Summary
Denne protokollen presenterer et nytt, robust og reproduserbart kultursystem for å generere og vokse tredimensjonale sfæroider fra Caco2 kolon adenokarsinomceller. Resultatene gir det første konseptbeviset for hensiktsmessigheten av denne tilnærmingen for å studere kreft stamcellebiologi, inkludert responsen på kjemoterapi.
Abstract
Kolorektal kreft er preget av heterogenitet og en hierarkisk organisasjon som består av en populasjon av kreftstamceller (CSC) som er ansvarlige for tumorutvikling, vedlikehold og resistens mot narkotika. En bedre forståelse av CSC-egenskaper for deres spesifikke målretting er derfor en forutsetning for effektiv terapi. Imidlertid er det en paucity av egnede kliniske modeller for grundige undersøkelser. Selv om in vitro todimensjonale (2D) kreftcellelinjer gir verdifull innsikt i tumorbiologi, replikerer de ikke fenotypisk og genetisk tumor heterogenitet. Tredimensjonale (3D)-modeller adresserer og reproduserer derimot nærfysiologisk kreftkompleksitet og celle heterogenitet. Målet med dette arbeidet var å designe et robust og reproduserbart 3D-kultursystem for å studere CSC-biologi. Den nåværende metodikken beskriver utvikling og optimalisering av forhold for å generere 3D-sfæroider, som er homogene i størrelse, fra Caco2 kolon adenokarsinomceller, en modell som kan brukes til langsiktig kultur. Viktigst, innenfor sfæroidene ble cellene som ble organisert rundt lumenlignende strukturer, preget av differensialcelleproliferasjonsmønstre og ved tilstedeværelse av CSC-er som uttrykker et panel av markører. Disse resultatene gir det første konseptbeviset for hensiktsmessigheten av denne 3D-tilnærmingen for å studere celle heterogenitet og CSC-biologi, inkludert responsen på kjemoterapi.
Introduction
Kolorektal kreft (CRC) er fortsatt den nest ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden1. Utviklingen av CRC er et resultat av en progressiv oppkjøp og akkumulering av genetiske mutasjoner og / eller epigenetiske endringer2,3, inkludert aktivering av onkogenes og inaktivering av tumordempergener3,4. Videre kan ikke-genetiske faktorer (f.eks. mikromiljøet) bidra til og fremme onkogen transformasjon og dermed delta i utviklingen av CRCs5. Viktigst, CRCer består av forskjellige cellepopulasjoner, inkludert uavklarte CSC-er og bulktumorceller som viser noen differensieringsegenskaper, som utgjør en hierarkisk struktur som minner om organiseringen av epitelet i en normal kolonkrypt6,7.
CSC anses å være ansvarlig for tumorutseende8, vedlikehold og vekst, metastatisk kapasitet og motstand mot konvensjonelle terapier6,7. Innenfor svulster viser kreftceller, inkludert CSC, et høyt nivå av heterogenitet og kompleksitet når det gjelder deres distinkte mutasjons- og epigenetiske profiler, morfologiske og fenotypiske forskjeller, genuttrykk, metabolisme, spredningshastigheter og metastatisk potensial9. Derfor, for bedre å forstå kreftbiologi, tumorprogresjon og oppkjøp av motstand mot terapi og oversettelse til effektive behandlinger, er menneskelige prekliniske modeller som fanger denne kreft heterogeniteten og hierarkiet viktig10,11.
In vitro 2D kreftcellelinjer har blitt brukt i lang tid og gir verdifull innsikt i tumorutvikling og mekanismene som ligger til grunn for effekten av terapeutiske molekyler. Imidlertid er deres begrensning med hensyn til mangelen på fenotypisk og genetisk heterogenitet som finnes i de opprinnelige svulstene nå allment anerkjent12. Videre reproduseres ikke næringsstoffer, oksygen, pH-gradienter og tumormikromiljøet, mikromiljøet er spesielt viktig for vedlikehold av forskjellige celletyper, inkludert CSCer11,12. For å overvinne disse største ulempene har flere 3D-modeller blitt utviklet for å eksperimentelt adressere og reprodusere kompleksiteten og heterogeniteten til kreft. Faktisk recapitulate disse modellene tumor cellulær heterogenitet, cellecelle interaksjoner, og romlig arkitektur, ligner de observerte in vivo12,13,14. Primære tumororganoider etablert fra friske svulster, samt cellelinjeavledede sfæroider, er i stor grad ansatt15,16.
Sfæroider kan dyrkes på en stillasfri eller stillasbasert måte for å tvinge cellene til å danne seg og vokse i cellemengder. Stillasfrie metoder er basert på kulturen til celler under ikke-tilhengerforhold (f.eks. hengende dråpemetode eller ultra-lave festeplater), mens stillasbaserte modeller er avhengige av naturlige, syntetiske eller hybride biomaterialer til kulturceller12,13,14. Stillasbaserte sfæroider presenterer forskjellige ulemper, da den endelige sfæroidformasjonen vil avhenge av arten og sammensetningen av (bio)materialet som brukes. Selv om stillasfrie sfæroidmetoder som er tilgjengelige så langt, ikke er avhengige av substratets natur, genererer de sfæroider som varierer i struktur og størrelse17,18.
Dette arbeidet var rettet mot å designe et robust og reproduserbart 3D-kultursystem av sfæroider, som er homogene i størrelse, sammensatt av Caco2 kolon adenokarsinomceller for å studere CSC-biologi. Caco2 celler er av spesiell interesse på grunn av deres evne til å skille over tid19,20, sterkt antyder et stamcellelignende potensial. Følgelig avslørte sfæroidenes langsiktige kultur tilstedeværelsen av forskjellige CSC-populasjoner med forskjellige svar på kjemoterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Detaljene for alle reagenser og materialer er oppført i materiallisten.
1. Sfæroiddannelse
- Sfæroid kulturmedier
- Forbered basal medium bestående av Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 4 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid.
- Forbered DMEM komplett medium som inneholder 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Penn / Strep) i basal medium fra trinn 1.1.1.
- Forbered DMEM/kjellermembranmatrisemedium som inneholder 2,5 % kjellermembranmatrise, 10 % FBS og 1 % penn/strep i basalmedium fra trinn 1.1.1.
- Forberedelse av plater for sfæroiddannelse
- Varm basal og DMEM/kjellermembranmatrisemedium ved romtemperatur (RT) i ca. 20 min.
- Forbehandle brønnene på en 24-brønns plate dedikert til sfæroiddannelse ved å tilsette 500μL anti-tilslutningsvæskeløsning til hver brønn.
MERK: I disse platene består hver brønn av 1200 mikrowells. - Sentrifuger platen på 1200 × g i 5 min i en svingende bøtterotor med adaptere for plater.
MERK: Hvis bare én plate brukes, må du tilberede en ekstra standardplate fylt med vann for å balansere vekten. - Skyll hver brønn med 2 ml varmt basalmedium, og aspirer mediet fra brønnene.
- Vær oppmerksom på platen under mikroskopet for å sikre at bobler er helt fjernet fra mikrowells. Hvis bobler forblir fanget, sentrifugerer igjen på 1200 × g i 5 minutter for å eliminere boblene.
- Gjenta skylletrinnene 1.2.4-1.2.5.
- Tilsett 1 ml varm DMEM/kjellermembranmatrisemedium til hver brønn.
- Generering av sfæroider
- Vokse Caco2-cellene i en 2D monolayer i DMEM medium supplert med 10% FBS og 1% Penn / Strep ved 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 (heretter referert til som 37 ° C / 5% CO2).
MERK: Maksimalt antall cellepassasjer som skal brukes er 80. - Når 80% av samløpet er nådd, vask cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) 1x (5 ml for en 10 cm tallerken), tilsett trypsin-etylendiamin tetraacetisk syre (EDTA) (2 ml for en 10 cm tallerken), og inkuber i 2-5 min ved 37 °C/5 % CO2.
- Kontroller celleavløsning under mikroskopet, og nøytraliser trypsin ved å tilsette 4 ml DMEM komplett medium per 10 cm tallerken.
- Telle celler ved hjelp av et hemocytometer for å bestemme det totale antallet celler.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 1200 × g i 5 min. Kast supernatanten, og bruk pelletsen på nytt i et passende volum DMEM/kjellermembranmatrisemedium.
- Se tabell 1 for å bestemme antall celler som kreves per brønn for å oppnå ønsket antall celler per mikrowell. Alternativt kan du beregne antall celler ved hjelp av følgende formel for en 24-brønns plate, med tanke på at hver brønn inneholder 1200 mikrowells
Nødvendig antall celler per brønn = Ønsket antall celler per mikrowell × 1200 - Tilsett det nødvendige volumet av cellefjæringen til hver brønn for å oppnå ønsket cellenummer i et sluttvolum på 1 ml.
- Tilsett 1 ml DMEM/kjellermembranmatrisemedium til hver brønn for å nå det endelige volumet på 2 ml per brønn (se også trinn 1.2.7).
MERK: Pass på at du ikke introduserer bobler i mikrowells. - Sentrifuger platen umiddelbart på 1200 × g i 5 min for å fange cellene i mikrowells. Om nødvendig, motvekt sentrifugen med en standardplate fylt med vann.
- Vær oppmerksom på platen under mikroskopet for å bekrefte at cellene er jevnt fordelt mellom mikrowells.
- Inkuber platen ved 37 °C/5 % CO2 i 48 timer uten å forstyrre platen.
MERK: I henhold til den opprinnelige protokollen21, selv om mange cellelinjer kan danne sfæroider innen 24 timer, krever noen lengre inkubasjonstid. I denne protokollen er 48 timer tilstrekkelig for sfæroiddannelse.
- Vokse Caco2-cellene i en 2D monolayer i DMEM medium supplert med 10% FBS og 1% Penn / Strep ved 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 (heretter referert til som 37 ° C / 5% CO2).
- Høsting av sfæroidene fra mikrowells
- Varm opp basal- og DMEM/kjellermembranmatrisemediet på RT i ca. 20 min.
- Bruk en serologisk pipette, fjern halvparten av kulturmediet (1 ml) fra hver brønn.
- Tilsett mediet tilbake på overflaten av brønnen for å løsne sfæroidene fra mikrowells.
MERK: Ikke berør eller trianturer sfæroidene. - Plasser en 37 μm reversibel sil (eller en 40 μm standard sil) på toppen av et 15 ml konisk rør for å samle sfæroidene.
MERK: Hvis du bruker en 40 μm standard sil, plasser den opp ned. - Aspirer forsiktig de løsnede sfæroidene (fra trinn 1.4.3), og send sfæroidfjæringen gjennom silen.
MERK: Sfæroidene forblir på filteret; enkeltceller vil strømme gjennom med mediet. - Bruk en serologisk pipette, dispenser 1 ml av det varme basalmediet over hele overflaten av brønnen for å løsne eventuelle gjenværende sfæroider og gjenopprette dem på silen.
- Gjenta dette vasketrinnet 1.4.6 to ganger.
- Vær oppmerksom på platen under mikroskopet for å sikre at alle sfæroider er fjernet fra mikrowells. Gjenta vasken om nødvendig (trinn 1.4.6-1.4.7).
- Snu silen, og legg den på et nytt konisk rør på 15 ml. Samle sfæroidene ved å vaske silen med DMEM / kjellermembranmatrisemedium.
MERK: De innsamlede sfæroidene er klare for nedstrømsapplikasjoner og analyser.
- Langsiktig kultur av sfæroider
- Forbered 1,5% agarose løsning i basal medium, og steriliser den ved autoklavering (standard syklus).
- Mens agaroseoppløsningen er varm og fortsatt flytende, belegge brønnene til standard kulturplater eller retter, som beskrevet i tabell 2.
MERK: Oppvarming av fatet/platen i ovnen vil lette beleggtrinnet. Belagte retter/tallerkener kan etterlates hos RT i opptil 10 dager i et sterilt miljø og beskyttet mot lyset. - Frø de høstede sfæroidene (fra trinn 1.4.9) i de agarosebelagte platene, og tilsett DMEM / kjellermembranmatrisemedium for å oppnå det endelige volumet avhengig av platens størrelse.
MERK: For å unngå sfæroidaggregater, så dem med optimal tetthet på 22 sfæroider/cm2. Vær oppmerksom på at belegget ikke er helt flatt, og det stiger mot kanten, og skaper en lett konkavitet i midten av platen. Hvis antall sfæroider er for høyt, er det mer sannsynlig at de holder seg til hverandre. - Inkuber platen ved 37 °C/5 % CO2 til gjenvinning av sfæroidene for spesifikke analyser.
- Behandling av sfæroider med kjemoterapeutiske legemidler
- Plate sfæroider fra trinn 1.5.4, og vokse dem i 2 dager. Fra dag 3 (D3) behandler du dem med FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Irinotecan, 100 μg/ml; Leucovorin, 25 μg/ml) eller med FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Oxaliplatin, 10 μg/ml; Leucovorin, 25 μg/ml) kjemoterapeutiske regimekombinasjoner som rutinemessig brukes til å behandle CRC-pasienter22,23,24,25, eller opprettholde dem i (kontroll) ikke-behandlet (NT) tilstand.
- Samle sfæroidene etter 3 dagers behandling ved å bruke en pipette med spissen avskåret (1000 μL tips), og sørg for at hver tilstand er representert av minst tre replikerer. Sentrifuger dem på 1000 × g i 3 minutter, og fjern deretter supernatanten.
- Fest pelletsene i 2% paraformaldehyd (PFA) for histologisk analyse (se avsnitt 3), eller bruk pellets for RNA-ekstraksjon (se avsnitt 4).
- For å analysere celledød, inkuber sfæroidene fra trinn 1.6.1 i svarte kulturbrønnplater i DMEM / kjellermembranmatrisemedium i 30 min med en nukleinsyreflekk (1:5000 fortynning) som ikke gjennomsyrer levende celler, men trenger inn i de kompromitterte membranene til døde celler26. Mål opphopningen av fluorescens med en mikroplateleser.
2. Overvåking av sfæroid vekst
- Ved hjelp av et invertert mikroskop, skaffe representative bilder av sfæroider opprettholdt under forskjellige forhold gjennom dagene i kulturen.
- Analyser bildene ved å måle tre forskjellige representative diametre for hver sfæroid ved hjelp av passende programvare.
- Bruk følgende formel for å hente det estimerte sfærevolumet.
MERK: Begrepene d1, d2 og d3 er de tre diameterne på sfæroiden.
3. Immunfluorescence (IF) og histologisk farging
- Innebygging av fikserings- og parafin
- Samle sfæroidene på utvalgte tidspunkter ved hjelp av en pipette med spissen avskåret som beskrevet i trinn 1.6.2, og fest dem i 30 minutter på RT i 2% PFA.
MERK: Alternativt kan du oppbevare prøvene på dette trinnet ved 4 °C til videre bruk. - For parafininnbygging, vask sfæroidene 3x med PBS 1x, og resuspend dem i 70% etanol. Etter parafininkludering og seksjonering, utfør hematoksylin &eosin (H&E) farging for histologisk analyse.
- Samle sfæroidene på utvalgte tidspunkter ved hjelp av en pipette med spissen avskåret som beskrevet i trinn 1.6.2, og fest dem i 30 minutter på RT i 2% PFA.
- Immunolabeling av parafinseksjoner
MERK: Bruk 5-μm tykke seksjoner for indirekte immunstaining.- Inkuber glir ved 60 °C i 2 timer for å smelte voksen og forbedre deparaffiniseringen.
- Vask lysbildene to ganger i 3 min i metylcyklohexane.
- Vask lysbildene i 3 min i 1:1 metylcyklohexane:100% etanol.
- Vask lysbildene to ganger i 3 min i 100% etanol.
MERK: Utfør alle manipulasjoner for trinn 3.2.2 til trinn 3.2.4 i en kjemisk hette. - Vask lysbildene i 3 min i 90% etanol.
- Vask lysbildene i 3 min i 75% etanol.
- Vask lysbildene i 3 min i 50% etanol.
- Vask skliene under vann fra springen.
- Rehydrer lysbildene i destillert vann i 5 min.
- Forbered 700 ml 0,01 M sitratbuffer, pH 6,0, og legg den til en passende beholder (bredde: 11,5 cm, lengde: 17 cm, høyde: 7 cm); nedsenke lysbildene i den. Varm beholderen i mikrobølgeovnen i 9-10 min ved 700 W, og når kokingen starter, reduser strømmen til 400-450 W. Inkuber i ytterligere 10 minutter.
- La lysbildene avkjøles i bufferen til RT i ca. 30-40 min.
- Vask lysbildene to ganger i PBS i 5 minutter.
- Tegn en sirkel rundt inndelingene med en markørpenn for å opprette en barriere for væsker som påføres seksjonene.
- Inkuber hver seksjon med 50 μL blokkeringsbuffer (10% normalt geiteserum, 1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,02% Triton X-100 i PBS) i minst 30 minutter ved RT.
- Fjern blokkeringsbufferen, og tilsett 50 μL primærantistoffer fortynnet i inkubasjonsbufferen (1% normalt geitserum, 0,1% BSA og 0,02% Triton X-100 i PBS). Inkuber i 2 timer ved RT eller over natten ved 4 °C.
- Fjern de primære antistoffene, og vask lysbildene 3x i PBS i 5 min.
- Inkuber lysbildene med 50 μL fluorescerende sekundære antistoffer fortynnet i inkubasjonsbufferen i 1 time ved RT.
- Fjern sekundære antistoffer, og vask lysbildene 3x i PBS i 5 min.
- Tilsett 50 μL monteringsmedium med 4′,6-diamidino-2-fenylindole i hver seksjon, og legg et glassdeksler over delen.
4. RNA-ekstraksjon, omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) og kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR)
- Samle sfæroider på forskjellige tidspunkter, hvert punkt representert av minst tre replikerer. Sentrifuger dem på 1000 × g i 3 minutter, og fjern deretter supernatanten.
MERK: Pellets kan brukes direkte til RNA-ekstraksjon eller oppbevares ved -20 °C inntil videre bruk. - Isoler den totale RNA ved hjelp av et kommersielt RNA-isolasjonssett, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Omvendt transkribering 500 ng av hver RNA-prøve til komplementært DNA (cDNA) med et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Etter omvendt transkripsjon, utfør en PCR-analyse på 1 μL cDNA for å forsterke et rengjøringsgen med primere plassert i forskjellige eksoner.
MERK: Dette trinnet muliggjør verifisering av fraværet av genomisk DNA-forurensning i RNA-preparatene. For denne protokollen ble peptidylprolyl isomerase B(PPIB) primere brukt. - Utfør qPCR-forsterkning på 4 μL tidligere fortynnet cDNA (1:10 i RNAse-fritt dobbeltdestillert vann) ved hjelp av primere som er spesifikke for gener av interesse. I hvert utvalg kvantifiserer du spesifikt mRNA-uttrykk ved hjelp av ΔΔCt-metoden og verdier normalisert mot et rengjøringsgennivå.
MERK: For denne protokollen ble β-aktin (ACTB) valgt. Primere som brukes i denne protokollen, er oppført i tabell 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som mangel på homogenitet i størrelsen på sfæroider er en av de viktigste ulempene ved for tiden tilgjengelige 3D sfæroid kultursystemer13, var målet med dette arbeidet å sette opp en pålitelig og reproduserbar protokoll for å oppnå homogene sfæroider. For det første, for å etablere ideelle arbeidsforhold, ble forskjellige antall Caco2-celler testet, alt fra 50 til 2000 celler per mikrowell / sfæroid ved hjelp av dedikerte plater (Tabell 1). Faktisk inneholder hver brønn i disse platene 1200 mikrowells, noe som muliggjør dannelse av samme antall sfæroider per brønn, og enda viktigere, dannelsen av en sfæroid per mikrowell21. Etter to dager med kultur vokste brønnene som inneholdt 2000 celler per sfæroid som monolayer, og 50 celler per sfæroid ga opphav til små og ikke-homogene sfæroider (Figur 1A). Disse to forholdene ble derfor utelukket fra videre analyser. For å etablere langsiktige kulturer ble sfæroider høstet fra mikrowells og frø under ikke-tilhengerforhold i nylagde agarosebelagte plater. Sfæroid vekst ble deretter overvåket gjennom hele det eksperimentelle tidsforløpet ved å måle volumendringen. For å ta hensyn til den ikke-sfæriske formen ble tre forskjellige diametre av hver sfæroid målt, og volumformelen ble brukt27 (Figur 1B). Sfæroider generert fra 100 og 200 celler opprettholdt sin opprinnelige størrelse gjennom hele eksperimentet, mens de som inneholder 1000 celler gikk i oppløsning under høsting på grunn av deres store størrelse og presenterte derfor mer variasjon i volumet. Derfor, som sfæroider som følge av 500 celler viste den mest homogene økningen i størrelse over det eksperimentelle tidsforløpet, ble dette antall celler brukt til sfæroiddannelse.
For det andre, foruten 500 celler per sfæroid, ble ytterligere celletall fra 300 til 800 celler studert. Videre, for å forbedre de ikke-tilhengerforholdene, ble den opprinnelige protokollen modifisert ved å forbehandle brønnene to ganger i stedet for bare å bruke en vask. En forbedring i sfæroid homogenitet og komprimering ble observert med disse endringene (Figur 2A). Størrelsen på sfæroidene i hver tilstand ble målt på slaktetidspunktet (figur 2B), og deres langsiktige vekst ble overvåket gjennom dagene i kultur i agarosebelagte retter (Figur 2C). Basert på resultatene ble 500 og 600 celler/sfæroid bekreftet som de optimale forholdene som gir god vekst og lav variasjon. På grunn av den mer homogene vekstprofilen gjennom hele det eksperimentelle tidsforløpet og de kompakte strukturene som ble dannet, ble 600 celler per sfæroid valgt som cellenummer for etterfølgende eksperimenter. Til slutt, for å forbedre protokollen ytterligere, ble DMEM komplett medium supplert med 2,5% av kjellermembranmatrisen, som inneholder flere vekstfaktorer og et stort panel av ekstracellulære matriseproteiner28. Faktisk kan den multilobulære formen på sfæroidene skyldes mangel på signaler fra mikromiljøet som kan ha påvirket cellepolariseringen29,30. Tilsetningen av kjellermembranmatrise forbedret sfæroid vekst og forbedret deres homogenitet (Figur 2D). Et eksempel på denne forbedringen kan ses for 500 celler per sfæroid. I fravær av kjellermembranmatrisen (Figur 1B) var størrelsen på sfæroidene mer heterogen, doblet fra D3 til D7 og nådde deretter et platå. Men i nærvær av kjellermembranmatrisen (Figur 2C), var størrelsen på sfæroidene ved hvert tidspunkt mer homogen, og økte proporsjonalt over tid.
For å analysere de langsiktige egenskapene til sfæroidene ble de gjenvunnet på forskjellige tidspunkter etter kultur i agarosebelagte retter for detaljerte histologiske og IF-analyser på parafinseksjoner. H&E farging viste at celler i sfæroidene gjennomgikk endringer i deres organisasjon og form over tid. Faktisk ble celler tett ordnet i flerlags ved D3, mens flate celler arrangert i monolayers var tydelig synlige på D10. Interessant, som angitt av de svarte stiplede linjene i bildene, oppstod en lumen i sfæroidene fra D5 og utover (Figur 3). Parallelt ble celleproliferasjon og apoptose analysert av IF ved hjelp av spredningsmarkøren, spredning av celle kjernefysisk antigen (PCNA), og celledødsmarkøren, aktivert kaspase 3. Merking for PCNA avslørte at spredningsceller ofte var til stede på den ytre overflaten av sfæroidene, noen ganger i kryptlignende eller knopplignende strukturer som minner om organoidkulturer15. I tillegg ble det observert en klar økning i PCNA-positive celler ved D5 og D7 som gikk ned med D10 (Figur 4, venstre paneler). Overraskende nok ble aktivert kaspase 3 observert i svært få celler i sfæroidene ved både D3 og D5 (figur 4, venstre paneler) og over lengre perioder (data ikke vist). Uttrykksmønsteret til β-catenin ble også evaluert i parafinseksjoner. Interessant nok ble det observert høye nivåer av β-cateninuttrykk ved hvert tidspunkt med klar membranbundet og cytoplasmatisk farging (Figur 4, høyre paneler). Det er verdt å merke seg at membranbundet β-catenin deltar i cellecelleadhesjon ved å binde seg til E-kadherin31. Et høyt nivå av ß-catenin merking ble notert i klynger av celler på alle tidspunkter. I noen tilfeller viste celler også klar kjernefysisk ß-catenin lokalisering (Figur 4, høyre paneler). Caco2 celler er kjent for å skille in vitro i 2D hovedsakelig i enterocytter19,32. Uttrykket av differensieringsmarkører, for eksempel kromogranin A (enterokendokrine celler), lysozym (Paneth-celler) eller mucin 2 (MUC 2, begerceller), var imidlertid uoppdagelig i disse sfæroidene av IF (data ikke vist). Imidlertid ble potensialet til å skille seg ut i enterocytter bekreftet, gitt at sfæroidene uttrykte ALPI (alkalisk fosfatase) og løsningsmiddelbærerfamilie 2, transkripsjonsvariant 2 (SLC2A5)/glukosetransportør 5 (GLUT5) mRNAer (Figur 5). Disse mRNA-nivåene økte ved D5 og D7, men forskjellen var enten ikke signifikant (ALPI) eller bare marginalt signifikant (SLC2A5) sammenlignet med nivåene ved D3.
Med det endelige målet å definere om sfæroidene som genereres og dyrkes basert på denne nye metoden er et pålitelig verktøy for å studere CSC-er, ble uttrykket av CSC-markører analysert av IF og qRT-PCR. CD133 og CD44 karakteriserer kreftcellepopulasjoner, inkludert CSCer7,33,34 og uttrykkes også av SCer i normal tarm og kolon33,34,35. Klynger av CD133-positive celler ble hovedsakelig lokalisert på den ytre overflaten av sfæroidene ved hvert tidspunkt (Figur 6A, venstre paneler). CD44-positive celler var sjeldnere, men var alltid forbundet med CD133-positive celler (Figur 6A, høyre paneler), noe som indikerer eksistensen av en populasjon av CD133 / CD44 dobbeltpositive CSC-lignende celler og en populasjon som bare uttrykker CD133. Olfactomedin 4 (OLFM4) og Musashi 1 (MSI1) ble undersøkt som SC/CSC-markører; Disse markørene uttrykkes på en svært begrenset måte i kolonkrypter36,37 og også i distinkte cellepopulasjoner35,38. Bare noen få MSI1-positive celler ble observert ved hvert tidspunkt (figur 7), mens OLFM4 forble uoppdagelig (data vises ikke). Likevel, som observert for CD44 og CD133, var MSI1-merkede celler plassert på den ytre overflaten av sfæroidene i kryptlignende eller knopplignende strukturer. De samme markørene ble også analysert på mRNA-nivå samtidig etter kultur i agarosebelagte retter. Aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1a1), en godt karakterisert markør for CSC39,40, ble også inkludert i studien (Figur 8). Analysen av prominin-1 (PROM1-koding for CD133) og CD44 mRNAer bekreftet uttrykket av begge markørene i sfæroider ved alle tidspunkter analysert. Vær imidlertid oppmerksom på at mens PROM1 mRNA-nivåene var ganske like over tid i kulturen, gikk CD44-nivåene ned fra D3 og utover. Forskjellen var imidlertid bare marginalt signifikant ved sammenligning av mRNA-nivåene av D10 og D3.
Analysen av MSI1 mRNA bekreftet uttrykket i sfæroider ved hvert tidspunkt, med betydelig høyere nivåer ved D3 og D5 sammenlignet med de ved D7 eller D10 (figur 8), mens OLFM4 mRNA ikke var påviselig (ikke vist). Til slutt ble ALDH1a1 mRNA uttrykt i sfæroider ved hvert tidspunkt og viste en uttrykksprofil som falt ved D10, nivåene var bare marginalt signifikante sammenlignet med de ved D3 (Figur 8). For å validere hensiktsmessigheten til den nye modellen for å studere kreftcellebiologi, ble responsen på kjemoterapi analysert i sfæroider behandlet med FOLFOX eller FOLFIRI, kombinasjonsbehandlinger rutinemessig administrert til CRC-pasienter22,23,24,25. For det første ble effekten av behandlingene i induserende celledød undersøkt ved å inkubere sfæroidene med en fluorescerende nukleinsyreflekk som spesifikt kommer inn i døde celler26. Sammenlignet med kontrollen NT tilstand, utførte behandlingen med hvert av legemidlene betydelig celledød målt ved opphopning av fluorescens (figur 9A). Denne observasjonen ble også bekreftet på morfologisk nivå ved hjelp av levende mikroskopi, som viste at behandlingene sterkt påvirket størrelsen og utseendet på sfæroidene (Figur 9B). Til slutt ble uttrykket av SC/ CSC-markører analysert av qRT-PCR i sfæroider under samme forhold (Figur 9C). Interessant nok ble det observert en betydelig nedgang i PROM1 mRNA-nivåer under både FOLFOX- og FOLFIRI-forhold sammenlignet med nivåene for kontrollen, mens MSI1-nivåene ikke ble påvirket av behandlingene. Videre, mens FOLFOX ikke hadde noen effekt på ALDH1a1 mRNA-uttrykk sammenlignet med kontrollen, økte behandlingen med FOLFIRI betydelig nivåene. OLFM4 mRNA ble ikke oppdaget, og CD44 mRNA-nivåene var ekstremt lave (data ikke vist).
Figur 1: Oppsett av sfæroidkulturer. (A) Sfæroiddannelse initiert fra de angitte konsentrasjonene av Caco2 celler per sfæroid / mikrowell. Topppanelet viser et representativt bilde av en hel kulturplate etter to dager med kultur. Det nederste panelet viser bilder av utvalgte mikrowells per tilstand. Bilder ble tatt ved 4x forstørrelse (microwell størrelse: 400 μm). Skalastolper: lav forstørrelse, 100 μm; høy forstørrelse, 30 μm. (B) Vekstegenskaper til sfæroidene generert fra forskjellige antall celler per mikrowell og analysert på forskjellige tidspunkter. Legg merke til at de angitte dagene inkluderer de to første dagene av kulturen i mikrowells og den etterfølgende kulturen til de høstede sfæroidene i agarosebelagte plater. Histogrammer viser gjennomsnitt ± standardavvik, n = 4–6. Svarte sirkler viser verdiene for individuelle sfæroider. Formelen for det estimerte volumet vises i den øvre delen av panelet, der d1, d2 og d3 angir de tre diameterene som måles for hver sfæroid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Optimalisering av forholdene for sfæroiddannelse og kultur. (A) Representative bilder av sfæroider på D7 etter utvinning fra mikrowells (2 dager) og kultur i agarose-belagte retter (5 dager), ved hjelp av nye godt forberedelse og kultur middels forhold. Skalastang: 30 μm. (B) Estimert volum av de nyhøstet sfæroider to dager etter starten av cellekulturen i mikrowells. Histogrammer viser gjennomsnitt ± standardavvik (SD), n = 4–6. Svarte sirkler indikerer størrelsen på de enkelte sfæroidene. (C) Estimert volum av sfæroidene i langsiktig kultur basert på de nylig valgte forholdene. Grafer viser vekstegenskapene til sfæroidene generert fra forskjellige antall celler per sfæroid og analysert på forskjellige tidspunkter etter høsting, som angitt. Histogrammer viser gjennomsnittlig ± SD, n = 6–10. Svarte sirkler indikerer størrelsen på de enkelte sfæroidene. (D) Representative bilder av de valgte 600 cellene per sfæroid tilstand over det eksperimentelle tidsforløpet (høyre paneler) og i mikrowells (venstre panel). Bilder ble tatt med 4x forstørrelse. Skalastolper: lav forstørrelse, 100 μm; høy forstørrelse, 30 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Histologisk karakterisering av sfæroidene. Histologisk hematoksylin og eosin (H&E) farging av parafinseksjoner. Representative bilder av sfæroider på de angitte tidspunktene etter høsting, som angitt. Svarte stiplede linjer i hver høye forstørrelsessett avgrenser lumen i sfæroidene. Skalastolper: lav forstørrelse, 30 μm; høy forstørrelse, 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Caco2 sfæroid karakterisering ved immunisolering. Immunstaining av sfæroider for spredningsmarkør, spredning av celle kjernefysisk antigen (PCNA, rød) og celledødsmarkør, aktivert kaspase 3 (grønn) (venstre paneler) og for β-catenin (røde) (høyre paneler) på de angitte tidspunktene. Bilder viser sammenslått merking av PCNA (rød), aktivert kaspase 3 (grønn) og nuklei (blå) eller β-catenin (rød) og kjerner (blå). Hvite piler peker på celler eller grupper av celler som uttrykker høye nivåer av β-catenin. Bilder ble tatt med et 20x mål. Skala bar: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av enterocyttdifferensieringsmarkører av qRT-PCR. Analyse av alpi og SLC2A5 koding alkalisk fosfatase og GLUT5 proteiner, henholdsvis. Histogrammer viser gjennomsnitt ± standardavvik, n = 3, etter normalisering mot ACTB. Data representeres som foldeendring i forhold til normal kolonslimhinne (rød linje = 1). NS: ikke signifikant; MS: marginalt signifikant sammenlignet med D3 ved uparret Student t-test. Forkortelser: qRT-PCR = kvantitativ omvendt transkripsjon-polymerase kjedereaksjon; GLUT5 = glukosetransportør 5; SLC2A5 = solute carrier familie 2, transkripsjon variant 2; ACTB = β-aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Heterogent uttrykk for stamcellemarkører, CD44 og CD133, i sfæroidene. Immunstaining for stamcellemarkørene, CD133 og CD44, på de angitte tidspunktene. Bilder i de venstre panelene viser sammenslått merking av CD133 (grønn) og kjerner (blå); De samme bildene i de høyre panelene viser sammenslått merking av CD44 (rød) og kjerner (blå). Grønne piler i de venstre panelene peker på CD133-uttrykkende celler, og hvite piler i begge panelene peker mot celler eller grupper av celler som uttrykker CD44 og CD133. Bilder ble anskaffet med et 20x mål. Skala bar: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Heterogent uttrykk for stamcellemarkør, MSI1, i sfæroidene. Immunstaining for stamcellemarkøren MSI1 (rød) på de angitte tidspunktene. Bilder viser sammenslått merking av MSI1 (rød) og kjerner (blå). Hvite stiplede linjer understreker noen kryptlignende strukturer der cellene er positive for MSI1-immunolmerking. Bilder ble tatt med 20x forstørrelse. Skala bar: 5 μm. Forkortelse = MSI1 = Musashi 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Analyse av stamcellemarkører av qRT-PCR. Kvantifisering av nivåene PROM1, CD44, MSI1 og ALDH1a1 ble utført på mRNA fra sfæroider på de angitte tidspunktene. Histogrammer viser gjennomsnitt ± standardavvik, n = 3, etter normalisering mot ACTB. Data representeres som foldeendring i forhold til normal kolonslimhinne (rød linje = 1). NS: ikke signifikant; MS: marginalt signifikant sammenlignet med D3, ved hjelp av uparret Student t-test. *: P < 0,05 sammenlignet med D3 eller D5, ved hjelp av uparret Student t-test. Forkortelser: qRT-PCR = kvantitativ omvendt transkripsjon-polymerase kjedereaksjon; PROM1 = prominin-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehyd dehydrogenase 1 alfa; ACTB = β-aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Effekt av kjemoterapi på sfæroider. Etter høsting fra mikrowells ble sfæroider dyrket i agarosebelagte plater og behandlet i 3 dager med FOLFOX eller FOLFIRI eller ble opprettholdt i (kontroll) ikke-behandlet (NT) tilstand. (A) Analyse av fluorescens på grunn av merking av nukleinsyre i døde celler. Histogrammer viser gjennomsnitt ± standardavvik (SD), n = 4. (B) Morfologiske trekk ved sfæroidene opprettholdt under de forskjellige kulturforholdene. Bilder ble tatt med et 4x mål. Skalastang: 400 μm. (C) Kvantifisering av PROM1, MSI1 og ALDH1a1 mRNAer av qRT-PCR. Histogrammer viser gjennomsnitt ± SD, n = 4, etter normalisering mot ACTB. *: NS: ikke signifikant; P < 0,05; **: P < 0,01; : P < 0,001 sammenlignet med kontrollbetingelsen (NT), ved hjelp av uparret Student t-test. Forkortelser: FOLFOX = 5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Oxaliplatin, 10 μg/ml; Leucovorin, 25 μg/ml ; FOLFIRI = 5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Irinotecan, 100 μg/ml; Leucovorin, 25 μg/ml; qRT-PCR = kvantitativ omvendt transkripsjon-polymerase kjedereaksjon; PROM1 = prominin-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehyd dehydrogenase 1 alfa; ACTB = β-aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ønsket antall celler per sfæroid | Nødvendig antall celler per brønn |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1,2 x 105 |
| 200 | 2,4 x 105 |
| 300 | 3,6 x 105 |
| 400 | 4,8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7,2 x 105 |
| 700 | 8,4 x 105 |
| 800 | 9,6 x 105 |
| 1000 | 1,2 x 106 |
| 2000 | 2,4 x 106 |
Tabell 1: Oppsummering av sfæroiddannelse og cellesåing.
| 10 mm retter | 6-brønns plater | 12-brønns plater | 24-brønns plater | 96-brønns plater | |
| Volum for belegg | 4 ml | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL (ned og opp) |
Tabell 2: Volumer av agarose løsning for belegg av forskjellige plater / retter.
| Gener | Primere | sekvens | Produktlengde | |
| Differensieringsmarkører | ALPI | fremover | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| omvendt | ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | fremover | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| omvendt | AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG | |||
| Indikatorer for stamceller | ALDH1a1 | fremover | GCC TTC ACA GGA TCA ACA GAG | 147 |
| omvendt | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | fremover | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| omvendt | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| PROM1 | fremover | GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| omvendt | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | fremover | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| omvendt | TGA AGT GCT GCT CCT TTC-LOVEN | |||
| OLFM4 | fremover | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| omvendt | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| Rengjøringsgener | ACTB | fremover | CAC KATT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| omvendt | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | fremover | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| omvendt | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
Tabell 3: Primere som brukes til kvantitativ omvendt transkripsjon-polymerase kjedereaksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro 3D-modeller overvinner de viktigste eksperimentelle ulempene ved 2D kreftcellekulturer, da de ser ut til å være mer pålitelige i å rekapitulere typiske tumorfunksjoner, inkludert mikromiljø og celle heterogenitet. Ofte brukte 3D-modeller av sfæroider er stillasfrie (dyrket i lav-vedleggsforhold) eller stillasbaserte (ved hjelp av biomaterialer til kulturceller). Disse metodene presenterer forskjellige ulemper da de avhenger av stillasets natur som brukes eller gir opphav til sfæroider som er variable i struktur og størrelse.
Den nåværende protokollen rapporterer optimaliserte forhold for å produsere homogene sfæroider fra tykktarmen adenokarsinomcellelinjen, Caco2, ved hjelp av en stillasfri metode. Sfæroidene høstes lett og i motsetning til en tidligere rapportert studie41, de vokser vellykket og deres vekstegenskaper i løpet av kulturtiden kan også analyseres. Videre, med denne nye metoden, sprer sfæroidene (a) aktivt, (b) en svært lav grad av celledød, (c) organiserer seg for å danne en lumen inne i sfærene, og (d) viser differensieringskapasiteten til komponentcellene. Gitt at det endelige målet med den nye tilnærmingen var bruken til studier på CSC-biologi, ble uttrykket for forskjellige markører av CSC analysert. Interessant nok presenterte markørene et dynamisk uttrykksmønster avhengig av tidspunktet og definerte forskjellige CSC-populasjoner.
Av største betydning kan sfæroidene som genereres gjennom denne protokollen brukes til å analysere legemidler som er relevante for kliniske anvendelser som kjemoterapeutiske regimer, FOLFOX og FOLFIRI. Resultatene understreker også en heterogen respons av celler til stoffene avhengig av CSC-markøren analysert. Denne observasjonen samsvarer med gjeldende syn på at heterogene og flere CSC-lignende cellepopulasjoner i svulster viser forskjellige kjemosensitivitets-/kjemoresistansegenskaper42,43. Dette funnet forsterker sterkt anvendbarheten av denne nye metoden for storskala screening. I tillegg til søknadene som er rapportert i denne studien, kan den nye protokollen også brukes til et bredere spekter av analyser (f.eks. RNA- og/eller DNA-ekstraksjon og store analyser, vestlig blotting og immunfluorescens). Faktisk kan volumet av sfæroider og vekstegenskaper lett bestemmes ved å bruke sfærevolumformelen som om nødvendig også tar hensyn til forskjellige diametre for å motvirke avvik fra en perfekt sfærisk form. Spesifikke parametere bør imidlertid optimaliseres avhengig av celletype (cellelinje eller nye primærkulturer) og vekstkapasitet, for eksempel replikeringstid. Likevel indikerer protokollen kritiske trinn som enkelt kan justeres.
Noen bekymringspunkter må vurderes når du utfører sfæroidgenerering beskrevet i denne artikkelen. For det første bør flere vasketrinn utføres med anti-tilslutning skylleløsningen for å fremme homogenitet og komprimering av sfærene. I dette tilfellet var to vasker nødvendige. For det andre må bobler fjernes fra mikrowells, da dette kan forstyrre riktig dannelse av sfæroidene. For det tredje, når cellene er frøet i hver mikrowell etter sentrifugeringstrinnet, må platen forbli uforstyrret i to dager. Ytterligere hensyn og endringer i protokollen er nødvendig når du studerer de tidlige trinnene i sfæroiddannelse, muligens inkludert et automatisert visualiserings- og bildesystem. For det fjerde kan det være utfordrende å endre mediet uten å forstyrre sfæroidene, gitt at de er i suspensjon. Derfor anbefales det å endre bare halvparten av volumet hver gang. For det femte, når du høster sfæroidene, er det viktig å bevare strukturen. Derfor anbefales bruk av serologiske pipetter eller mikropipetter med spissene avskåret for alle dispenseringstrinn etter skylling i et serumholdig medium eller PBS for å forhindre at sfæroidene overholder spissene.
Det kan også oppstå noen begrensninger når du bruker denne protokollen. For det første har ikke alle cellelinjer eller celletyper de samme kulturparametrene. I noen tilfeller kan celle heterogenitet og antall passasjer/aldring av celler også påvirke evnen til å danne sfæroider. For det andre, i motsetning til organoider, kan det være vanskelig å opprettholde sfæroider i svært lang tid i kulturen. I tillegg kan de ikke replikeres ved enkel fragmentering gjennom en mikropipettespiss15. For det tredje kan denne protokollen ikke tilpasses for enkeltsfæroidanalyse fordi manuell gjenoppretting av sfæroider en etter en kan være vanskelig. Denne teknikken er mer egnet for å oppnå høye mengder homogene sfæroider samtidig. Til slutt, for studier som undersøker effekten av vekstfaktorer som stammer fra andre celletyper eller analyserer mikromiljøets betydning, ville det være viktig å berike modellen og utføre samkultureksperimenter.
Til slutt beskriver den nåværende metodikken en ny protokoll for effektivt å generere og kultursfæroider fra Caco2-celler. Resultatene viser at denne metoden kan brukes på studiet av tumor heterogenitet og for analyse av CSC. Denne metoden kan også brukes til høygjennomstrømning av legemiddelscreening og studiet av stamcellebiologi i kreft og ikke-kreftceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Vi anerkjenner avbildning og Anipath recherche histologi plattformer (CRCL, CLB). Vi står i gjeld til apoteket til Centre Léon Bérard (CLB) Hospital for den slags gave av FOLFOX og FOLFIRI. Vi takker også Brigitte Manship for kritisk lesning av manuskriptet. Arbeidet ble støttet av FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) og av Inca (PLBIO19-289). MVG og LC fikk støtte fra FRM og CF fikk støtte fra ARC foundation og Centre Léon Bérard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R.
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J.
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
