Summary
Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.
Abstract
Kolorektal kanserler heterojenlik ve tümör gelişimi, bakımı ve ilaçlara karşı dirençlerden sorumlu kanser kök hücre (CSC) popülasyonu içeren hiyerarşik bir organizasyon ile karakterizedir. Bu nedenle, CSC özelliklerinin spesifik hedeflemeleri için daha iyi anlaşılması, etkili tedavi için bir ön koşuldur. Bununla birlikte, derinlemesine incelemeler için uygun preklinik modellerin azlığı vardır. In vitro iki boyutlu (2D) kanser hücre hatları tümör biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlasa da fenotipik ve genetik tümör heterojenliğini çoğaltmaz. Buna karşılık, üç boyutlu (3D) modeller fizyolojik kanser karmaşıklığına ve hücre heterojenliğine hitap ediyor ve yeniden üretiyor. Bu çalışmanın amacı, CSC biyolojisini incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi tasarlamaktı. Mevcut metodoloji, uzun süreli kültür için kullanılabilecek bir model olan Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden homojen boyutta olan 3D küreseller üretmek için koşulların gelişimini ve optimizasyonunu açıklar. Daha da önemlisi, sferoidler içinde, lümen benzeri yapılar etrafında örgütlenen hücreler, diferansiyel hücre çoğalma paternleri ve bir işaret panelini ifade eden CSC'lerin varlığı ile karakterize edildi. Bu sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere hücre heterojenliğini ve CSC biyolojisini incelemek için bu 3D yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.
Introduction
Kolorektal kanser (CRC) dünyada kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1. CRC'nin gelişimi, onkogenlerin aktivasyonu ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu da dahil olmak üzere genetik mutasyonların ve / veya epigenetik değişikliklerin2,3,4'ünilerleyici bir edinimi ve birikmesinin sonucudur. Ayrıca, genetik olmayan faktörler (örneğin, mikroçevrim) onkojenik dönüşüme katkıda bulunabilir ve teşvik edebilir ve böylece CRC'lerin evrimine katılabilir5. Daha da önemlisi, CRC'ler, normal bir kolon mahzeninde epitelin organizasyonunu anımsatan hiyerarşik bir yapı oluşturan bazı farklılaşma özelliklerini gösteren farklı KSS'ler ve dökme tümör hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonlarından oluşur6,7.
CSC'lerin tümör görünümü8, bakımı ve büyümesi, metastatik kapasitesi ve konvansiyonel tedavilere karşı direnci6,7'densorumlu olduğu düşünülmektedir. Tümörlerde, CSC'ler de dahil olmak üzere kanser hücreleri, belirgin mutasyonel ve epigenetik profilleri, morfolojik ve fenotipik farklılıkları, gen ekspresyasyonu, metabolizma, çoğalma oranları ve metastatik potansiyel açısından yüksek düzeyde heterojenlik ve karmaşıklık gösterir9. Bu nedenle, kanser biyolojisini, tümörün ilerlemesini ve tedaviye karşı direncin kazanılmasını ve etkili tedavilere çevrildiğini daha iyi anlamak için, bu kanser heterojenliğini ve hiyerarşisini yakalayan insan preklinik modelleri önemlidir10,11.
In vitro 2D kanser hücre hatları uzun süredir kullanılmaktadır ve tümör gelişimi ve terapötik moleküllerin etkinliğinin altında yer alan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır. Bununla birlikte, orijinal tümörlerde bulunan fenotipik ve genetik heterojenliğin eksikliği ile ilgili sınırlamaları artık yaygın olarak tanınmaktadır12. Ayrıca, besinler, oksijen, pH gradyanları ve tümör mikroçevrimi çoğaltılmamıştır, mikroçevrim özellikle CSC11,12dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin bakımı için önemlidir. Bu ana dezavantajların üstesinden gelmek için, kanserlerin karmaşıklığını ve heterojenliğini deneysel olarak ele almak ve çoğaltmak için birkaç 3D model geliştirilmiştir. Aslında, bu modeller vivo12 , 13,14'tegözlemlenenlere benzer şekilde tümör hücresel heterojenliği, hücre-hücre etkileşimlerini ve mekansal mimariyi rekapitulate eder. Taze tümörlerden kurulan primer tümör organoidleri ve hücre hattı kaynaklı küreseloidler büyük ölçüde 15,16'dır.
Küreseller, hücreleri hücre agregalarında oluşmaya ve büyümeye zorlamak için iskelesiz veya iskele tabanlı bir şekilde kültürlenebilir. İskelesiz yöntemler, yapışmayan koşullar altında hücrelerin kültürüne (örneğin, asma-bırakma yöntemi veya ultra düşük bağlanma plakaları) dayandırılırken, iskele bazlı modeller kültür hücrelerine doğal, sentetik veya hibrit biyomalzemelere dayanır12,13,14. İskele bazlı sferoidler, son küresel oluşum kullanılan (biyo)malzemenin doğasına ve bileşimine bağlı olacağından farklı dezavantajlar sunar. Şimdiye kadar mevcut olan iskelesiz küresel yöntemler substratın doğasına dayanmasa da, yapı ve boyut olarak değişen küreseller üretirler17,18.
Bu çalışma, CSC biyolojisini incelemek için Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden oluşan homojen boyutta olan sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi tasarlamayı amaçladı. Caco2 hücreleri, zaman içinde farklılaşma kapasiteleri nedeniyle özellikle ilgi çekicidir19,20, güçlü bir şekilde kök benzeri bir potansiyel önermektedir. Buna göre, küresellerin uzun süreli kültürü, kemoterapiye farklı yanıtlarla farklı CSC popülasyonlarının varlığını ortaya koydu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm reaktiflerin ve malzemelerin ayrıntıları Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
1. Küresel oluşum
- Küresel kültür ortamı
- 4 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) içeren bazal ortam hazırlayın.
- Adım 1.1.1'den itibaren bazal ortamda %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisidin (Pen/Strep) içeren DMEM komple ortamını hazırlayın.
- Adım 1.1.1'den itibaren bazal ortamda %2,5 bodrum membran matrisi, %10 FBS ve %1 Pen/Strep içeren DMEM/bodrum membran matrisi ortamı hazırlayın.
