Un bioréacteur multi-cue pour évaluer la capacité inflammatoire et régénératrice des biomatériaux sous écoulement et étirement

Summary

L’objectif de ce protocole est d’exécuter une co-culture dynamique de macrophages humains et de myofibroblastes dans des échafaudages tubulaires électrospunés pour étudier la régénération tissulaire entraînée par les matériaux, à l’aide d’un bioréacteur qui permet le découplage de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique.

Abstract

L’utilisation de biomatériaux résorbables pour induire la régénération directement dans le corps est une stratégie attrayante d’un point de vue translationnel. Ces matériaux induisent une réponse inflammatoire lors de l’implantation, qui est le moteur de la résorption ultérieure du matériau et de la régénération de nouveaux tissus. Cette stratégie, également connue sous le nom d’ingénierie tissulaire in situ, est poursuivie pour obtenir des remplacements cardiovasculaires tels que des greffes vasculaires modifiées par des tissus. Les processus inflammatoires et régénératifs sont déterminés par les signaux biomécaniques locaux sur l’échafaudage (c.-à-d. contrainte d’étirement et de cisaillement). Ici, nous décrivons en détail l’utilisation d’un bioréacteur développé sur mesure qui permet de manière unique le découplage de la contrainte d’étirement et de cisaillement sur un échafaudage tubulaire. Cela permet l’évaluation systématique et standardisée de la capacité inflammatoire et régénératrice des échafaudages tubulaires sous l’influence de charges mécaniques bien contrôlées, que nous démontrons sur la base d’une expérience de co-culture dynamique utilisant des macrophages et des myofibroblastes humains. Les principales étapes pratiques de cette approche – la construction et la mise en place du bioréacteur, la préparation des échafaudages et de l’ensemencement des cellules, l’application et le maintien de l’écoulement d’étirement et de cisaillement, et la récolte d’échantillons pour analyse – sont discutées en détail.

Introduction

L’ingénierie tissulaire cardiovasculaire (TE) est poursuivie comme une option de traitement alternative aux prothèses cardiovasculaires permanentes actuellement utilisées (par exemple, greffes vasculaires, remplacements de valves cardiaques), qui sont sous-optimales pour de grandes cohortes de patients^1,2,3,4. Les applications très recherchées comprennent les greffes vasculaires d’ingénierie tissulaire (TEVG)^5,6 et les valves cardiaques (TEHV)^7,8. Le plus souvent, les méthodologies d’ÉT cardiovasculaire utilisent des biomatériaux résorbables (naturels ou synthétiques) qui servent d’échafaudage instructif pour la formation du nouveau tissu. La formation de nouveaux tissus peut soit être conçue complètement in vitro, en ensemencant l’échafaudage avec des cellules et en le cultivant dans un bioréacteur avant l’implantation (TE in vitro)^9,10,11, soit directement in situ, dans laquelle l’échafaudage synthétique est implanté sans pré-culture afin d’induire la formation de nouveaux tissus directement dans le corps (TE in situ)^12,13,14. Pour les approches cardiovasculaires TE in vitro et in situ, la régénération fonctionnelle réussie dépend principalement de la réponse immunitaire de l’hôte à la construction implantée et de la charge biomécanique appropriée.

L’importance de la charge biomécanique pour les TE cardiovasculaires est bien reconnue¹⁵. Dans le cas des implants cardiovasculaires, les cellules qui peuplent l’échafaudage sont exposées à des contraintes d’étirement et de cisaillement cycliques résultant de l’environnement hémodynamique. De nombreuses études ont rapporté l’effet stimulant de l’étirement (cyclique) sur la formation de composants de la matrice,tels que le collagène¹⁶,^17,18^,19, glycosaminoglycanes (GAGs)²⁰, et^{l’élastine 21,22}, par divers types de cellules. Par exemple, Huang et al. ont démontré que l’étirement biaxial élevait le dépôt et l’organisation du collagène et de l’élastine dans les TEVG in vitro en utilisant un bioréacteur vasculaire^23. Bien que l’accent soit généralement mis sur l’étirement en tant que charge dominante, ces études utilisent souvent des bioréacteurs pilotés par écoulement dans lesquels l’échantillon est également exposé à un écoulement de cisaillement. Bien que l’on sache relativement peu de choses sur l’influence isolée des contraintes de cisaillement sur la formation des tissus et l’inflammation en 3D, certaines données sont disponibles. Par exemple, Hinderer et al. et Eoh et al. ont démontré que le flux de cisaillement, en plus d’une microstructure d’échafaudage 3D, était important pour la formation d’élastine mature par les cellules musculaires lisses vasculaires humaines dans un système de modèle in vitro^24,25. Dans l’ensemble, ces résultats illustrent la pertinence de l’étirement cyclique et du stress de cisaillement pour l’ET cardiovasculaire.

Un autre déterminant important du succès ou de l’échec des implants TE est la réponse immunitaire de l’hôte au greffon implanté²⁶. Ceci est particulièrement important pour les stratégies TE in situ axées sur les matériaux, qui reposent en fait sur la réponse inflammatoire aiguë à l’échafaudage pour lancer les processus ultérieurs d’afflux cellulaire et de formation et de remodelage des tissus endogènes²⁷. Le macrophage est un initiateur critique de la régénération fonctionnelle des tissus, ce qui a été démontré par de multiples études^28,29,30. Analogue à la cicatrisation des plaies, la régénération des tissus est régie par la signalisation paracrine entre les macrophages et les cellules productrices de tissus telles que les fibroblastes et les myofibroblastes^31,32,33. En plus de coordonner les nouveaux dépôts tissulaires, les macrophages sont impliqués dans la résorption active des échafaudages étrangers^34,35. A ce titre, la réponse in vitro des macrophages à un biomatériau a été identifiée comme un paramètre prédictif du succès in vivo des implants^36,37,38.

La réponse des macrophages à un échafaudage implanté dépend des caractéristiques de conception de l’échafaudage telles que la composition du matériau et la microstructure^35,39,40. En plus des propriétés de l’échafaudage, la réponse des macrophages à un échafaudage et leur diaphonie avec les myofibroblastes sont également affectées par les charges hémodynamiques. Par exemple, l’étirement cyclique s’est avéré être un modulateur important du phénotype des macrophages^41,42,^43,44 et de la sécrétion de cytokines 43 ,^44,45,46 dans les échafaudages électrospunés 3D. En utilisant un système de co-culture de macrophages et de cellules musculaires lisses vasculaires, Battiston et al. ont démontré que la présence de macrophages entraînait une augmentation des niveaux d’élastine et de GAG et que des niveaux modérés d’étirement cyclique (1,07-1,10) stimulaient le dépôt de collagène I et d’élastine^47. Dans des travaux antérieurs, nous avons démontré que le stress de cisaillement est un déterminant important pour le recrutement des monocytes dans les échafaudages électro filés^{3D 48,49}, et que le stress de cisaillement et l’étirement cyclique ont un impact sur la signalisation paracrine entre les monocytes humains et les cellules stromales mésenchymateuses⁵⁰. Fahy et al. ont démontré que le flux de cisaillement augmentait la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les monocytes humains^51.

Pris ensemble, les preuves ci-dessus montrent qu’une compréhension et un contrôle adéquats des charges hémodynamiques sont cruciaux pour l’ÉT cardiovasculaire, et qu’il est important de prendre en compte la réponse inflammatoire pour y parvenir. De nombreux bioréacteurs ont été décrits précédemment pour la culture in vitro^{52,53,54,55,56,57,58} ou ex vivo^59,60,61 de tissus cardiovasculaires. Cependant, tous ces systèmes sont conçus pour imiter autant que possible les conditions physiologiques de charge hémodynamique. Bien que cela soit très utile dans le but de créer des tissus cardiovasculaires in vitro ou de maintenir des cultures ex vivo, de tels systèmes ne permettent pas d’études systématiques sur les effets individuels d’indices individuels. En effet, l’application de la contrainte d’étirement et de cisaillement cyclique dans ces bioréacteurs est entraînée par le même écoulement sous pression, qui les lie intrinsèquement. Alors que des microsystèmes permettant une manipulation mécanique multi-signaux précise ont été décrits pour les substrats^{2D 62} ou les configurations d’hydrogel 3D^63,64, de telles configurations ne permettent pas l’incorporation d’échafaudages de biomatériaux élastomères 3D.

Nous présentons ici l’application d’un système de bioréacteur tubulaire qui permet de manière unique le découplage de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique et aide à étudier mécaniquement leurs effets individuels et combinés. Ce système permet de tester une grande variété de greffes vasculaires d’ingénierie tissulaire (par exemple, origine synthétique ou naturelle, micro-architecture différente, porosités diverses). Pour découpler efficacement l’application de la contrainte de cisaillement et de l’étirement, les concepts clés utilisés par le bioréacteur sont (1) la séparation du contrôle de la contrainte de cisaillement et de l’étirement à l’aide de systèmes de pompage distincts et (2) la stimulation des échafaudages de manière « à l’envers » avec des dimensions pilotées par calcul. L’écoulement est appliqué sur la surface extérieure de l’échafaudage tubulaire à l’utilisation d’une pompe à débit, tandis que l’étirement circonférentiel de l’échafaudage est induit par l’expansion d’un tube en silicone sur lequel l’échafaudage est monté à l’utilisation d’une pompe de contrainte séparée. Les dimensions du tube en silicone et du tube en verre qui contient la construction sont soigneusement choisies et validées à l’aide de simulations computationnelles de la dynamique des fluides, afin de s’assurer que la contrainte de cisaillement sur l’échafaudage (due à l’écoulement) et l’étirement circonférentiel (dû à l’expansion du tube) ne s’affectent pas de manière significative. Cette conception à l’envers a plusieurs justifications pratiques. Si l’étirement est appliqué par la pression du fluide luminal (similaire à la charge physiologique), il nécessite intrinsèquement que le plan d’échantillonnage soit exempt de fuites. De plus, la pression requise pour étirer l’échantillon serait entièrement déterminée par la rigidité de l’échantillon, qui peut varier d’un échantillon à l’autre et à l’intérieur d’un échantillon au fil du temps, ce qui rend difficile le contrôle de l’étirement. Ce bioréacteur monte la greffe de tissu autour d’un tube en silicone et permet l’application de contraintes de cisaillement de la paroi (WSS) sur la paroi externe de la greffe et met la greffe sous pression de l’intérieur. De cette façon, des conditions de charge égales entre les échantillons et à l’intérieur des échantillons au fil du temps peuvent être assurées, et de plus, les échantillons sont autorisés à fuir, comme c’est le cas pour les échafaudages vasculaires poreux¹⁹. Ce bioréacteur à l’envers est spécifiquement destiné à des études systématiques sur les effets du cisaillement et / ou de l’étirement, plutôt qu’à l’ingénierie d’un vaisseau sanguin de type natif in vitro, pour lequel les configurations de bioréacteur vasculaire traditionnelles sont plus appropriées. Voir la figure 1A–B pour les dessins de conception du bioréacteur et le tableau 1 correspondant pour une description fonctionnelle et une justification des principaux composants du bioréacteur.

