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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

पेट के कैंसर स्टेम सेल का अध्ययन करने के लिए स्फेरॉइड का एक त्रि-आयामी मॉडल

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/61783
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

Summary

यह प्रोटोकॉल Caco2 पेट एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं से त्रि-आयामी स्फेरॉइड उत्पन्न करने और विकसित करने के लिए एक उपन्यास, मजबूत और प्रजनन योग्य संस्कृति प्रणाली प्रस्तुत करता है। परिणाम कीमोथेरेपी के लिए प्रतिक्रिया सहित कैंसर स्टेम सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण की उपयुक्तता के लिए पहली सबूत की अवधारणा प्रदान करते हैं ।

Abstract

कोलोरेक्टल कैंसर विषमता और एक पदानुक्रमित संगठन की विशेषता है जिसमें ट्यूमर के विकास, रखरखाव और दवाओं के प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की आबादी शामिल है। इसलिए, उनके विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए सीएससी गुणों की बेहतर समझ प्रभावी चिकित्सा के लिए एक पूर्व-अपेक्षित है। हालांकि, गहराई से जांच के लिए उपयुक्त प्रीक्लिनिकल मॉडलों की कमी है । हालांकि इन विट्रो टू-डायमेंशनल (2डी) कैंसर सेल लाइनें ट्यूमर जीव विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं, लेकिन वे फेनोटाइपिक और जेनेटिक ट्यूमर विषमता को दोहराने नहीं देती हैं। इसके विपरीत, त्रि-आयामी (3 डी) मॉडल निकट-शारीरिक कैंसर जटिलता और कोशिका विषमता को संबोधित और पुन: पेश करते हैं। इस काम का उद्देश्य सीएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और प्रजनन योग्य 3 डी संस्कृति प्रणाली डिजाइन करना था। वर्तमान पद्धति 3 डी स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए शर्तों के विकास और अनुकूलन का वर्णन करती है, जो आकार में समरूप हैं, Caco2 कोलन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं से, एक मॉडल जिसका उपयोग दीर्घकालिक संस्कृति के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि स्फेरॉइड के भीतर, ल्यूमेन जैसी संरचनाओं के आसपास आयोजित कोशिकाओं को अंतर कोशिका प्रसार पैटर्न और मार्कर के एक पैनल को व्यक्त करने वाले सीएससी की उपस्थिति की विशेषता थी। ये परिणाम कीमोथेरेपी की प्रतिक्रिया सहित सेल विषमता और सीएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस 3 डी दृष्टिकोण की उपयुक्तता के लिए पहला सबूत-अवधारणा प्रदान करते हैं।

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) दुनिया में कैंसर से जुड़ी मौतों का दूसरा प्रमुख कारण बना हुआ है1। सीआरसी का विकास एक प्रगतिशील अधिग्रहण और आनुवंशिक उत्परिवर्तनों और/या एपिजेनेटिक परिवर्तन2,3के संचय का परिणाम है, जिसमें ऑन्कोजीन की सक्रियता और ट्यूमर दबाने वाले जीन3,4की निष्क्रियता शामिल है । इसके अलावा, गैर-आनुवंशिक कारक (उदाहरण के लिए, माइक्रोएनवायरमेंट) ऑन्कोजेनिक परिवर्तन में योगदान और बढ़ावा दे सकते हैं और इस प्रकार सीआरसी5के विकास में भाग लेते हैं। महत्वपूर्ण बात, सीआरसी विभिन्न कोशिका आबादी से बना है, जिसमें कुछ भेदभाव लक्षण प्रदर्शित करने वाले अविभेदित सीएससी और थोक ट्यूमर कोशिकाएं शामिल हैं, जो एक सामान्य कोलोन क्रिप्ट6, 7में एपिथेलियम के संगठन की याद ताजा करने वाली एक पदानुक्रमित संरचना कागठनकरती हैं।

सीसीएस को ट्यूमर उपस्थिति8, इसकेरखरखाव और विकास, मेटास्टैटिक क्षमता और पारंपरिक उपचारों के प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार माना जाता है6,7। ट्यूमर के भीतर, सीएससी सहित कैंसर कोशिकाएं, अपने अलग उत्परिवर्तनीय और एपिजेनेटिक प्रोफाइल, रूपात्मक और फेनोटाइपिक मतभेदों, जीन अभिव्यक्ति, चयापचय, प्रसार दरों और मेटास्टैटिक क्षमता9के संदर्भ में उच्च स्तर की विषमता और जटिलता प्रदर्शित करती हैं। इसलिए, कैंसर जीव विज्ञान, ट्यूमर प्रगति, और चिकित्सा के प्रतिरोध के अधिग्रहण और प्रभावी उपचारों में इसके अनुवाद को बेहतर ढंग से समझने के लिए, इस कैंसर विषमता और पदानुक्रम पर कब्जा करने वाले मानव प्रीक्लिनिकल मॉडल महत्वपूर्ण हैं10,11।

इन विट्रो 2 डी कैंसर सेल लाइनों का उपयोग लंबे समय तक किया जाता रहा है और ट्यूमर के विकास और चिकित्सीय अणुओं की प्रभावकारिता में अंतर्निहित तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हालांकि, मूल ट्यूमर में पाए जाने वाले फेनोइपिक और आनुवंशिक विषमता की कमी के संबंध में उनकी सीमा अब व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है12। इसके अलावा, पोषक तत्व, ऑक्सीजन, पीएच ग्रेडिएंट, और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट पुन: उत्पन्न नहीं होते हैं, माइक्रोएनवायरमेंट सीएससी11, 12सहित विभिन्न सेल प्रकारों के रखरखाव के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इन मुख्य कमियों को दूर करने के लिए, कई 3 डी मॉडलों को प्रायोगिक रूप से पता लगाने और कैंसर की जटिलता और विषमता को पुन: पेश करने के लिए विकसित किया गया है। वास्तव में, ये मॉडल ट्यूमर सेलुलर विषमता, सेल-सेल इंटरैक्शन और स्थानिक वास्तुकला का पुनर्पूंजीकरण करते हैं, जो वीवो12,13,14में मनाए गए लोगोंकेसमान हैं। ताजा ट्यूमर से स्थापित प्राथमिक ट्यूमर ऑर्गेनॉइड, साथ ही सेल लाइन-व्युत्पन्न स्फेरॉइड, मोटे तौर पर15, 16 कार्यरतहैं।

कोशिकाओं को कोशिकाओं को बनाने और कोशिका समुच्चय में बढ़ने के लिए मजबूर करने के लिए स्पेरोइड को पाड़-मुक्त या पाड़-आधारित तरीके से सुसंस्कृत किया जा सकता है। पाड़ मुक्त विधियां गैर-अनुयायी स्थितियों (उदाहरण के लिए, फांसी-ड्रॉप विधि या अल्ट्रा-कम अटैचमेंट प्लेट्स) के तहत कोशिकाओं की संस्कृति पर आधारित होती हैं, जबकि पाड़ आधारित मॉडल प्राकृतिक, सिंथेटिक या हाइब्रिड बायोमैटेरियल्स पर संस्कृति कोशिकाओंको 12,13,14पर भरोसा करते हैं। पाड़ आधारित गोलाकार विभिन्न नुकसान पेश करते हैं क्योंकि अंतिम स्फेरॉइड गठन (जैव) सामग्री की प्रकृति और संरचना पर निर्भर करेगा। यद्यपि अब तक उपलब्ध पाड़ मुक्त गोलाकार विधियां सब्सट्रेट की प्रकृति पर निर्भर नहीं करती हैं, फिर भी वे स्फेरॉइड उत्पन्न करते हैं जो संरचना और आकार17,18में भिन्न होते हैं।

इस काम का उद्देश्य स्फेरॉइड की एक मजबूत और प्रजनन योग्य 3 डी संस्कृति प्रणाली तैयार करना था, जो आकार में समरूप हैं, जो सीएससी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए Caco2 पेट एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं से बना है। Caco2 कोशिकाओं को अपनी क्षमता के कारण विशेष रूप से समय19,20के साथ अंतर करने केलिए,दृढ़ता से एक स्टेम की तरह क्षमता का सुझाव है । तदनुसार, स्फेरॉइड की दीर्घकालिक संस्कृति ने कीमोथेरेपी के लिए विभिन्न प्रतिक्रियाओं के साथ विभिन्न सीएससी आबादी की उपस्थिति का खुलासा किया।

