Summary
このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。
Abstract
大腸癌は、異質性および腫瘍の発達、維持、および薬剤に対する耐性を担う癌幹細胞(CSC)の集団からなる階層的組織によって特徴付けられる。したがって、特定の標的化に対するCSC特性のより良い理解は、効果的な治療のための前提条件である。しかし、詳細な調査には適切な前臨床モデルの貧弱さがあります。in vitro 2次元(2D)癌細胞株は腫瘍生物学に関する貴重な洞察を提供するが、彼らは表現型および遺伝的腫瘍不均一性を複製しない。対照的に、3次元(3D)モデルは、ほぼ生理学的癌の複雑さと細胞の不均一性に対処し、再生する。この研究の目的は、CSC生物学を研究するための堅牢で再現性の高い3D培養システムを設計することであった。本手法は、Caco2結腸腺癌細胞から、サイズが均質な3Dスフェロイドを生成する条件の開発と最適化を説明する、長期培養に使用できるモデルである。重要なことに、スフェロイド内では、内腔様構造の周りに組織された細胞は、細胞増殖パターンの差動と、マーカーのパネルを発現するCSCの存在によって特徴づけられた。これらの結果は、化学療法に対する応答を含む細胞の異質性およびCSC生物学を研究するためのこの3Dアプローチの妥当性に関する最初の概念実証を提供する。
Introduction
大腸癌(CRC)は、世界における癌関連死の第2位の原因である。CRCの開発は、遺伝子変異および/またはエピジェネティックな変化の進行的な獲得および蓄積の結果である2、3、腫瘍抑制遺伝子の活性化および腫瘍抑制遺伝子3の不活性化を含む。さらに、非遺伝的要因(例えば、微小環境)は、発癌性転換に寄与し、そして促進し、したがってCRCs5の進化に関与することができる。重要なことに、CRCは、未分化CSCおよびバルク腫瘍細胞を含む異なる細胞集団で構成され、いくつかの分化形質を示し、これは正常な結腸暗号6,7における上皮の組織を連想させる階層構造を構成する。
CSCは腫瘍の外観8、その維持と成長、転移能力、および従来の治療法6、7に対する耐性を担うと考えられている。腫瘍内では、CSCを含む癌細胞は、その明確な突然変異およびエピジェネティックなプロファイル、形態学的および表現性の違い、遺伝子発現、代謝、増殖率、および転移電位の点で高レベルの不均一性および複雑さを示す9。したがって、がん生物学、腫瘍進行、および治療に対する耐性の獲得および有効な治療への翻訳をよりよく理解するために、この癌の異質性および階層を捉えるヒト前臨床モデルは重要である10,11である。
In vitro 2Dがん細胞株は、長い間使用されており、腫瘍の発達と治療分子の有効性の基礎となるメカニズムに関する貴重な洞察を提供してきました。しかし、元の腫瘍に見られる形質および遺伝的不均一性の欠如に関するそれらの限界は現在広く認識されている12。また、栄養素、酸素、pH勾配、及び腫瘍微小環境は再生されず、CSCs11,12を含む異なる細胞タイプの維持のために特に重要な微小環境である。これらの主な欠点を克服するために、いくつかの3Dモデルが実験的に対処し、癌の複雑さと不均一性を再現するために開発されました。事実上、これらのモデルは、腫瘍細胞異質性、細胞細胞相互作用、および空間的アーキテクチャを再現し、生体内12、13、14で観察されたものと同様である。新鮮な腫瘍から樹立された原発性腫瘍オルガノイドは、細胞系由来のスフェロイドと同様に、主に15,16個を採用している。
スフェロイドは、細胞を強制的に形成し、細胞凝集体で増殖させるために、足場を含まないまたは足場ベースの方法で培養することができる。足場を含まない方法は、非接着条件下での細胞の培養(例えば、吊り下げ法または超低添付プレート)に基づくが、足場ベースのモデルは、培養細胞12、13、14に天然、合成、またはハイブリッドバイオマテリアルに依存する。スキャフォールドベースのスフェロイドは、最終的なスフェロイド形成が使用される(バイオ)材料の性質および組成に依存するので、異なる欠点を提示する。これまで入手可能な足場を含まないスフェロイド法は基板の性質に依存しないが、それらは構造およびサイズ17、18で変化するスフェロイドを生成する。
この研究は、CSC生物学を研究するためにCaco2結腸腺癌細胞で構成される、サイズが均質であるスフェロイドの堅牢で再現可能な3D培養システムを設計することを目的としていた。Caco2細胞は、時間19,20の経過とともに分化する能力のために特に関心があり、ステムのような可能性を強く示唆している。従って、スフェロイドの長期培養は、化学療法に対する異なる応答を有する異なるCSC集団の存在を明らかにした。
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Protocol
注: すべての試薬と材料の詳細は、 材料表に記載されています。
1. スフェロイド形成
- スフェロイド培養培地
- 4 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを添加したダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)からなる基底培地を調製する。
- ステップ1.1.1から基礎培地に10%のウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)を含むDMEM完全培地を調製する。
- ステップ1.1.1から2.5%基底膜マトリックス、10%FBS、および1%のペン/ストレップを基底培地に含むDMEM/基底膜マトリックス培地を調製します。
- スフェロイド形成用プレートの作製
- 温かい基底およびDMEM/基底膜マトリックス媒体を室温(RT)で約20分間使用します。