L’utilisation du bioréacteur est démontrée sur la base d’une série d’études récentes de notre groupe dans lesquelles nous avons étudié les influences individuelles et combinées du stress de cisaillement et de l’étirement cyclique sur l’inflammation et la formation de tissus dans des échafaudages électrospunables résorbables pour les tissus cardiovasculaires in situ^19,43,44. À cette fin, nous avons utilisé des macrophages humains et des myofibroblastes en monoculture ou en co-culture pour simuler les différentes phases de la cascade régénérative in situ. Nous avons démontré que la sécrétion de cytokines par les macrophages humains est nettement affectée par l’étirement cyclique et la contrainte de cisaillement, affectant le dépôt et l’organisation de la matrice par les myofibroblastes humains dans ces échafaudages, à la fois via la signalisation paracrine et le contact direct^19,43,44. Notamment, ces études ont révélé que dans le cas de l’application combinée de contrainte de cisaillement et d’étirement, les effets sur la formation tissulaire et l’inflammation sont soit dominés par l’une des deux charges, soit il existe des effets synergiques des deux charges. Ces résultats illustrent la pertinence du découplage des deux charges pour mieux comprendre la contribution de l’environnement mécanique sur les processus TE. Cette compréhension peut être appliquée pour optimiser systématiquement les paramètres de conception des échafaudages dans les régimes de charge hémodynamique pertinents. En outre, les données mécanistes de ces environnements bien contrôlés peuvent servir d’entrée pour des modèles numériques en cours de développement pour prédire l’évolution du remodelage tissulaire in situ, comme cela a été récemment rapporté pour les TEVG⁶⁵ ou TEHV^66,afin d’améliorer encore la capacité prédictive.

Protocol

Dans les études décrites dans ce protocole, des macrophages humains primaires isolés des manteaux bouffants du sang périphérique et des myofibroblastes humains isolés de la veine saphène après une chirurgie de pontage coronaire ont été utilisés⁴⁴. Les manteaux bouffants ont été obtenus auprès de volontaires en bonne santé et anonymes qui ont fourni un consentement éclairé écrit, qui a été approuvé par le Comité d’éthique médicale de l’établissement de recherche Sanquin. L’utilisation de cellules de vena saphena humaines (HVSC) était conforme au « Code d’utilisation secondaire appropriée des tissus humains » développé par la Fédération des sociétés médicales (FMWV) aux Pays-Bas.

1. Préparatifs généraux et actions requises avant la mise en place du bioréacteur

REMARQUE: Pour plus de détails sur les protocoles d’isolement et de culture respectifs, veuillez vous référer aux travaux précédents^19,43,44. Tous les calculs du protocole sont donnés comme exemples pour une expérience de co-culture avec des monocytes et des myofibroblastes, ensemencés dans 8 échafaudages chargés hémodynamiquement et 2 témoins statiques (n = 10).

1. Commencer l’isolement cellulaire et la culture cellulaire. Les densités d’ensemencement pour les échantillons de monocytes et de myofibroblastes co-cultivés (avec un rapport d’ensemencement de 2:1) sont respectivement de 30 ×^{10 6} monocytes/cm3 et de 15 ×^{10 6} myofibroblastes/cm3.
   REMARQUE: Le matériau électropuné a une porosité élevée (>90%). Pour estimer le nombre requis de cellules par greffe, le volume de l’échafaudage est calculé avec la formule du volume d’un cylindre creux: π * (épaisseur)²* longueur ≈ 0,04 cm³. La quantité totale de cellules par greffe est de 1,2 × 10⁶ monocytes et 0,6 × 10⁶ myofibroblastes. Pour 10 échantillons, au moins 12 × 10⁶ monocytes et 6 × 10⁶ myofibroblastes sont nécessaires; commencez avec jusqu’à ~ 10 à 15 % de cellules en plus pour tenir compte des erreurs de pipetage possibles.
2. Dégazez le milieu de culture cellulaire qui sera utilisé pour des expériences impliquant le bioréacteur.
   1. Préparer le milieu pour les co-cultures, qui se compose de RPMI-1640:aDMEM (1:1), complété par 10% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine et 0,5% de L-glutamine.
   2. Placer le milieu pendant la nuit (O/N) dans un incubateur dans une fiole de culture cellulaire avec bouchon filtrant pour dégazer.
   3. Remplacez le bouchon du filtre par un bouchon étanche à l’air et conservez-le à 4 °C.
   4. Juste avant utilisation, ajouter 0,25 mg/mL d’acide L-ascorbique 2-phosphate (vitamine C) au milieu.
      REMARQUE: Pour les calculs, la quantité de milieu requise par chambre de culture d’écoulement est de 50 mL. Rafraîchissez le médium trois fois par semaine; L’ancien milieu de 25 mL est remplacé par un milieu frais de 25 mL. Pour 10 échantillons; après l’ensemencement, un total de 500 mL de milieu frais est nécessaire et, pour chaque changement de milieu subséquent, un total de 250 mL de milieu frais est utilisé. Préparez toujours un milieu frais, en particulier de la vitamine C doit être ajoutée juste avant de changer le milieu.
3. Préparer des échafaudages électropunés isotropes (diamètre luminal de 3 mm, épaisseur de paroi de 200 μm) tels que décrits par Van Haaften et al.¹⁹ (Figure 1G–I). En bref, les échafaudages tubulaires en polycaprolactone bisurée (PCL-BU) sont produits par électrofilage à partir de solutions de chloroforme-polymère à 15% (p /p). Les solutions polymères sont électrofilées à température ambiante et à 30 % d’humidité relative, à un débit de 40 μL/min, à une distance de 16 cm de la cible cylindrique rotative (Ø 3 mm, 500 tr/min), et une tension appliquée de 16 kV sur la buse d’électrofilage et de -1 kV sur la cible.
   REMARQUE: Bien que des greffes PCL-BU aient été utilisées pour ces expériences, une grande variété de greffes d’ingénierie tissulaire élastomère peuvent être montées dans ce bioréacteur (par exemple, d’origine synthétique ou naturelle différente, de microarchitecture différente, de porosités différentes)
   1. Retirez les échafaudages électropunés du mandrin.
      1. Faites un petit trou dans le capuchon d’un tube de 15 mL pour « maintenir » le mandrin au centre et l’empêcher de toucher la paroi du tube.
      2. Placez le mandrin avec l’échafaudage électropuné dans le tube de faucon et remplissez-le d’eau désionisée.
      3. Congeler les tubes O/N à -20 °C.
      4. Placez les tubes à température ambiante (RT) et retirez les mandrins après quelques minutes, en laissant les greffons électrofilés dans la glace.
      5. Laissez la glace dégeler complètement, retirez le tube électropuné de l’eau décongelée et « suspendez»pour sécher verticalement pendant plusieurs heures. Assurez-vous que les échafaudages ne s’effondrent pas sous leur propre poids.
   2. Échafaudages secs sous vide O/N.
   3. Imagez un petit échantillon des greffons électropunés à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB) pour évaluer leur microstructure (p. ex., morphologie des fibres, diamètre des fibres). Les greffons dans les exemples d’études ont une orientation de fibre isotrope et un diamètre de fibre de 5 μm(Figure 1H–I).
4. Un jour avant de commencer l’expérience, placez le réservoir hydraulique rempli d’eau désionisée dans l’incubateur. Fermez les huit connexions pour les chambres de culture d’écoulement avec des bouchons Luer blancs. Connectez-vous au système d’air comprimé et insérez le capteur de pression. Exécutez la pompe de contrainte (voir l’étape 5.6) O/N pour permettre une petite expansion du soufflet en téflon.
   REMARQUE : Assurez-vous que tous les matériaux et équipements nécessaires sont nettoyés et/ou autoclavés (voir la colonne Tableau des matériaux,Commentaires/Description pour lesquels les matériaux peuvent être autoclavés), conformément au protocole du fabricant ou comme décrit aux étapes 7.3 à 7.6.
5. Assurer des conditions de travail stériles pour le reste du protocole.
   1. Effectuez les étapes 2 à 5.3 (configuration du système), l’étape 6.3 (changement de milieu) et les étapes 7.1 à 7.2 (récolte de constructions vasculaires) dans une armoire à flux laminaire stérile.
   2. Placez des matériaux qui ne sont pas directement nécessaires pour les étapes suivantes dans des boîtes de Petri fermées afin de garder tout aussi propre que possible.
   3. Nettoyez ou séchez régulièrement les surfaces des matériaux en trempant un mouchoir en papier avec 70% d’éthanol et essuyez les surfaces des composants du bioréacteur et de l’armoire à flux laminaire.

2. Mise en place du bioréacteur

REMARQUE : Effectuez l’étape 2 dans une armoire à flux laminaire.