- Sferoid oluşumu için plakaların hazırlanması
- Oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 20 dakika sıcak bazal ve DMEM/bodrum membran matris ortamı.
- Her kuyuya 500μL yapışma önleyici durulama çözeltisi ekleyerek küresel oluşuma adanmış 24 kuyulu bir plakanın kuyularını ön işlemden geçirdirin.
NOT: Bu plakalarda her kuyu 1.200 mikrowell'den oluşur. - Plakayı 1.200 × g'da plakalar için adaptörlü sallanan bir kova rotorunda 5 dakika boyunca santrifüj edin.
NOT: Sadece bir plaka kullanılıyorsa, ağırlığı dengelemek için su dolu ek bir standart plaka hazırlayın. - Her kuyuyu 2 mL ılık bazal ortamla durulayın ve ortamı kuyulardan epire edin.
- Kabarcıkların mikrowelllerden tamamen çıkarıldığından emin olmak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin. Kabarcıklar sıkışmış kalırsa, kabarcıkları ortadan kaldırmak için 5 dakika boyunca 1.200 × g'da tekrar santrifüjleyin.
- Durulama adımları 1.2.4-1.2.5'i yineleyin.
- Her kuyuya 1 mL ılık DMEM/bodrum membran matrisi ortamı ekleyin.
- Küresellerin üretimi
- Caco2 hücrelerini% 5 CO 2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 Pen / Strep ile desteklenmiş DMEM ortamında bir2D monolayerde büyütün (bundan böyle% 37 ° C / 5 CO2olarak adlandırılır).
NOT: Kullanılacak maksimum hücre geçişi sayısı 80'dir. - Konfluensisin % 80'ine ulaşıldığında, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) 1x (10 cm'lik bir yemek için 5 mL) ile yıkayın, tripsin-etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) ekleyin (10 cm'lik bir yemek için 2 mL) ekleyin ve 37 °C/% 5 CO2'de2-5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Mikroskop altında hücre müfrezesini kontrol edin ve 10 cm'lik çanak başına 4 mL DMEM tam orta ekleyerek tripsin nötralize edin.
- Toplam hücre sayısını belirlemek için hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- Hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 1.200 × g'da santrifüj. Süpernatantı atın ve peletin uygun bir DMEM/bodrum membran matris ortamı hacminde yeniden kullanılabilir.
- Mikrowell başına istenen hücre sayısını elde etmek için kuyu başına gereken hücre sayısını belirlemek için Tablo 1'e bakın. Alternatif olarak, her kuyunun 1.200 mikrowell içerdiğini göz önünde bulundurarak, 24 kuyu plakası için aşağıdaki formülü kullanarak hücre sayısını hesaplayın
Kuyu başına gerekli hücre sayısı = Mikrowell başına istenen hücre sayısı × 1.200 - 1 mL'lik son hacimde istenen hücre sayısını elde etmek için her kuyuya gerekli hücre süspansiyonu hacmini ekleyin.
- Kuyu başına 2 mL'lik son hacme ulaşmak için her kuyuya 1 mL DMEM/bodrum membran matris ortamı ekleyin (ayrıca bkz. adım 1.2.7).
NOT: Mikro kabarcıklara kabarcık sokmamaya dikkat edin. - Mikrowelllerdeki hücreleri yakalamak için plakayı 5 dakika boyunca 1.200 g'da × hemen santrifüj edin. Gerekirse, santrifüjü suyla dolu standart bir plaka ile dengelayın.
- Hücrelerin mikrowelller arasında eşit olarak dağıtıldığını doğrulamak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin.
- Plakayı rahatsız etmeden 48 saat boyunca %37 °C/5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Orijinal protokole göre21Birçok hücre hattı 24 saat içinde küreseller oluşturabilse de, bazıları daha uzun bir kuluçka süresi gerektirir. Bu protokolde küresel oluşum için 48 saat yeterlidir.
- Caco2 hücrelerini% 5 CO 2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C'de% 10 FBS ve% 1 Pen / Strep ile desteklenmiş DMEM ortamında bir2D monolayerde büyütün (bundan böyle% 37 ° C / 5 CO2olarak adlandırılır).
- Mikrowelllerden küresellerin toplanması
- Basal ve DMEM/bodrum membran matris ortamını RT'de yaklaşık 20 dakika ısıtın.
- Serolojik bir pipet kullanarak, kültür ortamının yarısını (1 mL) her kuyudan çıkarın.
- Küreselleri mikrowelllerden çıkarmak için ortamı kuyunun yüzeyine geri ekleyin.
NOT: Küresellere dokunmayın veya üçe kütüre etmeyin. - Küreselleri toplamak için 15 mL konik tüpün üstüne 37 μm ters çevrilebilir bir süzgeç (veya 40 μm standart süzgeç) yerleştirin.
NOT: 40 μm standart süzgeç kullanıyorsanız, baş aşağı yerleştirin. - Yerinden sferoidleri hafifçe epire edin (adım 1.4.3'ten itibaren) ve küresel süspansiyonu süzgeçten geçirin.
NOT: Küreseller filtrede kalacaktır; tek hücreler ortamla birlikte akacaktır. - Serolojik bir pipet kullanarak, kalan küreselleri yerinden çıkarmak ve süzgeçte geri kazanmak için kuyunun tüm yüzeyine 1 mL sıcak bazal ortam dağıtın.
- Bu yıkama adımı 1.4.6'yı iki kez tekrarlayın.
- Tüm küresellerin mikrowelllerden çıkarıldığından emin olmak için mikroskop altındaki plakayı gözlemleyin. Gerekirse yıkamayı tekrarlayın (adım 1.4.6-1.4.7).
- Süzgeci ters çevirin ve yeni bir 15 mL konik boruya yerleştirin. Süzgeci DMEM/bodrum membran matris ortamı ile yıkayarak küreselleri toplayın.
NOT: Toplanan küreseller aşağı akış uygulamaları ve analizleri için hazırdır.
- Uzun süreli küresel kültür
- Bazal ortamda % 1,5 agarose çözeltisi hazırlayın ve otomatik olarak kaplayarak sterilize edin (standart döngü).
- Agarose çözeltisi sıcak ve hala sıvı olsa da, Tablo 2'deaçıklandığı gibi standart kültür tabaklarının veya yemeklerinin kuyularını kaplayın.
