Summary
Этот протокол представляет собой новую, надежную и воспроизводимую культурную систему для генерации и выращивания трехмерных сфероидов из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2. Результаты обеспечивают первое доказательство-концепции для целесообразности этого подхода к изучению биологии раковых стволовых клеток, в том числе ответ на химиотерапию.
Abstract
Колоректальный рак характеризуется неоднородностью и иерархической организацией, состоящей из группы раковых стволовых клеток (ККС), ответственных за развитие опухоли, поддержание и устойчивость к наркотикам. Таким образом, более глубокое понимание свойств CSC для их конкретного таргетинга является необходимым условием для эффективной терапии. Однако существует нехватка подходящих доклинических моделей для углубленных исследований. Хотя в пробирке двумерных (2D) линий раковых клеток обеспечивают ценную информацию в биологии опухоли, они не повторяют фенотипической и генетической неоднородности опухоли. В отличие от этого, трехмерные (3D) модели адрес и воспроизвести почти физиологические сложности рака и клеточной неоднородности. Целью этой работы было проектирование надежной и воспроизводимой системы 3D-культуры для изучения биологии CSC. Нынешняя методология описывает развитие и оптимизацию условий для генерации 3D сфероидов, которые являются однородными по размеру, из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2, модели, которая может быть использована для долгосрочной культуры. Важно отметить, что в сфероидах, клетки, которые были организованы вокруг люменоподобных структур, характеризовались дифференциальными моделями распространения клеток и наличием CSCs, выражаюющих панель маркеров. Эти результаты являются первым доказательством целесообразности этого 3D-подхода для изучения клеточной неоднородности и биологии CSC, включая реакцию на химиотерапию.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) остается второй ведущей причиной связанных с раком смертей в мире1. Развитие CRC является результатом прогрессивного приобретения и накопления генетических мутаций и/или эпигенетическихизменений 2,3,включая активацию онкогенов и инактивацию генов супрессораопухоли 3,4. Кроме того, негенекогенные факторы (например, микроокнирония) могут способствовать и способствовать онкогенной трансформации и, таким образом, участвовать в эволюции CRCs5. Важно отметить, что CRCs состоят из различных популяций клеток, в том числе недифференцированных CSCs и объемных опухолевых клеток, отображающих некоторые признаки дифференциации, которые представляют собой иерархическую структуру, напоминающую организацию эпителия в нормальном склепетолстой кишки 6,7.
CSCs считаются ответственными за появление опухоли8, его поддержание и рост, метастатическая способность, и устойчивость к обычнымтерапии 6,7. В опухолях раковые клетки, включая ККС, демонстрируют высокий уровень неоднородности и сложности с точки зрения их различных мутационных и эпигенетических профилей, морфологических и фенотипических различий, экспрессии генов, метаболизма, скорости распространения иметастатического потенциала 9. Таким образом, чтобы лучше понять биологию рака, прогрессирование опухоли, и приобретение устойчивости к терапии и ее перевод на эффективное лечение, человека доклиникологических моделей захвата этого рака неоднородности и иерархииважны 10,11.
В пробирке 2D линии раковых клеток были использованы в течение длительного времени и обеспечивают ценную информацию о развитии опухоли и механизмов, лежащих в основе эффективности терапевтических молекул. Тем не менее, их ограничение в отношении отсутствия фенотипической и генетической неоднородности, найденной в оригинальных опухолей в настоящее время широкопризнано 12. Кроме того, питательные вещества, кислород, градиенты рН и микроокнония опухоли не воспроизводятся, микроокантиния особенно важна для поддержания различных типов клеток, включая CSCs11,12. Для преодоления этих основных недостатков было разработано несколько 3D-моделей для экспериментального решения и воспроизведения сложности и неоднородности раковых заболеваний. По сути, эти модели повторно резюмируют неоднородность опухоли клеток, клеточно-клеточные взаимодействия и пространственную архитектуру, аналогичные тем, которые наблюдаются в vivo12,13,14. Первичные органоиды опухоли, установленные из свежих опухолей, а также клеточных линейных сфероидов, в основномиспользуются 15,16.
Сфероиды могут быть отрастаются в эшафот-бесплатно или эшафот основе образом, чтобы заставить клетки формироваться и расти в клетках агрегатов. Методы, свободные от леса, основаны на культуре клеток в неприятающих условиях (например, метод подвешивного падения или ультра-низкие пластины крепления), в то время как эшафот-модели полагаются на естественные, синтетические или гибридные биоматериалыдля культурных клеток 12,13,14. Сфероиды на основе эшафота представляют различные недостатки, поскольку окончательное образование сфероидов будет зависеть от характера и состава используемого (био)материала. Хотя эшафот свободных сфероидных методов, доступных до сих пор не полагаться на природу субстрата, они генерируют сфероиды, которые различаются поструктуре и размеру 17,18.
Эта работа была направлена на разработку надежной и воспроизводимой 3D-культуры системы сфероидов, которые являются однородными по размеру, состоящий из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2 для изучения биологии CSC. Клетки Caco2 имеют особый интерес из-за их способностидифференцировать с течением времени 19,20, сильно предлагая стволовых, как потенциал. Соответственно, долгосрочная культура сфероидов выявила наличие различных популяций CSC с различными реакциями на химиотерапию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о всех реагентов и материалов перечислены в таблице материалов.
1. Образование сфероидов
- Сфероидная культура СМИ
- Подготовка базальной среды, состоящей из модифицированных Игл Средний Dulbecco (DMEM) дополнен 4 мММ L-аланил-L-глутамин дипептида.