- 500μLの抗付着リンス溶液を各ウェルに添加することで、スフェロイド形成専用の24ウェルプレートのウェルを退却させます。
注:これらのプレートでは、各井戸は1,200マイクロウェルで構成されています。 - プレート用アダプター付きのスイングバケットローターで、1,200×gで5分間プレートを遠心します。
注:1つのプレートのみを使用する場合は、重量のバランスを取るために水で満たされた追加の標準プレートを準備してください。 - 温かい基底培地を2mLずつよく洗い、井戸から培地を吸引する。
- マイクロウェルから泡が完全に取り除かれていることを確認するために、顕微鏡の下でプレートを観察します。気泡が閉じ込められたままの場合、気泡を除去するために5分間1,200×gで再び遠心分離機。
- リンスの手順 1.2.4~ 1.2.5 を繰り返します。
- 各ウェルに1mLの温かいDMEM/基質膜マトリックス培地を加えます。
- スフェロイドの生成
- Caco2細胞を、5%CO2(以下37°C/5%CO2と呼ぶ)を含む加湿雰囲気で37°Cで10%FBSおよび1%のペン/ストレップを添加したDMEM培地中の2D単層で増殖させる。
注: 使用するセルの通過の最大数は 80 です。 - 合流率の80%に達したら、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1x(10cm皿の場合は5mL)で細胞を洗浄し、トリプシンエチレン酢酸(EDTA)(10cm皿の場合は2mL)を加え、37°C/5%CO2で2〜5分間インキュベートする。
- 顕微鏡下で細胞剥離をチェックし、10cm皿あたり4 mLのDMEM完全培地を加えてトリプシンを中和します。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞の総数を計算するセルをカウントします。
- 細胞懸濁液を1,200×gで5分間遠心する。上清を捨て、ペレットを適切な容積のDMEM/基底膜マトリックス媒体で再懸濁する。
- マイクロウェル当たりの所望の細胞数を達成するためにウェル当たりの必要な細胞数を決定するには 、表1 を参照してください。または、24ウェルプレートに対して次の式を使用してセル数を計算し、各ウェルに1,200マイクロウェルが含まれていることを考慮します。
ウェルあたりの必要なセル数 = マイクロウェル当たりの必要数 × 1,200 - 各ウェルに細胞懸濁液の必要量を加えて、最終体積1mLで所望のセル数を達成します。
- DMEM/基膜マトリックス培地を1 mLずつウェルあたり2 mLの最終体積に達します(ステップ1.2.7も参照)。
注意:マイクロウェルに泡を入れないように注意してください。 - マイクロウェル内の細胞を捕捉するために5分間1,200×gでプレートを直ちに遠心します。 必要に応じて、遠心分離機と水で満たされた標準的なプレートのバランスを取ります。
- 顕微鏡下でプレートを観察し、細胞がマイクロウェルに均等に分布していることを確認します。
- プレートを邪魔することなく、37°C/5%CO2で48時間インキュベートします。
注:元のプロトコル21によれば、多くの細胞株は24時間以内にスフェロイドを形成することができるが、一部はより長いインキュベーション時間を必要とする。このプロトコルでは、48時間はスフェロイド形成に十分である。
- Caco2細胞を、5%CO2(以下37°C/5%CO2と呼ぶ)を含む加湿雰囲気で37°Cで10%FBSおよび1%のペン/ストレップを添加したDMEM培地中の2D単層で増殖させる。
- マイクロウェルからスフェロイドを収穫する
- 約20分間RTで基底とDMEM/基底膜マトリックス培地を温めます。
- 血清ピペットを使用して、各ウェルから培養培地(1mL)の半分を除去する。
- マイクロウェルからスフェロイドを取り除くためにウェルの表面に媒体を戻します。
メモ:回転楕円体に触れたり、三角回転させたりしないでください。 - 37 μm リバーシブルストレーナー(または40 μm標準ストレーナー)を15 mL円錐形チューブの上に置き、スフェロイドを収集します。
注:40 μmの標準ストレーナーを使用する場合は、上下逆に置きます。 - 取り外したスフェロイドを静かに吸引し(ステップ1.4.3から)、ストレーナーを通してスフェロイド懸濁液を通過させる。
注: 回転楕円体はフィルタに残ります。単一のセルは、媒体と一緒に流れます。 - 血清ピペットを使用して、ウェルの全表面に暖かい基底媒体の1 mLを分配し、残りのスフェロイドを取り除き、ストレーナーに回収します。
- この洗浄手順 1.4.6 を 2 回繰り返します。
- 顕微鏡下でプレートを観察し、すべての回転楕円体がマイクロウェルから取り除かれていることを確認します。必要に応じて洗浄を繰り返します(ステップ1.4.6~1.4.7)。
- ストレーナーを反転し、新しい15 mL円錐形チューブに置きます。DMEM/基膜マトリックス媒体でストレーナーを洗浄することにより、スフェロイドを収集します。
注: 収集されたスフェロイドは、下流のアプリケーションと分析の準備が整っています。
- スフェロイドの長期培養
- 1.5%アガロース溶液を基底培地で調製し、オートクレーブ(標準サイクル)で滅菌します。
- アガロース溶液が暖かく、まだ液体である間、 表2に記載されているように、標準的な培養プレートまたは皿の井戸をコーティングする。
注:オーブンで皿/プレートを温めるので、コーティングのステップが容易になります。コーティングされた皿/皿は無菌環境で10日までRTで残され、光から保護することができる。 - 採取したスフェロイド(ステップ1.4.9から)をアガロースコーティングプレートにシードし、DMEM/基膜マトリックス媒体を添加してプレートのサイズに応じて最終的な体積を達成します。