1. Coupez les échafaudages électropunés dans des tubes d’environ 25 mm de longueur et documentez-les avant utilisation (p. ex., photographiez la longueur, pesez avec la balance pour la masse initiale).
2. Décontaminer les échafaudages électropunés.
   1. Placez les échafaudages électropunés inclinés dans une plaque de puits ou une boîte de Petri, avec une ouverture face à la source de lumière ultraviolette (UV), pour permettre à la lumière UV (253,7 nm) d’éclairer l’intérieur des échafaudages.
   2. Exposez les échafaudages électropunés à la lumière UV pendant 5 min.
   3. Tournez tous les échafaudages et répétez l’éclairage UV pour l’autre ouverture.
      REMARQUE: Après cette étape, ne touchez l’échafaudage électrospuné qu’en cas de besoin. Utilisez toujours une pince à épiler propre ou des gants propres.
   4. Prenez les tubes de verre des chambres de culture en flux qui sont stockés dans 70%, lavez les tubes de verre dans de l’eau ultrapure, séchez-les et placez-les dans une grande boîte de Petri fermée.
      REMARQUE: Les étapes suivantes, en particulier les étapes 2.3 à 2.5, sont idéalement effectuées par deux expérimentateurs.
3. Montez les échafaudages électropunés sur le tube en silicone.
   1. Fixez la suture de prolène 5-0 à une extrémité du tube en silicone en prenant la suture d’un côté du tube et de l’autre, en laissant deux sutures tendues opposées couvrant la section transversale du tube. Faites un petit nœud des deux côtés du tube tout en comprimant le tube au locus des nœuds et laissez environ 10 cm de fil sur les deux nœuds. Faites un troisième nœud à l’extrémité des deux fils restants de 10 cm.
      1. Coupez l’aiguille de suture et tous les fils libres qui pourraient sortir et endommager l’intérieur de l’échafaudage électrofilé. Coupez les bords du tube en silicone en une forme triangulaire pour aider à tirer le tube en silicone à travers l’échafaudage électropuné.
   2. Trempez l’échafaudage électrofilé dans de l’éthanol à 30% (cela sert d’étape de décontamination supplémentaire et aide à faire glisser l’échafaudage électrofilé sur le tube de silicium) et placez l’échafaudage électrofilé sur le fil libre de 10 cm. L’expérimentateur A étire le tube en silicone en tirant doucement sur le tube en silicone et le nœud du fil de suture de 10 cm, tandis que l’expérimentateur B fait glisser doucement l’échafaudage électrofilé sur le tube en silicone à l’aide d’une pince à épier avec une pointe intérieure lisse pour éviter d’endommager les échafaudages.
   3. Relâchez lentement l’étirement sur le tube en silicone, tout en lissant simultanément l’échafaudage électro filé avec une pince à épiler. Trempez deux fois l’échafaudage électropuné sur le tube en silicone dans de l’eau ultrapure.
      REMARQUE: Il est possible qu’un certain froissement de l’échafaudage électrospuné se produise. Ces rides disparaîtront pendant le pré-étirement appliqué juste avant de fixer les échafaudages aux conduits de pression à l’étape 2.5.3.
   4. Répétez les étapes 2.3.2 et 2.3.3 pour les autres échafaudages électropunés. Selon la longueur du tube en silicone, plusieurs échafaudages électrospunés peuvent être montés sur le même tube en silicone.
   5. Lorsque tous les échafaudages électropunés sont montés sur le tube en silicone, coupez le tube en silicone autour des échafaudages, le tout à la même longueur (5,5 cm); d’un côté, près de l’extrémité de l’échafaudage électropuné, de l’autre côté, laissant ~ 2–3 cm de tube en silicone libre.
4. Construire le compartiment inférieur de la chambre de culture d’écoulement (Figure 1A–B).
   1. Prenez la partie supérieure du compartiment inférieur contenant la sortie de débit et fermez la sortie de débit avec un bouchon Luer mâle.
   2. Poussez le conduit de pression avec des trous à travers le compartiment inférieur et placez un joint torique en silicone autour de l’extrémité inférieure du conduit de pression pour éviter les fuites. Vissez la partie inférieure du compartiment inférieur à la partie supérieure du compartiment inférieur pour fixer le conduit de pression. Assurez-vous que la rainure gravée inférieure du conduit de pression se trouve à environ 3 à 5 mm au-dessus du bord de la bague de l’adaptateur du compartiment inférieur; cela « maintiendra » plus tard le nœud serré du fil de suture, fixant l’échafaudage électrofilé sur le tube en silicone.
      REMARQUE: Si le conduit de pression peut être facilement manœuvré de haut en bas, cela indique que le compartiment inférieur n’est pas bien fixé. Répétez l’étape 2.4.2 pour éviter les fuites dans les étapes ultérieures(Figure 2D).
5. Fixez le tube en silicone avec l’échafaudage électropuné au conduit de pression.
   1. Tirez le tube en silicone avec l’échafaudage électrofilé sur le conduit de pression.
   2. Faites un nœud avec le fil de suture à l’extrémité inférieure de l’échafaudage électrofilé à l’emplacement de la rainure gravée sur le conduit de pression. Faites un deuxième nœud du côté opposé pour fixer fermement le tube en silicone avec la greffe électropunée.
      ATTENTION : Il s’agit d’une étape critique. Assurez-vous que le nœud « tombe » exactement dans la rainure gravée du conduit de pression pour éviter toute fuite de l’eau du réservoir hydraulique vers les chambres de culture d’écoulement. Si vous n’êtes pas sûr, essayez de serrer le fil de suture à plusieurs positions, au-dessus ou au-dessous de l’emplacement prévu de la rainure, pour vous assurer que les nœuds finaux sont exactement à la rainure gravée (Figure 2A).
   3. Placez la pince à ciseaux à l’extrémité supérieure du tube en silicone et étirez le tube en silicone vers le haut (cela testera directement le premier nœud, s’il est possible de déplacer le tube en silicone avec l’échafaudage électrospuné sur le conduit de pression, il n’a pas été suffisamment serré). Avec la force de traction, le tube en silicone est pré-étiré. Pour vous assurer que le tube en silicone est cohérent entre les différents échantillons, fixez une règle à la pince à ciseaux. Tirez la pince à ciseaux vers le haut jusqu’à ce que l’extrémité inférieure de la règle atteigne la hauteur de l’extrémité inférieure de l’échafaudage.
      REMARQUE: Il est important de garder le pré-étirement dans chaque échantillon à peu près le même (~ 5%) pour deux raisons: (1) si le tube en silicone est pré-étiré, il en résultera une expansion plus homogène sur toute la longueur de l’échantillon lorsqu’il est sous pression; (2) le pré-étirement aura un impact sur les propriétés mécaniques du silicone, il devrait donc être le même pour tous les échantillons afin de garantir des conditions d’étirement égales entre les échantillons.
   4. Enlevez les rides dans l’échafaudage électropuné en tirant doucement sur l’échafaudage électropuné. Encore une fois, faites deux nœuds des deux côtés avec un fil de suture à l’extrémité supérieure de l’échafaudage à l’emplacement de la rainure supérieure gravée sur le conduit de pression.
   5. Relâchez la pince à ciseaux et coupez l’excès de tube en silicone avec un couteau, en laissant 20 à 30% du filetage de vis recouvert de tube en silicone, pour éviter les fuites lorsque le cône de nez est monté sur le filetage de la vis.
      REMARQUE : Répétez les étapes 2.4 et 2.5 pour tous les échantillons dynamiques.
   6. Pour les échantillons de contrôle statique, fixez l’échafaudage électropun monté sur le tube en silicone sur des conduits de pression sans trous. Ces conduits peuvent être conservés séparément dans un tube de 15 mL jusqu’à l’ensemencement (étape 4) et n’ont pas besoin d’être montés dans les compartiments de la chambre de culture en flux.
6. Décontaminer les chambres de culture d’écoulement partiellement construites avec un échafaudage électropuné en l’exposant à la lumière UV pendant 10 minutes. Tournez les chambres de culture d’écoulement avec des échafaudages électro filés de l’autre côté et répétez l’exposition à la lumière UV pendant 10 minutes.
7. Vissez les cônes de nez sur le filetage des conduits de pression avec des trous pour les échantillons dynamiques.
   1. Assurez-vous que l’extrémité supérieure du tube en silicone s’insère dans le cône de nez pour éviter les fuites dans les étapes ultérieures. S’il y a trop de tubes en silicone, coupez l’excès de tubes avec un couteau.
   2. Placez les chambres de culture d’écoulement partiellement construites dans une grande boîte de Pétri et pointez le cône de nez vers la source de lumière UV. Appliquez l’éclairage UV pendant 5 min.
8. Construction complète de la chambre de culture d’écoulement avec le tube de verre et le compartiment supérieur de la chambre de culture d’écoulement (Figure 1A–B).
   1. Pré-mouillez les échafaudages électropunés en trempant le conduit de pression avec le tube en silicone et l’échafaudage électropuné dans de l’éthanol à 30%, suivi d’un plongeon dans de l’eau ultrapure deux fois.
   2. Placez le tube de verre sur le conduit de pression, poussez doucement dans le compartiment inférieur et fixez-le doucement.
   3. Prenez le compartiment supérieur contenant l’entrée d’écoulement, placez un joint torique en silicone, le redresseur d’écoulement et la bague de l’adaptateur dans le bon ordre(Figure 1A à B), placez-lesur l’extrémité ouverte du tube en verre et fixez-le doucement.
   4. Vissez un bouchon Luer blanc sur l’entrée d’écoulement du compartiment supérieur.
   5. Retirez le bouchon Luer mâle de la sortie d’écoulement du compartiment inférieur et nettoyez la surface qui l’entoure avec un mouchoir en papier imbibé d’éthanol.
   6. Placez une seringue contenant 10 mL d’eau ultrapure dans la sortie d’écoulement, ouvrez le capuchon Luer blanc sur le compartiment supérieur et remplissez la chambre d’eau ultrapure. Refermissez le capuchon Luer blanc, retirez la seringue, nettoyez à nouveau avec de l’éthanol et fermez la sortie de débit avec un bouchon Luer mâle.
      REMARQUE : Répétez les étapes 2.6 à 2.8 pour toutes les chambres de culture d’écoulement.
   7. Pour les commandes statiques, ajouter 10 mL d’eau ultrapure aux tubes de 15 mL contenant les échantillons montés sur les conduits de pression sans trous.
9. Placez toutes les chambres de culture d’écoulement dans l’incubateur. Remplacer l’eau ultrapure par un milieu de culture un jour avant l’ensemencement cellulaire de la même manière que celle décrite aux étapes 2.8.5 et 2.8.6 (assurez-vous de recueillir l'« ancienne » eau ultrapure avec un mouchoir en papier imbibé d’éthanol placé directement sur la sortie du flux).

[Le protocole peut être mis en pause ici]

3. Préparatifs pour la configuration de la pompe de débit

REMARQUE: Effectuez l’étape 3 dans une armoire à flux laminaire.