NOT: Kabın/tabağın fırında ısıtması kaplama adımını kolaylaştıracaktır. Kaplamalı yemekler/tabaklar RT'de steril bir ortamda 10 güne kadar bırakılabilir ve ışıktan korunabilir. - Hasat edilen küreselleri (adım 1.4.9'dan itibaren) agarose kaplı plakalara tohumlayın ve plakanın büyüklüğüne bağlı olarak son hacme ulaşmak için DMEM / bodrum membran matrisi ortamı ekleyin.
NOT: Küresel agregaları önlemek için, bunları 22küresel/cm2 optimum yoğunlukta tohumlayın. Kaplamanın mükemmel bir şekilde düz olmadığını ve plakanın merkezinde hafif bir konsavite oluşturarak kenara doğru yükseldiğini gözlemleyin. Küresellerin sayısı çok yüksekse, birbirlerine yapışmaları daha olasıdır. - Plakayı belirli analizler için küresellerin geri kazanımı kadar % 37 °C/5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
- Kemoterapötik ilaçlarla sferoidlerin tedavisi
- 1.5.4 adımından plaka sferoidleri ve 2 gün boyunca yetiştirin. 3. günden (D3) başlayarak, onları FOLFIRI (5-Florourasil, 50 μg / mL) ile tedavi edin; Irinotecan, 100 μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL) veya FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/mL); Oksaliplatin, 10 μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL) kemoterapötik rejim kombinasyonları rutin olarak22 , 23,24,25CRC hastalarını tedavi etmek veya (kontrol) tedavi edilmeyen (NT) durumda tutmak için kullanılır.
- 3 günlük tedaviden sonra, ucu kesilmiş bir pipet (1.000 μL uç) kullanarak, her durumun en az üç kopya ile temsil edilmesini sağlayarak küreselleri toplayın. Onları 3 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüj edin ve ardından süpernatantı çıkarın.
- Histolojik analiz için peletleri %2 paraformaldehitte (PFA) sabitlemek (bkz. bölüm 3) veya RNA ekstraksiyonu için peletleri kullanın (bkz. bölüm 4).
- Hücre ölümünü analiz etmek için, DMEM / bodrum membran matriks ortamındaki siyah kültür kuyu plakalarındaki 1.6.1 adımındaki küresel sferoidleri canlı hücrelere nüfuz etmeyen, ancak ölü hücrelerin tehlikeye atılmış zarlarına nüfuz eden bir nükleik asit lekesi (1:5000 seyreltme) ile 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın26. Mikro plaka okuyucu ile floresan birikimini ölçün.
2. Küresel büyümeyi izleme
- Ters bir mikroskop kullanarak, kültürde günler boyunca farklı koşullar altında tutulan küresellerin temsili görüntülerini elde edin.
- Uygun yazılımı kullanarak her bir küreselin üç farklı temsili çapını ölçerek görüntüleri analiz edin.
- Tahmini küre hacmini elde etmek için aşağıdaki formülü kullanın.
NOT: d1, d2 ve d3 terimleri, küreselin üç çapıdır.
3. İmmünoresans (IF) ve histolojik lekelenme
- Fiksasyon ve parafin gömme
- Sferoidleri, 1.6.2 adımında açıklandığı gibi ucu kesilmiş bir pipet kullanarak seçilen zaman noktalarında toplayın ve %2 PFA'da RT'de 30 dakika boyunca sabitlayın.
NOT: Alternatif olarak, numuneleri bu adımda 4 °C'de bir sonraki kullanıma kadar saklayın. - Parafin gömme için, küreselleri PBS 1x ile 3x yıkayın ve% 70 etanolde yeniden ıslatın. Parafin inklüzyumu ve kesitinden sonra histolojik analiz için hematoksilin & eozin (H&E) boyama yapın.
- Sferoidleri, 1.6.2 adımında açıklandığı gibi ucu kesilmiş bir pipet kullanarak seçilen zaman noktalarında toplayın ve %2 PFA'da RT'de 30 dakika boyunca sabitlayın.
- Parafin bölümlerinin immünoblabeling
NOT: Dolaylı immünostaining için 5-μm kalınlığında bölümler kullanın.- Balmumunu eritmek ve deparaffinizasyonu iyileştirmek için 2 saat boyunca 60 °C'de kaydırakları kuluçkaya yatırın.
- Slaytları metilsiklopohexane'de 3 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Slaytları 1:1 metilsiklopohexane:100% etanolde 3 dakika yıkayın.
- Slaytları iki kez% 100 etanolde 3 dakika boyunca yıkayın.
NOT: Kimyasal bir başlıkta 3.2.2 ile 3.2.4. - Slaytları% 90 etanolde 3 dakika yıkayın.
- Slaytları% 75 etanolde 3 dakika yıkayın.
- Slaytları% 50 etanolde 3 dakika yıkayın.
- Slaytları musluk suyunun altında yıkayın.
- Slaytları damıtılmış suda 5 dakika boyunca yeniden sulandırın.
- 700 mL 0,01 M sitrat tamponu, pH 6,0 hazırlayın ve uygun bir kaba ekleyin (genişlik: 11,5 cm, uzunluk: 17 cm, yükseklik: 7 cm); slaytları içine batırın. Kabı mikrodalga fırında 700 W'ta 9-10 dakika ısıtın ve kaynama başladığında, gücü 400-450 W'a düşürin.
- Slaytların arabellekte yaklaşık 30-40 dakika boyunca RT'ye soğumasını bekleyin.
- Slaytları PBS'de iki kez 5 dakika yıkayın.
- Bölümlere uygulanan sıvılar için bir bariyer oluşturmak için bölümlerin etrafına bir işaret kalemi ile bir daire çizin.
- Her bölümü RT'de en az 30 dakika boyunca 50 μL blokaj tamponu (%10 normal keçi serumu, %1 sığır serumu albümin (BSA) ve %0,02 Triton X-100 ile kuluçkaya yatırın.
- Bloklama tamponunu çıkarın ve kuluçka tamponunda seyreltilmiş 50 μL primer antikor ekleyin (PBS'de% 1 normal keçi serumu, % 0.1 BSA ve% 0.02 Triton X-100). RT'de 2 saat veya 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- Birincil antikorları çıkarın ve slaytları PBS'de 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
- Slaytları, KULUÇKA tamponunda seyreltilmiş 50 μL floresan ikincil antikorlarla RT'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- İkincil antikorları çıkarın ve slaytları PBS'de 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
- Her bölüme 4′, 6-diamidino-2-fenylindole ile 50 μL montaj ortamı ekleyin ve bölümün üzerine bir cam kapaklı yerleştirin.
