Summary
Ce protocole présente un système original, robuste, et reproductible de culture pour générer et faire croître les sphéroïdes tridimensionnels des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points. Les résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche pour étudier la biologie des cellules souches cancéreuses, y compris la réponse à la chimiothérapie.
Abstract
Les cancers colorectaux sont caractérisés par une hétérogénéité et une organisation hiérarchique comprenant une population de cellules souches cancéreuses (CSC) responsables du développement tumoral, de l’entretien et de la résistance aux médicaments. Une meilleure compréhension des propriétés du SCC pour leur ciblage spécifique est donc une condition préalable à l’efficacité d’un traitement. Cependant, il y a un manque de modèles précliniques appropriés pour des enquêtes approfondies. Bien que les variétés de cellule bidimensionnelles in vitro de cancer (2D) fournissent des aperçus valables dans la biologie de tumeur, elles ne répliquent pas l’hétérogénéité phénotypique et génétique de tumeur. En revanche, les modèles tridimensionnels (3D) abordent et reproduisent la complexité quasi physiologique du cancer et l’hétérogénéité cellulaire. L’objectif de ces travaux était de concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible pour étudier la biologie du CSC. La méthodologie actuelle décrit le développement et l’optimisation des conditions pour générer des sphéroïdes 3D, qui sont homogènes dans la taille, des cellules caco2 d’adénocarcinome de deux points, un modèle qui peut être employé pour la culture à long terme. D’une manière primordiale, dans les sphéroïdes, les cellules qui ont été organisées autour de lumen-comme des structures, ont été caractérisées par des modèles différentiels de prolifération cellulaire et par la présence de CSCs exprimant un panneau de marqueurs. Ces résultats fournissent la première preuve de concept de la pertinence de cette approche 3D pour étudier l’hétérogénéité cellulaire et la biologie du CSC, y compris la réponse à la chimiothérapie.
Introduction
Le cancer colorectal (CCR) reste la deuxième cause de décès associés au cancer dans le monde1. Le développement du CRC est le résultat d’une acquisition et d’une accumulation progressives de mutations génétiques et/ou d’altérations épigénétiques2,3,notamment l’activation d’oncogènes et l’inactivation de gènes suppresseurs detumeurs 3,4. De plus, des facteurs non génétiques (p. ex. le microenvironnement) peuvent contribuer à la transformation oncogène et la promouvoir, et ainsi participer à l’évolution des CRC5. Il est important de faire en sorte que les CRC soient composés de différentes populations cellulaires, notamment de CSC indifférenciés et de cellules tumorales en vrac présentant certains traits de différenciation, qui constituent une structure hiérarchique rappelant l’organisation de l’épithélium dans une crypte normale du côlon6,7.
Les CSC sont considérés comme responsables de l’aspect tumoral8,de son maintien et de sa croissance, de sa capacité métastatique et de sa résistance aux thérapies conventionnelles6,7. Dans les tumeurs, les cellules cancéreuses, y compris les CSC, présentent un niveau élevé d’hétérogénéité et de complexité en termes de profils mutationnels et épigénétiques distincts, de différences morphologiques et phénotypiques, d’expression génique, de métabolisme, de taux de prolifération et de potentiel métastatique9. Par conséquent, pour mieux comprendre la biologie du cancer, la progression tumorale et l’acquisition de la résistance à la thérapie et sa traduction en traitements efficaces, les modèles précliniques humains capturant cette hétérogénéité et cette hiérarchie du cancer sont importants10,11.
Les lignées cellulaires in vitro du cancer 2D sont utilisées depuis longtemps et fournissent des informations précieuses sur le développement tumoral et les mécanismes sous-jacents à l’efficacité des molécules thérapeutiques. Cependant, leur limitation en ce qui concerne l’absence de l’hétérogénéité phénotypique et génétique trouvée dans les tumeurs originales est maintenant largement reconnue12. De plus, les nutriments, l’oxygène, les gradients de pH et le microenvironnement tumoral ne sont pas reproduits, le microenvironnement étant particulièrement important pour le maintien des différents types de cellules, y compris les CSC11,12. Pour surmonter ces principaux inconvénients, plusieurs modèles 3D ont été développés pour traiter et reproduire expérimentalement la complexité et l’hétérogénéité des cancers. En effet, ces modèles récapitulent l’hétérogénéité cellulaire tumorale, les interactions cellule-cellule, et l’architecture spatiale, semblables à celles observées in vivo12,13,14. Les organoïdes tumoraux primaires établis à partir de tumeurs fraîches, ainsi que des sphéroïdes dérivés de la lignée cellulaire, sont largement employés15,16.
Les sphéroïdes peuvent être cultivés d’une manière sans échafaudage ou basée sur l’échafaudage pour forcer les cellules à se former et à se développer dans des agrégats cellulaires. Les méthodes sans échafaudage sont basées sur la culture de cellules dans des conditions non adhérentes (par exemple, la méthode de suspension-goutte ou les plaques de fixation ultra-basses), tandis que les modèles à base d’échafaudages reposent sur des biomatériaux naturels, synthétiques ou hybrides pour les cellules de culture12,13,14. Les sphéroïdes à base d’échafaudage présentent différents inconvénients car la formation finale des sphéroïdes dépendra de la nature et de la composition du (bio)matériau utilisé. Bien que les méthodes de sphéroïdes sans échafaudage disponibles jusqu’à présent ne reposent pas sur la nature du substrat, elles génèrent des sphéroïdes dont la structure et la taillevarient 17,18.
Ce travail visait à concevoir un système de culture 3D robuste et reproductible d’asphéroïdes, de taille homogène, composé de cellules d’adénocarcinome du côlon Caco2 pour étudier la biologie du CSC. Les cellules Caco2 présentent un intérêt particulier en raison de leur capacité à se différencier au fil du temps19,20,suggérant fortement un potentiel de type radical. En conséquence, la culture à long terme des sphéroïdes a indiqué la présence de différentes populations de CSC avec différentes réponses à la chimiothérapie.
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Protocol
REMARQUE : Les détails de tous les réactifs et matériaux sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Formation de sphéroïdes
- Milieux de culture sphéroïdes
- Préparer un milieu basal composé du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par un dipeptide L-alanyl-L-glutamine de 4 mM.
- Préparer le milieu complet DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen/Strep) en milieu basal à partir de l’étape 1.1.1.
- Préparer un milieu matriciel DMEM/membrane basale contenant 2,5 % de matrice membranaire de sous-sol, 10 % de FBS et 1 % de pen/streptocoque en milieu basal à partir de l’étape 1.1.1.
- Préparation de plaques pour la formation de sphéroïdes
- Milieu matriciel basal chaud et DMEM/membrane basale à température ambiante (RT) pendant environ 20 min.
- Prétraiter les puits d’une plaque de 24 puits dédiée à la formation d’sphéroïdes en ajoutant 500μL de solution de rinçage anti-adhérence à chaque puits.
REMARQUE : Dans ces plaques, chaque puits est constitué de 1 200 micropuits. - Centrifuger la plaque à 1 200 × g pendant 5 min dans un rotor à godet oscillant avec des adaptateurs pour plaques.
NOTA : Si une seule plaque est utilisée, préparez une plaque étalon supplémentaire remplie d’eau pour contrebalancer le poids. - Rincez chaque puits avec 2 mL de milieu basal chaud et aspirez le milieu des puits.
- Observez la plaque au microscope pour vous assurer que les bulles ont été complètement retirées des micropuits. Si les bulles restent piégées, centrifuger à nouveau à 1 200 × g pendant 5 min pour éliminer les bulles.
- Répétez les étapes de rinçage 1.2.4-1.2.5.
- Ajouter 1 mL de milieu matriciel chaud DMEM/membrane basale à chaque puits.
- Génération d’asphéroïdes
- Cultiver les cellules Caco2 dans une monocouche 2D en milieu DMEM complétée par 10% FBS et 1% Pen/Strep à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% deCO2 (ci-après dénommée 37°C/5%CO2).
Remarque : le nombre maximal de passages de cellule à utiliser est 80. - Lorsque 80 % de confluence est atteinte, laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x (5 mL pour une boîte de 10 cm), ajouter de l’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) (2 mL pour une boîte de 10 cm) et incuber pendant 2 à 5 min à 37 °C/5 % deCO2.
- Vérifiez le détachement cellulaire au microscope et neutralisez la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu complet DMEM par plat de 10 cm.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 1 200 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant et ressuscitez la pastille dans un volume approprié de milieu matriciel DMEM/membrane basale.
- Reportez-vous au tableau 1 pour déterminer le nombre de cellules nécessaires par puits pour atteindre le nombre souhaité de cellules par micropuit. Vous pouvez également calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule suivante pour une plaque de 24 puits, étant donné que chaque puits contient 1 200 micropuits
Nombre requis de cellules par puits = Nombre souhaité de cellules par micropuit × 1 200 - Ajouter le volume requis de la suspension cellulaire à chaque puits pour obtenir le numéro de cellule souhaité dans un volume final de 1 mL.
- Ajouter 1 mL de milieu matriciel DMEM/membrane basale à chaque puits pour atteindre le volume final de 2 mL par puits (voir aussi l’étape 1.2.7).
REMARQUE: Veillez à ne pas introduire de bulles dans les micropuits. - Centrifuger la plaque immédiatement à 1 200 × g pendant 5 min pour capturer les cellules dans les micropuits. Si nécessaire, contrebalancez la centrifugeuse avec une plaque standard remplie d’eau.
- Observez la plaque au microscope pour vérifier que les cellules sont réparties uniformément entre les micropuits.
- Incuber la plaque à 37 °C/5 % deCO2 pendant 48 h sans la perturber.
REMARQUE: Selon le protocole original21, bien que de nombreuses lignées cellulaires puissent former des sphéroïdes dans les 24 h, certaines nécessitent un temps d’incubation plus long. Dans ce protocole, 48 h sont suffisants pour la formation sphéroïde.
- Cultiver les cellules Caco2 dans une monocouche 2D en milieu DMEM complétée par 10% FBS et 1% Pen/Strep à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% deCO2 (ci-après dénommée 37°C/5%CO2).
- Récolte des sphéroïdes des micro-puits
- Réchauffer le milieu matriciel basal et DMEM/sous-sol à TA pendant environ 20 min.
- À l’aide d’une pipette sérologique, retirer la moitié du milieu de culture (1 mL) de chaque puits.
- Rajouter le milieu à la surface du puits pour déloger les sphéroïdes des micropuits.
Remarque : ne touchez pas ou triturate les sphéroïdes. - Placez une passoire réversible de 37 μm (ou une passoire standard de 40 μm) sur le dessus d’un tube conique de 15 mL pour recueillir les sphéroïdes.
REMARQUE: Si vous utilisez une passoire standard de 40 μm, placez-la à l’envers. - Aspirez doucement les sphéroïdes délogés (à partir de l’étape 1.4.3) et passez la suspension sphéroïde à travers la passoire.
Remarque : les sphéroïdes resteront sur le filtre ; les cellules simples circuleront avec le milieu. - À l’aide d’une pipette sérologique, distribuez 1 mL du milieu basal chaud sur toute la surface du puits pour déloger les sphéroïdes restants et les récupérer sur la passoire.
- Répétez deux fois cette étape de lavage 1.4.6.
- Observez la plaque au microscope pour vous assurer que tous les sphéroïdes ont été retirés des micropuits. Répéter le lavage si nécessaire (étapes 1.4.6-1.4.7).
- Inversez la passoire et placez-la sur un nouveau tube conique de 15 mL. Recueillir les sphéroïdes en lavant la passoire avec DMEM / milieu de matrice de membrane de sous-sol.
REMARQUE: Les sphéroïdes collectés sont prêts pour les applications et les analyses en aval.
- Culture à long terme de sphéroïdes
- Préparer une solution d’agarose à 1,5% en milieu basal et la stériliser par autoclavage (cycle standard).
- Bien que la solution d’agarose soit chaude et encore liquide, enrobez les puits de plaques ou de plats de culture standard, comme décrit dans le tableau 2.
REMARQUE: Le réchauffement de la vaisselle / plaque dans le four facilitera l’étape de revêtement. Les plats /assiettes enduits peuvent être laissés à RT jusqu’à 10 jours dans un environnement stérile et protégés de la lumière. - Ensemencez les sphéroïdes récoltés (à partir de l’étape 1.4.9) dans les plaques recouvertes d’agarose et ajoutez le milieu matriciel DMEM/membrane basale pour atteindre le volume final en fonction de la taille de la plaque.
REMARQUE: Pour éviter les agrégats sphéroïdes, ensemencez-les à la densité optimale de 22 sphéroïdes / cm2. Observez que le revêtement n’est pas parfaitement plat et qu’il s’élève vers le bord, créant une concavité légère au centre de la plaque. Si le nombre de sphéroïdes est trop élevé, ils sont plus susceptibles d’adhérer les uns aux autres. - Incuber la plaque à 37 °C/5 % deCO2 jusqu’à récupération des sphéroïdes pour des analysesspécifiques.
- Traitement des sphéroïdes avec des médicaments chimiothérapeutiques
- Plaque sphéroïdes de l’étape 1.5.4, et les cultiver pendant 2 jours. À partir du jour 3 (D3), traitez-les avec FOLFIRI (5-fluorouracile, 50 μg/mL; Irinotécan, 100 μg/mL; Leucovorine, 25 μg/mL) ou avec FOLFOX (5-fluorouracile, 50 μg/mL; Oxaliplatine, 10 μg/mL; Leucovorine, 25 μg/mL) combinaisons de régimes chimiothérapeutiques couramment utilisées pour traiter les patients atteints de CCR22,23,24,25, ou les maintenir dans un état (témoin) non traité (NT).
- Recueillir les sphéroïdes après 3 jours de traitement à l’aide d’une pipette avec la pointe coupée (pointe de 1 000 μL), en veillant à ce que chaque condition soit représentée par au moins trois répétitions. Centrifugez-les à 1 000 × g pendant 3 min, puis retirez le surnageant.
- Fixer les pastilles dans du paraformaldéhyde à 2 % (PFA) pour l’analyse histologique (voir la section 3), ou utiliser les pastilles pour l’extraction de l’ARN (voir la section 4).
- Pour analyser la mort cellulaire, incuber les sphéroïdes de l’étape 1.6.1 dans des plaques de puits de culture noires dans un milieu matriciel DMEM/membrane basale pendant 30 min avec une coloration d’acide nucléique (dilution 1:5000) qui n’imprègne pas les cellules vivantes, mais pénètre dans les membranes compromises des cellules mortes26. Mesurer l’accumulation de fluorescence avec un lecteur de microplaque.
2. Surveillance de la croissance des sphéroïdes
- À l’aide d’un microscope inversé, acquérir des images représentatives des sphéroïdes maintenus dans différentes conditions tout au long des jours en culture.
- Analysez les images en mesurant trois diamètres représentatifs différents de chaque sphéroïde à l’aide d’un logiciel approprié.
- Utilisez la formule suivante pour obtenir le volume de sphère estimé.
Remarque : Les termes, d1, d2 et d3, sont les trois diamètres de l’asphéroïde.
3. Immunofluorescence (FI) et coloration histologique
- Fixation et incorporation de paraffine
- Recueillir les sphéroïdes à des points de temps choisis à l’aide d’une pipette avec la pointe coupée comme décrit à l’étape 1.6.2, et les fixer pendant 30 minutes à droite dans 2% PFA.
NOTA : Vous pouvez également conserver les échantillons à cette étape à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure. - Pour l’incorporation de paraffine, lavez les sphéroïdes 3x avec du PBS 1x et ressuscitez-les dans de l’éthanol à 70%. Après l’inclusion et le sectionnement de paraffine, effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) pour l’analyse histologique.
- Recueillir les sphéroïdes à des points de temps choisis à l’aide d’une pipette avec la pointe coupée comme décrit à l’étape 1.6.2, et les fixer pendant 30 minutes à droite dans 2% PFA.
- Immunomarquage des sections de paraffine
REMARQUE : Utilisez des sections de 5 μm d’épaisseur pour l’immunomarquage indirect.- Incuber les lames à 60 °C pendant 2 h pour faire fondre la cire et améliorer la déparaffination.
- Laver les lames deux fois pendant 3 min dans du méthylcyclohexane.
- Laver les lames pendant 3 min dans du méthylcyclohexane 1:1 : 100 % éthanol.
- Lavez les lames deux fois pendant 3 min dans de l’éthanol à 100%.
NOTA : Effectuer toutes les manipulations pour les étapes 3.2.2 à 3.2.4 dans une hotte chimique. - Laver les lames pendant 3 min dans de l’éthanol à 90%.
- Laver les lames pendant 3 min dans de l’éthanol à 75%.
- Laver les lames pendant 3 min dans de l’éthanol à 50%.
- Lavez les toboggans sous l’eau du robinet.
- Réhydratez les lames dans de l’eau distillée pendant 5 min.
- Préparer 700 mL de tampon citrate de 0,01 M, pH 6,0, et l’ajouter à un récipient approprié (largeur: 11,5 cm, longueur: 17 cm, hauteur: 7 cm); submerger les toboggans dedans. Chauffer le récipient au micro-ondes pendant 9-10 min à 700 W, et lorsque l’ébullition commence, diminuer la puissance à 400-450 W. Incuber pendant 10 minutes supplémentaires.
- Laissez les lames refroidir dans le tampon à RT pendant environ 30-40 min.
- Lavez les lames deux fois en PBS pendant 5 min.
- Dessinez un cercle autour des sections à l’aide d’un stylo marqueur pour créer une barrière pour les liquides appliqués aux sections.
- Incuber chaque section avec 50 μL de tampon de blocage (10 % de sérum de chèvre normal, 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,02 % de Triton X-100 dans du PBS) pendant au moins 30 minutes à TA.
- Retirer le tampon de blocage et ajouter 50 μL d’anticorps primaires dilués dans le tampon d’incubation (1 % de sérum de chèvre normal, 0,1 % de BSA et 0,02 % de Triton X-100 dans du PBS). Incuber pendant 2 h à TA ou pendant une nuit à 4 °C.
- Retirez les anticorps primaires et lavez les lames 3x dans du PBS pendant 5 min.
- Incuber les lames avec 50 μL d’anticorps secondaires fluorescents dilués dans le tampon d’incubation pendant 1 h à TA.
- Retirez les anticorps secondaires et lavez les lames 3x dans du PBS pendant 5 min.
- Ajouter 50 μL de milieu de montage avec 4′,6-diamidino-2-phénylindole à chaque section, et placer une lame de couverture en verre sur la section.
4. Extraction de l’ARN, réaction en chaîne de la transcription-polymérase inverse (RT-PCR) et RT-PCR quantitative (qRT-PCR)
- Recueillir des sphéroïdes à différents points de temps, chaque point représenté par au moins trois répétitions. Centrifugez-les à 1 000 × g pendant 3 min, puis retirez le surnageant.
REMARQUE: Les granulés peuvent être utilisés directement pour l’extraction de l’ARN ou stockés à -20 ° C jusqu’à une utilisation ultérieure. - Isolez l’ARN total à l’aide d’un kit d’isolation de l’ARN commercial, conformément aux instructions du fabricant.
- Transcrivez à l’envers 500 ng de chaque échantillon d’ARN en ADN complémentaire (ADNc) avec un kit commercial selon les instructions du fabricant.
- Après transcription inverse, effectuer une analyse PCR sur 1 μL d’ADNc pour amplifier un gène d’entretien ménager avec des amorces situées dans différents exons.
REMARQUE: Cette étape permet de vérifier l’absence de toute contamination génomique de l’ADN dans les préparations d’ARN. Pour ce protocole, des amorces de peptidylprolyl isomerase B(PPIB) ont été employées. - Effectuer une amplification qPCR sur 4 μL d’ADNc préalablement dilué (1:10 dans de l’eau doublement distillée sans RNAse) en utilisant des amorces spécifiques aux gènes d’intérêt. Dans chaque échantillon, quantifier l’expression spécifique de l’ARNm en utilisant la méthode ΔΔCt et les valeurs normalisées par rapport à des niveaux de gènes d’entretien ménager.
REMARQUE: Pour ce protocole, β-actine(ACTB) a été sélectionné. Les amorces utilisées dans ce protocole sont répertoriées dans le tableau 3.
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Representative Results
Comme le manque d’homogénéité dans la taille des sphéroïdes est l’un des principaux inconvénients des systèmes de culture sphéroïde 3D actuellement disponibles13,le but de ce travail était de mettre en place un protocole fiable et reproductible pour obtenir des sphéroïdes homogènes. Tout d’abord, pour établir des conditions de travail idéales, différents nombres de cellules Caco2 ont été testés, allant de 50 à 2 000 cellules par microwell /sphéroïde à l’aide de plaques dédiées(tableau 1). En effet, chaque puits de ces plaques contient 1 200 micropuits, permettant la formation du même nombre de sphéroïdes par puits, et surtout, la formation d’un sphéroïde par microwell21. Après deux jours de culture, les puits contenant 2 000 cellules par sphéroïde se sont développés en monocouche, et 50 cellules par sphéroïde ont donné naissance à de petits sphéroïdes non homogènes(figure 1A). Ces deux conditions ont donc été exclues des analyses ultérieures. Pour établir des cultures à long terme, des sphéroïdes ont été récoltés dans les micropuits et ensemencés dans des conditions non adhérentes dans des assiettes fraîchement préparées enrobées d’agarose. La croissance de Spheroid a été alors surveillée tout au long du temps-cours expérimental en mesurant le changement du volume. Pour tenir compte de la forme non sphérique, trois diamètres différents de chaque sphéroïde ont été mesurés, et la formule volumique a été appliquée27 (figure 1B). Les sphéroïdes générés à partir de 100 et 200 cellules ont maintenu leur taille initiale au cours de l’expérience, tandis que ceux contenant 1.000 cellules se sont désintégrés pendant la récolte en raison de leur grande taille et, par conséquent, ont présenté plus de variabilité dans leur volume. Par conséquent, comme les sphéroïdes résultant de 500 cellules ont montré l’augmentation la plus homogène de la taille au cours du temps expérimental, ce nombre de cellules a été employé pour la formation de sphéroïde.
Deuxièmement, outre 500 cellules par sphéroïde, des nombres additionnels de cellules s’étendant de 300 à 800 cellules ont été étudiés. De plus, pour améliorer les conditions non adhérentes, le protocole original a été modifié en prétraité les puits deux fois au lieu de n’appliquer qu’un seul lavage. On a observé une amélioration de l’homogénéité et du compactage des sphéroïdes avec ces changements(figure 2A). La taille des sphéroïdes dans chaque condition a été mesurée au moment de la récolte(figure 2B),et leur croissance à long terme a été surveillée tout au long des jours en culture dans des plats enduits d’agarose(figure 2C). Basé sur les résultats, 500 et 600 cellules/sphéroïde ont été confirmés comme conditions optimales rapportant la bonne croissance et la basse variabilité. En raison du profil de croissance plus homogène dans tout le temps-cours expérimental et des structures compactes formées, 600 cellules par sphéroïde ont été choisies comme nombre de cellules pour des expériences ultérieures. Enfin, pour améliorer encore le protocole, le milieu complet DMEM a été complété par 2,5% de matrice membranaire sous-sol, qui contient des facteurs de croissance supplémentaires et un grand panel de protéines de matrice extracellulaire28. En effet, la forme multilobulaire des sphéroïdes pourrait être due à l’absence de signaux du microenvironnement qui a pu affecter la polarisation cellulaire29,30. L’ajout de la matrice membranaire du sous-sol a amélioré la croissance des sphéroïdes et leur homogénéité (Figure 2D). Un exemple de cette amélioration peut être vu pour 500 cellules par sphéroïde. En l’absence de la matrice membranaire du sous-sol(figure 1B),la taille des sphéroïdes était plus hétérogène, doublant de D3 à D7, puis atteignant un plateau. Cependant, en présence de la matrice membranaire du sous-sol(figure 2C),la taille des sphéroïdes à chaque point temporel était plus homogène, augmentant proportionnellement au fil du temps.
Pour analyser les dispositifs à long terme des sphéroïdes, ils ont été récupérés à différents moments après culture dans des plats agarose-enduits pour des analyses histologiques et SI détaillées sur des sections de paraffine. La souillure de H&E a prouvé que les cellules dans les sphéroïdes ont subi des changements de leur organisation et forme au fil du temps. En effet, les cellules étaient densément disposées en multicouches à D3, tandis que les cellules aplatir disposées en monocouches étaient clairement visibles à D10. Fait intéressant, comme l’indiquent les lignes pointillées noires dans les images, une lumière est apparue dans les sphéroïdes à partir de D5 (Figure 3). En parallèle, la prolifération cellulaire et l’apoptosis ont été analysés par SI utilisant le marqueur de prolifération, l’antigène nucléaire de cellules de prolifération (PCNA), et le marqueur de mort cellulaire, caspase activée 3. L’étiquetage de PCNA a révélé que les cellules proliférantes étaient souvent présentes à la surface externe des sphéroïdes, parfois dans des structures ressemblant à des cryptes ou à des bourgeons rappelant des cultures organoïdes15. En outre, une nette augmentation des cellules PCNA-positives à D5 et D7 a été observée qui a diminué par D10 (Figure 4, panneaux gauches). Étonnamment, la caspase 3 activée a été observée dans très peu de cellules des sphéroïdes à D3 et D5(figure 4,panneaux de gauche) et sur de plus longues périodes (données non présentées). Le modèle d’expression de β-caténoïne a été également évalué dans des sections de paraffine. Fait intéressant, des niveaux élevés d’expression de β-caténine ont été observés à chaque point de temps avec une coloration claire liée à la membrane et cytoplasmique(figure 4,panneaux de droite). Il est intéressant de noter que la β-caténoine liée à la membrane participe à l’adhérence cellule-cellule en se liant à l’E-cadhérine31. Un niveau élevé de ß-catène a été noté dans les grappes de cellules à tous les points temporels. Dans certains cas, les cellules présentaient également une localisation claire de la ß-catène nucléaire(Figure 4,panneaux de droite). Les cellules Caco2 sont connues pour différencier in vitro en 2D principalement enentérocytes 19,32. Cependant, l’expression des marqueurs de différenciation, tels que la chromogranine A (cellules entéroendocrines), le lysozyme (cellules de Paneth) ou la mucine 2 (MUC 2, cellules de gobelet), était indétectable dans ces sphéroïdes par SI (données non montrées). Cependant, le potentiel de différenciation en entérocytes a été confirmé, étant donné que les sphéroïdes ont exprimé l’ALPI (phosphatase alcaline) et la famille de porteurs de soluté 2, transcription variante2 (SLC2A5)/transporteurde glucose 5(GLUT5)ARNm(Figure 5). Ces niveaux d’ARNm ont augmenté à D5 et D7, mais la différence n’était pas significative(ALPI)ou seulement marginalement significative(SLC2A5)par rapport aux niveaux à D3.
Dans le but final de définir si les sphéroïdes générés et cultivés basés sur cette nouvelle méthode sont un outil fiable pour étudier des CSC, l’expression des marqueurs CSC a été analysée par IF et qRT-PCR. Cd133 et CD44 caractérisent les populations de cellules cancéreuses, y compris les CSC7,33,34 et sont également exprimés par les SC dans l’intestin normal et le côlon33,34,35. Des grappes de cellules CD133-positives ont été principalement localisées sur la surface externe des sphéroïdes à chaque point de temps(Figure 6A, panneaux gauches). Les cellules CD44-positives étaient moins fréquentes, mais ont toujours été associées aux cellules CD133-positives (figure 6A, panneaux droits), indiquant l’existence d’une population de cellules cd133/cd44 double-positives CSC-like et d’une population exprimant seulement CD133. L’olfactomène 4 (OLFM4) et le Musashi 1 (MSI1) ont été examinés comme marqueurs SC/CSC; ces marqueurs sont exprimés de manière très limitée dans les cryptes du côlon36,37 et également dans des populations cellulaires distinctes35,38. Seules quelques cellules MSI1 positives ont été observées à chaque point temporel(figure 7),tandis que l’OLFM4 est demeurée indétectable (données non présentées). Néanmoins, comme observé pour CD44 et CD133, msi1-labeled cellules ont été situées sur la surface externe des sphéroïdes dans crypte-comme ou bourgeon-comme des structures. Les mêmes marqueurs ont été également analysés au niveau de l’ARNm aux mêmes points temporels après culture dans des plats enduits d’agarose. L’aldéhyde déshydrogénase 1(ALDH1a1),un marqueur bien caractérisé des CSC39,40,a également été incluse dans l’étude(figure 8). L’analyse de prominin-1(codage PROM1 pour CD133) et cd44 arNm a confirmé l’expression des deux marqueurs dans les sphéroïdes à tous les moments analysés. Il convient de noter, cependant, que les niveaux d’ARNm PROM1 étaient assez similaires au fil du temps en culture, les niveaux de CD44 ont diminué à partir de D3. La différence, cependant, n’était que marginalement significative en comparant les niveaux d’ARNm de D10 et de D3.
L’analyse de l’ARNm MSI1 a confirmé son expression dans les sphéroïdes à chaque point de temps, avec des niveaux significativement plus élevés à D3 et D5 par rapport à ceux à D7 ou D10 (Figure 8), tandis que l’ARNm OLFM4 n’était pas détectable (non montré). Enfin, l’ARNm ALDH1a1 a été exprimé en sphéroïdes à chaque point temporel et a montré un profil d’expression qui a diminué à D10, les niveaux n’étant que marginalement significatifs par rapport à ceux de D3 (Figure 8). Pour valider la pertinence du nouveau modèle pour étudier la biologie des cellules cancéreuses, la réponse à la chimiothérapie a été analysée dans des sphéroïdes traités par FOLFOX ou FOLFIRI, des polythérapies systématiquement administrées aux patients atteints de CCR22,23,24,25. Tout d’abord, l’efficacité des traitements à induire la mort cellulaire a été examinée en incubant les sphéroïdes avec une coloration d’acide nucléique fluorescente qui pénètre spécifiquement dans les cellules mortes26. Par rapport à l’état de NT de contrôle, le traitement avec chacun des médicaments a induit une mort cellulaire significative mesurée par l’accumulation de fluorescence(figure 9A). Cette observation a également été confirmée au niveau morphologique par microscopie vivante, qui a montré que les traitements affectaient fortement la taille et l’apparence des sphéroïdes(figure 9B). Enfin, l’expression des marqueurs SC/CSC a été analysée par qRT-PCR dans les sphéroïdes dans les mêmes conditions(figure 9C). Curieusement, une diminution significative des niveaux d’ARNm PROM1 dans les conditions FOLFOX et FOLFIRI a été observée par rapport aux niveaux pour le contrôle, tandis que les niveaux MSI1 n’ont pas été affectés par les traitements. En outre, alors que FOLFOX n’a eu aucun effet sur l’expression de l’ARNm ALDH1a1 par rapport au contrôle, le traitement par FOLFIRI a augmenté de manière significative ses niveaux. L’ARNm OLFM4 n’a pas été détecté, et les niveaux d’ARNm CD44 étaient extrêmement bas (données non montrées).
Figure 1: Installation de cultures sphéroïdes. (A) Formation de sphéroïdes initiée à partir des concentrationsindiquées de cellules Caco2 pe r sphéroïde/microwell. Le panneau supérieur montre une image représentative d’une plaque de culture entière après deux jours de culture. Le panneau inférieur affiche des images de micropuits sélectionnés par condition. Les images ont été prises à un grossissement 4x (taille du micropuit : 400 μm). Barres d’échelle : faible grossissement, 100 μm; fort grossissement, 30 μm. (B) Caractéristiques de croissance des sphéroïdes générés à partir d’un nombre différent de cellules par micropuit et analysés à différents moments. Notez que les jours indiqués comprennent les deux premiers jours de culture dans les micropuits et la culture ultérieure des sphéroïdes récoltés dans des plaques recouvertes d’agarose. Les histogrammes montrent la moyenne ± l’écart type, n = 4–6. Les cercles noirs montrent les valeurs des sphéroïdes individuels. La formule du volume estimé est indiquée dans la partie supérieure du panneau, où d1, d2 et d3 indiquent les trois diamètres mesurés pour chaque sphéroïde. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Optimisation des conditions de formation et de culture des sphéroïdes. (A) Images représentatives des sphéroïdes à D7 après leur récupération des micropuits (2 jours) et leur culture dans des plats enduits d’agarose (5 jours), en utilisant de nouvelles conditions de préparation de puits et de milieu de culture. Barre d’échelle: 30 μm. (B) Volume estimé des sphéroïdes fraîchement récoltés deux jours après le début de la culture cellulaire dans les micropuits. Les histogrammes montrent la moyenne ± l’écart type (ET), n = 4–6. Les cercles noirs indiquent la taille des sphéroïdes individuels. (C) Volume estimé des sphéroïdes dans la culture à long terme basé sur les conditions nouvellement sélectionnées. Les graphiques montrent les caractéristiques de croissance des sphéroïdes générés à partir d’un nombre différent de cellules par sphéroïde et analysés à différents moments après leur récolte, comme indiqué. Les histogrammes montrent la moyenne ± écart-type, n = 6–10. Les cercles noirs indiquent la taille des sphéroïdes individuels. (D) Images représentatives des 600 cellules choisies par état sphéroïde au cours du temps expérimental (panneaux de droite) et dans les micropuits (panneau de gauche). Les images ont été prises à grossissement 4x. Barres d’échelle : faible grossissement, 100 μm; fort grossissement, 30 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Caractérisation histologique des sphéroïdes. Coloration histologique de hematoxylin et d’éosine (H&E) des sections de paraffine. Images représentatives des sphéroïdes aux points de temps indiqués après la récolte, comme indiqué. Des lignes pointillées noires dans chaque encart à fort grossissement délimitent la lumière dans les sphéroïdes. Barres d’échelle: faible grossissement, 30 μm; grossissement élevé, 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Caractérisation des sphéroïdes Caco2 par immunomarquage. Immunomarquage des sphéroïdes pour le marqueur de prolifération, l’antigène nucléaire de cellules de prolifération (PCNA, rouge), et le marqueur de mort cellulaire, caspase activée 3 (vert) (panneaux de gauche) et pour β-caténoine (rouge) (panneaux de droite) aux heures indiquées. Les images montrent l’étiquetage fusionné de PCNA (rouge), de caspase activée 3 (vert) et de noyaux (bleu) ou de β-caténine (rouge) et de noyaux (bleu). Les flèches blanches pointent vers des cellules ou des groupes de cellules exprimant des niveaux élevés de β-caténoine. Les images ont été prises avec un objectif 20x. Barre d’échelle: 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Analyse des marqueurs de différenciation des entérocytaires par qRT-PCR. Analyse de l’ALPI et du SLC2A5 codant respectivement pour la phosphatase alcaline et les protéines GLUT5. Les histogrammes montrent la moyenne ± l’écart type, n = 3, après normalisation par rapport à ACTB. Les données sont représentées par un changement de pli par rapport à la muqueuse normale du côlon (ligne rouge = 1). N.-S. : non significatif; MS: marginalement significatif par rapport à D3 par le test tde Student non apparié. Abréviations : qRT-PCR = transcription inverse quantitative-réaction en chaîne de la polymérase; GLUT5 = transporteur de glucose 5; SLC2A5 = famille de porteurs de soluté 2, transcription variante 2; ACTB = β-actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Expression hétérogène de marqueurs de cellules souches, CD44 et CD133, dans les sphéroïdes. Immunomarquage pour les marqueurs de cellules souches, CD133 et CD44, aux moments indiqués. Les images dans les panneaux de gauche montrent l’étiquetage fusionné de CD133 (vert) et de noyaux (bleu); les mêmes images dans les panneaux de droite montrent l’étiquetage fusionné de CD44 (rouge) et de noyaux (bleu). Les flèches vertes dans les panneaux de gauche pointent vers les cellules exprimant CD133, et les flèches blanches dans les deux panneaux pointent vers des cellules ou des groupes de cellules exprimant CD44 et CD133. Les images ont été acquises avec un objectif 20x. Barre d’échelle: 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Expression hétérogène du marqueur de cellules souches, MSI1, dans les sphéroïdes. Immunomarquage pour le marqueur de cellules souches MSI1 (rouge) aux heures indiquées. Les images montrent l’étiquetage fusionné de MSI1 (rouge) et de noyaux (bleu). Des lignes pointillées blanches soulignent certaines structures ressemblant à des cryptes où les cellules sont positives pour l’immunomarquage MSI1. Les images ont été prises à un grossissement 20x. Barre d’échelle: 5 μm. Abréviation = MSI1 = Musashi 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: Analyse des marqueurs de cellules souches par qRT-PCR. La quantification des niveaux de PROM1, CD44, MSI1, et ALDH1a1 a été exécutée sur l’ADN messagère des sphéroïdes aux moments indiqués. Les histogrammes montrent la moyenne ± l’écart type, n = 3, après normalisation par rapport à ACTB. Les données sont représentées par un changement de pli par rapport à la muqueuse normale du côlon (ligne rouge = 1). N.-S. : non significatif; MS: marginalement significatif par rapport à D3, en utilisant le test tde Student non apparié. *: P < 0,05 par rapport à D3 ou D5, en utilisant le test tnon apparié de Student. Abréviations : qRT-PCR = transcription inverse quantitative-réaction en chaîne de la polymérase; PROM1 = prominine-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldéhyde déshydrogénase 1 alpha; ACTB = β-actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9: Effet de la chimiothérapie sur les sphéroïdes. Après la récolte des micropuits, des sphéroïdes ont été cultivés dans des plaques enrobées d’agarose et traités pendant 3 jours avec FOLFOX ou FOLFIRI ou ont été maintenus dans l’état (témoin) non traité (NT). (A) Analyse de la fluorescence due au étiquetage de l’acide nucléique dans les cellules mortes. Les histogrammes montrent la moyenne ± l’écart type (ET), n = 4. (B) Caractéristiques morphologiques des sphéroïdes maintenus dans les différentes conditions de culture. Les images ont été prises avec un objectif 4x. Barre d’échelle: 400 μm. (C) Quantification des ARNm1, MSI1 et ALDH1a1 par qRT-PCR. Les histogrammes montrent la moyenne ± l’écart-type, n = 4, après normalisation par rapport à l’ACTB. *: NS: pas significatif; P < 0,05; ** : P < 0,01; : P < 0,001 par rapport à la condition de contrôle (NT), en utilisant le test t-de Student non apparié. Abréviations : FOLFOX = 5-fluorouracile, 50 μg/mL; Oxaliplatine, 10 μg/mL; Leucovorine, 25 μg/mL ; FOLFIRI = 5-fluorouracile, 50 μg/mL; Irinotécan, 100 μg/mL; Leucovorine, 25 μg/mL; qRT-PCR = réaction en chaîne quantitative inverse transcription-polymérase; PROM1 = prominine-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldéhyde déshydrogénase 1 alpha; ACTB = β-actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Nombre souhaité de cellules par sphéroïde | Nombre requis de cellules par puits |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1,2 x 105 |
| 200 | 2,4 x 105 |
| 300 | 3,6 x 105 |
| 400 | 4,8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7,2 x 105 |
| 700 | 8,4 x 105 |
| 800 | 9,6 x 105 |
| 1000 | 1,2 x 106 |
| 2000 | 2,4 x 106 |
Tableau 1 : Résumé de la formation des sphéroïdes et de l’ensemencement cellulaire.
| Plats de 10 mm | Plaques de 6 puits | Plaques de 12 puits | Plaques de 24 puits | Plaques de 96 puits | |
| Volume de revêtement | 4 mL | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL (bas et haut) |
Tableau 2 : Volumes de solution d’agarose pour le revêtement de différentes assiettes / plats.
| Gènes | Amorces | séquence | Longueur du produit | |
| Marqueurs de différenciation | ALPI | en avant | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| inverse | ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | en avant | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| inverse | AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG | |||
| Marqueurs de cellules souches | ALDH1a1 | en avant | GCC TTC ACA GGA TCA ACA GAG | 147 |
| inverse | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | en avant | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| inverse | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| PROM1 | en avant | GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| inverse | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | en avant | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| inverse | TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT | |||
| MFP4 | en avant | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| inverse | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| Gènes d’entretien ménager | ACTB | en avant | CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| inverse | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | en avant | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| inverse | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
Tableau 3 : Amorces utilisées pour la transcription inverse quantitative-réaction en chaîne de la polymérase.
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Discussion
Les modèles 3D in vitro surmontent les principaux inconvénients expérimentaux des cultures de cellules cancéreuses 2D, car ils semblent être plus fiables pour récapituler les caractéristiques tumorales typiques, y compris le microenvironnement et l’hétérogénéité cellulaire. Les modèles 3D couramment utilisés de sphéroïdes sont sans échafaudage (cultivés dans des conditions de faible fixation) ou à base d’échafaudage (en utilisant des biomatériaux pour faire culturer des cellules). Ces méthodes présentent des inconvénients différents car elles dépendent de la nature de l’échafaudage utilisé ou donnent naissance à des sphéroïdes dont la structure et la taille varient.
Le protocole actuel rapporte des conditions optimisées pour produire des sphéroïdes homogènes de la variété de cellule d’adénocarcinome de deux points, Caco2, utilisant une méthode échafaudage-libre. Les sphéroïdes sont facilement récoltés et contrairement à une étude précédemment rapportée41,ils se développent avec succès et leurs caractéristiques de croissance pendant le temps de culture peuvent également être analysées. D’ailleurs, avec cette nouvelle méthode, les sphéroïdes (a) prolifèrent activement, (b) présentent un très faible taux de mort cellulaire, (c) s’organisent pour former un lumen à l’intérieur des sphères, et (d) présentent la capacité de différenciation des cellules composantes. Étant donné que l’objectif final de la nouvelle approche était son utilisation pour les études sur la biologie du CSC, l’expression de différents marqueurs des CSC a été analysée. Fait intéressant, les marqueurs présentaient un modèle d’expression dynamique en fonction du point temporel et définissait différentes populations du SCC.
De la plus haute importance, les sphéroïdes générés par ce protocole pourraient être utilisés pour analyser des médicaments pertinents pour des applications cliniques telles que les régimes chimiothérapeutiques, FOLFOX et FOLFIRI. Les résultats soulignent également une réponse hétérogène des cellules aux médicaments en fonction du marqueur CSC analysé. Cette observation est compatible avec la vue actuelle que les populations hétérogènes et multiples de CSC-comme de cellules dans les tumeurs montrent diverses propriétés de chemosensitivity/chemoresistance42,43. Cette découverte renforce fortement l’applicabilité de cette nouvelle méthode pour le dépistage à grande échelle. En plus des applications rapportées dans cette étude, le nouveau protocole peut également être utilisé pour un plus large éventail d’analyses (p. ex. extraction d’ARN et/ou d’ADN et analyses à grande échelle, western blotting et immunofluorescence). En effet, le volume des sphéroïdes et les caractéristiques de croissance peuvent être facilement déterminés en appliquant la formule de volume de sphère qui, si nécessaire, prend également en considération différents diamètres pour contrebalancer les écarts d’une forme parfaitement sphérique. Cependant, des paramètres spécifiques doivent être optimisés en fonction du type de cellule (lignée cellulaire ou cultures primaires fraîches) et de la capacité de croissance, comme le temps de réplication. Néanmoins, le protocole indique des étapes critiques qui peuvent être facilement ajustées.
Quelques points de préoccupation doivent être considérés en exécutant la génération de sphéroïde décrite dans cet article. Tout d’abord, plusieurs étapes de lavage doivent être effectuées avec la solution de rinçage anti-adhérence pour favoriser l’homogénéité et le compactage des sphères. Dans ce cas, deux lavages étaient nécessaires. Deuxièmement, les bulles doivent être retirées des micropuits car cela peut perturber la formation correcte des sphéroïdes. Troisièmement, une fois que les cellules sont ensemencées dans chaque micropuit après l’étape de centrifugation, la plaque doit rester intacte pendant deux jours. Des considérations et des changements supplémentaires dans le protocole sont nécessaires en étudiant les premières étapes de la formation de sphéroïde, y compris probablement un système automatisé de visualisation et d’imagerie. Quatrièmement, changer le milieu sans déranger les sphéroïdes, étant donné qu’ils sont en suspension, peut être difficile. Par conséquent, il est recommandé de ne changer que la moitié du volume à chaque fois. Cinquièmement, lors de la récolte des sphéroïdes, il est important de préserver leur structure. Par conséquent, l’utilisation de pipettes sérologiques ou de micropipettes avec les pointes coupées est recommandée pour toutes les étapes de distribution après le rinçage dans un milieu contenant du sérum ou du PBS pour empêcher les sphéroïdes d’adhérer aux pointes.
Certaines limitations peuvent également être rencontrées lors de l’utilisation de ce protocole. Tout d’abord, toutes les lignées cellulaires ou tous les types de cellules n’ont pas les mêmes paramètres de culture ; dans certains cas, l’hétérogénéité cellulaire et le nombre de passages/vieillissement des cellules peuvent également affecter la capacité de former des sphéroïdes. Deuxièmement, contrairement aux organoïdes, il peut être difficile de maintenir les sphéroïdes pendant une très longue période en culture. De plus, ils ne peuvent pas être répliqués par simple fragmentation à travers une pointe de micropipette15. Troisièmement, ce protocole ne peut pas être adapté à l’analyse d’un seul sphéroïde, car la récupération manuelle des sphéroïdes un par un peut être délicate. Cette technique est plus appropriée pour obtenir de grandes quantités de sphéroïdes homogènes en même temps. Enfin, pour les études portant sur les effets des facteurs de croissance provenant d’autres types de cellules ou analysant l’importance du microenvironnement, il serait important d’enrichir le modèle et d’effectuer des expériences de co-culture.
En conclusion, la méthodologie actuelle décrit un nouveau protocole pour générer et culture efficacement des sphéroïdes à partir de cellules Caco2. Les résultats démontrent que cette méthode peut être appliquée à l’étude de l’hétérogénéité de tumeur et pour l’analyse de CSCs. Cette méthode peut également être utilisée pour le dépistage de médicaments à haut débit et l’étude de la biologie des cellules souches dans le cancer et les cellules non cancéreuses.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Nous reconnaissons les plateformes d’imagerie et d’histologie de recherche anipathique (CRCL, CLB). Nous sommes redevables à la pharmacie de l’Hôpital du Centre Léon Bérard (CLB) pour le don de type FOLFOX et FOLFIRI. Nous remercions également Brigitte Manship pour la lecture critique du manuscrit. Les travaux ont été soutenus par le FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) et par l’Inca (PLBIO19-289). MVG et LC ont reçu le soutien du FRM et CF a reçu le soutien de la fondation ARC et du Centre Léon Bérard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
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