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Protocol

नोट: सभी अभिकर्णों और सामग्रियों का विवरण सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं।

1. गोलाकार गठन

  1. स्फेरॉइड कल्चर मीडिया
    1. 4 एमएमएम एल-एलेनिल-एल-ग्लूटामाइन डिपेप्टाइड के साथ पूरक दुलबेक्को के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) से मिलकर बेसल माध्यम तैयार करें।
    2. डीएमईएम को स्टेप 1.1.1 से बेसल मीडियम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप) युक्त पूरा माध्यम तैयार करें।
    3. 1.1.1 चरण से बेसल माध्यम में 2.5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, 10% एफबीएस, और 1% पेन/स्ट्रेप युक्त डीएमईएम/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम तैयार करें।
  2. गोला बनाने के लिए प्लेटों की तैयारी
    1. लगभग 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर गर्म बेसल और डीएमईएम/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम ।
    2. प्रत्येक कुएं में 500μL एंटी-पालन रिंसिंग समाधान जोड़कर स्फेरॉइड गठन के लिए समर्पित 24-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं का पूर्वनिरीक्षित करें।
      नोट: इन प्लेटों में, प्रत्येक कुएं में 1,200 माइक्रोवेल होते हैं।
    3. प्लेटों के लिए एडाप्टर के साथ एक झूल बाल्टी रोटर में 5 मिनट के लिए 1,200 × जी पर प्लेट अपकेंद्रित्र करें।
      नोट: यदि केवल एक प्लेट का उपयोग किया जाता है, तो वजन को प्रतिसंतुलित करने के लिए पानी से भरी एक अतिरिक्त मानक प्लेट तैयार करें।
    4. प्रत्येक को गर्म बेसल माध्यम के 2 एमएल के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें, और कुओं से माध्यम को एस्पिरेट करें।
    5. माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माइक्रोवेल से बुलबुले पूरी तरह से हटा दिए गए हैं। यदि बुलबुले फंस जाते हैं, तो बुलबुले को खत्म करने के लिए 5 मिनट के लिए 1,200 × जी पर फिर से अपकेंद्रित्र करें।
    6. रिंसिंग चरण 1.2.4-1.2.5 दोहराएं।
    7. प्रत्येक कुएं में गर्म डीएमईएम/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम का 1 एमसीएल जोड़ें।
  3. स्फेरॉइड का उत्पादन
    1. डीएमईएम माध्यम में 2डी मोनोलेयर में Caco2 कोशिकाओं को 10% एफबीएस और 1% पेन/स्ट्रीप के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 युक्त आर्द्र वातावरण में बढ़ाएं (इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2के रूप में संदर्भित) ।
      नोट: उपयोग किए जाने वाले सेल मार्ग की अधिकतम संख्या 80 है।
    2. जब 80% घुलन क्षमता तक पहुंच जाता है, तो कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) 1x (10 सेमी डिश के लिए 5 एमसीएल) से धोएं, ट्राइप्सिन-एथिलीनडाइमाइन टेट्राएकेटिक एसिड (EDTA) (10 सेमी डिश के लिए 2 एमसीएल), और 37 डिग्री सेल्सियस/5% CO22 पर2-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट जोड़ें।
    3. माइक्रोस्कोप के नीचे सेल टुकड़ी की जांच करें, और 10 सेमी डिश प्रति डीएमईएम पूर्ण माध्यम के 4 एमएल जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें।
    4. कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें।
    5. 5 मिनट के लिए 1,200 × जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को त्यागें, और डीएमईएम/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम की उचित मात्रा में गोली को फिर से खर्च करें।
    6. माइक्रोवेल प्रति कोशिकाओं की वांछित संख्या को प्राप्त करने के लिए प्रति अच्छी तरह से आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए तालिका 1 को देखें। वैकल्पिक रूप से, 24-अच्छी प्लेट के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें, प्रत्येक कुएं पर विचार करने में 1,200 माइक्रोवेल होते हैं
      प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की आवश्यक संख्या = प्रति माइक्रोवेल कोशिकाओं की वांछित संख्या 1,200 ×
    7. 1 एमएल की अंतिम मात्रा में वांछित सेल नंबर प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
    8. डीएमईएम/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के 1 एमएल को अच्छी तरह से 2 एमएल की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए जोड़ें (यह भी चरण 1.2.7 देखें)।
      नोट: माइक्रोवेल में बुलबुले पेश न करने के लिए सावधान रहें।
    9. माइक्रोवेल में कोशिकाओं को पकड़ने के लिए 5 मिनट के लिए 1,200 × जी पर प्लेट को तुरंत केंद्रित करें। यदि आवश्यक हो, तो पानी से भरी एक मानक प्लेट के साथ अपकेंद्री को प्रतिसंतुलित करें।
    10. माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट का निरीक्षण करें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि कोशिकाओं को माइक्रोवेल के बीच समान रूप से वितरित किया जाता है।
    11. प्लेट को परेशान किए बिना 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: मूल प्रोटोकॉल21के अनुसार, हालांकि कई सेल लाइनें 24 घंटे के भीतर गोलाकार बना सकती हैं, कुछ को लंबे समय तक इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, 48 एच स्फेरॉइड गठन के लिए पर्याप्त हैं।
  4. माइक्रोवेल से गोलाकारों की कटाई
    1. लगभग 20 मिनट के लिए आरटी में बेसल और DMEM/तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम गर्म ।
    2. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम (1 एमएल) का आधा हिस्सा हटा दें।
    3. माइक्रोवेल से गोलाकार को उखाड़ फेंकने के लिए मध्यम को कुएं की सतह पर वापस जोड़ें।
      नोट: स्फेरॉइड को न छुएं या न करें।
    4. गोलाकारों को इकट्ठा करने के लिए 15 एमएल शंकु नली के शीर्ष पर 37 माइक्रोन रिवर्सिबल छन्नी (या 40 माइक्रोन मानक छलनी) रखें।
      नोट: यदि 40 माइक्रोन मानक छन्नी का उपयोग कर रहे हैं, तो इसे उल्टा रखें।
    5. धीरे-धीरे उखाड़ दिए गए स्फेरॉइड (चरण 1.4.3 से) को हटा दें, और छलनी के माध्यम से स्फेरॉयड निलंबन पारित करें।
      नोट: स्पेरोइड फिल्टर पर रहेंगे; एकल कोशिकाओं के माध्यम से माध्यम के साथ प्रवाह होगा ।
    6. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, किसी भी शेष स्फेरॉइड को उखाड़ फेंकने और उन्हें छलनी पर ठीक करने के लिए कुएं की पूरी सतह में गर्म बेसल माध्यम के 1 एमएल को वितरित करें।
    7. इस वाशिंग स्टेप को 1.4.6 बार दोहराएं।
    8. माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माइक्रोवेल से सभी स्फेरॉइड हटा दिए गए हैं। यदि आवश्यक हो तो धो दोहराएं (चरण 1.4.6-1.4.7)।
    9. छलनी उलटा, और यह एक नया 15 एमएल शंकु ट्यूब पर जगह है। डीएमईएम/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम से छलनी धोकर स्फेरॉइड ले लीजिए।
      नोट: एकत्र spheroids डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों और विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।
  5. स्फेरॉइड की दीर्घकालिक संस्कृति
    1. बेसल माध्यम में 1.5% एगरल्ड समाधान तैयार करें, और इसे ऑटोक्लेविंग (मानक चक्र) द्वारा स्टरलाइज करें।
    2. जबकि एगर उठे समाधान गर्म और अभी भी तरल है, टेबल 2में वर्णित मानक संस्कृति प्लेटों या व्यंजनों के कुओं को कोट करें।
      नोट: ओवन में डिश/प्लेट वार्मिंग कोटिंग कदम की सुविधा होगी । लेपित व्यंजन/प्लेटें एक बाँझ वातावरण में 10 दिनों तक के लिए आरटी पर छोड़ दिया जा सकता है और प्रकाश से संरक्षित ।
    3. एगर उठे-लेपित प्लेटों में काटा गया स्पेरोइड (चरण 1.4.9 से) बीज, और प्लेट के आकार के आधार पर अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए डीएमईएम/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम जोड़ें।
      नोट: गोलाकार समुच्चय से बचने के लिए, उन्हें 22 स्फेरॉइड/सेमी2के इष्टतम घनत्व पर बीज । निरीक्षण करें कि कोटिंग पूरी तरह से सपाट नहीं है, और यह किनारे की ओर बढ़ जाता है, जिससे प्लेट के केंद्र में एक प्रकाश संक्षिप्तता पैदा होती है। यदि गोलाकारों की संख्या बहुत अधिक है, तो वे एक दूसरे का पालन करने की अधिक संभावना है।
    4. विशिष्ट विश्लेषणों के लिए गोलाकारों की वसूली तक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ 2 पर इनक्यूबेट करें।
  6. कीमोथैरेपी दवाओं के साथ गोलाकार का उपचार
    1. प्लेट स्टेप 1.5.4 से गोलाकार, और उन्हें 2 दिनों के लिए विकसित करें। 3 दिन (D3) से शुरू, उन्हें FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 μg/ Irinotecan, १०० μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL) या FOLFOX के साथ (5-Fluorouracil, ५० μg/mL; ऑक्सलिप्लैटिन, 10 μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL) कीमोथेटिक आहार संयोजन नियमित रूप से सीआरसी रोगियों22,23, 24,25केइलाज के लिए इस्तेमाल किया, या उंहें (नियंत्रण) नहीं इलाज (एनटी) हालत में बनाए रखने ।
    2. टिप कट ऑफ (1,000 माइक्रोल टिप) के साथ एक पिपेट का उपयोग करके उपचार के 3 दिनों के बाद गोलाकार एकत्र करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रत्येक स्थिति कम से कम तीन प्रतिकृति द्वारा दर्शाई जाती है। उन्हें 3 मिनट के लिए 1,000 × जी पर सेंट्रलाइज करें, और फिर सुपरनैंट को हटा दें।
    3. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (सेक्शन 3 देखें) के लिए 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में छर्रों को ठीक करें, या आरएनए निष्कर्षण के लिए छर्रों का उपयोग करें (सेक्शन 4 देखें)।
    4. सेल डेथ का विश्लेषण करने के लिए, डीएमईएम/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम में काली संस्कृति में अच्छी प्लेटों में चरण 1.6.1 से स्फेरोइड को एक न्यूक्लिक एसिड दाग (1:5000 कमजोर पड़ने) के साथ 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जो जीवित कोशिकाओं को पार नहीं करता है, लेकिन मृत कोशिकाओं की समझौता झिल्ली में प्रवेश करता है26। एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ फ्लोरेसेंस के संचय को मापें।