注:スフェロイド凝集体を避けるために、22のスフェロイド/cm2の最適な密度でそれらを播種します。コーティングが完全に平坦ではなく、エッジに向かって上昇し、プレートの中心に光の凹面を作り出すことに注意してください。スフェロイドの数が多すぎると、互いに付着する可能性が高くなります。 - 特定の分析のためにスフェロイドを回収するまで、プレートを37°C/5%CO2でインキュベートします。
- 化学療法薬によるスフェロイドの治療
- ステップ1.5.4からプレートスフェロイド、および2日間それらを成長させます。3日目(D3)から、FOLFIRI(5-フルオロウラシル、50 μg/mL)でそれらを治療します。イリノテカン、100 μg/mL;ロイコボリン、25 μg/mL)またはFOLFOX(5-フルオロウラシル、50 μg/mL;オキサリプラチン、10 μg/mL;ロイコボリン、25 μg/mL)化学療法レジメンの組み合わせは、CRC患者22、23、24、25を治療するために日常的に使用される、または(コントロール)非治療(NT)状態でそれらを維持するために使用される。
- 3日間の処理後に、チップを切り取ったピペット(1,000 μLチップ)を使用してスフェロイドを回収し、各条件が少なくとも3回の反復で表されることを確認します。遠心分離機 1,000 × g で 3 分間、上清を取り除く。
- 組織学的分析のために2%パラホルムアルデヒド(PFA)にペレットを固定するか(セクション3を参照)、RNA抽出用のペレットを使用(セクション4参照)。
- 細胞死を解析するために、DMEM/基膜マトリックス培地中の黒い培養ウェルプレートのステップ1.6.1から、生細胞に浸透しない核酸染色(1:5000希釈)を有する30分間の黒い培養ウェルプレートで、生細胞の侵害された膜を貫通する。マイクロプレートリーダーで蛍光の蓄積を測定します。
2. スフェロイドの成長のモニタリング
- 逆顕微鏡を用いて、培養中の日々を通して異なる条件下で維持されたスフェロイドの代表的な画像を取得する。
- 適切なソフトウェアを使用して、各回転楕円体の3つの異なる代表直径を測定することによって画像を分析します。
- 次の式を使用して、推定球体積を取得します。
注: d1、d2、および d3 という用語は、回転楕円体の 3 つの直径です。
3. 免疫蛍光(IF)と組織学的染色
- 固定およびパラフィン埋め込み
- ステップ1.6.2で説明したようにチップを切り取ったピペットを使用して、選択した時点でスフェロイドを収集し、2%PFAのRTで30分間固定します。
注:または、このステップでサンプルを4°Cで保存し、さらに使用するまで保管してください。 - パラフィン埋め込みの場合は、スフェロイド3xをPBS 1xで洗浄し、70%エタノールで再懸濁します。パラフィンの包含および切除後、組織学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行う。
- ステップ1.6.2で説明したようにチップを切り取ったピペットを使用して、選択した時点でスフェロイドを収集し、2%PFAのRTで30分間固定します。
- パラフィン切片の免疫標識
注:間接免疫染色には5μmの厚いセクションを使用してください。- 60°Cで2時間滑り込み、ワックスを溶かし、脱パラフィンを改善します。
- メチルシクロヘキサンで3分間、スライドを2回洗います。
- 1:1メチルシクロヘキサン:100%エタノールで3分間スライドを洗浄します。
- スライドを100%エタノールで3分間2回洗浄します。
注:ステップ3.2.2からステップ3.2.4までの操作をすべて化学フードで実行します。 - スライドを90%エタノールで3分間洗います。
- 75%エタノールで3分間スライドを洗います。
- スライドを50%エタノールで3分間洗います。
- 水道水の下でスライドを洗います。
- スライドを蒸留水で5分間水分補給します。
- 0.01 Mクエン酸バッファー、pH 6.0の700 mLを準備し、適切な容器(幅:11.5 cm、長さ:17センチメートル、高さ:7センチメートル)に追加します。その中のスライドをマージします。700 Wで9〜10分間電子レンジに容器を熱し、沸騰が始まったら、さらに10分間インキュベートする400-450 Wに電力を下げます。
- スライドをバッファ内で約30〜40分間RTに冷却します。
- スライドをPBSで2回5分間洗います。
- マーカー ペンでセクションの周囲に円を描き、セクションに適用される液体のバリアを作成します。
- 各セクションを50 μLのブロッキングバッファー(通常のヤギ血清10%、牛血清アルブミン(BSA)、0.02%トリトンX-100(PBS)でRTで少なくとも30分間インキュベートします。
- ブロッキングバッファーを取り外し、インキュベーションバッファーで希釈した一次抗体の 50 μL を加えます (PBS では、通常のヤギ血清 1%、BSA 0.1% BSA、および 0.02% トリトン X-100)。RTで2時間、または4°Cで一晩インキュベートする。
- 一次抗体を取り出し、スライド3xをPBSで5分間洗浄します。
- RTで1時間インキュベーションバッファーに希釈された蛍光二次抗体の50 μLでスライドをインキュベートします。
- 二次抗体を取り除き、スライド3xをPBSで5分間洗浄します。
- 各セクションに4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドールを用いた取り付け媒体50μLを加え、ガラスカバースリップをセクションの上に置きます。
4. RNA抽出、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、定量RT-PCR(qRT-PCR)
- 異なるポイントで、少なくとも3つの反復によって表される各点でスフェロイドを収集する。遠心分離機 1,000 × g で 3 分間、上清を取り除く。