4. RNA ekstraksiyonu, ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve nicel RT-PCR (qRT-PCR)
- Her nokta en az üç çoğaltma ile temsil edilen farklı zaman noktalarında küreselleri toplayın. Onları 3 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüj edin ve ardından süpernatantı çıkarın.
NOT: Peletler doğrudan RNA ekstraksiyonu için kullanılabilir veya bir sonraki kullanıma kadar -20 °C'de saklanabilir. - Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir RNA izolasyon kiti kullanarak toplam RNA'yı izole edin.
- Her RNA örneğinin 500 ng'lik kısmını, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit ile tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters çevirin.
- Ters transkripsiyondan sonra, farklı eksonlarda bulunan astarlarla bir temizlik genini güçlendirmek için 1 μL cDNA üzerinde PCR analizi yapın.
NOT: Bu adım, RNA preparatlarında herhangi bir genomik DNA kontaminasyonunun olmadığının doğrulanmasını sağlar. Bu protokol için peptidylprolyl isomerase B(PPIB) primerleri kullanılmıştır. - İlgi genlerine özgü astarlar kullanarak 4 μL daha önce seyreltilmiş cDNA (RNNA içermeyen çift damıtılmış suda 1:10) üzerinde qPCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Her örnekte, ΔΔCt yöntemini ve bir temizlik gen seviyelerine karşı normalleştirilmiş değerleri kullanarak belirli mRNA ekspresyonunun ölçülmesini ölçün.
NOT: Bu protokol için β-actin(ACTB) seçildi. Bu protokolde kullanılan astarlar Tablo 3'te listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sferoidlerin boyutunda homojenlik eksikliği şu anda mevcut olan 3D küresel kültür sistemlerinin ana dezavantajlarından biri olduğundan13, bu çalışmanın amacı homojen sferoidler elde etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaktı. İlk olarak, ideal çalışma koşullarını belirlemek için, özel plakalar kullanılarak mikrowell / küresel başına 50 ila 2.000 hücre arasında değişen farklı sayıda Caco2 hücresi test edilmiştir (Tablo 1). Aslında, bu plakalardaki her kuyu 1.200 mikrowell içerir, kuyu başına aynı sayıda küresel oluşumu ve daha da önemlisi, mikrowell başına bir küresel oluşumusağlar 21. İki günlük kültürden sonra, küresel başına 2.000 hücre içeren kuyular monolayer olarak büyüdü ve küresel başına 50 hücre küçük ve homojen olmayan küresellere yol açtı (Şekil 1A). Bu nedenle bu iki koşul daha fazla analizden dışlandı. Uzun vadeli kültürler oluşturmak için, küreseller mikrowelllerden hasat edildi ve taze hazırlanmış agarose kaplı plakalarda yapışmayan koşullar altında tohumlandı. Daha sonra hacimdeki değişim ölçülerek deneysel zaman dilimi boyunca küresel büyüme izlendi. Küresel olmayan şekli dikkate almak için, her bir küreselin üç farklı çapı ölçüldü ve hacim formülü27 (Şekil 1B) uygulandı. 100 ve 200 hücreden üretilen küreseller deney boyunca başlangıç boyutlarını korurken, 1.000 hücre içerenler büyük boyutları nedeniyle hasat sırasında parçalandı ve sonuç olarak hacimlerinde daha fazla değişkenlik gösterdi. Bu nedenle, 500 hücreden kaynaklanan küreseller deneysel zaman diliminde en homojen boyut artışını gösterdiğinden, bu hücre sayısı küresel oluşum için kullanılmıştır.
İkinci olarak, küresel başına 500 hücrenin yanı sıra, 300 ila 800 hücre arasında değişen ek hücre sayıları çalışılmıştır. Ayrıca, yapışmayan koşulları iyileştirmek için, orijinal protokol sadece bir yıkama uygulamak yerine kuyuları iki kez önlenerek değiştirildi. Bu değişikliklerle sferoid homojenlik ve sıkıştırmada bir iyileşme gözlenmiştir (Şekil 2A). Her durumdaki küresellerin büyüklüğü hasat sırasında ölçüldü (Şekil 2B) ve agarose kaplı yemeklerde kültürde günler boyunca uzun vadeli büyümeleri izlendi (Şekil 2C). Sonuçlara göre, 500 ve 600 hücre/sferoidin iyi büyüme ve düşük değişkenlik sağlayan optimal koşullar olduğu doğrulandı. Deneysel zaman dilimi boyunca daha homojen büyüme profili ve oluşan kompakt yapılar sayesinde, sonraki deneyler için hücre sayısı olarak küresel başına 600 hücre seçildi. Son olarak, protokolü daha da geliştirmek için, DMEM komple ortamı, ek büyüme faktörleri ve hücre dışı matris proteinlerinin büyük bir panelini içeren bodrum membran matrisinin%2,5'iile desteklenmiştir 28 . Gerçekten de, küresellerin çok kutuplu şekli, hücre polarizasyonunu etkilemiş olabilecek mikroçevreden gelen sinyallerin eksikliğinden kaynaklanabilir29,30. Bodrum membran matrisinin eklenmesi küresel büyümeyi artırdı ve homojenliklerini artırdı (Şekil 2D). Bu iyileşmenin bir örneği küresel her 500 hücre için görülebilir. Bodrum membran matrisinin yokluğunda (Şekil 1B), küresellerin büyüklüğü daha heterojendi, D3'ten D7'ye ikiye katlandı ve daha sonra bir platoya ulaştı. Bununla birlikte, bodrum membran matrisinin varlığında (Şekil 2C), her zaman noktasındaki küresellerin büyüklüğü daha homojendi ve zamanla orantılı olarak arttı.