2. स्फेरॉइड विकास की निगरानी

  1. एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, संस्कृति में दिन भर में विभिन्न परिस्थितियों में बनाए रखा गोलाकार के प्रतिनिधि छवियों का अधिग्रहण।
  2. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक स्फेरॉइड के तीन अलग-अलग प्रतिनिधि व्यास को मापकर छवियों का विश्लेषण करें।
  3. अनुमानित क्षेत्र मात्रा प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें।
    Equation 1

    नोट: शर्तें, d1, d2, और d3, स्फेरॉइड के तीन व्यास हैं।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और हिस्टोलॉजिकल धुंधला

  1. फिक्सेशन और पैराफिन एम्बेडिंग
    1. चरण 1.6.2 में वर्णित टिप कट के साथ एक पिपेट का उपयोग करके चयनित समय-बिंदुओं पर गोलाकार एकत्र करें, और उन्हें 2% पीएफए में आरटी में 30 मिनट के लिए ठीक करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर इस चरण में नमूनों को स्टोर करें।
    2. पैराफिन एम्बेडिंग के लिए, स्पेरोइड्स 3x को पीबीएस 1x के साथ धोएं, और उन्हें 70% इथेनॉल में फिर से खर्च करें। पैराफिन समावेशन और सेक्शनिंग के बाद, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचएंडई) धुंधला प्रदर्शन करें।
  2. पैराफिन वर्गों की इम्यूनोबेलिंग
    नोट: अप्रत्यक्ष इम्यूनोदाता के लिए 5-माइक्रोन-मोटी वर्गों का उपयोग करें।
    1. मोम को पिघलाने और डिपैराफिनाइजेशन में सुधार करने के लिए 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट स्लाइड।
    2. मिथाइलसाइक्लोहेक्सेन में 3 मिनट के लिए स्लाइड्स को दो बार धोएं।
    3. 1:1 मिथाइलसाइक्लोएक्सेन: 100% इथेनॉल में 3 मिनट के लिए स्लाइड धोएं।
    4. 100% इथेनॉल में 3 मिनट के लिए दो बार स्लाइड धोएं।
      नोट: एक रासायनिक हुड में 3.2.4 कदम करने के लिए चरण 3.2.2 के लिए सभी जोड़तोड़ प्रदर्शन करते हैं।
    5. 90% इथेनॉल में 3 मिनट के लिए स्लाइड धोएं।
    6. 75% इथेनॉल में 3 मिनट के लिए स्लाइड धोएं।
    7. 50% इथेनॉल में 3 मिनट के लिए स्लाइड धोएं।
    8. नल के पानी के नीचे स्लाइड धोएं।
    9. 5 मिनट के लिए आसुत पानी में स्लाइड रीहाइड्रेट।
    10. 0.01 मीटर साइट्रेट बफर, पीएच 6.0 के 700 एमएल तैयार करें, और इसे एक उपयुक्त कंटेनर में जोड़ें (चौड़ाई: 11.5 सेमी, लंबाई: 17 सेमी, ऊंचाई: 7 सेमी); इसमें स्लाइड्स जलमग्न हो जाते हैं। 700 डब्ल्यू पर 9-10 मिनट के लिए माइक्रोवेव में कंटेनर गर्म करें, और जब उबलना शुरू होता है, तो अतिरिक्त 10 मिनट के लिए 400-450 डब्ल्यू इनक्यूबेट की शक्ति कम करें।
    11. स्लाइड लगभग 30-40 मिनट के लिए आर टी के लिए बफर में ठंडा करते हैं ।
    12. पीबीएस में दो बार 5 मिनट के लिए स्लाइड धोएं ।
    13. वर्गों पर लागू तरल पदार्थों के लिए एक बाधा बनाने के लिए मार्कर पेन के साथ वर्गों के चारों ओर एक सर्कल बनाएं।
    14. अवरुद्ध बफर (10% सामान्य बकरी सीरम, 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), और पीबीएस में 0.02% ट्राइटन एक्स-100) के 50 माइक्रोल के साथ प्रत्येक खंड को कम से कम 30 मिनट के लिए करें।
    15. अवरुद्ध बफर को हटा दें, और इनक्यूबेशन बफर (1% सामान्य बकरी सीरम, 0.1% बीएसए, और पीबीएस में 0.02% ट्राइटन एक्स-100) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 माइक्रोन जोड़ें। आरटी में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
    16. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें, और 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड 3x धोएं।
    17. आरटी में 1 एच के लिए इनक्यूबेशन बफर में पतला फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के ५० μL के साथ स्लाइड इनक्यूबेट ।
    18. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें, और 5 मिनट के लिए PBS में स्लाइड 3x धोएं ।
    19. प्रत्येक खंड में 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल के साथ बढ़ते माध्यम के 50 माइक्रोन जोड़ें, और अनुभाग के ऊपर एक ग्लास कवरलिप रखें।

4. आरएनए निष्कर्षण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर), और मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर)

