skördade sfäroiderna (från steg 1.4.9) i de agarosbelagda plattorna och tillsätt DMEM/ källarmembranmatrismedium för att uppnå den slutliga volymen beroende på plattans storlek.
      OBS: För att undvika sfäroidaggregat, så dem med optimal densitet av 22 sfäroider/cm2. Observera att beläggningen inte är helt platt, och den stiger mot kanten, vilket skapar en lätt konkavitet i mitten av plattan. Om antalet sfäroider är för högt är de mer benägna att hålla sig till varandra.
    4. Inkubera plattan vid 37 °C/5% CO2 tills sfäroiderna har återhämtats för specifika analyser.
  6. Behandling av sfäroider med kemoterapeutiska läkemedel
    1. Plattsfäroider från steg 1.5.4 och odla dem i 2 dagar. Från dag 3 (D3), behandla dem med FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Irinotecan, 100 μg/ml; Leucovorin, 25 μg/ml) eller med FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Oxaliplatin, 10 μg/ml; Leucovorin, 25 μg/ml) kemoterapeutiska regimkombinationer som rutinmässigt används för att behandla CRC-patienter 22,23,24,25, eller upprätthålla dem i (kontroll) inte behandlade (NT) tillstånd.
    2. Samla sfäroiderna efter 3 dagars behandling genom att använda en pipett med spetsen avskuren (1 000 μL-spets), vilket säkerställer att varje tillstånd representeras av minst tre replikat. Centrifug dem på 1000 × g i 3 min och ta sedan bort supernaten.
    3. Fixera pelletsen i 2% paraformaldehyd (PFA) för histologisk analys (se avsnitt 3) eller använd pelletsen för RNA-extraktion (se avsnitt 4).
    4. För att analysera celldöd, inkubera sfäroiderna från steg 1.6.1 i svarta kulturbrunnplattor i DMEM / källarmembranmatrismedium i 30 minuter med en nukleinsyrafläck (1:5000 utspädning) som inte genomsyrar levande celler, men tränger in i de komprometterade membranen i döda celler26. Mät ackumuleringen av fluorescens med en mikroplåtläsare.

2. Övervakning av sfäroid tillväxt

  1. Använd ett inverterat mikroskop, förvärva representativa bilder av sfäroider som upprätthålls under olika förhållanden under dagarna i kulturen.
  2. Analysera bilderna genom att mäta tre olika representativa diametrar för varje sfäroid med lämplig programvara.
  3. Använd följande formel för att hämta den uppskattade sfärvolymen.
    Equation 1

    OBS: Termerna d1, d2 och d3 är sfäroidens tre diametrar.

3. Immunofluorescens (IF) och histologisk färgning

  1. Fixering och paraffinininbäddning
    1. Samla sfäroiderna vid valda tidpunkter med en pipett med spetsen avskuren enligt beskrivningen i steg 1.6.2 och fixa dem i 30 minuter på RT i 2% PFA.
      OBS: Förvara proverna i detta steg vid 4 °C tills de används vidare.
    2. För paraffin inbäddning, tvätta sfäroiderna 3x med PBS 1x och återanvänd dem i 70% etanol. Efter paraffininkludering och sektionering, utför hematoxylin & eosin (H&E) färgning för histologisk analys.
  2. Immunolabeling av paraffinsektioner
    OBS: Använd 5-μm tjocka sektioner för indirekt immunstaining.
    1. Inkubera diabilder vid 60 °C i 2 timmar för att smälta vaxet och förbättra avparaffiniseringen.
    2. Tvätta rutschkanorna två gånger i 3 min i metylcyklohexan.
    3. Tvätta rutschkanorna i 3 min i 1:1 metylcyklohexan:100% etanol.
    4. Tvätta rutschkanorna två gånger i 3 min i 100% etanol.
      OBS: Utför alla manipuleringar för steg 3.2.2 till steg 3.2.4 i en kemisk huva.
    5. Tvätta rutschkanorna i 3 min i 90% etanol.
    6. Tvätta rutschkanorna i 3 min i 75% etanol.
    7. Tvätta rutschkanorna i 3 min i 50% etanol.
    8. Tvätta rutschkanorna under kranvatten.
    9. Återfukta rutschkanorna i destillerat vatten i 5 minuter.
    10. Förbered 700 ml 0,01 M citratbuffert, pH 6,0, och tillsätt den i en lämplig behållare (bredd: 11,5 cm, längd: 17 cm, höjd: 7 cm); dränk rutschkanorna i den. Värm behållaren i mikrovågsugnen i 9-10 min vid 700 W, och när kokningen börjar, minska strömmen till 400-450 W. Inkubera i ytterligare 10 minuter.
    11. Låt bilderna svalna i bufferten till RT i cirka 30-40 minuter.
    12. Tvätta rutschkanorna två gånger i PBS i 5 minuter.
    13. Rita en cirkel runt sektionerna med en markörpenna för att skapa en barriär för vätskor som appliceras på sektionerna.
    14. Inkubera varje sektion med 50 μL blockeringsbuffert (10% normalt getserum, 1% bovint serumalbumin (BSA) och 0,02% Triton X-100 i PBS) i minst 30 minuter vid RT.
    15. Ta bort blockeringsbufferten och tillsätt 50 μL primära antikroppar som späds ut i inkubationsbufferten (1% normalt getserum, 0, 1% BSA och 0, 02% Triton X-100 i PBS). Inkubera i 2 timmar vid RT eller över natten vid 4 °C.
    16. Ta bort de primära antikropparna och tvätta bilderna 3x i PBS i 5 minuter.
    17. Inkubera diabilderna med 50 μL fluorescerande sekundära antikroppar som späds ut i inkubationsbufferten i 1 timme vid RT.
    18. Ta bort de sekundära antikropparna och tvätta bilderna 3x i PBS i 5 minuter.
    19. Tillsätt 50 μL monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-fenylindole till varje sektion och placera ett glaslock över sektionen.