- Подготовка DMEM полной среды, содержащей 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин (Pen/Strep) в базальной среде от шага 1.1.1.
- Подготовка DMEM / подвал мембраны матрицы среды, содержащей 2,5% подвал мембраны матрицы, 10% FBS, и 1% Пен / Strep в базальной среде от шага 1.1.1.
- Подготовка пластин для образования сфероидов
- Теплая базальная и DMEM/подвал мембранная матричная среда при комнатной температуре (RT) в течение приблизительно 20 мин.
- Предварительно обработать скважины 24-хорошо пластины, посвященной образованию сфероидов, добавив 500 мл анти-присоединения полоскания раствора для каждой скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этих пластинах, каждый колодец состоит из 1200 микровелл. - Центрифуга пластины на 1200 × в течение 5 мин в размахивая ротор ведро с адаптерами для пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется только одна тарелка, подготовьте дополнительную стандартную тарелку, наполненную водой, чтобы уравновесить вес. - Промыть каждую скважину с 2 мл теплой базальной среды, и аспирировать среды из скважин.
- Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки были полностью удалены из микроуровн. Если пузырьки остаются в ловушке, центрифуга снова на 1200 × в течение 5 минут, чтобы устранить пузырьки.
- Повторите полоскания шаги 1.2.4-1.2.5.
- Добавьте 1 мл теплой мембранной матрицы DMEM/basement для каждой хорошо.
- Поколение сфероидов
- Выращивайте клетки Caco2 в 2D-монослойе в среде DMEM, дополненной 10% FBS и 1% Pen/Strep при 37 градусах Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 (далее именуемый 37 C/5% CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное количество проходов клеток, которые будут использоваться, составляет 80. - Когда 80% слияния достигнуто, мыть клетки с фосфатно-буферной солевой (PBS) 1x (5 мл для 10 см блюдо), добавить трипсин-этилендиамин тетраакетической кислоты (EDTA) (2 мл для 10 см блюдо), и инкубировать в течение 2-5 мин при 37 C/5% CO2.
- Проверьте отслоение клеток под микроскопом, и нейтрализовать трипсина, добавив 4 мл DMEM полной среды на 10 см блюдо.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, чтобы определить общее количество клеток.
- Центрифуга клеточной подвески при 1200 × в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и повторно поместьте гранулы в соответствующем объеме DMEM/basement мембранной матрицы среды.
- Обратитесь к таблице 1, чтобы определить количество ячеек, необходимых для достижения желаемого количества клеток на микроуэлл. Кроме того, вычислить количество ячеек, используя следующую формулу для 24-хорошо пластины, учитывая каждый колодец содержит 1200 микровелл
Требуемое количество ячеек на колодец - желаемое количество клеток на микрооколодец × 1200 - Добавьте необходимый объем подвески ячейки к каждой хорошо для достижения желаемого номера ячейки в окончательном объеме 1 мл.
- Добавьте 1 мл матрицы dmEM/basement мембраны к каждой хорошо для достижения конечного объема 2 мл на колодец (см. также шаг 1.2.7).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не ввести пузырьки в микроуровн. - Центрифуга пластины сразу на 1200 × в течение 5 минут, чтобы захватить клетки в микроуэллах. При необходимости уравновешивают центрифугу стандартной тарелкой, наполненной водой.
- Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены между микроуэллами.
- Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию/5% CO2 в течение 48 ч, не нарушая пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно первоначальному протоколу21, хотя многие клеточные линии могут образовывать сфероиды в пределах 24 ч, некоторые требуют более длительного времени инкубации. В этом протоколе, 48 ч достаточно для образования сфероидов.
- Выращивайте клетки Caco2 в 2D-монослойе в среде DMEM, дополненной 10% FBS и 1% Pen/Strep при 37 градусах Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 (далее именуемый 37 C/5% CO2).
- Сбор сфероидов из микроуровн
- Разогреть базальный и DMEM / подвал мембраны матрицы среды на RT в течение примерно 20 мин.
- Используя серологическую пипетку, удалите половину среды культуры (1 мл) из каждой колодец.
- Добавьте среду обратно на поверхность колодеца, чтобы выбить сфероиды из микроуровн.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь и не тритурировать сфероиды. - Поместите 37 мкм обратимый ситечко (или 40 мкм стандартный ситечко) на верхней части 15 мл конической трубки для сбора сфероидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании стандартного ситечком в 40 мкм поместите его вверх дном. - Аккуратно аспирировать выбитые сфероиды (из шага 1.4.3) и пройти сфероидную подвеску через ситечко.
ПРИМЕЧАНИЕ: сфероиды останутся на фильтре; одиночные клетки будут течь через со средой. - Используя серологическую пипету, обойтись 1 мл теплой базальной среды по всей поверхности хорошо, чтобы выбить все оставшиеся сфероиды и восстановить их на ситечко.
- Повторите этот шаг стирки 1.4.6 дважды.
- Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что все сфероиды были удалены из микроуровн. Повторите стирку при необходимости (шаги 1.4.6-1.4.7).
- Инвертировать ситечко, и поместите его на новую 15 мл конической трубки. Соберите сфероиды путем мытья ситечко с DMEM / подвал мембраны матрицы среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные сфероиды готовы к применению и анализу ниже по течению.
- Долгосрочная культура сфероидов
- Приготовьте 1,5% раствор агарозы в базальной среде и стерилизовать его путем автоклавирования (стандартного цикла).