  1. अलग-अलग समय-बिंदुओं पर गोलाकार एकत्र करें, प्रत्येक बिंदु कम से कम तीन प्रतिकृति द्वारा दर्शाया गया है। उन्हें 3 मिनट के लिए 1,000 × जी पर सेंट्रलाइज करें, और फिर सुपरनैंट को हटा दें।
    नोट: छर्रों सीधे आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या आगे का उपयोग करने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक वाणिज्यिक आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके कुल आरएनए को अलग करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट के साथ पूरक डीएनए (सीडीएनए) में प्रत्येक आरएनए नमूने के रिवर्स-टाइप 500 एनजी।
  4. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद, विभिन्न एक्सोन्स में स्थित प्राइमर के साथ हाउसकीपिंग जीन को बढ़ाने के लिए सीडीएनए के 1 माइक्रोन पर पीसीआर विश्लेषण करें।
    नोट: यह कदम आरएनए की तैयारी में किसी भी जीनोमिक डीएनए संदूषण की अनुपस्थिति के सत्यापन में सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल के लिए पेप्टिडाइलप्रोलाइल आइसोमेराज बी(पीपीआईबी) प्राइमर का इस्तेमाल किया गया।
  5. ब्याज के जीन के लिए विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके पहले पतला सीडीएनए (आरएनएएस-मुक्त डबल-आसुत पानी में 1:10) के 4 माइक्रोन पर क्यूपीसीआर प्रवर्धन करें। प्रत्येक नमूने में, एक हाउसकीपिंग जीन के स्तर के खिलाफ सामान्यीकृत ΑCt विधि और मूल्यों का उपयोग करके विशिष्ट mRNA अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, β-ऐक्टिन(ACTB) का चयन किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर तालिका 3में सूचीबद्ध हैं।

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Representative Results

चूंकि स्फेरॉइड के आकार में एकरूपता की कमी वर्तमान में उपलब्ध 3 डी स्फेरॉइड कल्चर सिस्टम13की मुख्य कमियों में से एक है, इसलिए इस काम का उद्देश्य समरूप गोलाकार प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल स्थापित करना था। सबसे पहले, आदर्श कार्य दशाओं को स्थापित करने के लिए, Caco2 कोशिकाओं की विभिन्न संख्याओं का परीक्षण किया गया था, जिसमें समर्पित प्लेटों(टेबल 1)का उपयोग करके प्रति माइक्रोवेल/स्फेरोइड प्रति 50 से 2,000 कोशिकाएं शामिल थीं। वास्तव में, इन प्लेटों में प्रत्येक कुएं में 1,200 माइक्रोवेल होते हैं, जो प्रति अच्छी तरह से एक ही संख्या में स्फेरॉइड के गठन को सक्षम करते हैं, और इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि माइक्रोवेल21के प्रति एक गोलाकार का गठन। दो दिनों की संस्कृति के बाद, प्रति गोलाकार 2,000 कोशिकाओं वाले कुओं में मोनोलेयर के रूप में वृद्धि हुई, और प्रति गोलाकार 50 कोशिकाओं ने छोटे और गैर-समरूप स्फेरॉइड(चित्रा 1 ए)को जन्म दिया। इसलिए इन दोनों शर्तों को आगे के विश्लेषणों से बाहर रखा गया । दीर्घकालिक संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए, माइक्रोवेल से गोलाकारों को काटा गया था और ताजा तैयार एगरेटेड प्लेटों में गैर-अनुयायी परिस्थितियों में वरीयता प्राप्त किया गया था। तब मात्रा में परिवर्तन को मापकर प्रायोगिक समय-पाठ्यक्रम में स्पेरोइड विकास की निगरानी की गई थी। गैर-गोलाकार आकार को ध्यान में रखने के लिए, प्रत्येक गोलाकार के तीन अलग-अलग व्यास मापा गया था, और वॉल्यूम फॉर्मूला27 (चित्रा 1 B)लागू किया गया था। 100 और 200 कोशिकाओं से उत्पन्न स्फेरॉइड ने प्रयोग के पूरे पाठ्यक्रम में अपने प्रारंभिक आकार को बनाए रखा, जबकि 1,000 कोशिकाओं वाले लोग अपने बड़े आकार के कारण कटाई के दौरान विघटित हो गए और परिणामस्वरूप, उनकी मात्रा में अधिक परिवर्तनशीलता प्रस्तुत की। इसलिए, 500 कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाले स्फेरॉइड के रूप में प्रायोगिक समय-पाठ्यक्रम में आकार में सबसे समरूप वृद्धि दिखाई गई, कोशिकाओं की इस संख्या का उपयोग गोलाकार गठन के लिए किया गया था।

दूसरा, प्रति स्पेरोइड ५०० कोशिकाओं के अलावा, ३०० से ८०० कोशिकाओं को लेकर अतिरिक्त सेल संख्या का अध्ययन किया गया । इसके अलावा, गैर-पालनात्मक स्थितियों में सुधार करने के लिए, मूल प्रोटोकॉल को केवल एक धोने को लागू करने के बजाय दो बार कुओं का पूर्वउपचार करके संशोधित किया गया था। इन बदलावों(चित्रा 2 ए)के साथ गोलाकार एकरूपता और कॉम्पिटिशन में सुधार देखा गया । प्रत्येक स्थिति में गोलाकारों के आकार को फसल(चित्रा 2B)के समय मापा गया था, और उनके दीर्घकालिक विकास की निगरानी संस्कृति में पूरे दिनों में एगर उठे-लेपित व्यंजन(चित्रा 2C)में की गई थी। परिणामों के आधार पर, ५०० और ६०० कोशिकाओं/स्फेरॉइड की पुष्टि अच्छी वृद्धि और कम परिवर्तनशीलता देने वाली इष्टतम स्थितियों के रूप में की गई थी । प्रायोगिक समय-पाठ्यक्रम और कॉम्पैक्ट संरचनाओं के गठन में अधिक समरूप विकास प्रोफ़ाइल के कारण, प्रति स्फेरॉइड 600 कोशिकाओं को बाद के प्रयोगों के लिए सेल नंबर के रूप में चुना गया था। अंत में, प्रोटोकॉल को और बेहतर बनाने के लिए, डीएमईएम पूर्ण माध्यम को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 2.5% के साथ पूरक किया गया था, जिसमें अतिरिक्त विकास कारक और बाह्राश मैट्रिक्स प्रोटीन28का एक बड़ा पैनल शामिल है। दरअसल , स्फेरॉइड का बहुभाषी आकार माइक्रोएनवायरमेंट से संकेतों की कमी के कारण हो सकता है जिससे सेल ध्रुवीकरण29,30प्रभावित हो सकता है । बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के अलावा स्फेरॉइड विकास में वृद्धि हुई और उनकी एकरूपता(चित्रा 2डी) मेंसुधार हुआ। इस सुधार का एक उदाहरण 500 कोशिकाओं प्रति गोलाकार के लिए देखा जा सकता है। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स(चित्रा 1B)की अनुपस्थिति में, गोलाकार का आकार अधिक विषम था, डी 3 से डी 7 तक दोगुना हो गया और फिर एक पठार तक पहुंच गया। हालांकि, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स(चित्रा 2C)की उपस्थिति में, हर समय-बिंदु पर स्फेरॉइड का आकार अधिक सजातीय था, जो समय के साथ आनुपातिक रूप से बढ़ रहा था।