4. RNA-extraktion, omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) och kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Samla sfäroider vid olika tidpunkter, varje punkt representeras av minst tre replikat. Centrifug dem på 1000 × g i 3 min och ta sedan bort supernaten.
    OBS: Pellets kan användas direkt för RNA-extraktion eller lagras vid -20 °C tills vidare användning.
  2. Isolera det totala RNA med hjälp av ett kommersiellt RNA-isoleringskit, enligt tillverkarens instruktioner.
  3. Omvänd transkribera 500 ng av varje RNA-prov till kompletterande DNA (cDNA) med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner.
  4. Efter omvänd transkription, utför en PCR-analys på 1 μL cDNA för att förstärka en hushållningsgen med primers belägna i olika exoner.
    OBS: Detta steg möjliggör verifiering av frånvaron av genomisk DNA-kontaminering i RNA-preparaten. För detta protokoll användes peptidylprolyl isomerasE B(PPIB) primers.
  5. Utför qPCR-förstärkning på 4 μL tidigare utspädd cDNA (1:10 i RNAse-fritt dubbeldestillerat vatten) med hjälp av primers som är specifika för de gener av intresse. I varje prov kvantifierar du specifika mRNA-uttryck med hjälp av ΔΔCt-metoden och värden som normaliserats mot en hushållningsgennivå.
    OBS: För detta protokoll valdes β-actin(ACTB). Primers som används i det här protokollet listas i tabell 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eftersom bristen på homogenitet i storleken på sfäroider är en av de främsta nackdelarna med för närvarande tillgängliga 3D-sfäroidkultursystem13, var syftet med detta arbete att inrätta ett tillförlitligt och reproducerbart protokoll för att erhålla homogena sfäroider. För det första, för att fastställa idealiska arbetsförhållanden testades olika antal Caco2-celler, allt från 50 till 2 000 celler per mikrowell / sfäroid med dedikerade plattor (Tabell 1). I själva verket innehåller varje brunn i dessa plattor 1 200 mikrobrunnar, vilket möjliggör bildandet av samma antal sfäroider per brunn, och ännu viktigare, bildandet av en sfäroid per mikrobrunn21. Efter två dagars kultur växte brunnarna som innehöll 2 000 celler per sfäroid som monoskikt, och 50 celler per sfäroid gav upphov till små och icke-homogena sfäroider (Figur 1A). Dessa två villkor uteslöts därför från ytterligare analyser. För att etablera långsiktiga kulturer skördades sfäroider från mikrobrunnarna och såddes under icke-vidhäftande förhållanden i nyberedda agarosebelagda plattor. Sfäroid tillväxt övervakades sedan under hela den experimentella tidskursen genom att mäta volymförändringen. För att ta hänsyn till den icke-sfäriska formen mättes tre olika diametrar av varje sfäroid och volymformelntillämpades 27 (figur 1B). Sfäroider som genererades från 100 och 200 celler behöll sin ursprungliga storlek under hela experimentet, medan de som innehöll 1 000 celler upplöstes under skörden på grund av deras stora storlek och följaktligen presenterade mer variation i volymen. Därför, som sfäroider som härrör från 500 celler visade den mest homogena ökningen i storlek över den experimentella tidsförhöjningen, användes detta antal celler för sfäroidbildning.