注:ペレットは、RNA抽出に直接使用するか、さらに使用されるまで-20°Cで保存することができます。 - メーカーの指示に従って、市販のRNA分離キットを使用してRNA全体を分離します。
- メーカーの指示に従って、各RNAサンプルの500 ngを相補DNA(cDNA)に逆転写します。
- 逆転写後、1 μLのcDNAに対してPCR分析を行い、異なるエキソンに配置されたプライマーを用いてハウスキーピング遺伝子を増幅します。
注:このステップはRNAの準備の任意のゲノムDNA汚染の不在の検証を可能にする。このプロトコルには、ペプチジルプロリリルイソメラーゼB(PPIB) プライマーが用いられた。 - 対象遺伝子に特異的なプライマーを用いて、希釈したcDNAの4 μL(RNAAseフリーの二重蒸留水で1:10)にqPCR増幅を行います。各サンプルにおいて、ΔΔCt法を用いて特定のmRNA発現を定量化し、ハウスキーピング遺伝子レベルに対して正規化した値を用いる。
メモ: このプロトコルでは、β-actin(ACTB) が 選択されました。このプロトコルで使用されているプライマーを 表 3に示します。
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Representative Results
スフェロイドの大きさの均質性の欠如は、現在利用可能な3Dスフェロイド培養システム13の主な欠点の1つであるため、この研究の目的は、均質なスフェロイドを得るための信頼性と再現性の高いプロトコルを設定することであった。まず、理想的な作業条件を確立するために、Caco2細胞の異なる数を、専用プレートを用いてマイクロウェル/スフェロイド当たり50〜2,000細胞の範囲で試験した(表1)。事実上、これらのプレート内の各ウェルには1,200個のマイクロウェルが含まれ、ウェル当たり同数のスフェロイドの形成が可能であり、さらに重要なことに、マイクロウェル21当たり1個のスフェロイドの形成が可能となる。培養2日後、1回転楕円体当たり2,000個の細胞を含むウェルは単層として成長し、1回転楕円体当たり50個の細胞が小さく、非均質な回転楕円体を生み出した(図1A)。したがって、これら2つの条件は、さらなる分析から除外されました。長期培養を確立するために、スフェロイドはマイクロウェルから収穫され、作りたてのアガロースコーティングされたプレートに非接着条件で播種された。次いで、体積変化を測定することにより、実験時間コース全体を通して回転楕円体の成長をモニタリングした。非球形状を考慮に入れて、各スフェロイドの3つの異なる直径を測定し、容積式を27(図1B)に適用した。100個と200個の細胞から生成されたスフェロイドは、実験の全過程で初期サイズを維持したのに対し、1,000個の細胞を含む細胞は大きなサイズのために収穫中に崩壊し、その結果、体積の変動性が高まった。したがって、500個の細胞から生じるスフェロイドが実験時間コースで最も均質なサイズの増加を示したように、この数の細胞はスフェロイド形成に使用された。
第2に、球状体当たり500個の細胞のほかに、300〜800細胞の範囲の追加細胞数が研究された。また、非付着条件を改善するために、元のプロトコルは、1回の洗浄のみを施すのではなく、ウェルを2回前処理することによって改変した。これらの変化により、スフェロイド均質性および圧縮の改善が認められた(図2A)。各条件におけるスフェロイドの大きさは収穫時に測定し(図2B)、アガロースコーティングされた皿の培養中のそれらの長期成長を日々監視した(図2C)。その結果に基づいて、500および600個の細胞/スフェロイドが良好な増殖および低い変動をもたらす最適条件として確認された。実験時間コース全体でより均質な成長プロファイルと形成されたコンパクトな構造のために、その後の実験のために、スフェロイド当たり600個の細胞を細胞数として選択した。最後に、プロトコルをさらに改善するために、DMEM完全培地を基体膜マトリックスの2.5%を添加し、これは追加の成長因子および細胞外マトリックスタンパク質28の大きなパネルを含む。実際、回転楕円体の多球状形状は、細胞偏光29,30に影響を及ぼした可能性のある微小環境からの信号の欠如に起因する可能性がある。基体膜マトリックスの添加により、スフェロイド成長が増強され、その均質性が向上した(図2D)。この改善の一例は、1回転楕円体当たり500個の細胞に対して見ることができる。基部膜マトリックス(図1B)がない場合、スフェロイドのサイズはより異質で、D3からD7に倍増し、次いで高原に達した。しかし、基質膜マトリックス(図2C)の存在下では、各時点におけるスフェロイドのサイズはより均一であり、時間の経過とともに比例的に増加した。
スフェロイドの長期的な特徴を分析するために、アガロースコーティングされた料理の培養後に異なる時点で回収され、パラフィンセクションの詳細な組織学的およびIF分析が行われました。H&E染色は、回転楕円体内の細胞が時間の経過とともに組織と形状の変化を受けたことを示した。実際、D3では細胞を多層に密に配置し、単層に配置された平らな細胞はD10ではっきりと見えた。興味深いことに、画像の黒い点線で示されているように、D5以降の回転楕円体の中にルーメンが現れました(図3)。並行して、増殖マーカーを用いてIFにより細胞増殖とアポトーシスを解析し、増殖性細胞核抗原(PCNA)、および細胞死マーカー、活性化カスパーゼ3を用いた。PCNA用の標識は、増殖細胞がしばしばスフェロイドの外表面に存在することを明らかにした、時にはオルガノイド培養15を連想させる暗号状または芽様構造において。また、D5およびD7でPCNA陽性細胞の明らかな増加が見られ、D10によって減少した(図4、左パネル)。驚くべきことに、活性化カスパーゼ3は、D3およびD5の両方でスフェロイド内の非常に少数の細胞(図4、左パネル)およびより長い期間にわたって観察された(データは示されていない)。βカテニンの発現パターンもパラフィン切片で評価した。