स्फेरॉइड की दीर्घकालिक विशेषताओं का विश्लेषण करने के लिए, उन्हें विस्तृत हिस्टोलॉजिकल और पैराफिन वर्गों पर विश्लेषण के लिए एगर उठे-लेपित व्यंजनों में संस्कृति के बाद विभिन्न समय-बिंदुओं पर बरामद किया गया था। एचएंडई धुंधला से पता चला है कि स्फेरॉइड के भीतर कोशिकाओं को समय के साथ उनके संगठन और आकार में परिवर्तन किया गया । दरअसल, कोशिकाओं को डी 3 में मल्टीलेयर में घनी व्यवस्थित किया गया था, जबकि मोनोलेयर में व्यवस्थित चपटी कोशिकाएं D10 में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही थीं। दिलचस्प बात यह है कि छवियों में काले बिंदीदार रेखाओं द्वारा संकेत दिया गया है, डी 5 के बाद(चित्र 3)से गोलाकार के भीतर एक ल्यूमेन दिखाई दिया। समानांतर में, सेल प्रसार और एपोप्टोसिस का विश्लेषण प्रसार मार्कर, प्रसार परमाणु एंटीजन (पीसीएनए) का उपयोग करके, और सेल डेथ मार्कर, सक्रिय कैस्पाज़ 3 द्वारा किया गया था। पीसीएनए के लिए लेबलिंग से पता चला है कि कोशिकाओं का प्रसार अक्सर स्पेरोइड की बाहरी सतह पर मौजूद होता था, कभी-कभी क्रिप्ट जैसी या कली जैसी संरचनाओं में ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की याद ताजा करती है15। इसके अलावा, D5 और D7 में पीसीएनए-पॉजिटिव कोशिकाओं में स्पष्ट वृद्धि देखी गई जिसमें D10(चित्रा 4, बाएंपैनल) द्वारा गिरावट आई। आश्चर्यजनक रूप से, सक्रिय कैस्पाज़ 3 को डी 3 और डी 5(चित्रा 4, बाएंपैनल) और लंबे समय तक (डेटा नहीं दिखाए गए) में स्पेरोइड्स में बहुत कम कोशिकाओं में देखा गया था। पैराफिन वर्गों में β-कैटेनिइन के अभिव्यक्ति पैटर्न का भी मूल्यांकन किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि β-कैटेनिन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्रत्येक समय-बिंदु पर स्पष्ट झिल्ली-बाउंड और साइटोप्लाज्मिक धुंधला(चित्रा 4,सही पैनल) के साथ देखा गया था। यह देखने लायक है कि झिल्ली से बंधे β-catenin ई-कैडरिन31के लिए बाध्यकारी द्वारा सेल सेल आसंजन में भाग लेता है । कोशिकाओं के समूहों में सभी समय-बिंदुओं पर उच्च स्तर की कैटेलिन लेबलिंग का उल्लेख किया गया था। कुछ मामलों में, कोशिकाओं ने स्पष्ट परमाणु-कैटेलिन स्थानीयकरण(चित्रा 4,सही पैनल) भी प्रदर्शित किए। कैको2 कोशिकाओं को 2डी में विट्रो में अंतर करने के लिए जाना जाता है मुख्य रूप से एंटोसाइट्स19,32में। हालांकि, यदि (डेटा नहीं दिखाया गया) द्वारा इन स्फेरॉइड में क्रोमोग्रानिन ए (एंटेरोएंड्रोक्राइन कोशिकाओं), लिसोजिम (पैनेथ कोशिकाओं) या म्यूसिन 2 (एमयूसी 2, गोबलेट कोशिकाओं) जैसे विभेदन मार्कर की अभिव्यक्ति अज्ञेय थी। हालांकि, एंटेरोसाइट्स में अंतर करने की क्षमता की पुष्टि की गई थी, यह देखते हुए कि स्फेरॉइड्स ने एएलपीआई (क्षारीय फॉस्फेटे) और सोल्यूट कैरियर परिवार 2, ट्रांसक्रिप्ट वैरिएंट 2(SLC2A5)/ग्लूकोजट्रांसपोर्टर 5(ग्लूट5)mRNAs(चित्रा 5)व्यक्त किया । ये mRNA स्तर D5 और D7 में वृद्धि हुई है, लेकिन अंतर या तो महत्वपूर्ण नहीं था(ALPI)या केवल मामूली महत्वपूर्ण(SLC2A5)D3 पर स्तर की तुलना में ।

यह परिभाषित करने के अंतिम उद्देश्य के साथ कि क्या इस नई विधि के आधार पर उत्पन्न और सुसंस्कृत सीएससी का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण हैं, सीएससी मार्कर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण आईएफ और क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा किया गया था। सीडी 133 और सीडी 44 में कैंसर सेलकी आबादीकी विशेषता है जिसमें सीएससी 7,33,34 और सामान्य आंत और पेट 33 , 34,35में अनुसूचित जाति द्वारा भी व्यक्त कियाजाताहै । CD133-सकारात्मक कोशिकाओं के समूहों को मुख्य रूप से हर समय बिंदु(चित्रा 6A, बाएं पैनल) पर गोलाकार की बाहरी सतह पर स्थानीयकृत किया गया था। CD44-सकारात्मक कोशिकाओं को कम अक्सर थे, लेकिन हमेशा CD133-सकारात्मक कोशिकाओं(चित्रा 6A,सही पैनल) के साथ जुड़ेथे, CD133/CD44 डबल सकारात्मक सीएससी की तरह कोशिकाओं की आबादी के अस्तित्व का संकेत है और एक जनसंख्या केवल CD133 व्यक्त । ओल्फोक्टोमेडिन 4 (OLFM4) और मुसाशी 1 (MSI1) अनुसूचित जाति/सीएससी मार्कर के रूप में जांच की गई; इन मार्कर कोलोन क्रिप्ट्स36,37 में एक बहुत ही सीमित तरीके से व्यक्त कर रहे हैं और यह भी अलग सेल आबादी में35,38. प्रत्येक समय-बिंदु(चित्रा 7)पर केवल कुछ MSI1-सकारात्मक कोशिकाओं को देखा गया था, जबकि OLFM4 अज्ञेय (डेटा नहीं दिखाया गया) बना रहा। फिर भी, जैसा कि सीडी 44 और सीडी 133 के लिए मनाया गया है, MSI1-लेबल कोशिकाएं क्रिप्टो जैसी या कली जैसी संरचनाओं में स्फेरॉइड की बाहरी सतह पर स्थित थीं। एक ही मार्कर भी एक ही समय में mRNA स्तर पर विश्लेषण किया गया-agarose-लेपित व्यंजनों में संस्कृति के बाद अंक । एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1(ALDH1a1),सीएससी39,40का एक अच्छी तरह से विशेषता वाला मार्कर भी अध्ययन में शामिल किया गया था(चित्र 8)। प्रोमिनिन-1 (सीडी133 के लिए PROM1 एन्कोडिंग) और सीडी 44 एमआरएएनए के विश्लेषण ने सभी समय-बिंदुओं पर स्फेरॉइड में दोनों मार्कर की अभिव्यक्ति की पुष्टि की। ध्यान दें, हालांकि, जबकि PROM1 mRNA स्तर संस्कृति में समय के साथ काफी समान थे, CD44 का स्तर D3 के बाद से कम हो गया । हालांकि, D10 और D3 के एमआरएनए स्तरों की तुलना करते समय अंतर केवल मामूली रूप से महत्वपूर्ण था।

MSI1 mRNA के विश्लेषण ने प्रत्येक बार-बिंदु पर स्फेरॉइड में अपनी अभिव्यक्ति की पुष्टि की, D7 या D10(चित्रा 8)की तुलना में D3 और D5 में काफी उच्च स्तर के साथ, जबकि OLFM4 mRNA का पता लगाने योग्य नहीं था (नहीं दिखाया गया)। अंत में, ALDH1a1 mRNA हर समय बिंदु पर spheroids में व्यक्त किया गया था और एक अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल है कि D10 में गिरावट आई दिखाया, स्तर केवल मामूली D3(चित्रा 8)पर उन लोगों की तुलना में महत्वपूर्ण जा रहा है । कैंसर सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए नए मॉडल की उपयुक्तता को मान्य करने के लिए, कीमोथेरेपी की प्रतिक्रिया का विश्लेषण फोलफॉक्स या फोलफिरी के साथ इलाज किए गए स्फेरॉइड में किया गया था, सीआरसी रोगियों को नियमित रूप से प्रशासित उपचार22,23,24, 25। सबसे पहले, कोशिका मृत्यु को प्रेरित करने में उपचारों की प्रभावकारिता की जांच फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ स्फेरोइड को इनक्यूबेटिंग करके की गई थी जो विशेष रूप से मृत कोशिकाओं में प्रवेश करती है26। नियंत्रण एनटी स्थिति की तुलना में, प्रत्येक दवाओं के साथ उपचार ने फ्लोरेसेंस(चित्र 9 ए)के संचय से मापा गया महत्वपूर्ण सेल मौत को प्रेरित किया। लाइव माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रूपात्मक स्तर पर इस अवलोकन की भी पुष्टि की गई, जिससे पता चला कि उपचार ने स्फेरॉइड(चित्रा 9B)के आकार और उपस्थिति को दृढ़ता से प्रभावित किया। अंत में, एससी/सीएससी मार्कर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा उन्हीं शर्तों(चित्रा 9सी)के तहत स्फेरॉइड में किया गया । दिलचस्प बात यह है कि नियंत्रण के स्तर की तुलना में फोलफॉक्स और फोल्फिरी दोनों स्थितियों के तहत PROM1 mRNA के स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई, जबकि MSI1 का स्तर उपचार से प्रभावित नहीं था। इसके अलावा, जबकि FOLFOX नियंत्रण की तुलना में ALDH1a1 mRNA अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं था, FOLFIRI के साथ उपचार काफी अपने स्तर में वृद्धि हुई है । OLFM4 mRNA का पता नहीं चला था, और CD44 mRNA का स्तर बेहद कम था (डेटा नहीं दिखाया गया) ।