1. Collectez tous les matériaux de configuration de la pompe et préparez-vous à l’utilisation.
   REMARQUE: Les expérimentateurs sont renvoyés au protocole du fabricant pour une description détaillée de la mise en place de la pompe, des unités fluidiques et du tube moyen à travers les vannes de l’unité fluidique.
   1. Réglez la pompe sur une capacité de 200 mbar.
   2. Vissez les porte-réservoirs de 60 mL aux unités fluidiques.
   3. Nettoyez les filtres à air en caoutchouc réutilisables avec un mouchoir en papier imbibé d’éthanol, assurez-vous que le filtre à air reste sec.
2. Placez les réservoirs de 60 mL dans les réservoirs et placez le tuyau de milieu standard à travers les vannes de l’unité fluidique. Connectez le tube moyen avec un diamètre intérieur plus grand avec des coupleurs de verrouillage Luer femelles dans une boucle fermée.
3. Serrez le tube moyen avec un clip de tuyau, directement sous les réservoirs.
4. Remplissez les réservoirs avec 25 mL de milieu de culture par réservoir de 60 mL. Relâchez le clip du tuyau et laissez le fluide pénétrer dans le tube.
5. Fermez les réservoirs de fluide avec les filtres à air en caoutchouc et placez la configuration de la pompe de débit dans l’incubateur jusqu’à l’étape 4.

4. Ensemencement cellulaire utilisant la fibrine comme transporteur cellulaire

REMARQUE: Effectuez l’étape 4 dans une armoire à flux laminaire.

1. Préparez le gel de fibrine pour l’étape d’ensemencement cellulaire. Pour plus de détails, voir Mol et al.⁶⁷ Pour le gel de fibrine, la solution de fibrinogène doit avoir une concentration finale de 10 mg/mL (ce qui est correct pour la pureté du stock protéique), et la solution de thrombine doit avoir une concentration finale de 10 U/mL.
   1. Décongeler le fibrinogène en RT, avant de peser ~50 mg (assez pour 10 échantillons) dans un récipient en plastique avec un couvercle rouge.
   2. Ajouter le milieu de culture cellulaire pour préparer la solution de fibrinogène (à une concentration de 10 mg/mL, correcte pour la pureté du stock de protéines). Bien mélanger et filtrer pour stériliser la solution de fibrinogène avec un filtre à seringue de 0,2 μm dans un tube stérile de 15 mL. Conservez la solution de fibrinogène filtrée sur de la glace.
      REMARQUE: Évitez de préparer la solution de fibrinogène trop longtemps à l’avance, sinon le fibrinogène peut coaguler spontanément.
   3. Décongeler la thrombine et fabriquer une solution de thrombine (à une concentration de 10 U/mL) dans un milieu de culture cellulaire et la placer sur de la glace. Préparer une solution de thrombine + cellules de 20 μL par échantillon. Pour n = 10 échantillons, 200 μL sont nécessaires; par conséquent, préparez une solution de thrombine de 250 μL pour tenir compte des erreurs de pipetage possibles.
2. Recueillir et compter les cellules des flacons de culture. Mélanger les cellules dans le rapport et la quantité désirés (1,2 × 10⁶ monocytes et 0,6 × 10⁶ myofibroblastes par échafaudage). Assurez-vous qu’il y a suffisamment de cellules pour que les échantillons n+1 corrigent les erreurs de pipetage. Centrifuger à 350 × g pendant 10 min à RT. Retirer le surnageant.
3. Faites un mélange des cellules en suspension et de la thrombine.
   1. Pour chaque échantillon, utiliser 20 μL de la solution de thrombine. Pour n = 10 échantillons, ajouter 200 μL de thrombine à la pastille cellulaire et mélanger. Mesurez le volume de la suspension cellulaire (cellules + thrombine) et calculez comment diviser uniformément sur les 10 échafaudages (par exemple, si la suspension de thrombine + cellules a un volume de 260 μL, chaque échantillon électro filé recevra 260 μL / 10 échantillons = 26 μL de thrombine + suspension cellulaire).
   2. Comme l’ensemencement des échafaudages s’effectue en deux étapes, préparez deux tubes de microfuge de 1,5 mL qui contiendront la moitié de la suspension cellulaire pour chaque échafaudage (dans l’exemple de calcul de l’étape précédente: préparez deux tubes avec 13 μL de thrombine + suspension cellulaire). Placer sur la glace.
      REMARQUE: Les étapes suivantes, en particulier l’étape 4.4, sont idéalement effectuées par deux expérimentateurs.
4. Séchez les échafaudages électro filés pré-mouillés avec le vide pour préparer l’ensemencement des cellules.
   1. Connectez une pipette Pasteur en verre au système de vide de l’armoire à flux laminaire et placez-la dans un tube vide de 50 mL pour un stockage temporaire stérile.
   2. Prenez les chambres de culture d’écoulement de l’incubateur, retirez le bouchon Luer mâle de la sortie d’écoulement et retirez le milieu après avoir ouvert le bouchon Luer blanc et placé un mouchoir en papier imbibé d’éthanol devant la sortie d’écoulement.
   3. Retirez le compartiment supérieur et le tube de verre, et placez-les dans une boîte de Petri stérile pour un stockage temporaire.
   4. Placez la pipette Pasteur sous vide sur l’échafaudage électrospuné et retirez autant de fluide que possible.
      ATTENTION : Séchez l’échafaudage électro filé sous vide très doucement. Au lieu d’un mouvement linéaire de va-et-vient sur l’échafaudage, placez la pipette à vide à plusieurs endroits. Serrez le tube à vide sur le dessus de la pipette du Pasteur entre les doigts pour un meilleur contrôle.
   5. Mélanger la solution de fibrinogène dans un rapport de 1:1 avec la suspension de thrombine + cellules (par exemple, mélanger 13 μL de fibrinogène avec 13 μL de thrombine + suspension cellulaire). Pour vous assurer que la fibrine polymérise dans l’échafaudage et non dans le tube de microfuge, pipet le fibrinogène, tournez la roue de pipet pour le « volume supplémentaire » de la suspension de thrombine + cellule, et pipetez de haut en bas une fois dans le tube de microfuge avec suspension cellulaire pour mélanger.
   6. Égoutter directement de manière homogène la solution sur toute la longueur de l’échafaudage électropuné. Il est conseillé que l’expérimentateur A goutte à goutte le mélange de fibrine, tandis que l’expérimentateur B maintient le compartiment inférieur avec l’échafaudage électro filé monté sur le conduit de pression.
   7. Une fois que la fibrine avec les cellules est égouttée sur l’échafaudage électrospuné, l’expérimentateur B déplace lentement l’échafaudage, de gauche à droite et de haut en bas, pour diviser les cellules uniformément sur l’échafaudage.
   8. Répétez les étapes 4.4.5 - 4.4.7 de l’autre côté de l’échafaudage électropuné.
   9. Remontez la chambre de culture d’écoulement en plaçant soigneusement le tube de verre (empêchez le collage et la coagulation de la fibrine sur le côté interne du tube de verre) et repoussez le compartiment supérieur de la chambre de culture d’écoulement. Placez directement la construction ensemencée sans milieu ni solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans la chambre de culture en flux de l’incubateur.
   10. Répétez les étapes 4.4.1 à 4.4.9 pour tous les échantillons dynamiques. Pour les échantillons statiques montés sur des conduits de pression sans trous, ensemencer selon les étapes 4.4.1 à 4.4.8 et placer dans un tube de 15 mL par la suite.
   11. Laisser la fibrine polymériser pendant 60 min dans l’incubateur.

[Le protocole peut être mis en pause ici pendant 30 à 60 minutes.]

5. Après polymérisation, remplir les chambres de culture en flux (échantillons dynamiques) ou les tubes de 15 mL (échantillons statiques) avec un milieu.

5. Couplage des systèmes de bioréacteur et de pompe à débit avant le début de l’expérience

REMARQUE : Effectuez les étapes 5.1 à 5.3 dans une armoire à flux laminaire.

1. Prenez le plateau transportant les chambres de culture d’écoulement et les unités fluidiques avec des réservoirs de milieu remplis et des tubes de milieu connectés à l’intérieur des armoires d’écoulement laminaire.
2. Positionner les chambres de culture en flux sur la base du bioréacteur pour les groupes expérimentaux chargés d’étirement cyclique et de charges hémodynamiques combinées (Figure 1E).
   1. Inclinez la chambre de culture d’écoulement à l’envers et remplissez le conduit de pression par le bas avec de l’eau ultrapure à l’aide d’une seringue avec des tubes minces (cela peut être de tout type, tant qu’il est flexible et mince, dans cette expérience, un fil de 10 cm de long et de 0,15 mm de diamètre intérieur a été attaché à l’aiguille).
   2. Placez le tube mince à l’intérieur du conduit de pression et, pendant que le conduit de pression est rempli d’eau ultrapure en poussant progressivement l’eau hors de la seringue, retirez le fil du conduit de pression simultanément, pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur du conduit de pression.
   3. Placez la chambre de culture d’écoulement sur l’un des huit filetages de vis sur la base du bioréacteur. Placez un joint torique en silicone entre la base du bioréacteur et le connecteur Luer blanc pour éviter d’éventuelles fuites, et serrez le connecteur Luer blanc du compartiment inférieur.
   4. Répétez les étapes 5.2.2 et 5.2.3 pour tous les échantillons étirés cycliquement.
3. Connectez les chambres de culture d’écoulement pour tous les groupes expérimentaux, à l’exception de la commande statique, au système de pompe de débit.
   1. Placez un clip de tuyau sur le tube moyen. Retirez le capuchon Luer blanc qui recouvre l’entrée d’écoulement du compartiment supérieur de la chambre de culture d’écoulement. Retirez l’attelage Luer femelle du tube moyen et connectez le tube moyen d’un côté avec l’entrée d’écoulement sur le compartiment supérieur et de l’autre côté du tube moyen avec sortie d’écoulement dans le compartiment inférieur.
   2. Répétez l’étape 5.3.1 pour toutes les chambres de culture d’écoulement. À ce stade, le bioréacteur et les chambres de culture d’écoulement sont remplis de milieu et connectés aux systèmes d’écoulement.
   3. Pour les échantillons de contrôle statique, placez les échantillons verticalement dans une fiole de culture cellulaire avec capuchon filtrant à l’aide de la pince à ciseaux. Remplissez la fiole de culture cellulaire avec un milieu et placez-la dans l’incubateur.
4. Transférez la configuration complète de l’armoire à flux laminaire à l’incubateur et connectez les unités fluidiques au tube de pression d’air et au câble électrique.
5. Démarrez le logiciel et initialisez les pompes de débit. Démarrez le débit moyen pour les échantillons un par un.
   1. Vérifiez si les vannes de l’unité fluidique cliquent.
   2. Retirez la pince du tuyau du tuyau moyen.
   3. Démarrez la pompe à débit avec 100 mbar et un temps de commutation de 10 s.
   4. Vérifiez soigneusement le sens de l’écoulement pour détecter d’éventuelles fuites ou bulles d’air. Toutes les bulles d’air piégées peuvent être éliminées en retournant la chambre de culture d’écoulement à l’envers.
      REMARQUE: Assurez-vous que les niveaux moyens dans les réservoirs moyens sont équilibrés, afin d’éviter l’aspiration de l’air dans le système et les bulles d’air dans les chambres de culture d’écoulement, et de ne pas laisser les réservoirs s’assécher (Figure 2C).
   5. Répétez l’étape 5.5 pour toutes les unités fluidiques une par une.
6. Initialisez la pompe de déformation.
   1. Connectez la pompe actionnée pneumatiquement via l’entrée d’air du cylindre pneumatique à l’air comprimé. Connectez la sortie d’air inférieure avec le tube bleu pour l’air sortant (Figure 1F).
   2. Ouvrez le logiciel LabVIEW, exécutez le script LabVIEW et le système d’application de pression d’air comprimé, comme décrit par Van Kelle et al.^68,entrez le déplacement et la fréquence (commencez par une basse fréquence de 0,2 Hz). Mettez la pompe en pause lorsque le soufflet en téflon est à son niveau le plus bas.
   3. Placez le capteur de pression dans l’entrée du capteur de pression sur le réservoir hydraulique.
7. Modifiez les paramètres de la pompe aux réglages souhaités (pour 1,5 Pa, utilisez 150 mbar, temps de commutation de 10 s).
8. Démarrez la pompe de déformation et appliquez le réglage préféré (par exemple, 0,5 Hz, 1,05 étirement).