興味深いことに、各時点において、鮮明な膜結合および細胞質染色で高レベルのβカテニン発現が観察された(図4、右パネル)。膜結合βカテニンは、E-カドヘリン31に結合することにより細胞接着に関与していることは注目に値する。すべてのタイムポイントで細胞のクラスターで高レベルのß-カテニン標識が注目された。場合によっては、細胞はまた、明確な核ß-カテニン局在化を示した(図4、右パネル)。Caco2細胞は、主に腸球19,32に2D中でインビトロで分化することが知られている。しかしながら、染色体A(腸内分泌細胞)、リゾーム(パネス細胞)またはムチン2(MUC2、ゴブレット細胞)などの分化マーカーの発現は、IF(データを示さない)によってこれらのスフェロイドにおいて検出できなかった。しかし、腸球に分化する可能性が確認されたが、スフェロイドがALPI(アルカリホスファターゼ)及び溶質担体ファミリー2を発現していることを考えると、転写変異体2(SLC2A5)/グルコーストランスポーター5(GLUT5)mRNA(図5)。これらのmRNAレベルはD5およびD7で増加したが、その差はD3のレベルと比較して有意ではない(ALPI)またはわずかに有意(SLC2A5)であった。
この新しい方法に基づいて生成・培養されたスフェロイドがCSCを研究するための信頼できるツールであるかどうかを定義する最終目標を持ち、CSCマーカーの発現をIFおよびqRT-PCRで分析しました。CD133およびCD44は、CSCs7、33、34を含む癌細胞集団を特徴付け、正常腸および結腸33、34、35においてもSCによって発現される。CD133陽性細胞のクラスターは、各時点におけるスフェロイドの外部表面に主に局在していた(図6A、左パネル)。CD44陽性細胞は頻度が低かったが、CD133陽性細胞(図6A、右パネル)と常に関連していた、CD133/CD44二重陽性CSC様細胞の集団およびCD133のみを発現する集団の存在を示す。オルファグメジン4(OLFM4)および武蔵1(MSI1)をSC/CSCマーカーとして調べた。これらのマーカーは、結腸内窩36、37、および別個の細胞集団35、38において非常に限られた方法で発現される。各時点で観察されたMSI1陽性細胞はごくわずかであった(図7)ののに対し、OLFM4は検出不能のままであった(データは示されていない)。それにもかかわらず、CD44およびCD133について観察されたように、MSI1標識細胞は、暗号状または芽状の構造でスフェロイドの外部表面に位置していた。同じマーカーもアガロースコーティングされた皿の培養後の同じ時点でmRNAレベルで分析した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1(ALDH1a1)は、CSCs39,40の特徴が良く特徴付けられたマーカーであり、研究にも含まれていた(図8)。プロミニン-1(CD133用PROM1エンコーディング)およびCD44 mRNAの分析により、全ての時点でスフェロイド中の両方のマーカーの発現が確認された。しかし、PROM1 mRNAレベルは培養時間の経過とともに非常に類似していましたが、CD44レベルはD3以降減少しました。しかし、この差は、D10とD3のmRNAレベルを比較する場合にわずかに有意であった。
MSI1 mRNAの分析は、各時点でスフェロイドにおける発現を確認し、D7またはD10(図8)と比較してD3およびD5で有意に高いレベルであったのに対し、OLFM4 mRNAは検出できなかった(図示していない)。最後に、ALDH1a1 mRNAは各時点でスフェロイドで発現し、D10で低下した発現プロファイルを示し、D3のレベルに比べてわずかに有意なレベルを示した(図8)。癌細胞生物学を研究する新しいモデルの妥当性を検証するために、FOLFOXまたはFOLFIRIで治療されたスフェロイドで化学療法に対する応答を分析し、CRC患者22、23、24、25に定期的に投与される併用療法。まず、細胞死を誘発する際の治療の有効性を、死細胞26に特異的に入る蛍光核酸染色体を用いてスフェロイドをインキュベートすることによって調べた。対照NTの状態と比較して、各薬剤による治療は、蛍光の蓄積によって測定される有意な細胞死を誘発した(図9A)。この観察は、生きた顕微鏡を用いて形態学的レベルでも確認され、治療が回転楕円体の大きさと外観に強く影響を及ばしたことを示した(図9B)。最後に、SC/CSCマーカーの発現を、同じ条件下でスフェロイド中のqRT-PCRにより分析した(図9C)。興味深いことに、FOLFOXおよびFOLFIRI条件の両方でPROM1 mRNAレベルの有意な減少は、対照のレベルと比較して観察されたのに対し、MSI1レベルは治療の影響を受けなかった。さらに、FOLFOXはコントロールと比較してALDH1a1 mRNA発現に影響を及ぼさなかったのに対し、FOLFIRIによる治療はそのレベルを有意に増加させた。OLFM4 mRNAは検出されず、CD44 mRNAレベルは極めて低かった(データは示さなかった)。