- В то время как раствор агарозы теплый и все еще жидкий, покрыть колодцы стандартных пластин культуры или блюд, как описано в таблице 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потепление блюдо / пластина в духовке облегчит покрытие шаг. Посуда/тарелки с покрытием можно оставить в RT на срок до 10 дней в стерильной среде и защитить от света. - Семя собранных сфероидов (от шага 1.4.9) в агарозы покрытием пластин, и добавить DMEM / подвал мембраны матрицы среды для достижения окончательного объема в зависимости от размера пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать сусноидных агрегатов, посеять их при оптимальной плотности 22 сфероидов/см2. Обратитесь к тому, что покрытие не совсем плоское, и оно поднимается к краю, создавая световую вогнутость в центре пластины. Если количество сфероидов слишком высокое, они с большей вероятностью будут придерживаться друг друга. - Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию/5% CO2 до восстановления сфероидов для конкретныханализов.
- Лечение сфероидов химиотерапевтическими препаратами
- Плита сфероидов из шага 1.5.4, и выращивать их в течение 2 дней. Начиная с 3-го дня (D3), лечить их FOLFIRI (5-фторурацил, 50 мкг/мл; Ирикотекан, 100 мкг/мл; Лейковорин, 25 мкг/мл) или с FOLFOX (5-фторурацил, 50 мкг/мл; Оксалиплатин, 10 мкг/мл; Лейковорин, 25 мкг/мл) химиотерапевтического режима комбинации обычно используются для лечения пациентов CRC22,23,24,25, или поддерживать их в (контроль) не-обработанных (NT) состоянии.
- Соберите сфероиды после 3 дней лечения с помощью пипетки с отрезанным наконечником (1000 йл наконечник), гарантируя, что каждое условие представлено по крайней мере три репликации. Центрифуга их при 1000 × в течение 3 минут, а затем удалить супернатант.
- Зафиксировать гранулы в 2% параформальдегиде (PFA) для гистологического анализа (см. раздел 3) или использовать гранулы для извлечения РНК (см. раздел 4).
- Для анализа клеточной смерти, инкубировать сфероиды из шага 1.6.1 в черной культуре хорошо пластин в DMEM / подвал мембраны матрицы среды в течение 30 мин с нуклеиновой кислоты пятно (1:5000 разбавления), который не пронизывает живые клетки, но проникает в скомпрометированных мембранмертвых клеток 26. Измерьте накопление флуоресценции с помощью микропластиного считывателя.
2. Мониторинг роста сфероидов
- Используя перевернутый микроскоп, приобретайте репрезентативные изображения сфероидов, поддерживаемых в различных условиях в течение всех дней в культуре.
- Проанализируйте изображения, измеряя три различных репрезентативных диаметра каждого сфероида с помощью соответствующего программного обеспечения.
- Используйте следующую формулу для получения расчетной суммы сферы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Термины d1, d2 и d3 являются тремя диаметрами сфероида.
3. Иммунофлуоресценция (IF) и гистологическое окрашивание
- Фиксация и встраивание парафина
- Соберите сфероиды в выбранных точках времени с помощью пипетки с отрезанным наконечником, как описано в шаге 1.6.2, и исправить их в течение 30 минут на RT в 2% PFA.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы храните образцы на этом этапе при 4 градусах Цельсия до дальнейшего использования. - Для встраивания парафина, мыть сфероиды 3x с PBS 1x, и повторно их в 70% этанола. После включения парафина и секции, выполнить гематоксилин и эозин (ХЗЕ) окрашивание для гистологического анализа.
- Соберите сфероиды в выбранных точках времени с помощью пипетки с отрезанным наконечником, как описано в шаге 1.6.2, и исправить их в течение 30 минут на RT в 2% PFA.
- Иммунолабелирование секций парафина
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте секции толщиной 5 мкм для косвенного иммуностимтинга.- Инкубировать слайды при 60 градусов по Цельсию в течение 2 ч, чтобы расплавить воск и улучшить депарафинизацию.
- Вымойте горки дважды в течение 3 мин в метилциклогексане.
- Вымойте слайды в течение 3 мин в 1:1 метилциклолексана:100% этанола.
- Вымойте горки дважды в течение 3 мин в 100% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все манипуляции для шага 3.2.2, чтобы шаг 3.2.4 в химическом капюшоне. - Вымойте горки в течение 3 мин в 90% этанола.
- Вымойте горки в течение 3 мин в 75% этанола.
- Вымойте горки в течение 3 мин в 50% этанола.
- Вымойте горки под водопроводной водой.
- Увлажнять горки в дистиллированной воде в течение 5 мин.
- Приготовить 700 мл 0,01 м цитратного буфера, рН 6,0 и добавить в подходящий контейнер (ширина: 11,5 см, длина: 17 см, рост: 7 см); погрузить горки в него. Нагрейте контейнер в микроволновой печи в течение 9-10 мин при 700 Вт, а когда начнется кипение, уменьшите мощность до 400-450 Вт Incubate в течение еще 10 мин.
- Пусть слайды остыть в буфере к RT примерно 30-40 мин.
- Вымойте горки дважды в PBS в течение 5 минут.
- Нарисуйте круг вокруг секций маркерной ручкой, чтобы создать барьер для жидкостей, на применении к секциям.
- Инкубировать каждый раздел с 50 йл блокирующего буфера (10% нормальной сыворотки козы, 1% бычьей сыворотки альбумин (BSA), и 0,02% Тритон X-100 в PBS) по крайней мере 30 мин на RT.