För det andra, förutom 500 celler per sfäroid, studerades ytterligare cellnummer från 300 till 800 celler. För att förbättra de icke-vidhäftande förhållandena ändrades det ursprungliga protokollet genom att förbehandla brunnarna två gånger i stället för att bara applicera en tvätt. En förbättring av sfäroid homogenitet och komprimering observerades med dessa förändringar (figur 2A). Storleken på sfäroiderna i varje tillstånd mättes vid tidpunkten för skörden (figur 2B), och deras långsiktiga tillväxt övervakades under dagarna i kulturen i agarosebelagda rätter (Figur 2C). Baserat på resultaten bekräftades 500 och 600 celler/sfäroid som de optimala förhållanden som ger god tillväxt och låg variabilitet. På grund av den mer homogena tillväxtprofilen under hela den experimentella tidskursen och de kompakta strukturerna som bildades valdes 600 celler per sfäroid som cellnummer för efterföljande experiment. Slutligen, för att ytterligare förbättra protokollet, kompletterades DMEM komplett medium med 2,5% av källaren membran matris, som innehåller ytterligare tillväxtfaktorer och en stor panel av extracellulära matrisproteiner28. Faktum är att sfäroidens multilobulära form kan bero på bristen på signaler från mikromiljön som kan ha påverkat cellpolariseringen29,30. Tillsatsen av källarmembranmatris ökade sfäroidtillväxten och förbättrade deras homogenitet (Figur 2D). Ett exempel på denna förbättring kan ses för 500 celler per sfäroid. I avsaknad av källarmembranmatrisen (Figur 1B) var storleken på sfäroiderna mer heterogen, fördubblades från D3 till D7 och nådde sedan en platå. Men i närvaro av källarmembranmatrisen (Figur 2C) var storleken på sfäroiderna vid varje tidpunkt mer homogen och ökade proportionellt över tiden.

För att analysera långsiktiga funktioner i sfäroiderna, de återfanns vid olika tidpunkter efter kultur i agarose-belagda rätter för detaljerade histologiska och OM analyser på paraffin avsnitt. H&E färgning visade att celler inom sfäroider genomgick förändringar i deras organisation och form över tid. Faktum är att celler var tätt arrangerade i multilayers på D3, medan tillplattade celler arrangerade i monolayers var tydligt synliga på D10. Intressant nog, som indikeras av de svarta prickade linjerna i bilderna, uppträdde en lumen inom sfäroiderna från D5 och framåt (Figur 3). Parallellt analyserades cellproliferation och apoptos av IF med hjälp av spridningsmarkören, prolifererande cell nukleära antigen (PCNA) och celldödsmarkören, aktiverad caspase 3. Märkning för PCNA visade att prolifererande celler ofta var närvarande vid sfäroidernas yttre yta, ibland i kryptliknande eller knoppliknande strukturer som påminner om organoidkulturer15. Dessutom observerades en tydlig ökning av PCNA-positiva celler vid D5 och D7 som minskade med D10(figur 4, vänster paneler). Överraskande observerades aktiverad caspase 3 i mycket få celler i sfäroiderna vid både D3 och D5 (figur 4, vänster paneler) och under längre tidsperioder (data visas inte). Uttryck mönstret för β-catenin utvärderades också i paraffin avsnitt. Intressant nog observerades höga nivåer β-catenin uttryck vid varje tidpunkt med tydlig membran-bundna och cytoplasmic färgning(figur 4, rätt paneler). Det är värt att notera att membranbundet β-catenin deltar i cellcells vidhäftning genom att binda till E-cadherin31. En hög nivå av ß-catenin märkning noterades i kluster av celler vid alla tidpunkter. I vissa fall uppvisade cellerna också tydlig ß-cateninlokalisering(figur 4, högerpaneler). Caco2 celler är kända för att skilja in vitro i 2D främst i enterocyter19,32. Uttrycket av differentieringsmarkörer, såsom kromogranin A (enteroendokrina celler), lysozyme (Paneth-celler) eller mucin 2 (MUC 2, bägare celler), var dock oidentifierbart i dessa sfäroider av IF (data visas inte). Potentialen att differentiera sig till enterocyter bekräftades dock, med tanke på att sfäroiderna uttryckte ALPI (alkaliskt fosfatas) och solute carrier family 2, transcript variant 2 (SLC2A5)/glukostransportör 5 (GLUT5) mRNAs (Figur 5). Dessa mRNA-nivåer ökade vid D5 och D7, men skillnaden var antingen inte signifikant (ALPI) eller endast marginellt signifikant (SLC2A5) jämfört med nivåerna vid D3.