図1: スフェロイド培養物の設定 (A) カコ2細胞の示された濃度から開始されたスフェロイド形成は、ス フェロイド/マイクロウェルを形成する。上のパネルは、培養2日後の培養プレート全体の代表的な画像を示しています。下部パネルには、条件ごとに選択されたマイクロウェルの画像が表示されます。画像は4倍の倍率(マイクロウェルサイズ:400μm)で撮影した。スケールバー:低倍率、100 μm。高倍率、30 μm。(B)マイクロウェル当たり異なる数の細胞から生成されたスフェロイドの成長特性を、異なる時点で分析する。なお、示された日には、マイクロウェルにおける培養の最初の2日間およびアガロースコーティングされたプレートにおける収穫されたスフェロイドのその後の培養が含まれる。ヒストグラムは標準偏差±平均を示し、n = 4-6です。黒い円は、個々の回転楕円体の値を示します。推定体積の式はパネルの上部に示され、d1、d2、およびd3は各回転楕円体について測定された3つの直径を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:スフェロイド形成と培養条件の最適化(A)D7におけるスフェロイドの代表的な画像は、新しい井戸調製および培養培地条件を用いて、マイクロウェル(2日間)およびアガロースコーティングされた皿(5日間)での培養から回復した後である。スケールバー:30 μm。(B)ミクロウェルにおける細胞培養開始の2日後に収穫したばかりのスフェロイドの推定量。ヒストグラムは標準偏差(SD)±平均値を示し、n = 4–6です。黒丸は、個々の回転楕円体のサイズを示します。(C)新たに選択された条件に基づく長期培養におけるスフェロイドの推定体積。グラフは、スフェロイド当たり異なる数の細胞から生成されたスフェロイドの成長特性を示し、示されているように、収穫後の異なる時点で分析した。ヒストグラムはSD±平均値を示し、n = 6-10を示します。黒丸は、個々の回転楕円体のサイズを示します。(D) 実験時間コース(右パネル)およびマイクロウェル(左パネル)内で選択した600個のセルをスフェロイド条件で表しています。画像は4倍の倍率で撮影されました。スケールバー:低倍率、100 μm。高倍率、30 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 回転楕円体の組織学的特徴 パラフィン切片の組織学的ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色収穫後に示された時点におけるスフェロイドの代表的な画像を、示されているとおり。各高倍率インセットの黒い点線は、回転楕円体内のルーメンを区切ります。スケールバー:低倍率、30 μm。高倍率、10 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:免疫標識によるカコ2スフェロイド特性測定 増殖マーカー、増殖細胞核抗原(PCNA、赤)、および細胞死マーカーに対するスフェロイドの免疫染色は、カスパーゼ3(緑色)(左パネル)およびβカテニン(赤)(右パネル)に対して示された時間に活性化した。画像は、PCNA(赤)、活性化カスパーゼ3(緑)、および核(青)またはβカテニン(赤)および核(青)の結合された標識を示しています。白い矢印は、高レベルのβカテニンを発現する細胞または細胞群を指しています。画像は20倍の目的で撮影されました。スケールバー:5 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:qRT-PCRによる腸細胞分化マーカーの解析アルカリホスファターゼおよびGLUT5タンパク質をそれぞれコードするALPIおよびSLC2A5タンパク質の分析。ヒストグラムは、ACTBに対する正規化後±標準偏差n = 3の平均を示す。データは、正常な結腸粘膜に対する折り目変化として表される(赤線=1)。NS:重要ではありません。MS:ペアになっていない学生のt-testによるD3と比較してわずかに有意です。略語: qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;GLUT5 = グルコーストランスポーター 5;SLC2A5= 溶質キャリアファミリー 2, 転写変異体 2;ACTB = βアクチン。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:スフェロイドにおける幹細胞マーカーCD44及びCD133の不均一な発現幹細胞マーカーに対する免疫染色は、CD133およびCD44、指示された時間における。左側のパネルの画像は、CD133(緑)と核(青)のマージされたラベルを示しています。右のパネルの同じ画像は、CD44(赤)と核(青)のマージされたラベルを示しています。左側のパネルの緑色の矢印は CD133 発現セルを指し、両方のパネルの白い矢印は CD44 および CD133 を表すセルまたはセルのグループを指します。画像は20倍の目的で取得されました。スケールバー:5 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:スフェロイドにおける幹細胞マーカーMSI1の不均一な発現示された時間における幹細胞マーカーMSI1(赤色)に対する免疫染色。画像は、MSI1 (赤) と核 (青) のマージされたラベルを示しています。白い点線は、細胞がMSI1免疫標識に陽性であるいくつかの暗号のような構造に下線を引く。画像は20倍の倍率で撮影されました。スケールバー:5 μm。略語 = MSI1 = 武蔵 1.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: qRT-PCRによる幹細胞マーカーの解析PROM1、CD44、MSI1、およびALDH1a1レベルの定量は、示された時間にスフェロイドからのmRNAに対して行った。 ヒストグラムは、ACTBに対する正規化後±標準偏差n = 3の平均を示す。データは、正常な結腸粘膜に対する折り目変化として表される(赤線=1)。NS:重要ではありません。MS:D3と比較してわずかに有意で、ペアになっていない学生のt-testを使用しています。*: P < 0.05 D3 または D5 と比較して、非対の学生のt-testを使用します。略語: qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;PROM1 = プロミニン-1;MSI1 = 武蔵 1;ALDH1α1 = アルデヒドデヒドロゲナーゼ1アルファ;ACTB = βアクチン。