- Удалите блокирующий буфер и добавьте 50 МКЛ первичных антител, разбавленных в буфере инкубации (1% нормальной козьей сыворотки, 0,1% BSA и 0,02% Triton X-100 в PBS). Инкубация в течение 2 ч на RT или на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Удалить основные антитела, и мыть слайды 3x в PBS в течение 5 мин.
- Инкубировать слайды с 50 йл флуоресцентных вторичных антител, разбавленных в буфере инкубации в течение 1 ч на RT.
- Удалить вторичные антитела, и мыть слайды 3x в PBS в течение 5 мин.
- Добавьте 50 МКЛ монтажной среды с 4',6-diamidino-2-фенилиндол к каждому разделу, и поместите стеклянную крышку над секцией.
4. Добыча РНК, обратная транскрипционно-полимеразная цепная реакция (RT-PCR) и количественный RT-PCR (qRT-PCR)
- Собирайте сфероиды в разных точках времени, каждая точка представлена по крайней мере тремя репликациями. Центрифуга их при 1000 × в течение 3 минут, а затем удалить супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пеллеты могут быть непосредственно использованы для извлечения РНК или храниться при -20 градусов по Цельсию до дальнейшего использования. - Изолировать общую РНК с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК, в соответствии с инструкциями производителя.
- Обратный транскрибировать 500 нг каждого образца РНК в дополнительные ДНК (cDNA) с коммерческим комплектом в соответствии с инструкциями производителя.
- После обратной транскрипции, выполнить анализ ПЦР на 1 МКЛ кДНК, чтобы усилить ген домашнего хозяйства с грунтовки, расположенные в различных экзонов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет проверить отсутствие какого-либо геномного загрязнения ДНК в препаратах РНК. Для этого протокола были использованы праймеры peptidylprolyl isomerase B(PPIB). - Выполните qPCR-усиление на 4 ЗЛ ранее разбавленной cDNA (1:10 в RNAse-бесплатной двойной дистиллированной воде) с помощью грунтовок, специфичных для генов, представляющих интерес. В каждом образце количественная оценка специфического экспрессии мРНК с помощью метода и значений, нормализуемых по отношению к уровням генов домашнего хозяйства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого β был выбран хе-актин(ACTB). Праймеры, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поскольку отсутствие однородности в размерах сфероидов является одним из основных недостатков имеющихся в настоящее время 3D систем сфероиднойкультуры 13,целью этой работы было создать надежный и воспроизводимый протокол для получения однородных сфероидов. Во-первых, чтобы создать идеальные условия труда, различные числа клеток Caco2 были протестированы, начиная от 50 до 2000 клеток на микроуэлл / сфероид с помощью выделенных пластин (Таблица 1). По сути, каждая колодец в этих пластинах содержит 1200 микроуровн, что позволяет сформировать одинаковое количество сфероидов на колодец, а главное, образование одного сфероида на микроуэлл21. После двух дней культуры колодцы, содержащие 2000 клеток на сфероид, выросли как монослой, а 50 клеток на сфероид породили мелкие и не однородные сфероиды(рисунок 1A). Поэтому эти два условия были исключены из дальнейшего анализа. Для создания долгосрочных культур сфероиды собирали из микроуровн и сеяли в неприязаемых условиях в свежеприготовленных пластинах с агарозой. Затем рост сфероидов отслеживался на протяжении всего экспериментального тайм-курса путем измерения изменения объема. С учетом несферической формы были измерены три различных диаметра каждого сфероида, а формула объема была применена27 (рисунок 1B). Сфероиды, генерируемые из 100 и 200 клеток, сохраняли свой первоначальный размер в течение всего эксперимента, в то время как клетки, содержащие 1000 клеток, распадались во время сбора урожая из-за их больших размеров и, следовательно, представляли большую изменчивость в их объеме. Поэтому, поскольку сфероиды, вытекающие из 500 клеток, показали наиболее однородное увеличение размера за экспериментальный тайм-курс, это количество клеток было использовано для формирования сфероидов.
Во-вторых, помимо 500 клеток на сфероид, были изучены дополнительные числа клеток в диапазоне от 300 до 800 клеток. Кроме того, для улучшения неприязающих условий, первоначальный протокол был изменен путем предварительной обработки скважин в два раза вместо применения только одной стирки. Улучшение сфероидной однородности и уплотнения наблюдалось с этими изменениями(рисунок 2A). Размер сфероидов в каждом состоянии был измерен во время сбора урожая(рисунок 2B), и их долгосрочный рост отслеживался в течение нескольких дней в культуре в блюдах с агарозой(рисунок 2C). На основе результатов, 500 и 600 клеток / сфероидов были подтверждены в качестве оптимальных условий, дать хороший рост и низкую изменчивость. Благодаря более однородному профилю роста на протяжении всего экспериментального тайм-курса и компактным структурам, 600 клеток на сфероид были выбраны в качестве числа клеток для последующих экспериментов. Наконец, для дальнейшего улучшения протокола, DMEM полная среда была дополнена 2,5% мембранной матрицы подвала, которая содержит дополнительные факторы роста и большую панель внеклеточных матричныхбелков 28. Действительно, многолобулярная форма сфероидов может быть связано с отсутствием сигналов от микропрофиония, которые могли повлиять наполяризацию клеток 29,30. Добавление мембранной матрицы подвала усиливает рост сфероидов и улучшает их однородность(рисунок 2D). Примером этого улучшения можно привести 500 клеток на сфероид. При отсутствии мембранной матрицы подвала(рисунок 1B),размер сфероидов был более неоднородным, удваиваясь с D3 до D7, а затем достигая плато. Однако, в присутствии мембранной матрицы подвала(рисунок 2C), размер сфероидов в каждой точке времени был более однородным, увеличиваясь пропорционально с течением времени.
Для анализа долгосрочных особенностей сфероидов, они были восстановлены в разные моменты времени после культуры в агарозы покрытием блюда для подробных гистологических и IF анализы на парафин разделов. Окрашивание H'E показало, что клетки в сфероидах претерпели изменения в их организации и форме с течением времени. Действительно, клетки были плотно расположены в многослойных на D3, в то время как сплющенные клетки, расположенные в монослой были хорошо видны на D10. Интересно, что, как указано на черных пунктирных линиях на изображениях, люмен появился в сфероидах от D5 и далее(рисунок 3). Параллельно, пролиферации клеток и апоптоза были проанализированы ИФ с помощью маркера распространения, размножающиеся клетки ядерного антигена (PCNA), и маркер смерти клеток, активированный caspase 3. Маркировка для PCNA показала, что размножающиеся клетки часто присутствуют на внешней поверхности сфероидов, иногда в криптовидных или бутоноподобных структурах, напоминающихорганоидные культуры 15. Кроме того, было отмечено явное увеличение ПХНА-положительных ячеек на D5 и D7, которые снизились на D10(рисунок 4, левые панели). Удивительно, но активированная каспазы 3 наблюдалась в очень немногих клетках сфероидов как на D3, так и на D5(рисунок 4, левыепанели) и в течение более длительных периодов времени (данные не показаны). В парафиновых разделах β экспрессия хе-катенина. Интересно, что высокие уровни β экспрессии катенина наблюдались в каждый момент времени с четким мембранным и цитоплазмическим окрашиванием(рисунок 4,правые панели). Стоит отметить, что мембранный β-катенин участвует в клеточной адгезии путем связывания с E-кадерин31. Высокий уровень маркировки катенина был отмечен в кластерах ячеек во всех точках времени. В некоторых случаях ячейки также демонстрировали четкую ядерную локализацию катенина(рисунок 4,правые панели). Клетки Caco2, как известно, дифференцируют in vitro в 2D в основном вэнтероциты 19,32. Тем не менее, выражение маркеров дифференциации, таких как хромогранин А (энтероэндокринные клетки), лизозим (клетки Панета) или муцин 2 (MUC 2, клетки кубков), было необнаруживаемым в этих сфероидах IF (данные не показаны). Тем не менее, потенциал для дифференциации в энтероциты был подтвержден, учитывая, что сфероиды выразили ALPI (щелочная фосфатаза) и растворимый носитель семьи 2, стенограмма вариант 2 (SLC2A5)/глюкоза транспортер 5 (GLUT5) mRNAs (Рисунок 5). Эти уровни мРНК увеличились на D5 и D7, но разница была либо незначительной(ALPI),либо лишь незначительно значительной(SLC2A5)по сравнению с уровнями D3.
С конечной целью определения того, являются ли сфероиды, генерируемые и культурные на основе этого нового метода, надежным инструментом для изучения КСК, экспрессия маркеров CSC была проанализирована IF и qRT-PCR. CD133 и CD44 характеризуют популяции раковыхклеток,включая CSCs7,33,34, а также выражаются СК в нормальном кишечнике итолстой кишке 33,34,35. Кластеры CD133-положительных клеток в основном локализовались на внешней поверхности сфероидов в каждой точкевремени (рисунок 6A, левые панели). CD44-положительные клетки были менее частыми, но всегда были связаны с CD133-положительнымиклетками (рисунок 6A, правые панели), что указывает на существование популяции CD133/CD44 двух-положительных CSC-как клетки и населения, выражают только CD133. Олфактомедин 4 (OLFM4) и Мусаси 1 (MSI1) были рассмотрены в качестве маркеров SC/CSC; эти маркеры выражаются в очень ограниченной манере в склепах толстойкишки 36,37, а также в различныхпопуляциях клеток 35,38. Только несколько MSI1-положительных клеток наблюдались в каждый моментвремени (рисунок 7), в то время как OLFM4 оставался необнаруживаемым (данные не показаны). Тем не менее, как и в случае CD44 и CD133, клетки с маркировкой MSI1 располагались на внешней поверхности сфероидов в криптовидных или бутоноподобных структурах. Те же маркеры были также проанализированы на уровне мРНК в то же время точки после культуры в агарозы покрытием блюд. Альдегид дегидрогеназы 1 (ALDH1a1), хорошо характерный маркер CSCs39,40, также был включен в исследование (Рисунок 8). Анализ проминина-1(кодирование PROM1 для CD133) и CD44 mRNAs подтвердил экспрессию обоих маркеров в сфероидах во всех проанализированных точках времени. Следует отметить, однако, в то время как уровни PROM1 mRNA были очень похожи с течением времени в культуре, уровни CD44 снизились с D3 года. Разница, однако, была лишь незначительной при сравнении уровней мРНК D10 и D3.
Анализ MSI1 mRNA подтвердил его экспрессию в сфероидах в каждой точке времени, со значительно более высокими уровнями в D3 и D5 по сравнению с уровнями D7 или D10(рисунок 8), в то время как OLFM4 mRNA не был обнаружен (не показан). Наконец, ALDH1a1 мРНК выражался в сфероидах в каждый момент времени и показал профиль выражения, который снизился на D10, уровни лишь незначительно значительным по сравнению с теми, на D3 (Рисунок 8). Для проверки целесообразности новой модели для изучения биологии раковых клеток, ответ на химиотерапию был проанализирован в сфероидов, обработанных FOLFOX или FOLFIRI, комбинированныеметоды лечениярегулярно вводят crCпациентов 22,23,24,25 . Во-первых, эффективность лечения в индуцировании смерти клеток был рассмотрен путем инкубации сфероидов с флуоресцентной нуклеиновой кислоты пятно, которое специально входит в мертвыеклетки 26. По сравнению с состоянием контроля NT, лечение с каждым из препаратов индуцированных значительной клеточной смерти измеряется накоплением флуоресценции(рисунок 9A). Это наблюдение было также подтверждено на морфологическом уровне с помощью живой микроскопии, которая показала, что лечение сильно повлияло на размер и внешний вид сфероидов(рисунок 9B). Наконец, экспрессия маркеров SC/CSC была проанализирована qRT-PCR в сфероидах при тех же условиях(рисунок 9C). Интересно, что значительное снижение уровня ПРОМ1 мРНК как в условиях FOLFOX, так и в условиях FOLFIRI наблюдалось по сравнению с уровнями контроля, в то время как уровни MSI1 не были затронуты лечением. Кроме того, в то время как FOLFOX не влияет на экспрессию ALDH1a1 mRNA по сравнению с контролем, лечение FOLFIRI значительно увеличило его уровни. OLFM4 мРНК не была обнаружена, а уровни CD44 mRNA были крайне низкими (данные не показаны).
Рисунок 1: Настройка сфероидных культур. (A) Образование сфероидов, инициированное из указанных концентраций клеток Caco2 per spheroid/microwell. Верхняя панель показывает репрезентативное изображение всей культурной пластины после двух дней культуры. Нижняя панель показывает изображения выбранных микроуровн в состоянии. Изображения были сделаны при 4x увеличении (размер микроуровна: 400 мкм). Шкала баров: низкое увеличение, 100 мкм; высокое увеличение, 30 мкм. (B)Характеристики роста сфероидов, генерируемых из разного количества клеток на микроуэлл и анализируемых в разных точках времени. Обратите внимание, что указанные дни включают первые два дня культуры в микронауэллах и последующую культуру собранных сфероидов в пластинах с агарозой. Гистограммы показывают среднее ± стандартное отклонение, n No 4-6. Черные круги показывают значения для отдельных сфероидов. Формула предполагаемого объема показана в верхней части панели, где d1, d2 и d3 указывают три диаметра, измеренные для каждого сфероида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оптимизация условий для формирования сфероидов и культуры. (A) Представитель изображения сфероидов на D7 после их восстановления от микроуровн (2 дня) и культуры в агарозы покрытием блюда (5 дней), используя новые хорошо подготовки и культуры средних условиях. Шкала бар: 30 мкм. (B)Предполагаемый объем свежесобранных сфероидов через два дня после начала клеточной культуры в микронажениях. Гистограммы показывают среднее ± стандартное отклонение (SD), n No 4-6. Черные круги указывают на размер отдельных сфероидов. (C)Предполагаемый объем сфероидов в долгосрочной культуре на основе вновь выбранных условий. Графики показывают характеристики роста сфероидов, генерируемых из разного количества клеток на сфероид и анализируемых в разных точках времени после их сбора, как указано. Гистограммы показывают среднее ± SD, n No 6-10. Черные круги указывают на размер отдельных сфероидов. (D)Репрезентативные изображения выбранных 600 клеток на сфероидное состояние в течение экспериментального тайм-курса (правые панели) и в микроуэллах (левая панель). Изображения были сделаны при 4x увеличении. Шкала баров: низкое увеличение, 100 мкм; высокое увеличение, 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Гистологическая характеристика сфероидов. Гистологический гематоксилин и эозин (ХЗЕ) окрашивание парафиновых секций. Репрезентативные изображения сфероидов в указанных точках времени после сбора урожая, как указано. Черные пунктирные линии в каждом высоком увеличении вставки делимит люмена в сфероидов. Шкала баров: низкое увеличение, 30 мкм; высокое увеличение, 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Характеристика сфероидов Caco2 путем иммунолабеля. Иммуностепенирование сфероидов для маркера распространения, размножающийся клеточный ядерный антиген (PCNA, красный) и маркер смерти клеток, активированная каспазы 3 (зеленые) (левые панели) и для β-катенина (красный) (правые панели) в указанное время. Изображения показывают слитую маркировку PCNA (красный), активированный caspase 3 (зеленый), и ядра (синий) или β-катенин (красный) и ядра (синий). Белые стрелки указывают на клетки или группы клеток, выражают высокий уровень β-катенина. Изображения были сделаны с целью 20x. Шкала бар: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ маркеров дифференциации энтероцитов по qRT-PCR. Анализ белков ALPI и SLC2A5, кодирующих щелочную фосфатазу и glut5 соответственно. Гистограммы показывают ± стандартное отклонение, n No 3, после нормализации против ACTB. Данные представлены как изменение створки по отношению к нормальной слизистой оболочке толстой кишки (красная линия No 1). NS: не является значительным; MS: незначительно значительным по сравнению с D3 по неспаренным студент t-тест. Аббревиатуры: qRT-PCR - количественная обратная транскрипционно-полимеразная цепная реакция; GLUT5 - транспортер глюкозы 5; SLC2A5 - семейство носителей 2, вариант транскрипта 2; ACTB β-актин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Неоднородное выражение маркеров стволовых клеток, CD44 и CD133, в сфероидах. Иммуностеинирование маркеров стволовых клеток, CD133 и CD44, в указанное время. Изображения в левой панели показывают слитую маркировку CD133 (зеленый) и ядра (синий); на тех же изображениях в правой панели показана слитая маркировка CD44 (красный) и ядра (синий). Зеленые стрелки в левой панели указывают на CD133-экспресс-клетки, а белые стрелки в обеих панелях указывают на клетки или группы ячеек, выражают CD44 и CD133. Изображения были приобретены с целью 20x. Шкала бар: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Неоднородное выражение маркера стволовых клеток, MSI1, в сфероидах. Иммуностенение для маркера стволовых клеток MSI1 (красный) в указанное время. Изображения показывают объединенную маркировку MSI1 (красный) и ядра (синий). Белые пунктирные линии подчеркивают некоторые крипто-как структуры, где клетки являются положительными для MSI1 иммунолабеля. Изображения были сделаны при 20-м увеличении. Шкала бар: 5 мкм. Аббревиатура - MSI1 - Мусаси 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Анализ маркеров стволовых клеток с помощью qRT-PCR. Количественная оценка уровней PROM1 , CD44, MSI1 и ALDH1a1 проводилась на мРНК из сфероидов в указанное время. Гистограммы показывают ± стандартное отклонение, n No 3, после нормализации против ACTB. Данные представлены как изменение створки по отношению к нормальной слизистой оболочке толстой кишки (красная линия No 1). NS: не является значительным; MS: незначительно значительным по сравнению с D3, используя неспареный студент t-тест. Вопрос: P < 0,05 по сравнению с D3 или D5, используя неспареный тестстудента. Аббревиатуры: qRT-PCR - количественная обратная транскрипционно-полимеразная цепная реакция; ПРОМ1 - проминин-1; MSI1 - Мусаси 1; ALDH1-1 - альдегид дегидрогеназа 1 альфа; ACTB β-актин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Влияние химиотерапии на сфероиды. После сбора урожая из микровелл, сфероиды были отработано в агарозных пластин и лечение в течение 3 дней с FOLFOX или FOLFIRI или были сохранены в (контроль) необработав (NT) состояние. (A)Анализ флуоресценции из-за маркировки нуклеиновой кислоты в мертвых клетках. Гистограммы показывают среднее ± стандартное отклонение (SD), n No 4. (B)Морфологические особенности сфероидов, поддерживаемых в различных культурных условиях. Изображения были сделаны с 4x цели. Шкала бар: 400 мкм. (C)Количественная оценка PROM1, MSI1 и ALDH1a1 mRNAs по qRT-PCR. Гистограммы показывают, ± SD, n No 4, после нормализации против ACTB. Вопрос: NS: не является значительным; P < 0.05; Вопрос:. < 0,01; : P < 0.001 по сравнению с состоянием управления (NT), используя неспареный тест студента. Аббревиатуры: FOLFOX 5-фторурацил, 50 мкг/мл; Оксалиплатин, 10 мкг/мл; Лейковорин, 25 мкг/мл; ФОЛФИРИ No 5-Фторурацил, 50 мкг/мл; Ирикотекан, 100 мкг/мл; Лейковорин, 25 мкг/мл; qRT-PCR - количественная обратная транскрипционно-полимеразная цепная реакция; ПРОМ1 - проминин-1; MSI1 - Мусаси 1; ALDH1-1 - альдегид дегидрогеназа 1 альфа; ACTB β-актин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Нужное количество клеток на сфероид | Требуемое количество ячеек на колодец |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1.2 x 105 |
| 200 | 2.4 x 105 |
| 300 | 3,6 x 105 |
| 400 | 4.8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7.2 x 105 |
| 700 | 8.4 x 105 |
| 800 | 9.6 x 105 |
| 1000 | 1.2 x 106 |
| 2000 | 2.4 x 106 |
Таблица 1: Резюме формирования сфероидов и посева клеток.
| 10 мм посуда | 6-хорошо пластины | 12-хорошо пластины | 24-хорошо пластины | 96-хорошо пластины | |
| Объем покрытия | 4 мл | 300 йл | 250 йл | 150 йл | 50 йл (вниз и вверх) |
Таблица 2: Объемы раствора агарозы для покрытия различных пластин/посуды.
| Гены | Грунтовки | последовательность | Длина продукта | |
| Маркеры дифференциации | АЛЬПИ | вперёд | CTG GTA CTC АГА TGC TGA CA | 81 |
| обратный | ATG TTG КЛЯП ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | вперёд | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| обратный | AAC AGG ATC АГА ГКА ТГА АГ | |||
| Маркеры стволовых клеток | ALDH1a1 | вперёд | ССЗ TTC АКА ГГА TCA АКА КЛЯП | 147 |
| обратный | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | вперёд | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| обратный | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| ПРОМ1 | вперёд | GTA АГА АКК CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| обратный | ССЗ ТТК ТТК ТТГ ГТА ГТГ ТТГ | |||
| CD44 | вперёд | TGC CTT TGA TGG АКК ААТ ТАС | 160 | |
| обратный | TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT | |||
| OLFM4 | вперёд | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| обратный | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| Гены домашнего хозяйства | ACTB | вперёд | CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| обратный | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | вперёд | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| обратный | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
Таблица 3: Праймеры используются для количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D-модели In vitro преодолевают основные экспериментальные недостатки 2D культур раковых клеток, поскольку они кажутся более надежными в повторном воспроизведении типичных опухолевых особенностей, включая микроокноронность и неоднородность клеток. Обычно используемые 3D-модели сфероидов не имеют эшафота (культурны в условиях низкой привязанности) или на основе эшафота (с использованием биоматериалов для культурных клеток). Эти методы представляют различные недостатки, поскольку они зависят от характера эшафот используется или привести к сфероидов, которые являются переменными по структуре и размеру.
Настоящий протокол сообщает оптимизированные условия для производства однородных сфероидов из линии аденокарциномы толстой кишки, Caco2, с помощью эшафота свободной метод. Сфероиды легко собирают и вопреки ранее сообщалосьисследование 41, они растут успешно и их характеристики роста в течение времени в культуре также могут быть проанализированы. Более того, с помощью этого нового метода сфероиды (а) активно размножаются, b) представляют 17% клеточной смертности, с) организуются для формирования люмена внутри сфер, а (d) проявляют дифференциацию способности клеток-компонентов. Учитывая, что конечной целью нового подхода было его использование для исследований по биологии CSC, было проанализировано выражение различных маркеров CSC. Интересно, что маркеры представляли динамическую модель выражения в зависимости от точки времени и определяли различные популяции CSC.
Крайне важно, сфероиды, генерируемые с помощью этого протокола, могут быть использованы для анализа препаратов, имеющих отношение к клиническим приложениям, таким как химиотерапевтические схемы, FOLFOX и FOLFIRI. Результаты также подчеркивают неоднородную реакцию клеток на препараты в зависимости от анализируемого маркера CSC. Это наблюдение согласуется с текущим мнением, что неоднородные и несколько CSC-как популяции клеток в опухолях отображения различных химиочувствительность / химиорезистанссвойства 42,43. Этот вывод сильно потенцит применимость этого нового метода для крупномасштабного скрининга. В дополнение к приложениям, о чем сообщается в данном исследовании, новый протокол может также использоваться для более широкого спектра анализов (например, РНК и/или извлечения ДНК и крупномасштабных анализов, западного блатирования и иммунофлуоресценции). Действительно, объем сфероидов и характеристики роста можно легко определить, применяя формулу объема сферы, которая при необходимости также учитывает различные диаметры для противовеса отклонениям от совершенно сферической формы. Тем не менее, конкретные параметры должны быть оптимизированы в зависимости от типа ячейки (клеточная линия или свежие первичные культуры) и емкости роста, такой как время репликации. Тем не менее, протокол указывает на критические шаги, которые могут быть легко скорректированы.
При проведении фероидного поколения, описанного в данной статье, необходимо учитывать некоторые вызывающие озабоченность моменты. Во-первых, несколько шагов мытья должны быть выполнены с анти-присоединения полоскания решение для содействия однородности и уплотнения сфер. В этом случае были необходимы две стирки. Во-вторых, пузырьки должны быть удалены из микровеллов, так как это может нарушить правильное образование сфероидов. В-третьих, как только клетки посеяны в каждом микроуэлле после шага центрифугации, пластина должна оставаться нетронутой в течение двух дней. Дополнительные соображения и изменения в протоколе необходимы при изучении ранних стадий формирования сфероидов, возможно, включая автоматизированную визуализацию и систему визуализации. В-четвертых, изменение среды, не нарушая сфероидов, учитывая, что они находятся в подвеске, может быть сложной задачей. Поэтому рекомендуется каждый раз менять только половину объема. В-пятых, при сборе сфероидов важно сохранить их структуру. Таким образом, использование серологических пипеток или микропипет с отрезанными кончиками рекомендуется для всех дозаторных шагов после полоскания в сывороткесодержащей среде или PBS, чтобы предотвратить соблюдение сфероидов к кончикам.
При использовании этого протокола также могут возникнуть некоторые ограничения. Во-первых, не все клеточные линии или типы клеток имеют одинаковые параметры культуры; в некоторых случаях неоднородность клеток и количество проходов/старения клеток могут также влиять на способность формировать сфероиды. Во-вторых, на противоположность органоидов, это может быть трудно поддерживать сфероиды в течение очень долгого времени в культуре. Кроме того, они не могут быть воспроизведены простой фрагментации через микропайпетт отзыв15. В-третьих, этот протокол не может быть адаптирован для односферного анализа, потому что вручную восстановить сфероиды один за другим может быть сложно. Этот метод больше подходит для получения большого количества однородных сфероидов в то же время. Наконец, для исследований, исследующих влияние факторов роста, происходящих из других типов клеток или анализа важности микроокниронирования, было бы важно обогатить модель и провести эксперименты по совместной культуре.
В заключение, нынешняя методология описывает новый протокол для эффективного генерации и культуры сфероидов из клеток Caco2. Результаты показывают, что этот метод может быть применен к изучению неоднородности опухоли и для анализа CSCs. Этот метод также может быть использован для скрининга высокой пропускной способности наркотиков и изучения биологии стволовых клеток в раковых и нераковой клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Мы признаем, изображения и Anipath recherche гистологии платформ (CRCL, CLB). Мы в долгу перед аптекой больницы Центра Леона Берарда (CLB) за добрый подарок FOLFOX и FOLFIRI. Мы также благодарим Брижит Химан за критическое прочтение рукописи. Работа была поддержана FRM (Equipes FRM 2018, ДЕЗ20181039598) и инков (PLBIO19-289). MVG и LC получили поддержку от FRM и CF, получивших поддержку от фонда ARC и Центра Леона Берарда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R.
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J.
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