Med det slutliga syftet att definiera om de sfäroider som genereras och odlas baserat på denna nya metod är ett tillförlitligt verktyg för att studera CSC, analyserades uttrycket av CSC-markörer av IF och qRT-PCR. CD133 och CD44 kännetecknar cancercellpopulationer inklusive CSCs7,33,34 och uttrycks också av SCs i normaltarmen ochkolon 33,34,35. Kluster av CD133-positiva celler lokaliserades huvudsakligen på sfäroidernas yttre yta vid varje tidpunkt (figur 6A, vänster paneler). CD44-positiva celler var mindre frekventa, men var alltid associerade med CD133-positiva celler(figur 6A, höger paneler), vilket indikerar förekomsten av en population av CD133/CD44 dubbelpositiva CSC-liknande celler och en population som endast uttrycker CD133. Olfactomedin 4 (OLFM4) och Musashi 1 (MSI1) undersöktes som SC/CSC-markörer. dessa markörer uttrycks på ett mycket begränsat sätt i kolonkrypterade36,37 och även i distinkta cellpopulationer35,38. Endast ett fåtal MSI1-positiva celler observerades vid varje tidpunkt (figur 7), medan OLFM4 förblev oidentifierbar (data visades inte). Som observerats för CD44 och CD133 fanns MSI1-märkta celler dock på den yttre ytan av sfäroiderna i kryptliknande eller knoppliknande strukturer. Samma markörer analyserades också på mRNA-nivå samtidigt efter kultur i agarosebelagda rätter. Aldehyddehydrogenas 1 (ALDH1a1), en väl karakteriserad markör för CSC39,40, ingick också i studien (Figur 8). Analysen av prominin-1 (PROM1 kodning för CD133) och CD44 mRNAs bekräftade uttrycket av båda markörer i sfäroider vid alla analyserade tidpunkter. Notera, emellertid, för stunder PROM1 mRNA jämnar var ganska liknande över tid i kultur, CD44 jämnar minskat från D3 onwards. Skillnaden var dock endast marginellt signifikant när man jämförde mRNA-nivåerna för D10 och D3.

Analysen av MSI1 mRNA bekräftade dess uttryck i sfäroider vid varje tidpunkt, med betydligt högre nivåer vid D3 och D5 jämfört med de vid D7 eller D10 (figur 8), medan OLFM4 mRNA inte kunde detekteras (visas inte). Slutligen uttrycktes ALDH1a1 mRNA i sfäroider vid varje tidpunkt och visade en uttrycksprofil som minskade vid D10, var nivåerna endast marginellt signifikanta jämfört med dem vid D3 (figur 8). För att validera lämpligheten hos den nya modellen för att studera cancercellsbiologi analyserades svaret på kemoterapi i sfäroider behandlade med FOLFOX eller FOLFIRI, kombinationsbehandlingar som rutinmässigt administreras till CRC-patienter22,23,24,25. För det första undersöktes effekten av behandlingarna för att inducera celldöd genom att inkubera sfäroiderna med en fluorescerande nukleinsyrafläck som specifikt kommer in i döda celler26. Jämfört med kontroll NT-tillståndet inducerade behandlingen med vart och ett av läkemedlen betydande celldöd mätt genom ackumulering av fluorescens (figur 9A). Denna iakttagelse bekräftades också på morfologisk nivå med levande mikroskopi, som visade att behandlingarna starkt påverkade storleken och utseendet på sfäroiderna (figur 9B). Slutligen analyserades uttrycket av SC/CSC-markörer av qRT-PCR i sfäroider under samma förhållanden (figur 9C). Intressant nog observerades en signifikant minskning av PROM1 mRNA nivåer under både FOLFOX och FOLFIRI villkor i jämförelse med nivåerna för kontrollen, medan MSI1 nivåer påverkades inte av behandlingarna. Dessutom, medan FOLFOX hade ingen effekt på ALDH1a1 mRNA uttryck jämfört med kontrollen, ökade behandlingen med FOLFIRI avsevärt sina nivåer. OLFM4 mRNA upptäcktes inte, och CD44 mRNA nivåer var extremt låga (data visas inte).

Figure 1
Figur 1: Inställning av sfäroidkulturer. A)Sfäroidbildning som initierats från de angivna koncentrationerna av Caco2-celler per sfäroid/mikrowell. Den övre panelen visar en representativ bild av en hel kulturplatta efter två dagars kultur. Den nedre panelen visar bilder av valda mikrobrunnar per villkor. Bilderna togs vid 4x förstoring (mikrobrunnstorlek: 400 μm). Skalstänger: låg förstoring, 100 μm; hög förstoring, 30 μm. B)Tillväxtegenskaper hos de sfäroider som genereras från olika antal celler per mikrobrunn och analyseras vid olika tidpunkter. Observera att de angivna dagarna inkluderar de första två dagarna av kultur i mikrobrunnarna och den efterföljande kulturen hos de skördade sfäroiderna i agarosebelagda plattor. Histogram visar genomsnittlig ± standardavvikelse, n = 4–6. Svarta cirklar visar värdena för enskilda sfäroider. Formeln för den uppskattade volymen visas i den övre delen av panelen, där d1, d2 och d3 anger de tre diametrar som mäts för varje sfäroid. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2:Optimering av förutsättningarna för sfäroidbildning och kultur. A)Representativa bilder av sfäroider vid D7 efter deras återhämtning från mikrobrunnarna (2 dagar) och kulturen i agarosebelagda rätter (5 dagar), med hjälp av nya brunnsberednings- och kulturmediumförhållanden. Skalstång: 30 μm. B)Beräknad volym av de nyskördade sfäroiderna två dagar efter cellkulturens början i mikrobrunnarna. Histogram visar genomsnittlig ± standardavvikelse (SD), n = 4–6. Svarta cirklar anger storleken på de enskilda sfäroiderna. C)Uppskattad volym av sfäroiderna i den långsiktiga kulturen på grundval av de nyligen utvalda förhållandena. Grafer visar tillväxtegenskaperna hos de sfäroider som genereras från olika antal celler per sfäroid och analyseras vid olika tidpunkter efter skörden, som anges. Histogram visar elaka ± SD, n = 6–10. Svarta cirklar anger storleken på de enskilda sfäroiderna. (D) Representativa bilder av de valda 600 cellerna per sfäroidtillstånd under den experimentella tidskursen (höger paneler) och i mikrobrunnarna (vänster panel). Bilder togs vid 4x förstoring. Skalstänger: låg förstoring, 100 μm; hög förstoring, 30 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Histologisk karakterisering av sfäroiderna. Histologiska hematoxylin och eosin (H&E) färgning av paraffin avsnitt. Representativa bilder av sfäroider vid de angivna tidpunkterna efter skörden, enligt anvisningarna. Svarta prickade linjer i varje hög förstoring inset avgränsa lumen inom sfäroiderna. Skalstänger: låg förstoring, 30 μm; hög förstoring, 10 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Caco2-sfäroid karakterisering genom immunolabeling. Immunostaining av sfäroider för spridningsmarkör, prolifererande cell nukleärt antigen (PCNA, röd) och celldödsmarkör, aktiverad caspase 3 (grön) (vänster paneler) och för β-catenin (röd) (höger paneler) vid angivna tidpunkter. Bilder visar sammanslagen märkning av PCNA (röd), aktiverad caspase 3 (grön) och atomkärnor (blå) eller av β-catenin (röd) och atomkärnor (blå). Vita pilar pekar på celler eller grupper av celler som uttrycker höga nivåer β-catenin. Bilder togs med ett 20x mål. Skalstång: 5 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Analys av enterocyt differentieringsmarkörer av qRT-PCR. Analys av ALPI- och SLC2A5-kodning av alkaliska fosfatas- respektive GLUT5-proteiner. Histogram visar genomsnittlig ± standardavvikelse, n = 3, efter normalisering mot ACTB. Data representeras som vikförändring i förhållande till normal kolonslemhinnan (röd linje = 1). NS: inte signifikant; MS: marginellt signifikant jämfört med D3 genom unpaired Students t-test. Förkortningar: qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion; GLUT5 = glukostransportör 5; SLC2A5 = solute carrier family 2, transkription variant 2; ACTB = β-aktin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Heterogent uttryck för stamcellsmarkörer, CD44 och CD133, i sfäroiderna. Immunostaining för stamcellsmarkörerna CD133 och CD44, vid angivna tidpunkter. Bilder i de vänstra panelerna visar sammanfogad märkning av CD133 (grön) och atomkärnor (blå); samma bilder i de högra panelerna visar sammanfogad märkning av CD44 (röd) och atomkärnor (blå). Gröna pilar i de vänstra panelerna pekar på CD133-uttrycksceller, och vita pilar i båda panelerna pekar på celler eller grupper av celler som uttrycker CD44 och CD133. Bilder förvärvades med ett 20x mål. Skalstång: 5 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Heterogent uttryck för stamcellsmarkör, MSI1, i sfäroiderna. Immunostaining för stamcellsmarkören MSI1 (röd) vid angivna tidpunkter. Bilder visar sammanfogad märkning av MSI1 (röd) och atomkärnor (blå). Vita prickade linjer understryker vissa kryptliknande strukturer där celler är positiva för MSI1-immunolabeling. Bilder togs vid 20x förstoring. Skalstång: 5 μm. Förkortning = MSI1 = Musashi 1. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Analys av stamcellsmarkörer med qRT-PCR. Kvantifiering av PROM1, CD44, MSI1 och ALDH1a1 nivåer utfördes på mRNA från sfäroider vid de angivna tiderna. Histogram visar genomsnittlig ± standardavvikelse, n = 3, efter normalisering mot ACTB. Data representeras som vikförändring i förhållande till normal kolonslemhinnan (röd linje = 1). NS: inte signifikant; MS: marginellt signifikant jämfört med D3, med hjälp av unpaired Student'st-test. *: P < 0,05 jämfört med D3 eller D5, med hjälp av unpaired Student'st-test. Förkortningar: qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion; PROM1 = prominin-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehyddehydrogenas 1 alfa; ACTB = β-aktin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 9
Figur 9: Effekten av kemoterapi på sfäroider. Efter skörd från mikrobrunnarna odlades sfäroider i agarosebelagda plattor och behandlades i 3 dagar med FOLFOX eller FOLFIRI eller bibehölls i (kontroll) icke-behandlat (NT) tillstånd. A)Analys av fluorescens på grund av märkning av nukleinsyra i döda celler. Histogram visar genomsnittlig ± standardavvikelse (SD), n = 4. B)Morfologiska egenskaper hos de sfäroider som upprätthålls under de olika odlingsförhållandena. Bilder togs med ett 4x-mål. Skalstång: 400 μm. c)Kvantifiering av PROM1, MSI1 och ALDH1a1 mRNAs med qRT-PCR. Histogram visar medelvärdet ± SD, n = 4, efter normalisering mot ACTB. *: NS: inte betydande; P < 0,05; **: P < 0,01; : P < 0,001 jämfört med kontrolltillståndet (NT), med hjälp av unpaired Student's t-test. Förkortningar: FOLFOX = 5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Oxaliplatin, 10 μg/ml; Leucovorin, 25 μg/ml; FOLFIRI = 5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Irinotecan, 100 μg/ml; Leucovorin, 25 μg/ml; qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion; PROM1 = prominin-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehyddehydrogenas 1 alfa; ACTB = β-aktin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Önskat antal celler per sfäroid Obligatoriskt antal celler per brunn
50 6 x 104
100 1,2 x 105
200 2,4 x 105
300 3,6 x 105
400 4,8 x 105
500 6 x 105
600 7,2 x 105
700 8,4 x 105
800 9,6 x 105
1000 1,2 x 106
2000 2,4 x 106