6. Exécution de l’expérience pendant plusieurs jours; Surveillance du cisaillement et de l’étirement pendant la culture et le remplacement du milieu

1. Calculez le WSS au niveau du mur de l’échafaudage.
   1. Enregistrez l’amplitude du débit tous les deux jours (voir le manuel du fabricant de la pompe de débit pour plus de détails). En bref, observez le changement des niveaux de liquide (en mL) dans les réservoirs moyens entre la commutation du réservoir de l’unité fluidique pendant 10 s. Effectuez au moins cinq mesures, calculez la valeur moyenne et multipliez par 6 pour obtenir le débit Q en mL/min.
   2. L’écoulement est décrit par un écoulement de Poiseuille à travers un canal annulaire. En supposant que le milieu de culture soit un fluide newtonien, calculer le WSS à la paroi de l’échafaudage, r₁, par l’équation 1.
      (1)
      où le WSS τ_w au niveau de la paroi de l’échafaudage (r₁ ; ici r1 = 1,7 mm), résultant d’un écoulement à l’état d’équilibre, est déterminé par la pression appliquée p et le rayon intérieur du tube de verre r₂ (ici r₂ = 2,3 mm). Le gradient de pression dans la direction axiale est supposé être uniforme entre l’entrée et la sortie de l’écoulement et est donné par l’équation 2(figure 1J).
      (2)
      avec μ la viscosité dynamique (ici la viscosité moyenne a été supposée constante, μ = 0,7 × 10^-3 Pa∙s à 37 °C) et Q le débit appliqué.
2. Surveillez l’étirement appliqué aux échafaudages tous les deux jours.
   1. Placez un fond sombre derrière la chambre de culture d’écoulement pour augmenter le contraste entre l’échafaudage et l’arrière-plan. Positionnez les lampes lumineuses LED, pointant vers l’échafaudage, pour aider à la visualisation de l’échafaudage.
   2. Prenez des photos en accéléré de l’échafaudage à une fréquence de 30 Hz pendant 6 s (c.-à-d. 3 cycles d’étirement) avec une caméra haute vitesse.
      REMARQUE: Une fréquence d’enregistrement plus basse peut suffire si la caméra le permet. Cependant, la fréquence minimale requise n’a pas été déterminée.
   3. Déterminez manuellement le diamètre minimum et maximum de l’échafaudage à partir des images.
   4. Calculez le diamètre extérieur minimum et maximal de l’échafaudage électropuné pour calculer les étirements maximaux selon l’équation 3.
      (3)
      où l’étirement circonférentiel (λ_θ) est donné par le rapport entre le diamètre extérieur de l’échafaudage, d₁, et son diamètre initial, d₀.
3. Corriger l’évaporation moyenne et rafraîchir le milieu trois fois par semaine.
   1. Arrêtez et découplez les câbles des systèmes d’écoulement et de la pompe de contrainte.
   2. Placez des clips de tuyau sur le tube moyen.
   3. Déterminer la quantité de milieu évaporée en fonction des marques de l’indicateur de volume sur les réservoirs moyens.
   4. Transférer le plateau avec le bioréacteur et les unités fluidiques dans l’armoire à flux laminaire.
   5. Retirez les filtres à air en caoutchouc des réservoirs moyens; ajouter de l’eau ultrapure autoclavée pour compenser le volume évaporé du milieu. Refermer les réservoirs de milieu et se connecter à nouveau à la pompe pour mélanger le milieu avec l’eau ultrapure.
   6. Répétez les étapes 6.3.1 à 6.3.5. Retirez à nouveau les filtres à air en caoutchouc, retirez 25 mL de milieu de culture et faites tourner à 300 × g pendant 5 min à TA.
      1. Prélever 1,5 mL de surnageant et conserver à -30 °C pour l’analyse des profils sécrétoires (pour analyse avec dosage immuno-enzymatique (ELISA)).
      2. Recueillir le volume souhaité de surnageant pour les études de signalisation paracrine, en utilisant le surnageant comme milieu conditionné⁴³.
   7. Ajouter 25 mL de milieu frais aux réservoirs moyens.
   8. Replacez les filtres à air en caoutchouc sur les réservoirs moyens.
   9. Replacez l’installation complète dans l’incubateur; connectez tous les câbles et les tubes d’air à la pompe et à la pompe de contrainte. Relâchez les clips du tuyau et répétez les étapes 5.4 à 5.8.
4. Vérifiez si les billes de séchage de silice dans les bouteilles de séchage reliées à la pompe sont humides (aspect blanc) et remplacez-les par des billes de silice sèches si nécessaire (aspect orange).

7. Fin de l’expérience, collecte d’échantillons et nettoyage et stockage de l’équipement

1. Le dernier jour de l’expérience, corrigez l’évaporation du milieu comme décrit aux étapes 6.3.1 à 6.3.5 et récoltez les échantillons un par un.
   1. Pour récolter les échantillons un par un, la pompe de débit et la pompe de contrainte doivent être mises en pause plusieurs fois. Placez un clip de tuyau sur un tube moyen. Arrêtez temporairement la pompe de débit et la pompe de déformation. Déconnecter une chambre de culture à écoulement de la base du bioréacteur; remplacer par un capuchon Luer blanc sur la base du bioréacteur. Prenez la chambre de culture d’écoulement et l’unité fluidique dans l’armoire d’écoulement laminaire. Redémarrez la pompe de débit et la pompe de contrainte pour appliquer la charge hémodynamique aux autres échantillons jusqu’à la récolte.
   2. Collecter le milieu des réservoirs du milieu pour l’analyse de la production de cytokines paracrines via ELISA.
2. Découpler les unités d’écoulement et la construction tubulaire de récolte. Section selon le schéma de coupe souhaité. Certaines parties de la construction peuvent être stockées à 4 °C (après 15 min de fixation dans 3,7 % de formaldéhyde et 3 x 5 min de lavage dans du PBS) ou à -30 °C (après congélation instantanée dans de l’azote liquide) jusqu’à une analyse plus approfondie.
3. Nettoyez les composants du bioréacteur et de la pompe. De plus, la méthode de nettoyage conseillée par article est mentionnée dans le tableau des matériaux.
   1. Nettoyez les filtres à air en caoutchouc avec 70% d’éthanol. Faites très attention à ne pas humidifier le filtre intérieur !
   2. Recueillir tous les composants séparés : tubes moyens, réservoirs moyens, tubes en verre, bouchons Luer mâles et serrures Luer femelles, bouchons Luer blancs, conduits de pression, cônes de nez, joints toriques en silicone, bagues d’adaptateur, redresseurs d’écoulement (à l’exclusion des pompes, des unités fluidiques, des filtres à air en caoutchouc, de la base du bioréacteur) et rincer à l’eau courante du robinet.
   3. Placer O/N dans du dodécylsulfate de sodium à 0,1 % dans de l’eau désionisée.
      REMARQUE: N’utilisez pas d’eau ultrapure car les pièces pourraient rouiller.
   4. Rincer à l’eau du robinet et au savon à vaisselle.
   5. Immerger dans de l’eau désionisée, suivie de 70% d’éthanol deux fois, suivie d’eau désionisée.
   6. Placez tous les matériaux séparément sur les mouchoirs en papier et laissez-les sécher. Utilisez de l’air sous pression pour sécher les tubes.
   7. Nettoyez tous les matériaux non autoclavables avec un mouchoir en papier imbibé d’éthanol à 70%. Cela inclut le filtre à air en caoutchouc (gardez à l’esprit que le filtre à air doit rester sec) et la base du bioréacteur (soufflet en téflon et cylindre pneumatique).
   8. Autoclavez les composants de la chambre fluidique (y compris le joint torique en silicone), le tube moyen, les réservoirs moyens (sans le filtre à air en caoutchouc), les bouchons Luer mâles et les coupleurs Luer femelles, les bouchons Luer blancs, les clips de tuyau et l’équipement standard (par exemple, pinces à épiler, ciseaux de serrage)
   9. Pour une utilisation pratique lors des prochaines expériences, combinez les composants séparés pour une chambre fluidique complète dans une boîte autoclavable.
4. Retirez l’eau du réservoir hydraulique. Nettoyer avec 70% d’éthanol, suivi d’eau désionisée. Laissez sécher. Remplissez avec de l’eau désionisée et quelques gouttes de désinfectant préservant le bain-marie.
5. Stockez les tubes de verre pour la chambre de culture en flux dans de l’éthanol à 70%.
6. Placer les billes de séchage de silice humide (aspect blanc) dans le four O/N à 120 °C pour les laisser sécher (aspect orange), et conserver dans une fiole hermétique.