Figure 1
चित्रा 1:गोलाकार संस्कृतियों का सेटअप। (A)सेफरॉयड फॉर्मेशन कैको2 कोशिकाओं पेआर स्फेरॉइड/माइक्रोवेल की इंगित सांद्रता से शुरू किया गया । शीर्ष पैनल संस्कृति के दो दिनों के बाद एक पूरी संस्कृति थाली की एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है । नीचे पैनल प्रति शर्त चयनित माइक्रोवेल की छवियों को दिखाता है। छवियां 4x आवर्धन (माइक्रोवेल आकार: 400 माइक्रोन) पर ली गई थीं। स्केल बार: कम आवर्धन, 100 माइक्रोन; उच्च आवर्धन, 30 माइक्रोन। (ख)प्रति माइक्रोवेल कोशिकाओं की विभिन्न संख्या से उत्पन्न स्पेरोइड्स की विकास विशेषताओं और विभिन्न समय-बिंदुओं पर विश्लेषण किया जाता है । ध्यान दें कि इंगित दिनों में माइक्रोवेल में संस्कृति के पहले दो दिन और एगर उठे-लेपित प्लेटों में काटे गए स्पेरोइड की बाद की संस्कृति शामिल है। हिस्टोग्राम शो का मतलब ± मानक विचलन, एन = 4-6। काले घेरे व्यक्तिगत स्फेरॉइड के लिए मूल्यों को दिखाते हैं। अनुमानित मात्रा के लिए सूत्र पैनल के ऊपरी भाग में दिखाया गया है, जहां d1, d2, और d3 प्रत्येक स्फेरॉइड के लिए मापा तीन व्यास इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:स्फेरॉइड गठन और संस्कृति के लिए शर्तों का अनुकूलन। (A)नई अच्छी तरह से तैयारी और संस्कृति मध्यम परिस्थितियों का उपयोग करते हुए, माइक्रोवेल (2 दिन) और एगरेज-कोटेड व्यंजन (5 दिनों) में संस्कृति से वसूली के बाद डी 7 में स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार: 30 माइक्रोन। (ख)माइक्रोवेल्स में सेल कल्चर शुरू होने के दो दिन बाद ताजा काटे गए स्पेरोइड्स की अनुमानित मात्रा । हिस्टोग्राम शो का मतलब ± मानक विचलन (एसडी), एन = 4-6। काले घेरे व्यक्तिगत स्फेरॉइड के आकार का संकेत देते हैं। (ग)नवचयनित परिस्थितियों के आधार पर दीर्घकालिक संस्कृति में स्फेरॉइड की अनुमानित मात्रा । रेखांकन प्रति गोलाकार कोशिकाओं की विभिन्न संख्या से उत्पन्न स्फेरॉइड की विकास विशेषताओं को दिखाते हैं और उनकी कटाई के बाद विभिन्न समय-बिंदुओं पर विश्लेषण करते हैं, जैसा कि संकेत दिया गया है। हिस्टोग्राम शो का मतलब ± एसडी, एन = 6-10। काले घेरे व्यक्तिगत स्फेरॉइड के आकार का संकेत देते हैं। (घ)प्रायोगिक समय-पाठ्यक्रम (दाएं पैनल) और माइक्रोवेल (बाएं पैनल) के भीतर प्रति स्पेरोइड स्थिति में चुने गए 600 कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। छवियां 4x आवर्धन पर ली गई थीं । स्केल बार: कम आवर्धन, 100 माइक्रोन; उच्च आवर्धन, 30 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:स्फेरॉइड का हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन। हिस्टोलॉजिकल हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन (एचएंडई) पैराफिन सेक्शन का धुंधला। कटाई के बाद इंगित समय-बिंदुओं पर स्फेरॉइड की प्रतिनिधि छवियां, जैसा कि संकेत दिया गया है। प्रत्येक उच्च आवर्धन इनसेट में काली बिंदीदार रेखाएं स्पेरोइड्स के भीतर ल्यूमेन को परिसीमित करती हैं। स्केल बार: कम आवर्धन, 30 माइक्रोन; उच्च आवर्धन, 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:इम्यूनोलाबेलिंग द्वारा Caco2 स्फेरॉइड लक्षण वर्णन। प्रसार मार्कर के लिए स्पेरोइड्स का इम्यूनोस्टेटिंग, सेल न्यूक्लियर एंटीजन (पीसीएनए, लाल), और सेल डेथ मार्कर, सक्रिय कैस्पाज़ 3 (ग्रीन) (बाएं पैनल) और संकेत समय पर β-कैटेनिन (लाल) (दाएं पैनल) के लिए। छवियां पीसीएनए (लाल), सक्रिय कैस्पाज़ 3 (हरा), और नाभिक (नीला) या β-catenin (लाल) और नाभिक (नीला) की विलय लेबलिंग दिखाती हैं। सफेद तीर कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों को इंगित करते हैं जो β-कैटेलिन के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। छवियों को 20x उद्देश्य के साथ लिया गया था। स्केल बार: 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा एंटोसाइट विभेदन मार्कर का विश्लेषण। ALPI और SLC2A5 एन्कोडिंग क्षारीय फॉस्फेट और ग्लूट5 प्रोटीन का विश्लेषण क्रमशः। हिस्टोग्राम शो का मतलब है ± मानक विचलन, एन = 3, ACTBके खिलाफ सामान्यीकरण के बाद । डेटा को सामान्य कोलन म्यूकोसा (रेड लाइन = 1) के सापेक्ष गुना परिवर्तन के रूप में दर्शाया जाता है। एनएस: महत्वपूर्ण नहीं; एमएस: बिनायर छात्र के टी-टेस्टद्वारा D3 की तुलना में मामूली रूप से महत्वपूर्ण है। संक्षिप्त: क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन; GLUT5 = ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 5; SLC2A5 = सोल्यूट कैरियर परिवार 2, ट्रांसक्रिप्ट वैरिएंट 2; ACTB = β-actin । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:स्फेरॉइड में स्टेम सेल मार्कर, सीडी 44 और सीडी 133 की विषम अभिव्यक्ति। संकेत समय पर स्टेम सेल मार्कर, सीडी 133 और सीडी 44 के लिए इम्यूनोस्टेटिंग। बाएं पैनलों में छवियां CD133 (हरे) और नाभिक (नीला) की विलय लेबलिंग दिखाती हैं; सही पैनलों में एक ही छवियों CD44 (लाल) और नाभिक (नीला) के विलय लेबलिंग दिखाते हैं । बाएं पैनलों में हरे तीर CD133-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं को इंगित करते हैं, और दोनों पैनलों में सफेद तीर सीडी 44 और सीडी 133 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं या कोशिकाओं के समूहों को इंगित करते हैं। छवियों को 20x उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत किया गया था। स्केल बार: 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:स्फेरॉइड में स्टेम सेल मार्कर, एमएसआई1 की विषम अभिव्यक्ति। संकेत समय पर स्टेम सेल मार्कर MSI1 (लाल) के लिए इम्यूनोस्टेटिंग। छवियां MSI1 (लाल) और नाभिक (नीला) की विलय लेबलिंग दिखाते हैं । सफेद बिंदीदार रेखाएं कुछ तहखाना जैसी संरचनाओं को रेखांकित करती हैं जहां कोशिकाएं MSI1 इम्यूनोबेलिंग के लिए सकारात्मक होती हैं। छवियां 20x आवर्धन पर लिया गया । स्केल बार: 5 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम = MSI1 = मुसाशी 1. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8:क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा स्टेम सेल मार्कर का विश्लेषण। प्रोम 1, सीडी 44, एमएसआई1 और एएलएच1ए1 स्तरों का मात्राकरण इंगित समय पर स्फेरॉइड से एमआरएनए पर किया गया था। हिस्टोग्राम शो का मतलब है ± मानक विचलन, एन = 3, ACTBके खिलाफ सामान्यीकरण के बाद । डेटा को सामान्य कोलन म्यूकोसा (रेड लाइन = 1) के सापेक्ष गुना परिवर्तन के रूप में दर्शाया जाता है। एनएस: महत्वपूर्ण नहीं; एमएस: D3 के साथ तुलना में मामूली महत्वपूर्ण है, unpaired छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर । *: पी < 0.05 D3 या D5 के साथ तुलना में, unpaired छात्र टीपरीक्षण का उपयोग कर. संक्षिप्त: क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन; PROM1 = प्रोमिनिन-1; MSI1 = मुसाशी 1; ALDH1α1 = एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज़ 1 अल्फा; ACTB = β-actin । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9:स्फेरॉइड पर कीमोथेरेपी का प्रभाव। माइक्रोवेल से कटाई के बाद, स्पेरोइड्स को एगरल्ड-लेपित प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया था और फोलफॉक्स या फोलफिरी के साथ 3 दिनों के लिए इलाज किया गया था या (नियंत्रण) गैर-उपचारित (एनटी) स्थिति में बनाए रखा गया था। (ए)मृत कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड के लेबलिंग के कारण फ्लोरेसेंस का विश्लेषण। हिस्टोग्राम शो का मतलब ± मानक विचलन (एसडी), एन = 4 है। (ख)विभिन्न संस्कृति स्थितियों में बनाए गए गोलाकारों की रूपात्मक विशेषताएं। छवियों को 4x उद्देश्य के साथ लिया गया था। स्केल बार: 400 माइक्रोन। (C)क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा PROM1, MSI1, और ALDH1a1 mRNAs का क्वांटिफिकेशन । हिस्टोग्राम शो का मतलब है ± एसडी, एन = 4, ACTBके खिलाफ सामान्यीकरण के बाद । *: एनएस: महत्वपूर्ण नहीं; पी < 0.05; **: पी < 0.01; : पी < नियंत्रण (एनटी) की स्थिति की तुलना में ०.००१, अकीदतित छात्र टी परीक्षणका उपयोग कर । संक्षिप्त: फोल्फॉक्स = 5-फ्लोरोरासिल, 50 माइक्रोग्राम/ ऑक्सलिप्लैटिन, 10 μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL; FOLFIRI = 5-Fluorouracil, 50 μg/ Irinotecan, १०० μg/mL; Leucovorin, 25 μg/mL; क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन; PROM1 = प्रोमिनिन-1; MSI1 = मुसाशी 1; ALDH1α1 = एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज़ 1 अल्फा; ACTB = β-actin । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रति कोशिकाओं की वांछित संख्या कोशिकाओं की आवश्यक संख्या प्रति अच्छी तरह से
50 6 x 104
100 1.2 x 105
200 2.4 x 105
300 3.6 x 105
400 4.8 x 105
500 6 x 105
600 7.2 x 105
700 8.4 x 105
800 9.6 x 105
1000 1.2 x 106
2000 2.4 x 106

तालिका 1: स्फेरॉइड गठन और सेल सीडिंग का सारांश।

10 मिमी व्यंजन 6-अच्छी प्लेटें 12-अच्छी प्लेटें 24-अच्छी तरह से प्लेटें 96-अच्छी तरह से प्लेटें
कोटिंग वॉल्यूम 4 एमएल 300 माइक्रोल 250 माइक्रोल 150 माइक्रोल 50 माइक्रोन (डाउन एंड अप)

तालिका 2: विभिन्न प्लेटों/व्यंजनों की कोटिंग के लिए एगरेग्यास समाधान की मात्रा।

जीन प्राइमरों अनुक्रम उत्पाद की लंबाई
भेदभाव मार्कर एएलपीआई आगे सीटीजी जीटीए सीटीए आगा टीजीसी टीजीए सीए 81
उल्टा एटीजी टीटीजी गैग एजी एजीसी टीजीए जीटी
SLC2A5 आगे टीएसी सीसीए टीएसी TGG AAG GAT GA 94
उल्टा एएसी एजी एटीसी आगा जीसीए टीगा एजी
स्टेम सेल मार्कर ALDH1a1 आगे जीसीसी टीटीसी एसीए जीजीए टीसीए एसीए गैग 147
उल्टा टीजीसी एएए टीटीसी एएसी एजीसी एटीएटी जीटीसी
एमएसआई1 आगे एजीटी टीजीजी सीएजी एक्ट एसीजी कैग जीए 131
उल्टा टीजीटीसी एएए जीटीजी एएजी एएजी
PROM1 आगे जीटीए आगा एसीसी सीजीजी एएए एजीजी 131
उल्टा जीसीसी टीटीजी टीसीसी टीटीजी जीटीए जीटीजी टीटीजी
सीडी44 आगे टीजीसी सीटीटी टीजी एसीसी AAT टीएसी 160
उल्टा टीजीए एजीटी जीसीटी जीसीटी सीसीटी टीटीसी एक्ट
ओएलएफएम4 आगे टीसीटी जीटीजी टीसीसी कैग टीटीजी टीटीटी टीसीसी 118
उल्टा एटीटी सीसीए एजीसी जीटीटीसी सीसीए सीटीसी टीजीटी
हाउसकीपिंग जीन एसीटीबी आगे सीएसी कैट टीजीजी सीएए टीजीए जीसीटीटी सी 134
उल्टा एजीजी टीसीटी टीटीजी सीजीजी टीसीसी एसीजी टी
पीपीआईबी आगे एटीसी एटीसी कैग जीजीसी जीजीए जीएसी टीटी 100
उल्टा जीसीसी सीजीटी एजीटी जीसीटी टीसीए जीटीटी टीजी

तालिका 3: मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पॉलीमरेज चेन रिएक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

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Discussion

इन विट्रो 3 डी मॉडल 2D कैंसर सेल संस्कृतियों की मुख्य प्रयोगात्मक कमियों को दूर करते हैं, क्योंकि वे माइक्रोएनवायरमेंट और सेल विषमता सहित विशिष्ट ट्यूमर सुविधाओं को फिर से पंजा लगाने में अधिक विश्वसनीय दिखाई देते हैं। आमतौर पर स्फेरॉइड के 3डी मॉडल का उपयोग किया जाता है पाड़-मुक्त (कम-अनुलग्नक स्थितियों में सुसंस्कृत) या पाड़-आधारित (संस्कृति कोशिकाओं के लिए बायोमैटेरियल्स का उपयोग करना)। ये विधियां विभिन्न नुकसान पेश करती हैं क्योंकि वे इस्तेमाल किए गए पाड़ की प्रकृति पर निर्भर करती हैं या संरचना और आकार में परिवर्तनशील स्फेरॉइड को जन्म देती हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल पाड़ मुक्त विधि का उपयोग करके कोलन एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन, कैको 2 से सजातीय स्फेरॉइड के उत्पादन के लिए अनुकूलित स्थितियों की रिपोर्ट करता है। स्पेरोइड आसानी से काटा जाता है और पहले से सूचित अध्ययन41के विपरीत, वे सफलतापूर्वक बढ़ते हैं और संस्कृति में समय के दौरान उनकी विकास विशेषताओं का विश्लेषण भी किया जा सकता है। इसके अलावा, इस नई विधि के साथ, स्फेरॉइड (ए) सक्रिय रूप से पैदा होते हैं, (ख) कोशिका मृत्यु की बहुत कम दर प्रस्तुत करते हैं, (ग) क्षेत्रों के अंदर एक ल्यूमेन बनाने के लिए व्यवस्थित करते हैं, और (घ) घटक कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता प्रदर्शित करते हैं। यह देखते हुए कि नए दृष्टिकोण का अंतिम उद्देश्य सीएससी जीव विज्ञान पर अध्ययन के लिए इसका उपयोग था, सीएससी के विभिन्न मार्कर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था । दिलचस्प बात यह है कि मार्कर ने समय-बिंदु के आधार पर एक गतिशील अभिव्यक्ति पैटर्न प्रस्तुत किया और विभिन्न सीएससी आबादी को परिभाषित किया।

अत्यंत महत्वपूर्ण, इस प्रोटोकॉल के माध्यम से उत्पन्न स्फेरॉइड का उपयोग नैमोथैरेपी रेजिस्टेंस, फोलफॉक्स और फोलफिरी जैसे नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए प्रासंगिक दवाओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। परिणाम भी सीएससी मार्कर विश्लेषण के आधार पर दवाओं के लिए कोशिकाओं की एक विषम प्रतिक्रिया को रेखांकित । यह अवलोकन वर्तमान दृष्टिकोण के अनुरूप है कि ट्यूमर के भीतर विषम और कई सीएससी जैसी कोशिका आबादी विविध रसायनों की विशिष्टता/रसायनीय गुणों को प्रदर्शित करती है42,43। यह खोज बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए इस नई विधि की प्रयोज्यता को दृढ़ता से शक्तिशाली बनाती है। इस अध्ययन में सूचित अनुप्रयोगों के अलावा, नए प्रोटोकॉल का उपयोग विश्लेषणों (जैसे, आरएनए और/या डीएनए निष्कर्षण और बड़े पैमाने पर विश्लेषण, पश्चिमी दाग, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस) की एक व्यापक श्रृंखला के लिए भी किया जा सकता है । दरअसल, गोलाकार और विकास विशेषताओं की मात्रा को आसानी से क्षेत्र की मात्रा सूत्र लागू करके निर्धारित किया जा सकता है, जो यदि आवश्यक हो, तो पूरी तरह से गोलाकार रूप से विचलन को प्रतिसंतुलित करने के लिए विभिन्न व्यासों को भी ध्यान में रखता है। हालांकि, विशिष्ट मापदंडों को सेल प्रकार (सेल लाइन या ताजा प्राथमिक संस्कृतियों) और प्रतिकृति समय जैसे विकास क्षमता के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। फिर भी, प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण चरणों को इंगित करता है जिन्हें आसानी से समायोजित किया जा सकता है।

इस लेख में वर्णित स्पेरोइड पीढ़ी को बाहर ले जाने पर चिंता के कुछ बिंदुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, क्षेत्रों की एकरूपता और कॉम्पैक्टेशन को बढ़ावा देने के लिए विरोधी पालन रिंसिंग समाधान के साथ कई धोने के कदम किए जाने चाहिए। इस मामले में, दो वॉश आवश्यक थे। दूसरा, बुलबुले को माइक्रोवेल से हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि यह स्फेरॉइड के सही गठन को परेशान कर सकता है। तीसरा, एक बार कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र चरण के बाद प्रत्येक माइक्रोवेल में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, थाली दो दिनों के लिए अशान्त रहना चाहिए । गोलाकार गठन के शुरुआती चरणों का अध्ययन करते समय प्रोटोकॉल में अतिरिक्त विचार और परिवर्तन की आवश्यकता होती है, संभवतः एक स्वचालित दृश्य और इमेजिंग सिस्टम शामिल है। चौथा, स्पेरोइड्स को परेशान किए बिना माध्यम को बदलना, यह देखते हुए कि वे निलंबन में हैं, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए, हर बार केवल आधा वॉल्यूम बदलने की सिफारिश की जाती है। पांचवां, स्पेरोइड की कटाई करते समय, उनकी संरचना को संरक्षित करना महत्वपूर्ण है। इसलिए, सीरम युक्तियों या पीबीएस में कुल्ला करने के बाद सभी डिस्पेटिंग चरणों के लिए कट ऑफ युक्तियों के साथ सीरोलॉजिकल पिपेट या माइक्रोपिपेट्स के उपयोग की सिफारिश की जाती है ताकि स्फेरॉइड को युक्तियों का पालन करने से रोका जा सके।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय कुछ सीमाएं भी सामने आ सकती हैं। सबसे पहले, सभी सेल लाइनों या सेल प्रकारों में एक ही संस्कृति पैरामीटर नहीं होते हैं; कुछ मामलों में, कोशिका विषमता और कोशिकाओं के मार्ग/वृद्धावस्था की संख्या भी गोलाकार बनाने की क्षमता को प्रभावित कर सकती है । दूसरा, ऑर्गेनॉइड के विपरीत, संस्कृति में बहुत लंबे समय तक स्फेरॉइड बनाए रखना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, उन्हें माइक्रोपिपेट टिप15के माध्यम से सरल विखंडन द्वारा दोहराया नहीं जा सकता है। तीसरा, इस प्रोटोकॉल को एकल-गोलाकार विश्लेषण के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता है क्योंकि मैन्युअल रूप से एक-एक करके स्फेरॉइड को ठीक करना मुश्किल हो सकता है। यह तकनीक एक ही समय में सजातीय स्फेरॉइड की उच्च मात्रा प्राप्त करने के लिए अधिक उपयुक्त है। अंत में, अन्य कोशिका प्रकारों से उत्पन्न होने वाले विकास कारकों के प्रभावों की जांच करने या माइक्रोएनवायरमेंट के महत्व का विश्लेषण करने वाले अध्ययनों के लिए, मॉडल को समृद्ध करना और सह-संस्कृति प्रयोगों का प्रदर्शन करना महत्वपूर्ण होगा।

अंत में, वर्तमान पद्धति Caco2 कोशिकाओं से कुशलतापूर्वक उत्पन्न और संस्कृति स्फेरॉइड के लिए एक नए प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि इस विधि को ट्यूमर विषमता के अध्ययन और सीएससी के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और कैंसर और गैर-कैंसर कोशिकाओं में स्टेम सेल जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

हम इमेजिंग और एनिवरथ रिचेचे हॉटोलॉजी प्लेटफॉर्म (सीआरसीएल, सीएलबी) को स्वीकार करते हैं। हम फोलफॉक्स और फोलफिरी के तरह के उपहार के लिए सेंटर लेओन बेरार्ड (सीएलबी) अस्पताल की फार्मेसी के ऋणी हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ब्रिजित मैनशिप का भी शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को एफआरएम (इक्विज एफआरएम 2018, DEQ20181039598) और इंका (PLBIO19-289) द्वारा समर्थित किया गया था। एमवीजी और एलसी को एफआरएम से समर्थन मिला और सीएफ को एआरसी फाउंडेशन और सेंटर लेओन बेरार्ड से समर्थन मिला।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 µm Reversible Strainer, Large  STEMCELL Technologies 27250 To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) - stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose  Sigma A9539
Aggrewell 400 24-well plates STEMCELL Technologies 34411 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit Cell Signaling 9661 dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat eBioscience/Thermo Fisher 14-9896-82 dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL STEMCELL Technologies 07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat Invitrogen 14-133-82 dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit Abcam ab157107 dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse Dako M0879 dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse Santa Cruz Biotechnology sc-7963 dilution 1:50
Black multiwell plates Thermo Fisher Scientific 237108
Citric Acid Monohydrate Sigma C1909
CLARIOstar apparatus  BMG Labtech microplate reader
Dako pen marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21202 dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A10037 dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21206 dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A10042 dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Gibco 10569010
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI Interchim FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11077 dilution 1:1000
ImageJ software Spheroid image analysis
Irinotecan  Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase  Bio-Rad 1708891
Leucovorin Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit Macherey-Nagel 740902 .250
Oxaliplatin Gift from Pharmacy CLB - stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin Gibco 15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco 14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) Takara RR420B
SYTOX- Green Thermo Fisher Scientific S7020 nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %) Gibco 25300062
Zeiss-Axiovert microscope inverted microscope for acquiring images of spheroids

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References

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Giolito, M. V., Claret, L., Frau,… More

Giolito, M. V., Claret, L., Frau, C., Plateroti, M. A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells. J. Vis. Exp. (167), e61783, doi:10.3791/61783 (2021).

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