Tabell 1: Sammanfattning av sfäroidbildning och cellfröning.

10 mm rätter 6-brunnsplattor 12-brunnsplattor 24-brunnsplattor 96-brunnsplattor
Beläggningsvolym 4 ml 300 μL 250 μL 150 μL 50 μL (nedåt & uppåt)

Tabell 2: Volymer av agaroselösning för beläggning av olika tallrikar / rätter.

Gener Grundfärger sekvens Produktlängd
Differentieringsmarkörer ALPI (alpi) framåt CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA 81
omvända ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT
SLC2A5 (olika) framåt TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA 94
omvända AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG
Stamcellsmarkörer ALDH1a1 (aldh1a1) framåt GCC TTC ACA GGA TCA ACA GAG 147
omvända TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC
MSI1 (alla) framåt AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA 131
omvända TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG
PROM1 (olika) framåt GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG 131
omvända GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG
CD44 (cd44) framåt TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC 160
omvända TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT
OLFM4 (olika) framåt TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC 118
omvända ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT
Städgener ACTB (på alla) framåt CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C 134
omvända AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T
PPIB (på alla) framåt ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT 100
omvända GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG

Tabell 3: Primers används för kvantitativ omvänd transkription-polymeras kedja reaktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vitro 3D-modeller övervinner de viktigaste experimentella nackdelarna med 2D-cancercellskulturer, eftersom de verkar vara mer tillförlitliga när det gäller att rekapitla typiska tumöregenskaper inklusive mikromiljö och cell heterogenitet. Vanliga 3D-modeller av sfäroider är byggnadsställningar fria (odlade i lågtillsättningsförhållanden) eller byggnadsställningsbaserade (med hjälp av biomaterial till odlingsceller). Dessa metoder uppvisar olika nackdelar eftersom de beror på arten av den byggnadsställning som används eller ger upphov till sfäroider som är varierande i struktur och storlek.

Det nuvarande protokollet rapporterar optimerade villkor för att producera homogena sfäroider från kolon adenocarcinom cellinjen, Caco2, med hjälp av en ställning-fri metod. Sfäroiderna skördas lätt och i motsats till en tidigare rapporterad studie41växer de framgångsrikt och deras tillväxtegenskaper under tiden i kulturen kan också analyseras. Dessutom, med denna nya metod, proliferate sfäroiderna (a) aktivt, (b) presenterar en mycket låg frekvens av celldöd, (c) organiserar sig för att bilda en lumen inuti sfärerna, och (d) uppvisar differentieringskapacitet hos komponentcellerna. Med tanke på att det slutliga syftet med det nya tillvägagångssättet var dess användning för studier om CSC-biologi analyserades uttrycket av olika markörer för CSC. Intressant nog presenterade markörerna ett dynamiskt uttrycksmönster beroende på tidspunkten och definierade olika CSC-populationer.

Av yttersta vikt, de sfäroider som genereras genom detta protokoll kan användas för att analysera läkemedel som är relevanta för kliniska tillämpningar såsom kemoterapeutiska regimer, FOLFOX och FOLFIRI. Resultaten understryker också ett heterogent svar av celler på drogerna beroende på CSC markör analyseras. Denna observation överensstämmer med den nuvarande uppfattningen att heterogena och flera CSC-liknande cellpopulationer inom tumörer visar olika chemosensitivity / chemoresistance egenskaper42,43. Detta konstaterande förstärker starkt tillämpligheten av denna nya metod för storskalig screening. Utöver de tillämpningar som rapporteras i denna studie kan det nya protokollet också användas för ett bredare spektrum av analyser (t.ex. RNA och/eller DNA-extraktion och storskaliga analyser, western blotting och immunofluorescens). Volymen av sfäroider och tillväxtegenskaper kan faktiskt lätt bestämmas genom att tillämpa sfärvolymformeln som vid behov också tar hänsyn till olika diametrar för motviktsavvikelser från en perfekt sfärisk form. Specifika parametrar bör dock optimeras beroende på celltyp (cellinje eller nya primära kulturer) och tillväxtkapacitet, till exempel replikeringstiden. Protokollet anger dock kritiska steg som enkelt kan justeras.

Vissa punkter av oro måste beaktas när du utför sfäroid generation beskrivs i denna artikel. För det första bör flera tvättsteg utföras med anti-adherence sköljningslösningen för att främja sfärernas homogenitet och komprimering. I det här fallet var två tvättar nödvändiga. För det andra måste bubblor avlägsnas från mikrobrunnarna eftersom detta kan störa korrekt bildning av sfäroiderna. För det tredje, när cellerna har såts i varje mikrobrunn efter centrifugationssteget, måste plattan förbli ostörd i två dagar. Ytterligare överväganden och ändringar i protokollet behövs när man studerar de tidiga stegen för sfäroidbildning, eventuellt inklusive ett automatiserat visualiserings- och bildsystem. För det fjärde kan det vara utmanande att ändra mediet utan att störa sfäroiderna, med tanke på att de är i suspension. Därför rekommenderas att ändra endast hälften av volymen varje gång. För det femte, när man skördar sfäroiderna är det viktigt att bevara deras struktur. Därför rekommenderas användning av serologiska pipetter eller mikropipetter med spetsarna avskurna för alla dispenseringssteg efter sköljning i ett seruminnehållande medium eller PBS för att förhindra att sfäroiderna fastnar vid spetsarna.

Vissa begränsningar kan också uppstå när du använder det här protokollet. För det första har inte alla cellinjer eller celltyper samma odlingsparametrar. I vissa fall kan cell heterogenitet och antalet passager/åldrande av celler också påverka förmågan att bilda sfäroider. För det andra, kontrariwise till organoider, det kan vara svårt att upprätthålla sfäroider under mycket lång tid i kulturen. Dessutom kan de inte replikeras genom enkel fragmentering genom en mikropipettspets15. För det tredje kan detta protokoll inte anpassas för ensfäroid analys eftersom manuell återställning av sfäroider en efter en kan vara svårt. Denna teknik är mer lämplig för att få höga mängder homogena sfäroider samtidigt. Slutligen, för studier som undersöker effekterna av tillväxtfaktorer som härrör från andra celltyper eller analyserar vikten av mikromiljön, skulle det vara viktigt att berika modellen och utföra samkulturexperiment.

Sammanfattningsvis beskriver den nuvarande metoden ett nytt protokoll för att effektivt generera och odla sfäroider från Caco2-celler. Resultaten visar att denna metod kan tillämpas på studien av tumör heterogenitet och för analys av CSCs. Denna metod kan också användas för läkemedelsscreening med hög genomströmning och studier av stamcellsbiologi i cancer och icke-cancerceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja

Acknowledgments

Vi erkänner bildbehandling och Anipath recherche histologi plattformar (CRCL, CLB). Vi står i skuld till apoteket på Centre Léon Bérard (CLB) Hospital för den snälla gåvan av FOLFOX och FOLFIRI. Vi tackar också Brigitte Manship för kritisk läsning av manuskriptet. Arbetet stöddes av FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) och Av Inca (PLBIO19-289). MVG och LC fick stöd från FRM och CF fick stöd från ARC Foundation och Centre Léon Bérard.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 µm Reversible Strainer, Large  STEMCELL Technologies 27250 To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) - stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose  Sigma A9539
Aggrewell 400 24-well plates STEMCELL Technologies 34411 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit Cell Signaling 9661 dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat eBioscience/Thermo Fisher 14-9896-82 dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL STEMCELL Technologies 07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat Invitrogen 14-133-82 dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit Abcam ab157107 dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse Dako M0879 dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse Santa Cruz Biotechnology sc-7963 dilution 1:50
Black multiwell plates Thermo Fisher Scientific 237108
Citric Acid Monohydrate Sigma C1909
CLARIOstar apparatus  BMG Labtech microplate reader
Dako pen marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21202 dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A10037 dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21206 dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A10042 dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Gibco 10569010
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI Interchim FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11077 dilution 1:1000
ImageJ software Spheroid image analysis
Irinotecan  Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase  Bio-Rad 1708891
Leucovorin Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit Macherey-Nagel 740902 .250
Oxaliplatin Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin Gibco 15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco 14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) Takara RR420B
SYTOX- Green Thermo Fisher Scientific S7020 nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %) Gibco 25300062
Zeiss-Axiovert microscope inverted microscope for acquiring images of spheroids

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
  3. Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
  4. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
  5. Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
  6. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  7. Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
  8. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  9. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  10. Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
  11. Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
  12. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  13. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  14. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  16. Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  17. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  18. Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
  19. Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
  20. Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
  21. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
  22. Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
  23. Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
  24. Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
  25. Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
  26. Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
  27. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  28. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  29. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
  30. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  31. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  32. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
  33. Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
  34. van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
  35. Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
  36. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  37. Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
  38. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  39. Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
  40. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  41. Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
  42. Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
  43. Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).

Tags

Cancerforskning utgåva 167 Caco2-celler Cancerstamceller Cellproliferation Tjocktarmscancer Colonospheres Colonospheres tillväxt
En tredimensionell modell av sfäroider för att studera tjocktarmscancerstamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Giolito, M. V., Claret, L., Frau,… More

Giolito, M. V., Claret, L., Frau, C., Plateroti, M. A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells. J. Vis. Exp. (167), e61783, doi:10.3791/61783 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter