Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon

Résumé

Ce protocole présente un système original, robuste, et reproductible de culture pour générer et faire croître les sphéroïdes tridimensionnels des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points. Les résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Résumé

Les cancers colorectaux sont caractérisés par une hétérogénéité et une organisation hiérarchique comprenant une population de cellules souches cancéreuses (CSC) responsables du développement tumoral, de l’entretien et de la résistance aux médicaments. Une meilleure compréhension des propriétés du SCC pour leur ciblage spécifique est donc une condition préalable à l’efficacité d’un traitement. Cependant, il y a un manque de modèles précliniques appropriés pour des enquêtes approfondies. Bien que les variétés de cellule bidimensionnelles in vitro de cancer (2D) fournissent des aperçus valables dans la biologie de tumeur, elles ne répliquent pas l’hétérogénéité phénotypique et génétique de tumeur. En revanche, les modèles tridimensionnels (3D) abordent et reproduisent la complexité quasi physiologique du cancer et l’hétérogénéité cellulaire. L’objectif de ces travaux était de concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible pour étudier la biologie du CSC. La méthodologie actuelle décrit le développement et l’optimisation des conditions pour générer des sphéroïdes 3D, qui sont homogènes dans la taille, des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points, un modèle qui peut être employé pour la culture à long terme. D’une manière primordiale, dans les sphéroïdes, les cellules qui ont été organisées autour de lumen-comme des structures, ont été caractérisées par des modèles différentiels de prolifération cellulaire et par la présence de CSCs exprimant un panneau de marqueurs. Ces résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche 3D pour étudier l’hétérogénéité cellulaire et la biologie du CSC, y compris la réponse à la chimiothérapie.

Introduction

Le cancer colorectal (CCR) reste la deuxième cause de décès associés au cancer dans le monde¹. Le développement du CRC est le résultat d’une acquisition et d’une accumulation progressives de mutations génétiques et/ou d’altérations épigénétiques^2,3,notamment l’activation d’oncogènes et l’inactivation de gènes suppresseurs de^{tumeurs 3,4.} De plus, des facteurs non génétiques (p. ex. le microenvironnement) peuvent contribuer à la transformation oncogène et la promouvoir, et ainsi participer à l’évolution des CRC^5.....

Protocole

REMARQUE : Les détails de tous les réactifs et matériaux sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Formation de sphéroïdes

1. Milieux de culture sphéroïdes
   1. Préparer un milieu basal composé du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par un dipeptide L-alanyl-L-glutamine de 4 mM.
   2. Préparer le milieu complet DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen/Strep) en milieu basal à partir de l’étape 1.1.1.
   3. Préparer un milieu matriciel DMEM/membrane basale contenant 2,5 % de matrice membranaire de sous-sol, 10 % de FBS et 1 % de pen/strept....

Résultats

Comme le manque d’homogénéité dans la taille des sphéroïdes est l’un des principaux inconvénients des systèmes de culture sphéroïde 3D actuellement disponibles^13,le but de ce travail était de mettre en place un protocole fiable et reproductible pour obtenir des sphéroïdes homogènes. Tout d’abord, pour établir des conditions de travail idéales, différents nombres de cellules Caco2 ont été testés, allant de 50 à 2 000 cellules par microwell /sphéroïde à l’aide de pla.......

Discussion

Les modèles 3D in vitro surmontent les principaux inconvénients expérimentaux des cultures de cellules cancéreuses 2D, car ils semblent être plus fiables pour récapituler les caractéristiques tumorales typiques, y compris le microenvironnement et l’hétérogénéité cellulaire. Les modèles 3D couramment utilisés de sphéroïdes sont sans échafaudage (cultivés dans des conditions de faible fixation) ou à base d’échafaudage (en utilisant des biomatériaux pour faire culturer des cellules). Ces méthodes présentent des inconvénient.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
37 et micro ; m Passoire réversible, grande  ;	STEMCELL Technologies	27250	À utiliser avec des tubes coniques de 50 mL
5-Fluorouracile	Cadeau de la Pharmacie du Centre Léon Bérard (CLB)	-	solution mère, 5 mg/100 mL ; concentration finale, 50 & micro ; g/mL
d’agarose  ;	Sigma	A9539
Aggrewell 400 Plaques à 24 puits	STEMCELL Technologies	34411	1 200 micropuits par puits pour la formation et la croissance de sphéroïdes
Anti Caspase3 - Signalisation	des cellules de	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Solution de rinçage anti-adhérence x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) -	Rat Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA - Souris	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-&beta ;-caténine - Souris	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Noir plaques multipuits	Thermo Fisher Scientific	237108
Acide citrique monohydraté	Sigma	C1909
CLARIOstar appareil  ;	BMG Labtech		lecteur de microplaques
Stylo			marqueur pour marquer des cercles sur les lames afin de créer des barrières pour les liquides
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) Donkey anti-souris, Alexa Fluor 488 Thermo	Fisher	Scientific A21202	dilution 1:1000
Anticorps secondaire anti-IgG de souris Donkey (H+L), Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
IgG anti-lapin Donkey (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
IgG anti-lapin Donkey (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel milieu de montage avec	DAPI Interchim	FP-DT094B
Chèvre anti-rat IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée, Alexa Fluor 568 Thermo	Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
Logiciel			Analyse d’images sphéroïdes
Irinotecan& nbsp ;	Cadeau de la pharmacie Solution mère CLB		, 20 mg/mL ; concentration finale, 100 & micro ; g/mL
de transcriptase inverse iScript  ;	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift de Pharmacy Solution mère CLB		, 50 mg/mL ; concentration finale, 25 & micro ; g/mL
Matrigel Matrice de membrane basale	Corning	354234	Matrice de membrane basale
ARN nucléospine XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatine	Cadeau de la pharmacie Solution mère CLB		, 100 mg/20 mL ;concentration finale, 10 & micro ; g/mL
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140130
Tampon phosphate salin (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	colorant à l’acide nucléique ; dilution 1:5000
Trypsine-EDTA (0,05 %)	Gibco
		Zeiss-Axiovert	inversé pour l’acquisition d’images de sphéroïdes

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