Küresellerin uzun vadeli özelliklerini analiz etmek için, parafin bölümlerinde ayrıntılı histolojik ve IF analizleri için agarose kaplı yemeklerde kültürden sonra farklı zaman noktalarında kurtarıldılar. H&E lekeleme, küreseller içindeki hücrelerin zaman içinde organizasyonlarında ve şekillerinde değişikliklere maruz kaldıklarını gösterdi. Gerçekten de, hücreler D3'te çok katmanlı olarak yoğun bir şekilde düzenlenirken, monolayerlerde düzenlenmiş düzleştirilmiş hücreler D10'da açıkça görülebiliyordu. İlginçtir ki, görüntülerdeki siyah noktalı çizgilerde belirtildiği gibi, D5'ten itibaren küreseller içinde bir lümen ortaya çıkmıştır (Şekil 3). Buna paralel olarak, hücre çoğalması ve apoptoz, çoğalma belirteci, çoğalan hücre nükleer antijeni (PCNA) ve hücre ölüm belirteci, aktif kaspaz 3 kullanılarak IF tarafından analiz edildi. PCNA için etiketleme, çoğalan hücrelerin genellikle küresellerin dış yüzeyinde, bazen organoid kültürlerini andıran mahzen benzeri veya tomurcuk benzeri yapılarda bulunduğunu ortaya koydu15. Buna ek olarak, D5 ve D7'deki PCNA pozitif hücrelerde D10(Şekil 4, sol paneller) tarafından gerileyen net bir artış gözlenmiştir. Şaşırtıcı bir şekilde, aktif kaspaz 3, hem D3 hem de D5'teki küresel hücrelerde(Şekil 4, sol paneller) ve daha uzun sürelerde (veri gösterilmedi) çok az hücrede gözlendi. β-catenin ekspresyon deseni de parafin bölümlerinde değerlendirildi. İlginçtir ki, her zaman noktasında açık membran bağlı ve sitoplazmik lekelenme ile yüksek düzeyde β-catenin ekspresyolü gözlenmiştir(Şekil 4, sağ paneller). Membran bağlı β-catenin'in E-cadherin31'ebağlanarak hücre-hücre yapışıklığına katıldığını belirtmek gerekir. Tüm zaman noktalarındaki hücre kümelerinde yüksek düzeyde ß-catenin etiketlemesi kaydedildi. Bazı durumlarda, hücreler ayrıca net nükleer ß-catenin lokalizasyonu(Şekil 4, sağ paneller) görüntüler. Caco2 hücrelerinin in vitro'yu 2D olarak esas olarak enterositlere ayırarak ayırt etmesi bilinmektedir19,32. Bununla birlikte, kromogranin A (enteroendokrin hücreler), lysozim (Paneth hücreleri) veya mucin 2 (MUC 2, goblet hücreleri) gibi farklılaşma belirteçlerinin ekspresyonu if (veriler gösterilmez) tarafından bu sferoidlerde tespit edilemezdi. Bununla birlikte, küresellerin ALPI (alkalin fosfataz) ve çözünen taşıyıcı aile 2, transkript varyantı 2 (SLC2A5)/glikoz taşıyıcı 5 ( GLUT5 ) mRNA'ları (Şekil 5)ifade ettiği göz önüne alındığında, enterositlere farklılaşma potansiyeli doğrulandı. Bu mRNA seviyeleri D5 ve D7'de arttı, ancak fark D3'teki seviyelere kıyasla önemli değildi (ALPI) veya sadece marjinal olarak önemli (SLC2A5).
Bu yeni yönteme dayanarak oluşturulan ve kültürlenen küresellerin CSC'leri incelemek için güvenilir bir araç olup olmadığını tanımlamak amacıyla, CSC işaretleyicilerinin ifadesi IF ve qRT-PCR tarafından analiz edildi. CD133 ve CD44, CSC7, 33, 34dahil olmak üzere kanser hücresi popülasyonlarını karakterize eder ve normal bağırsak ve kolon33 , 34,35'tekiSBC'ler tarafından da ifade edilir. CD133 pozitif hücre kümeleri esas olarak her zaman noktasında küresellerin dış yüzeyinde lokalize edildi(Şekil 6A, sol paneller). CD44 pozitif hücreler daha az sıklıkteydi, ancak her zaman CD133 pozitif hücrelerle ilişkiliydi (Şekil 6A, sağ paneller), CD133/CD44 çift pozitif CSC benzeri hücrelerin ve sadece CD133'ü ifade eden bir popülasyonun varlığını gösteren. Olfactomedin 4 (OLFM4) ve Musashi 1 (MSI1) SC/CSC belirteçleri olarak incelendi; bu belirteçler kolon mahzenlerinde36 , 37ve ayrıca farklı hücre popülasyonlarında35 ,38ileçok sınırlı bir şekilde ifade edilir. Her zaman noktasında sadece birkaç MSI1 pozitif hücre gözlendi (Şekil 7), OLFM4 ise tespit edilemez kaldı (veriler gösterilmedi). Bununla birlikte, CD44 ve CD133 için gözlendiği gibi, MSI1 etiketli hücreler sferoidlerin dış yüzeyinde şifreli veya tomurcuk benzeri yapılarda bulunurdu. Aynı belirteçler agarose kaplı yemeklerde kültürden sonra aynı zaman noktalarında mRNA düzeyinde de analiz edildi. Aldehit dehidrogenaz 1 (ALDH1a1), CSC39,40'ıniyi karakterize edilmiş bir belirteci de çalışmaya dahil edildi (Şekil 8). Prominin-1 (CD133 içinPROM1 kodlaması) ve CD44 mRNA'ların analizi, analiz edilen tüm zaman noktalarında her iki belirtecin de küresellerde ekspresyonunun doğrulanmıştır. Bununla birlikte, PROM1 mRNA seviyeleri kültürde zaman içinde oldukça benzer olsa da, CD44 seviyeleri D3'ten itibaren azaldı. Ancak fark, D10 ve D3'ün mRNA seviyelerini karşılaştırırken sadece marjinal olarak önemliydi.
MSI1 mRNA'nın analizi, her zaman noktasında küresellerde ekspresyonunu doğruladı, D3 ve D5'te D7 veya D10'dakilere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde (Şekil 8), OLFM4 mRNA tespit edilemedi (gösterilmedi). Son olarak, ALDH1a1 mRNA her zaman noktasında küresel olarak ifade edildi ve D10'da azalan bir ifade profili gösterdi, seviyeler D3'tekilere kıyasla sadece marjinal olarak önemli (Şekil 8). Kanser hücre biyolojisini incelemek için yeni modelin uygunluğunu doğrulamak için, kemoterapiye yanıt FOLFOX veya FOLFIRI ile tedavi edilen küresellerde analiz edildi, CRC hastalarına rutin olarak uygulanan kombinasyon tedavileri22 , 23,24,25. İlk olarak, hücre ölümünü indükleyen tedavilerin etkinliği, sferoidlerin özellikle ölü hücrelere giren floresan nükleik asit lekesi ile inkübe ederekincelenmiştir 26. Kontrol NT durumu ile karşılaştırıldığında, ilaçların her biri ile tedavi floresan birikimi ile ölçülen önemli hücre ölümüne neden oldu (Şekil 9A). Bu gözlem ayrıca canlı mikroskopi kullanılarak morfolojik düzeyde doğrulandı, bu da tedavilerin sferoidlerin boyutunu ve görünümünü güçlü bir şekilde etkilediğini gösterdi (Şekil 9B). Son olarak, SC/CSC belirteçlerinin ekspresyyrı qRT-PCR ile aynı koşullar altında sferoidlerde analiz edildi (Şekil 9C). İlginçtir ki, prom1 mRNA düzeylerinde hem FOLFOX hem de FOLFIRI koşullarında kontrol düzeylerine kıyasla önemli bir düşüş gözlenirken, MSI1 düzeyleri tedavilerden etkilenmedi. Ayrıca FOLFOX'un ALDH1a1 mRNA ekspresyhinde kontrole göre hiçbir etkisi yoktur, FOLFIRI ile tedavi ise düzeylerini önemli ölçüde artırmıştır. OLFM4 mRNA saptı ve CD44 mRNA düzeyleri son derece düşüktü (veriler gösterilmedi).
Şekil 1: Küresel kültürlerin kurulumu. (A) Caco2 hücrelerinin belirtilen konsantrasyonlarından başlatılan küresel oluşum per sferoid/microwell. Üst panel, iki günlük kültürden sonra bütün bir kültür plakasının temsili bir görüntüsünü gösterir. Alt panel, koşul başına seçilen mikrowelllerin görüntülerini gösterir. Görüntüler 4x büyütmede çekildi (mikrowell boyutu: 400 μm). Ölçek çubukları: düşük büyütme, 100 μm; yüksek büyütme, 30 μm. (B) Mikrowell başına farklı sayıda hücreden üretilen ve farklı zaman noktalarında analiz edilen küresellerin büyüme özellikleri. Belirtilen günlerin mikrowells'teki kültürün ilk iki gününü ve agarose kaplı plakalarda hasat edilen küresellerin sonraki kültürünü içerdiğini unutmayın. Histogramlar standart sapma ± ortalama gösterir, n = 4–6. Siyah daireler tek tek küresellerin değerlerini gösterir. Tahmini hacim formülü panelin üst kısmında gösterilir, burada d1, d2 ve d3 her küresel için ölçülen üç çapı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Küresel oluşum ve kültür koşullarının optimizasyonu. (A) Mikrowelllerden (2 gün) ve agarose kaplı yemeklerde (5 gün) kültürden iyileştikten sonra D7'deki küresellerin temsili görüntüleri, yeni kuyu hazırlama ve kültür orta koşulları kullanılarak. Ölçek çubuğu: 30 μm. (B) Mikrowelllerde hücre kültürünün başlamasından iki gün sonra taze hasat edilen küresellerin tahmini hacmi. Histogramlar standart sapma (SD), n = 4-6 ± ortalama gösterir. Siyah daireler tek tek sferoidlerin boyutunu gösterir. (C) Yeni seçilen koşullara göre uzun süreli kültürde sferoidlerin tahmini hacmi. Grafikler, küresel başına farklı sayıda hücreden üretilen ve hasatlarından sonra farklı zaman noktalarında analiz edilen küresellerin büyüme özelliklerini gösterir. Histogramlar SD, n = 6-10 ± anlamına gelir. Siyah daireler tek tek sferoidlerin boyutunu gösterir. (D) Seçilen 600 hücrenin deneysel zaman dilimi (sağ paneller) ve mikrowelller (sol panel) üzerinde küresel durum başına temsili görüntüleri. Görüntüler 4x büyütmede çekildi. Ölçek çubukları: düşük büyütme, 100 μm; yüksek büyütme, 30 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Küresellerin histolojik karakterizasyonu. Parafin bölümlerinin histolojik hematoksilin ve eozin (H&E) boyanma. Sferoidlerin hasat sonrası belirtilen zaman noktalarında temsili görüntüleri, belirtildiği gibi. Her yüksek büyütme iç kısımdaki siyah noktalı çizgiler, küreseller içindeki lümeni sınırlar. Ölçek çubukları: düşük büyütme, 30 μm; yüksek büyütme, 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Caco2 sferoid karakterizasyonu ile immünolabeling. Çoğalma belirteci, çoğalan hücre nükleer antijeni (PCNA, kırmızı) ve hücre ölüm belirteci, aktif kaspaz 3 (yeşil) (sol paneller) ve belirtilen zamanlarda β-catenin (kırmızı) (sağ paneller) için sferoidlerin immünostaining. Görüntülerde PCNA (kırmızı), aktif caspase 3 (yeşil) ve çekirdek (mavi) veya β-catenin (kırmızı) ve çekirdek (mavi) birleştirilmiş etiketleme gösterilir. Beyaz oklar, yüksek β katenin düzeylerini ifade eden hücrelere veya hücre gruplarına işaret eder. Görüntüler 20x hedefle çekildi. Ölçek çubuğu: 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Enterosit farklılaşma işaretleyicilerinin qRT-PCR ile analizi. Sırasıyla ALPI ve SLC2A5 kodlama alkali fosfataz ve GLUT5 proteinlerinin analizi. Histogramlar, ACTB'ye karşı normalleşmeden sonra standart sapma, n = 3 ± anlamına gelir. Veriler, normal iki nokta üst üste mukozasına göre kat değişimi olarak temsil edilir (kırmızı çizgi = 1). NS: önemli değil; MS: Eşleşmeyen Öğrenci'nin t-testi ile D3 ile karşılaştırıldığında marjinal olarak anlamlıdır. Kısaltmalar: qRT-PCR = nicel ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu; GLUT5 = glikoz taşıyıcı 5; SLC2A5 = çözünen taşıyıcı ailesi 2, transkript varyantı 2; ACTB = β-actin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kök hücre belirteçlerinin heterojen ekspresyolü, CD44 ve CD133, küresellerde. Belirtilen zamanlarda kök hücre belirteçleri, CD133 ve CD44 için immünostaining. Sol panellerdeki görüntülerde CD133 (yeşil) ve çekirdek (mavi) etiketlerinin birleştirilmiş olduğu görülüyor; sağ panellerdeki aynı görüntülerde CD44 (kırmızı) ve çekirdek (mavi) etiketlerinin birleştirilmiş olduğu görülüyor. Sol panellerdeki yeşil oklar CD133 ifade eden hücreleri, her iki paneldeki beyaz oklar ise CD44 ve CD133'ü ifade eden hücreleri veya hücre gruplarını işaret eder. Görüntüler 20x hedefle elde edildi. Ölçek çubuğu: 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Kök hücre işaretleyicisinin heterojen ekspresyonu, MSI1, sferoidlerde. Belirtilen zamanlarda MSI1 (kırmızı) kök hücre işaretleyicisi için immünostaining. Görüntüler, MSI1 (kırmızı) ve çekirdeklerin (mavi) birleştirilmiş etiketlemesini gösterir. Beyaz noktalı çizgiler, hücrelerin MSI1 immün etiketlemesi için pozitif olduğu bazı mahzen benzeri yapıların altını çizmektedir. Görüntüler 20x büyütmede çekildi. Ölçek çubuğu: 5 μm. Kısaltma = MSI1 = Musashi 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Kök hücre belirteçlerinin qRT-PCR ile analizi. Prom1, CD44, MSI1 ve ALDH1a1 seviyelerinin ölçülmesi belirtilen zamanlarda küresellerden mRNA üzerinde gerçekleştirildi. Histogramlar, ACTB'ye karşı normalleşmeden sonra standart sapma, n = 3 ± anlamına gelir. Veriler, normal iki nokta üst üste mukozasına göre kat değişimi olarak temsil edilir (kırmızı çizgi = 1). NS: önemli değil; MS: D3 ile karşılaştırıldığında marjinal olarak anlamlıdır, eşleşmeyen Student's t-test'i kullanılarak. *: P < 0.05 ile karşılaştırıldığında D3 veya D5, eşleşmeyen Öğrenci t-test kullanarak. Kısaltmalar: qRT-PCR = nicel ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu; PROM1 = prominin-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehit dehidrogenaz 1 alfa; ACTB = β-actin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Kemoterapinin sferoidler üzerindeki etkisi. Mikrowelllerden hasat edildikten sonra, küreseller agarose kaplı plakalarda kültürlendi ve FOLFOX veya FOLFIRI ile 3 gün boyunca tedavi edildi veya (kontrol) tedavi edilmeyen (NT) durumda muhafaza edildi. (A) Ölü hücrelerde nükleik asidin etiketlenmesine bağlı floresan analizi. Histogramlar standart sapma (SD) ± ortalama gösterir, n = 4. (B) Farklı kültür koşullarında sürdürülen küresellerin morfolojik özellikleri. Görüntüler 4x hedefle çekildi. Ölçek çubuğu: 400 μm. (C) PROM1, MSI1 ve ALDH1a1 mRNA'ların qRT-PCR ile ölçülmesi. Histogramlar, ACTB'ye karşı normalleşmeden sonra SD, n = 4 ± anlamına gelir. *: NS: önemli değil; P < 0.05; **: P < 0.01; : P < 0.001 denetim (NT) koşuluna kıyasla, eşleşmeyen Öğrenci'nin t-testini kullanarak. Kısaltmalar: FOLFOX = 5-Florouracil, 50 μg/mL; Oksaliplatin, 10 μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL; FOLFIRI = 5-Florouracil, 50 μg/mL; Irinotecan, 100 μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL; qRT-PCR = nicel ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu; PROM1 = prominin-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehit dehidrogenaz 1 alfa; ACTB = β-actin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Küresel başına istenen hücre sayısı | Kuyu başına gerekli hücre sayısı |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1,2 x 105 |
| 200 | 2,4 x 105 |
| 300 | 3,6 x 105 |
| 400 | 4,8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7,2 x 105 |
| 700 | 8,4 x 105 |
| 800 | 9,6 x 105 |
| 1000 | 1,2 x 106 |
| 2000 | 2,4 x 106 |
Tablo 1: Küresel oluşumun ve hücre tohumlamanın özeti.
| 10 mm'lik yemekler | 6 kuyulu tabaklar | 12 kuyulu tabaklar | 24 kuyulu tabaklar | 96 kuyu plakaları | |
| Kaplama Hacmi | 4 mL | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL (Aşağı ve Yukarı) |
Tablo 2: Farklı tabakların / tabakların kaplanması için agarose çözeltisinin hacimleri.
| Gen | Astar | sıra | Ürün Uzunluğu | |
| Farklılaşma işaretçileri | ALPI | iletmek | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| ters | ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | iletmek | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| ters | AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG | |||
| Kök hücre işaretleyicileri | ALDH1a1 | iletmek | GCC TTC ACA GGA TCA ACA GAG | 147 |
| ters | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | iletmek | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| ters | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| BALO1 | iletmek | GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| ters | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | iletmek | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| ters | TGA AGT GCT GCT CCT TTC YASASı | |||
| OLFM4 | iletmek | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| ters | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| Temizlik genleri | ACTB | iletmek | CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| ters | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | iletmek | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| ters | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
Tablo 3: Nicel ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu için kullanılan astarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro 3D modeller, mikroçevrim ve hücre heterojenliği de dahil olmak üzere tipik tümöral özelliklerin yeniden kapsüllenmesinde daha güvenilir göründükleri için 2D kanser hücre kültürlerinin ana deneysel dezavantajlarının üstesinden gelmektedir. Yaygın olarak kullanılan 3D küresel modeller iskelesizdir (düşük ek koşullarında kültürlenir) veya iskele bazlıdır (kültür hücrelerine biyomalzemeler kullanılarak). Bu yöntemler, kullanılan iskelenin doğasına bağlı oldukları veya yapı ve boyut olarak değişken olan küresellere yol açtıkları için farklı dezavantajlar sunar.
Mevcut protokol, kolon adenokarsinom hücre hattı Caco2'den homojen sferoidler üretmek için optimize edilmiş koşulları iskelesiz bir yöntem kullanarak rapor eder. Küreseller kolayca toplanır ve daha önce bildirilen bir çalışmanın aksine41, başarılı bir şekilde büyürler ve kültür zamanında büyüme özellikleri de analiz edilebilir. Ayrıca, bu yeni yöntemle, küreseller (a) aktif olarak çoğalır, (b) çok düşük bir hücre ölüm oranı sunar, (c) kürelerin içinde bir lümen oluşturmak için düzenler ve (d) bileşen hücrelerinin farklılaşma kapasitesini gösterir. Yeni yaklaşımın nihai amacının CSC biyolojisi üzerine yapılan çalışmalar için kullanılması olduğu göz önüne alındığında, CSC'lerin farklı belirteçlerinin ifadesi analiz edildi. İlginçtir ki, işaretçiler zaman noktasına bağlı olarak dinamik bir ifade deseni sundu ve farklı CSC popülasyonları tanımladı.
Son derece önemli olan, bu protokol ile üretilen küreseller, kemoterapötik rejimler, FOLFOX ve FOLFIRI gibi klinik uygulamalarla ilgili ilaçların analizi için kullanılabilir. Sonuçlar ayrıca analiz edilen CSC işaretleyicisine bağlı olarak hücrelerin ilaçlara heterojen bir tepkisinin altını çizmektedir. Bu gözlem, tümörlerdeki heterojen ve birden fazla CSC benzeri hücre popülasyonunun çeşitli kemosentitivite/chemoresistance özellikleri42,43gösterdiğine dair mevcut görüşle tutarlıdır. Bu bulgu, bu yeni yöntemin büyük ölçekli tarama için uygulanabilirliğini kuvvetle etkilemez. Bu çalışmada bildirilen uygulamalara ek olarak, yeni protokol daha geniş bir analiz yelpazesi (örneğin, RNA ve/veya DNA ekstraksiyonu ve büyük ölçekli analizler, batı şişkinliği ve immünofluoresans) için de kullanılabilir. Gerçekten de, küresellerin hacmi ve büyüme özellikleri, gerekirse mükemmel küresel bir formdan sapmaları dengelemek için farklı çapları da dikkate alan küre hacmi formülü uygulanarak kolayca belirlenebilir. Ancak, hücre türüne (hücre satırı veya taze birincil kültürler) ve çoğaltma süresi gibi büyüme kapasitesine bağlı olarak belirli parametreler en iyi duruma getirilmelidir. Bununla birlikte, protokol kolayca ayarlanabilen kritik adımları gösterir.
Bu makalede açıklanan küresel nesil gerçekleştirirken bazı endişe noktalarının göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, kürelerin homojenliğini ve sıkıştırılmasını teşvik etmek için yapışma önleyici durulama çözeltisi ile birkaç yıkama adımı yapılmalıdır. Bu durumda, iki yıkama gerekliydi. İkincisi, kabarcıklar mikrowelllerden çıkarılmalıdır, çünkü bu sferoidlerin doğru oluşumunu bozabilir. Üçüncüsü, hücreler santrifüj adımından sonra her mikrowell'de tohumlandıktan sonra, plaka iki gün boyunca bozulmadan kalmalıdır. Sferoid oluşumunun erken adımlarını incelerken, muhtemelen otomatik bir görselleştirme ve görüntüleme sistemi de dahil olmak üzere protokolde ek hususlara ve değişikliklere ihtiyaç vardır. Dördüncüsü, süspansiyonda oldukları göz önüne alındığında, küreselleri bozmadan ortamı değiştirmek zor olabilir. Bu nedenle, her seferinde hacmin yalnızca yarısını değiştirmeniz önerilir. Beşinci olarak, küreselleri toplarken, yapılarını korumak önemlidir. Bu nedenle, sferoidlerin uçlara bağlı kalmalarını önlemek için serum içeren bir ortamda veya PBS'de durulandıktan sonra tüm dağıtım adımları için serolojik pipetlerin veya mikropipettelerin kullanılması önerilir.
Bu iletişim kuralı kullanırken bazı sınırlamalarla da karşılaşılabilir. İlk olarak, tüm hücre satırları veya hücre türleri aynı kültür parametrelerine sahip değildir; bazı durumlarda, hücre heterojenliği ve hücrelerin geçiş sayısı / yaşlanması da sferoid oluşturma yeteneğini etkileyebilir. İkincisi, organoidlerin aksine, sferoidleri kültürde çok uzun süre korumak zor olabilir. Ek olarak, bir mikropipette ucu15aracılığıyla basit parçalanma ile çoğaltılamazlar. Üçüncüsü, bu protokol tek-küresel analiz için uyarlanamaz, çünkü tek tek sferoidleri manuel olarak kurtarmak zor olabilir. Bu teknik aynı zamanda yüksek miktarda homojen sferoid elde etmek için daha uygundur. Son olarak, diğer hücre tiplerinden kaynaklanan büyüme faktörlerinin etkilerini araştıran veya mikroçevrim önemini analiz eden çalışmalar için, modelin zenginleştirilmesi ve ortak kültür deneylerinin yapılması önemli olacaktır.
Sonuç olarak, mevcut metodoloji, Caco2 hücrelerinden verimli bir şekilde küreseller üretmek ve kültüre etmek için yeni bir protokol açıklar. Sonuçlar, bu yöntemin tümör heterojenliğinin incelenmesine ve CSC'lerin analizine uygulanabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, yüksek verimli ilaç taraması ve kanserli ve kanserli olmayan hücrelerde kök hücre biyolojisinin incelenmesi için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Görüntüleme ve Anipath recherche histoloji platformlarını (CRCL, CLB) kabul ediyoruz. FOLFOX ve FOLFIRI'nin nazik hediyesi için Centre Léon Bérard (CLB) Hastanesi eczanesine borçluyuz. Ayrıca brigitte manship'e makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) ve Inca (PLBIO19-289) tarafından desteklendi. MVG ve LC FRM'den, CF ise ARC vakfından ve Centre Léon Bérard'dan destek aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R.
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J.
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