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:スフェロイドに対する化学療法の効果マイクロウェルから収穫した後、スフェロイドをアガロースコーティングされたプレートで培養し、FOLFOXまたはFOLFIRIで3日間処理するか、または(対照)非処理(NT)状態で維持した。(A) 死細胞における核酸の標識による蛍光の分析ヒストグラムは標準偏差(SD)±平均、n = 4を示す。(B) 異なる培養条件で維持されるスフェロイドの形態学的特徴。画像は4倍の目的で撮影されました。スケールバー:400 μm。(C) qRT-PCR によるPROM1 、MSI1、および ALDH1a1 mRNA の定量化。ヒストグラムは、ACTBに対する正規化後±SD、n = 4の平均を示す。*: NS: 重要ではありません。P < 0.05;**: P < 0.01;: P < 0.001 をコントロール (NT) 条件と比較し、ペアになっていないスチューデントのt-検定を使用します。略語: FOLFOX = 5-フルオロウラシル, 50 μg/mL;オキサリプラチン、10 μg/mL;ロイコボリン, 25 μg/mL;フォルフィリ = 5-フルオロウラシル、50 μg/mL;イリノテカン、100 μg/mL;ロイコボリン、25 μg/mL;qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;PROM1 = プロミニン-1;MSI1 = 武蔵 1;ALDH1α1 = アルデヒドデヒドロゲナーゼ1アルファ;ACTB = βアクチン。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| スフェロイド当たりの所望の細胞数 | ウェルあたりの必要なセル数 |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1.2 x 105 |
| 200 | 2.4 x 105 |
| 300 | 3.6 x 105 |
| 400 | 4.8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7.2 x 105 |
| 700 | 8.4 x 105 |
| 800 | 9.6 x 105 |
| 1000 | 1.2 x 106 |
| 2000 | 2.4 x 106 |
表 1: スフェロイド形成と細胞播種の概要
| 10mm皿 | 6ウェルプレート | 12ウェルプレート | 24ウェルプレート | 96ウェルプレート | |
| コーティングボリューム | 4 mL | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL(ダウン&アップ) |
表 2: 異なるプレート/皿のコーティングのためのアガロース溶液のボリューム。
| 遺伝子 | プライマー | 順序 | 製品の長さ | |
| 分化マーカー | アルピ | フォワード | CTG GTC アガ TGC TGA CA | 81 |
| 逆 | ATG TTG ギャグ ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | フォワード | タック CCA TAC TGG AAG ガット GA | 94 | |
| 逆 | AAC アグ アグ ATC アガ GCA TGA AG | |||
| 幹細胞マーカー | アルド1a1 | フォワード | GCC TTC ACA GGA TCA ACAギャグ | 147 |
| 逆 | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | フォワード | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| 逆 | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| プロム1 | フォワード | GTA アガ ACC CGG ATC AAA アグ | 131 | |
| 逆 | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | フォワード | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| 逆 | TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT | |||
| オルFM4 | フォワード | TCT GTG TCC CAG TTG TTTT TCC | 118 | |
| 逆 | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| ハウスキーピング遺伝子 | ACTB | フォワード | CAC キャット TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| 逆 | アグ TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | フォワード | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| 逆 | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
表 3: 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるプライマー。
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Discussion
in vitro 3Dモデルは、2Dがん細胞培養の主な実験的欠点を克服し、微小環境や細胞の不均一性を含む典型的な腫瘍特徴をより再現する際に信頼性が高いように見えます。一般的に使用されるスフェロイドの3Dモデルは、足場を含まない(低い付着条件で培養)または足場ベース(培養細胞に生体材料を使用する)です。これらの方法は、使用される足場の性質に依存したり、構造やサイズが可変のスフェロイドを生じさせるため、異なる欠点を提示します。
本プロトコルは、結腸腺癌細胞株Caco2から、足場を含まない方法を用いて均質なスフェロイドを産生するための最適化条件を報告する。スフェロイドは、容易に収穫され、以前に報告された研究41に反して、彼らは正常に成長し、培養中のそれらの成長特性も分析することができる。さらに、この新しい方法により、スフェロイド(a)は活発に増殖し、(b)細胞死の非常に低い速度を提示し、(c)球内に内腔を形成するように編成し、そして(d)成分細胞の分化能力を示す。新しいアプローチの最終目的はCSC生物学の研究に用いられたことを考えると、CSCの異なるマーカーの発現を分析した。興味深いことに、マーカーは、時間ポイントに応じて動的な表現パターンを提示し、異なるCSC集団を定義しました。
最も重要なことは、このプロトコルを介して生成されたスフェロイドは、化学療法レジメン、FOLFOXおよびFOLFIRIのような臨床応用に関連する薬物を分析するために使用することができる。結果はまた、分析されたCSCマーカーに応じて、薬物に対する細胞の異種反応を強調する。この観察は、腫瘍内の異種および複数のCSC様細胞集団が多様な化学感受性/化学抵抗特性42,43を示すという現在の見解と一致している。この知見は、大規模スクリーニングに対するこの新しい方法の適用性を強く増強する。この研究で報告されたアプリケーションに加えて、新しいプロトコルは、より広い範囲の分析(例えば、RNAおよび/またはDNA抽出および大規模な分析、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光)にも使用できます。実際、球体の体積と成長特性は、必要に応じて、完全球形からの偏差を相殺するために異なる直径を考慮に入れる球体積式を適用することによって容易に決定することができる。ただし、特定のパラメーターは、セルの種類 (細胞株または新鮮な一次培養) とレプリケーション時間などの成長容量に応じて最適化する必要があります。それにもかかわらず、プロトコルは、簡単に調整できる重要なステップを示しています。
この記事で説明するスフェロイド生成を行う際には、いくつかの懸念事項を考慮する必要があります。まず、球体の均質性および圧縮を促進するために、いくつかの洗浄工程をアンチ付着リンス溶液で行う必要があります。この場合、2回の打ち込みが必要でした。第二に、これは回転楕円体の正しい形成を妨げることができるので、マイクロウェルから気泡を取り除かなければならない。第三に、遠心分離工程後に各マイクロウェルに細胞を播種すると、プレートは2日間妨げられていない状態でなければならない。自動化された可視化とイメージングシステムを含む、スフェロイド形成の初期段階を研究する際には、プロトコルの追加の考慮事項と変更が必要です。第四に、スフェロイドを乱すことなく培地を交換することは、懸濁液であることを考えると、困難な場合があります。したがって、毎回ボリュームの半分だけを変更することをお勧めします。第五に、スフェロイドを収穫する際には、その構造を維持することが重要である。したがって、セロロジカルピペットまたはマイクロピペットの使用は、セラム含有培地またはPBSでリンスした後のすべての分配ステップに推奨され、スフェロイドが先端に付着するのを防ぎます。
このプロトコルを使用する場合、いくつかの制限が発生する場合があります。まず、すべてのセル ラインまたはセル型が同じカルチャ パラメーターを持っているわけではありません。場合によっては、細胞の不均一性および細胞の通過/老化の数も、スフェロイドを形成する能力に影響を与える可能性があります。第二に、オルガノイドに対して逆に、培養において非常に長い時間回転楕円体を維持することは困難である可能性がある。さらに、マイクロピペットチップ15を介した単純な断片化によって複製することはできません。第三に、このプロトコルは、手動で回転楕円体を1つずつ回復するのは難しいため、シングルスフェロイド分析には適応できません。この技術は、同時に多量の均質なスフェロイドを得るのにより適している。最後に、他の細胞型由来の成長因子の影響を調べたり、微小環境の重要性を分析したりする研究では、モデルを充実させ、共培養実験を行うことが重要である。
結論として、本方法論は、Caco2細胞からスフェロイドを効率的に生成および培養するための新しいプロトコルを記述する。この結果は、この方法が腫瘍不均一性の研究およびCSCの分析に適用できることを実証した。この方法は、高スループットの薬物スクリーニングおよび癌細胞および非癌細胞における幹細胞生物学の研究にも使用することができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もない
Acknowledgments
我々は、イメージングおよびアニパス・レケルシュ・ヒスオロジー・プラットフォーム(CRCL、CLB)を認める。私たちは、FOLFOXとFOLFIRIの種類の贈り物のためにセンターレオンベラード(CLB)病院の薬局にお世話になっています。また、ブリジット・マンシップが原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。この作業は、FRM(Equipes FRM 2018、DEQ20181039598)とインカ(PLBIO19-289)によってサポートされました。MVGとLCは、FRMとCFから支援を受け、ARC財団とセンター・レオン・ベラードから支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
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