Representative Results

Ce bioréacteur a été développé pour étudier les effets individuels et combinés du stress de cisaillement et de l’étirement cyclique sur la croissance et le remodelage des tissus vasculaires dans les échafaudages de biomatériaux 3D. La conception du bioréacteur permet de cultiver jusqu’à huit constructions vasculaires dans diverses conditions de charge(Figure 1A). Les constructions vasculaires sont positionnées dans une chambre de culture en flux(Figure 1B)dans laquelle l’étirement circonférentiel et le WSS peuvent être contrôlés indépendamment. Le compartiment supérieur de la chambre de culture d’écoulement contient un redresseur d’écoulement pour stabiliser l’écoulement dans une longueur de décantation relativement courte(Figure 1C). Directement en aval du redresseur d’écoulement, le cône de nez répartit l’écoulement uniformément à travers le canal annulaire(Figure 1D). Lorsque toutes les étapes du protocole sont effectuées correctement, les échafaudages vasculaires dans la chambre de culture en flux peuvent être soumis à un écoulement unidirectionnel continu à travers le canal annulaire entre l’échafaudage et la paroi de verre et sont étirés circonférentiellement par la pompe pneumatique(Figure 1E–F). Avant le montage de l’échafaudage, le tube électropuné doit être découpé en tubes de 25 mm(Figure 1G)et peut être examiné avec SEM pour analyser la microarchitecture (Figure 1H–I). Il est important de noter que les greffes PCL-BU dans cet exemple peuvent être remplacées par d’autres greffes élastomères modifiées par des tissus (origine naturelle ou synthétique, microarchitecture ou porosité différente). La conception à l’envers permet de tester des greffons très poreux car ils ne doivent pas nécessairement être exempts de fuites. L’image schématique de la chambre de culture d’écoulement montre l’interprétation physique des paramètres utilisés dans les équations pour décrire le WSS (équation 1), le gradient de pression (équation 2) et l’étirement circonférentiel (équation 3)(Figure 1J).

Une exécution incorrecte des étapes critiques du protocole peut entraîner quelques scénarios. Par exemple, une fuite du réservoir hydraulique peut se produire à la suite de nœuds mal montés, entraînant une fuite de fluide hydraulique des conduits de pression avec des trous passant le tube de silicone et entrant dans la chambre de culture d’écoulement (Figure 2A). Une fuite du fluide hydraulique au niveau de la connexion entre les filetages de vis et la base du bioréacteur peut également se produire lorsque l’anneau en silicone n’est pas bien placé ou si le soufflet en téflon n’a pas été autorisé à se dilater légèrement O/N un jour avant l’expérience(Figure 2B). De plus, lorsque le milieu n’est pas dégazé, ou si les niveaux de milieu dans les réservoirs du milieu ne sont pas bien équilibrés et qu’un réservoir de milieu s’assèche, ce qui entraîne l’aspiration de l’air dans le système, des bulles d’air peuvent apparaître dans la chambre de culture en flux (Figure 2C), ce qui perturbe les pattes WSS, compromettant la viabilité cellulaire et la croissance tissulaire ultérieure. Enfin, lorsque le joint torique en silicone dans le compartiment inférieur n’est pas correctement placé, un déversement de milieu peut être observé sous la chambre de culture d’écoulement (Figure 2D).

Comme cette configuration de bioréacteur permet l’application de charges hémodynamiques individuelles et combinées, plusieurs groupes expérimentaux chargés hémodynamiquement peuvent être inclus dans une expérience(Figure 3A). Auparavant, différentes charges hémodynamiques (c.-à-d. deux régimes de contrainte de cisaillement et deux régimes d’étirement) étaient validées en appliquant divers paramètres possibles du système(figure 3B). Lorsque l’étirement (Figure 3C) et le WSS (Figure 3D) ont été surveillés sur des périodes de culture à long terme, il a été validé que ceux-ci peuvent être maintenus à des niveaux relativement constants sur une période allant jusqu’à 20 jours.

Le bioréacteur est particulièrement bien adapté pour étudier l’influence de la charge hémodynamique sur la croissance et le remodelage dans un contexte de TE vasculaire in situ. Les stades de l’TE in situ sont supposés refléter les stades de la réponse naturelle de cicatrisation desplaies (Figure 4A). Les co-cultures de macrophages dérivés de monocytes et de myofibroblastes dérivés de veines saphènes humaines, telles que décrites ici, ont été établies comme une imitation in vitro de la phase proliférative. Trois jours après l’ensemencement, la coloration par immunofluorescence a montré une distribution homogène des deux types de cellules dans tout l’échafaudage(figure 4B). Après 20 jours de co-culture, l’étirement cyclique seul a entraîné le dépôt de fibres de collagène de type I plus nombreuses et plus épaisses, tandis que dans le groupe avec des charges hémodynamiques combinées, cet effet de l’étirement cyclique a été annulé par le stress de cisaillement, entraînant un dépôt de collagène de type I moins prononcé, illustré ici par une coloration par immunofluorescence(Figure 4C). Pour une régénération tissulaire in situ réussie, un équilibre étroit entre la production de tissus et la résorption de l’échafaudage est nécessaire. En plus de la formation de tissus, le bioréacteur permet l’induction de la résorption d’échafaudage entraînée par des cellules. Par exemple, lors de la culture d’une monoculture de macrophages pendant 8 jours sur les greffons électrofilés, une érosion des fibres et un clivage des fibres ont été observés dans tous les régimes de charge hémodynamique, avec la résorption la plus prononcée dans le groupe statique et la résorption la moins prononcée dans le groupe de contrainte de cisaillement(Figure 4D). Ensemble, ces résultats montrent l’impact des différents régimes de charge hémodynamique sur la croissance et le remodelage. Ces informations sont utiles pour optimiser les paramètres de conception des TEVG in situ nouvellement développés.

Un autre déterminant important du processus de régénération tissulaire est la présence de cytokines pro- et anti-inflammatoires. Comme le bioréacteur est un système en boucle fermée, les cellules du système seront continuellement exposées aux stimuli paracrines des facteurs sécrétés. Les profils de sécrétion de cytokines dans le milieu des co-cultures chargées dynamiquement de macrophages dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) et de myofibroblastes humains provenant de veines saphènes ont été analysés aux stades précoce et ultérieur(Figure 5A). Ces résultats représentatifs illustrent l’impact de l’étirement cyclique et de la contrainte de cisaillement sur le profil de sécrétion de cytokines dans la configuration de co-culture. Fait intéressant, les effets combinés des deux charges ont montré soit une dominance de l’une des deux charges (par exemple, étirement cyclique pour l’interleukine-6 (IL-6) et la protéine chimioattractante monocytaire-1 (MCP-1)) ou des effets synergiques des deux charges (par exemple, pour l’IL-10)(Figure 5B). Ces informations, recueillies à l’aide de cette plate-forme de test in vitro, fournissent des informations précieuses pour le développement de TEVG in situ basés sur la logique de la régénération tissulaire in situ induite par les macrophages.

Des expériences de co-culture de macrophages et de myofibroblastes ont montré que l’environnement mécanique et les environnements inflammatoires dépendant de la charge qui en résultaient modulaient le phénotype des myofibroblastes. Après 20 jours de charge hémodynamique, l’expression génique des marqueurs myofibroblastiques a montré de nettes différences dans l’impact individuel et combiné de la charge et dans la signalisation directe et paracrine des macrophages sur les myofibroblastes (Figure 6A). De plus, les schémas d’expression génique du marqueur contractile alpha de l’actine du muscle lisse étaient corrélés à la synthèse desprotéines (Figure 6B). De plus, l’étirement cyclique a stimulé l’expression génique de la matrice collagène et élastique et atténué la matrice métalloprotéinase 1/inhibiteur tissulaire matrice métalloprotéinase 1 remodelage du collagène médié, tandis qu’un effet stabilisateur du stress de cisaillement a été observé dans la co-culture (Figure 6C). Ces expériences de co-culture à long terme montrent la possibilité d’étudier la phase de remodelage tissulaire à un stade ultérieur(Figure 4A)dans divers régimes de charge hémodynamique dans des greffes vasculaires modifiées par des tissus avec ce bioréacteur. Comme les TEVG sont montés « à l’envers » sur un tube en silicone, l’étirement circulaire et le WSS peuvent être appliqués pendant de plus longues périodes de culture.

Figure 1 : Conception et vue d’ensemble du bioréacteur. (A) Dessin de construction de la base du bioréacteur et (B) vue éclatée de la chambre de culture fluide avec toutes les parties indiquées (étapes 2.4–2.8). Le compartiment supérieur de la chambre de culture d’écoulement contient un redresseur d’écoulement. (C) Le cône de nez émoussé est positionné après le redresseur d’écoulement pour répartir le flux à travers le canal annulaire (direction d’écoulement indiquée en rose). (D) Ensemble, ces composants contrôlent et guident la directionnalité de l’écoulement. Voir le tableau 1 pour une description fonctionnelle des pièces mentionnées individuellement. (E) Photographie de la configuration complète du bioréacteur (étape 5.2) et (F) vue rapprochée des chambres de culture d’écoulement et du cylindre pneumatique (étape 5.6.1). (G) Aspect brut de l’échafaudage PCL-BU électropuné avant l’ensemencement (tiques de la règle 1 mm). Images microscopiques électroniques à balayage d’un échafaudage PCL-BU tubulaire électro filé avec un diamètre intérieur de 3 mm et un diamètre moyen de fibre de 5 μm à différents grossissements, barres d’échelle(H)100 μm et (I) 10 μm (étape 1.3). (J) Image schématique de la chambre de culture constituée d’un échafaudage tubulaire électro filé, de rayon extérieur (r₁) centré dans un tube de verre de rayon intérieur (r₂). Les entrées et sorties d’écoulement (Q) sont reliées à l’anneau annulaire, avec une hauteur de canal h pour l’application de la contrainte de cisaillement de la paroi (t). L’entrée pression/étirement(P)est reliée à l’échafaudage monté en silicone pour appliquer un étirement circonférentiel (λ(t))aux échafaudages électrospunés montés de l’intérieur (étape 6.1). Abréviations : polycaprolactone bisurée (PCL-BU). Les panneaux C, D et G–J ont été adaptés de Van Haaften et al.¹⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pièces de bioréacteur	Description fonctionnelle
Application d’étirement
Cylindre pneumatique	Actionne le soufflet en téflon.
Soufflet en téflon	Charge le réservoir hydraulique.
Réservoir hydraulique	Peut être connecté avec jusqu’à 8 chambres de culture d’écoulement, est rempli d’eau demi, applique une pression sur les constructions montées en silicone.
Filetage de vis	Connexion entre la chambre de culture d’écoulement et le réservoir hydraulique. L’entrée de pression pour les constructions montées en silicone.
Connecteur luer blanc	Utilisé pour visser la chambre de culture d’écoulement étanche à l’un des huit filetages de vis sur la base du réservoir hydraulique / bioréacteur.
Conduit de pression avec de petits trous	Directement relié à l’eau dans un réservoir hydraulique. Lorsque le réservoir hydraulique est pressurisé, les conduits de pression remplissent l’espace entre le tube en silicone (qui est monté sur le conduit de pression) avec de l’eau, poussant le tube en silicone vers l’extérieur, ce qui entraîne un étirement circonférentiel sur le greffon monté en silicone de l’intérieur.
Tubes en silicone	Pour monter la greffe électropunée sur le conduit de pression. Le tube en silicone est étiré de l’intérieur de manière circonférentielle.
Application de flux
Système de pompe à débit	Utilisé pour contrôler le flux dans les chambres de culture d’écoulement. (dans notre exemple: un système de pompe ibidi est utilisé.)
Compartiment supérieur et inférieur avec entrée et sortie de débit	Connecte la chambre de culture d’écoulement dans la boucle d’écoulement.
Tube de verre	Contient l’échafaudage sous pression au centre et permet la perfusion des échafaudages.
Lisseur d’écoulement	Stabilise l’écoulement dans une longueur de décantation relativement courte.
Ogive	Répartit le flux uniformément.
Bague d’adaptateur	Fixe le tube de verre.
Joint torique en silicone	Empêche les fuites de milieu.

Tableau 1 : Description fonctionnelle des principales caractéristiques du bioréacteur, correspond aux parties indiquées à la figure 1A-D.

Figure 2 : Résultats de l’exécution inexacte des étapes critiques du protocole. Photographies de certains événements qui peuvent être observés dans la configuration du bioréacteur lorsque les étapes critiques ne sont pas effectuées correctement. (A) Si le nœud n’est pas assez serré ou n’est pas exactement placé dans la rainure gravée (indiquée par une flèche), une légère fuite de fluide hydraulique dans la chambre de culture d’écoulement peut se produire (étape 2.5). (B) Si le soufflet en téflon n’a pas été autorisé à se dilater O/N un jour avant l’expérience ou lorsque l’anneau en silicone n’est pas bien placé, une fuite de liquide hydraulique du liquide hydraulique à la connexion entre les filetages de vis et la base du bioréacteur peut se produire (indiquée par une flèche) (étapes 1.4 et 5.2.3). (C) Les bulles d’air dans la chambre de culture d’écoulement (indiquées par une flèche) entraîneront des modèles de contrainte de cisaillement perturbés. Toujours dégazer le milieu de culture et s’assurer que les niveaux de milieu dans les réservoirs de milieu sont équilibrés pour éviter qu’un réservoir ne s’assèche et que l’air ne soit aspiré dans le système de chambre d’écoulement (étapes 1.2 et 5.5.4). (D) Lorsque l’anneau en silicone dans le compartiment inférieur n’est pas placé correctement, un déversement du milieu peut être observé (indiqué par une flèche) (étape 2.4.2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Contrôle de la contrainte de cisaillement et de l’étirement. Comme le bioréacteur permet une application indépendante et combinée de l’étirement et du cisaillement, (A) plusieurs groupes expérimentaux peuvent être inclus dans une expérience. (B) Exemples de variations des étirements maximaux et des contraintes de cisaillement à un moment précis dans le temps testés sous quatre réglages de système distincts (indiqués par les couleurs). Les rectangles noirs représentent la moyenne ±'écart-type des mesures pour chaque réglage. Les lignes pointillées sont calculées comme la moyenne des étirements(ligne horizontale)et les contraintes de cisaillement(ligne verticale)pour indiquer les quatre conditions de charge distinctes. (C) Étirements circonférentiels cycliques dans l’étirement cyclique et groupes combinés au cours de l’expérience de 20 jours, sur la base de mesures de diamètre extérieur des constructions d’échafaudage surveillées avec un laps de temps de caméra à grande vitesse (étape 6.2). (D) Contraintes de cisaillement de paroi surveillées dans la contrainte de cisaillement et les groupes combinés au cours de l’expérience, en fonction de l’évolution des niveaux de milieu dans la seringue (étape 6.1). Les panneaux A, C et D ont été adaptés de Van Haaften et Wissing et al.⁴⁴; le panneau B a été adapté de Van Haaften et al.¹⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Concept d’ingénierie tissulaire vasculaire in situ, de distribution cellulaire, de production tissulaire et de dégradation de l’échafaudage. (A) Illustration schématique illustrant les phases hypothétiques de la régénération tissulaire entraînée par l’échafaudage au site fonctionnel de l’hôte. Les résultats présentés sont dérivés d’expériences axées sur la phase proliférative, au cours de laquelle les macrophages et les cellules productrices de tissus ont colonisé le matériau de l’échafaudage. (B) Myofibroblastes de la veine saphène humaine (rouge) et distribution des macrophages dérivés du PBMC (vert) sur le côté externe de l’échafaudage électrospuné (gris) au jour 3. Barre d’échelle 200 μm. (C) Coupe transversale de la construction de co-culture au jour 20 colorée pour le collagène de type I(vert),le collagène de type III(rouge)et le DAPI(blanc). Barre d’échelle 100 μm, *indique le côté extérieur de la construction, correspondant au côté de l’écoulement. (D) Images SEM de greffes décellularisées de monoculture de macrophages de 8 jours montrant la dégradation des macrophages; barre d’échelle 20 μm. Abréviations: cellules veineuses saphènes humaines (HVSC); cellule mononucléaire du sang périphérique (PBMC); 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI); microscopie électronique à balayage (MEB). Le panel A a été adapté de Wissing et Bonito et al.²⁷; les panneaux B et C ont été adaptés de Van Haaften et Wissing et al.⁴⁴; et le panneau D a été adapté de Wissing et al.⁴³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Environnement inflammatoire dans les constructions de co-culture chargées hémodynamiquement à 3 jours et 20 jours. Co-culture de macrophages humains dérivés du PBMC et de myofibroblastes humains provenant de veines saphènes. (A) Carte thermique de la sécrétion totale de cytokines mesurée en surnageant via ELISA multiplex. (B) Boxplots pour une sélection de cytokines au jour 20, normalisées à la teneur totale en ADN. Les valeurs de P ont été calculées à l’aide du test de Kruskal-Wallis avec un test de comparaison multiple de Dunn; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** Abréviations : inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase (TIMP), métalloprotéinase matricielle (MMP), interleukine (IL), protéine chimioattractante monocytaire 1 (MCP-1), facteur de croissance transformant bêta 1 (TGF-β1), facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF), facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), statique (ST), étirement cyclique (CS), stress de cisaillement (SS). Les panneaux A et B ont été adaptés de Van Haaften et Wissing et al.⁴⁴. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Changements dans le phénotype des myofibroblastes et marqueurs de la croissance et du remodelage de la matrice en réponse à la charge hémodynamique dans les constructions vasculaires au jour 20. (A) Expression génique relative des marqueurs phénotypiques spécifiques aux myofibroblastes. (B) Sections transversales colorées pour αSMA(vert)et DAPI(bleu),barre d’échelle 100 μm. (C) Expression relative des gènes liés à la matrice collagène, à la matrice élastique, aux protéoglycanes et aux gènes de remodelage. Les valeurs de P ont été calculées à l’aide du test de Kruskal-Wallis avec un test de comparaison multiple de Dunn; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Abréviations : S100 calcium binding protein A4 (S100A4), alpha-smooth muscle actin (αSMA ou ACTA2), calponin 1 (CNN1), smoothelin (SMTN), vimentin (VIM), collagen I (COL1A1), élastine (ELN), versican (VCAN), métalloprotéinase matricielle (MMP), inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase (TIMP), statique (ST), étirement cyclique (CS), stress de cisaillement (SS), 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). # mesuré à la limite de détection ou en dessous. Les panneaux A, B et C ont été adaptés de Van Haaften et Wissing et al.⁴⁴. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Expression protéique des monocultures de myofibroblastes et de macrophages soumises à des charges hémodynamiques individuelles et combinées. (A) Des images confocales représentatives de myofibroblastes, cultivés pendant 10 jours avec des fibres d’actine(vert),des noyaux(rouge)et des échafaudages(bleu),montrent une orientation claire des fibres d’actine dans les échantillons chargés, par rapport aux échantillons statiques dans lesquels aucune direction préférentielle des fibres d’actine ne peut être observée. Barre d’échelle 50 μm. (B) Images confocales de la même monoculture de myofibroblastes colorés pour le collagène(vert)et les noyaux/échafaudages(blanc). Barre d’échelle 50 μm. (C) Boxplots de profils de sécrétion de protéines de macrophages dérivés de THP1 cultivés statiquement et dynamiquement pendant 8 jours, avec des rapports M1 /M2 calculés basés sur les niveaux de sécrétion de cytokines d’IL-6, TNF-α, MCP-1 (pro-inflammatoire) et IL-10, IL-13, MMP-9 (anti-inflammatoire). Le point dans le graphique MCP-1 représente une valeur statistique aberrante. (D) Données ELISA des niveaux relatifs de sécrétion de protéines de macrophages cultivés statiquement et dynamiquement au jour 8 par rapport à la sécrétion moyenne de protéines pro-inflammatoires, anti-inflammatoires, de croissance et de remodelage (les niveaux de protéines ont été corrigés pour la teneur moyenne en ADN par groupe). Les points et les zones ombrées indiquent, respectivement,les 50e et 25e à 75e centiles. Abréviations : protéine chimioattractante 1 des monocytes (MCP-1), interleukine (IL), facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), métalloprotéinase matricielle (MMP), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF), facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), dosage immuno-enzymatique (ELISA).* p < 0,05 ; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Les panneaux A et B ont été adaptés de Van Haaften et al.¹⁹. Les panneaux C et D ont été adaptés de Wissing et al.⁴³. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Discussion

Le bioréacteur décrit ici permet l’évaluation systématique des contributions de l’individu et des effets combinés de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique sur l’inflammation et la régénération tissulaire dans les échafaudages tubulaires résorbables. Cette approche permet également d’effectuer une grande variété d’analyses sur des constructions vasculaires, comme l’illustre la section des résultats représentatifs. Ces résultats montrent l’impact distinctif des différents régimes de charge hémodynamique (c.-à-d. différentes combinaisons de cisaillement et d’étirement) sur la croissance et le remodelage de la construction TEVG. Ces informations, collectées via cette plate-forme in vitro, aident à l’optimisation des paramètres de conception des échafaudages pour les TEVG in situ nouvellement développés. Pour assurer un flux de travail expérimental approprié, il est important de comprendre les étapes critiques et les limites de ce protocole.

Les étapes les plus critiques du protocole sont liées à l’application de l’étirement aux échantillons. Pour l’application extensible, il est essentiel que la configuration soit sans fuite. Il y a deux points faibles dans le système : les nœuds qui montent les greffons électro filés aux conduits de pression et la connexion entre la base du bioréacteur et les chambres de culture en flux. Comme décrit aux étapes 2.5.2 et 2.5.4, plusieurs nœuds serrés doivent être positionnés exactement au niveau de la rainure gravée. Si le nœud n’est pas assez serré ou est placé légèrement au-dessus ou au-dessous de la rainure, une légère fuite de fluide hydraulique dans la chambre de culture d’écoulement peut se produire. Cette fuite peut être détectée comme une perte de charge dans le réservoir hydraulique et une tension en constante augmentation sur la pompe de contrainte pour atteindre la valeur de pression définie. En outre, cela entraîne une perturbation de l’écoulement dans la chambre de culture en flux, un risque accru de contamination de la culture cellulaire et une dilution du milieu. Une fois que cela se produit, la chambre de culture d’écoulement doit être retirée de l’expérience et le filetage de vis sur le réservoir hydraulique doit être fermé avec un bouchon Luer blanc. Cette mesure majeure de prélèvement d’un échantillon complet, qui est nécessaire pour assurer la bonne poursuite de l’expérience pour les sept autres chambres de culture à écoulement, souligne l’importance de placer avec précision des nœuds serrés, exactement dans les rainures gravées. Ce n’est qu’alors qu’une séparation adéquate peut être assurée entre l’eau dans le réservoir hydraulique et le milieu dans les chambres de culture d’écoulement. Pour améliorer la robustesse du montage des échafaudages, les rainures dans les conduits de pression seront légèrement plus profondes dans une version révisée du bioréacteur, permettant un placement plus facile et meilleur des nœuds et ainsi, une séparation sûre du fluide hydraulique du milieu.

Une autre source potentielle de fuite se trouve entre les filetages de vis de la base du bioréacteur et les connecteurs Luer blancs de la chambre de culture d’écoulement. En raison de l’usure possible du matériau en téflon, un joint torique en silicone supplémentaire peut être ajouté pour éviter les fuites (étape 5.2.3). De plus, le soufflet en téflon de la pompe de déformation doit être autorisé à se dilater légèrement O/N un jour avant l’expérience (étape 1.4). En cas de fuite, la perte de fluide hydraulique doit être compensée par l’ajout d’une petite quantité d’eau ultrapure via l’un des huit filetages de vis (utilisez une seringue avec aiguille et fil flexible). Replacez la chambre de culture d’écoulement avec un petit morceau de parafilm entre le filetage de vis et le connecteur Luer blanc sur le compartiment inférieur de la chambre de culture d’écoulement. Pour surmonter ce problème de fuite dans de futures expériences, les filetages de vis en téflon actuels sur la base du bioréacteur seront remplacés par des filetages en acier inoxydable dans la version de nouvelle génération du bioréacteur pour éviter l’usure du système.

La variation de l’étirement (Figure 3C) est plus grande que la variation de WSS (Figure 3D), car l’étirement est plus difficile à contrôler. Néanmoins, outre les mesures visant à prévenir les fuites, il existe d’autres mesures qui limitent la variation de l’étirement: (i) éviter les bulles d’air dans la flûte (étapes 1.4 et 5.2.1),(ii) assurer un pré-étirement cohérent entre les différents échantillons (étape 2.5.3), et (iii) assurer des propriétés d’échafaudage cohérentes entre les différents échantillons (étape 1.3).

Enfin, une prudence supplémentaire est nécessaire lors du montage de l’échafaudage électro filé sur le tube en silicone (étape 2.3). Plus précisément, lorsque l’échafaudage électrofilé fragile doit être tiré sur le tube de silicone étiré, il est important de ne pas appliquer trop de force pour éviter que la greffe électrofilée ne soit endommagée, en particulier à l’intérieur de la greffe électrofilée. Si des dommages se produisent à l’intérieur de la greffe électropunée, soit par traction énergique, soit par un étirement trop faible du tube en silicone, l’étendue des dommages aux fibres électropunées ne devient visible qu’après la récolte et l’analyse de la construction. Dans la configuration actuelle, le succès de l’ensemencement ne peut être confirmé que par immunofluorescence ou analyse immunohistochimique, après avoir sacrifié l’échantillon. Cependant, la procédure d’ensemencement avec de la fibrine comme vecteur cellulaire est une méthode bien établie⁶⁷ qui conduit généralement à une distribution cellulaire homogène pour les échafaudages avec une taille de pores suffisamment grande. L’un des aspects les plus importants en ce qui concerne l’ensemencement cellulaire est de s’assurer que l’échafaudage est aussi sec que possible avant l’ensemencement (étape 4.4),afin d’empêcher le gel de fibrine avec les cellules de passer à travers l’échafaudage humide, ce qui entraîne un ensemencement inhomogène. Enfin, bien que la méthode de décontamination du greffon électropuné par rayonnement UV et trempage dans de l’éthanol à 30% ne soit pas aussi stricte que la stérilisation des greffons électropunés préparés pour des études in vivo, qui sont souvent stérilisés par oxyde d’éthylène ou irradiation gamma, elle est suffisante pour des expériences de culture in vitro pouvant durer jusqu’à 20 jours sans aucun signe de contamination (par exemple, voir Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6, et Van Haaften et Wissing (2020)⁴⁴). De plus, le matériau PCL-BU utilisé ici ne permet pas une exposition prolongée à des concentrations élevées d’éthanol. La méthode de stérilisation la plus appropriée peut être choisie en fonction du matériau utilisé.

En plus des résultats d’études de co-culture précédemment réalisées, une plus grande variété d’études peut être réalisée avec le même système. Le système a déjà été utilisé pour effectuer des monocultures dynamiques de myofibroblastes (Figure supplémentaire 1A-B) et de macrophages (Figure supplémentaire 1C-D) pour étudier les effets de la charge hémodynamique sur les types cellulaires individuels et leur signalisation paracrine^19,43. Différents régimes de charge hémodynamique ont entraîné une orientation claire des fibres d’actine dans les myofibroblastes (Figure supplémentaire 1A) et des dépôts de collagène nettement différents (Figure supplémentaire 1B) après 10 jours. La production de cytokines par les macrophages dérivés de THP1 était radicalement différente entre les différentes charges hémodynamiques (Figure supplémentaire 1C) et montrait un profil plus pro-inflammatoire lorsqu’il était chargé (Figure supplémentaire 1D). D’autres possibilités validées incluent l’application d’un flux oscillatoire, en utilisant une pompe supplémentaire et une unité fluidique. La viscosité du milieu peut être augmentée vers la plage de viscosité du sang (par exemple, en ajoutant de la gomme de xanthane)⁶⁹. La modulation de la viscosité du milieu représente une variable supplémentaire pour élargir la gamme des contraintes de cisaillement applicables. Enfin, bien que le protocole décrit utilise la configuration de conditionnement de flux « Ibidi », des configurations d’autres fabricants peuvent également être utilisées, à condition que des régimes d’écoulement similaires puissent être appliqués.

L’un des principaux avantages de l’utilisation de ce système de bioréacteur est la construction relativement grande (environ 15 mm x 10,5 mm) qui peut être chargée hémodynamiquement, ce qui permet d’extraire une grande variété de paramètres de lecture possibles à partir d’un seul échantillon. Dans le même temps, la taille de la construction peut également être considérée comme une limitation, car cette configuration nécessite une quantité relativement importante de matériau (parfois coûteux), en particulier si des cellules primaires sont utilisées ou si le milieu de culture nécessite des additifs coûteux. De plus, le débit de la configuration est relativement faible. Par conséquent, la configuration actuelle est particulièrement adaptée à la recherche basée sur des hypothèses dans laquelle un nombre limité de variables est testé de manière exhaustive, plutôt qu’au dépistage d’un grand nombre de variables avec une lecture limitée. Pour les expériences futures, de petites améliorations sont apportées à la configuration actuelle pour permettre la possibilité de monter des échafaudages plus petits et de réduire la taille des réservoirs moyens. En ce qui concerne ces derniers, le volume actuel des réservoirs moyens est nécessaire pour permettre des débits volumétriques suffisants pour atteindre les contraintes de cisaillement souhaitées. Les débits requis – et avec cela, le volume des réservoirs moyens – peuvent être réduits en augmentant la viscosité du milieu (par exemple, en ajoutant de la gomme de xanthane, comme établi précédemment⁶⁹).

Pour conclure, ce bioréacteur permet de quantifier les effets individuels et combinés de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique sur la croissance et le remodelage des tissus sur une grande variété d’échafaudages de biomatériaux 3D élastomères. Le bioréacteur peut mettre en culture jusqu’à huit constructions vasculaires dans diverses conditions de charge. En raison de sa conception, le bioréacteur est particulièrement adapté pour étudier l’interaction entre l’hémodynamique et les processus TE vasculaires in situ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor - "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding