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Medicine

ह्यूमन कार्डियक मायोसाइट्स मॉडल में हाइपोथर्मिया-प्रीसींडीशनिंग के बाद मायोकार्डियल प्रोटेक्शन का इन विट्रो असेसमेंट

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61837
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Nanjing Medical University
* These authors contributed equally

Summary

मायोकार्डियल संरक्षण पर हाइपोथर्मिया की विभिन्न डिग्री के विशिष्ट प्रभावों का अच्छी तरह से मूल्यांकन नहीं किया गया है। वर्तमान अध्ययन का लक्ष्य एक मानव कार्डियोमायोसाइट आधारित मॉडल में विभिन्न हाइपोथर्मिया उपचार के बाद सेल मौत के स्तर की मात्रा निर्धारित करना था, जो भविष्य में गहराई से आणविक अनुसंधान की नींव रखता था।

Abstract

इस्केमिया/रिफ्यूजन-व्युत्पन्न मायोकार्डियल रोग कार्डियक सर्जरी के बाद रोगियों में एक आम नैदानिक परिदृश्य है । विशेष रूप से, इस्कीमिक चोट के लिए कार्डियोमायोसाइट्स की संवेदनशीलता अन्य कोशिका आबादी की तुलना में अधिक है। वर्तमान में, हाइपोथर्मिया एक अपेक्षित इस्कीमिक अपमान के खिलाफ काफी सुरक्षा प्रदान करता है । हालांकि, जटिल हाइपोथर्मिया प्रेरित आणविक परिवर्तनों में जांच सीमित रहती है । इसलिए, वीवो स्थितियों के समान संस्कृति स्थिति की पहचान करना आवश्यक है जो प्रजनन तरीके से नैदानिक स्थिति में देखी गई क्षति के समान नुकसान को प्रेरित कर सकता है। विट्रो में इस्केमिया जैसी स्थितियों की नकल करने के लिए, इन मॉडलों में कोशिकाओं को ऑक्सीजन/ग्लूकोज अभाव (OGD) द्वारा इलाज किया गया । इसके अलावा, हमने कार्डियक सर्जरी के दौरान उपयोग किए जाने वाले एक मानक समय-तापमान प्रोटोकॉल लागू किए। इसके अलावा, हम मायोकार्डियल चोट के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सरल लेकिन व्यापक विधि का उपयोग करने के लिए एक दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं। एपोप्टोसिस और एपोप्टोसिस से जुड़े प्रोटीन के अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा और एलिसा किट का उपयोग करके किया गया था। इस मॉडल में, हमने कार्डियोमायोसाइट एपोप्टोसिस इन विट्रो पर विभिन्न तापमान स्थितियों के प्रभावों के बारे में एक परिकल्पना का परीक्षण किया। इस मॉडल की विश्वसनीयता सख्त तापमान नियंत्रण, नियंत्रणीय प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और स्थिर प्रयोगात्मक परिणामों पर निर्भर करती है। इसके अतिरिक्त, इस मॉडल का उपयोग हाइपोथर्मिक कार्डियोप्रोटेक्शन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें हाइपोथर्मिया के साथ उपयोग के लिए पूरक चिकित्सा के विकास के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकते हैं।

Introduction

इस्केमिया/रिफ्यूजन-व्युत्पन्न मायोकार्डियल डिसफंक्शन कार्डियक सर्जरी1,2के बाद रोगियों में एक आम नैदानिक परिदृश्य है । गैर-पल्साटिल कम प्रवाह परफ्यूजन और कुल संचार गिरफ्तारी की अवधि के दौरान, सभी प्रकार की हृदय कोशिकाओं को शामिल करने वाली क्षति अभी भी होती है। विशेष रूप से, इस्कीमिक चोट के लिए कार्डियोमायोसाइट्स की संवेदनशीलता अन्य कोशिका आबादी की तुलना में अधिक है। वर्तमान में, चिकित्सकीय हाइपोथर्मिया (टीएच) कार्डियक सर्जरी3,4से गुजरने वाले रोगियों में अपेक्षित इस्कीमिक अपमान के खिलाफ पर्याप्त सुरक्षा प्रदान करता है। TH को 14-34 डिग्री सेल्सियस के मुख्य शरीर के तापमान के रूप में परिभाषित किया गया है, हालांकि कार्डियक सर्जरी5,6,7के दौरान ठंडा करने की परिभाषा के बारे में कोई आम सहमति मौजूद नहीं है। 2013 में, विशेषज्ञों के एक अंतरराष्ट्रीय पैनल ने प्रणालीगत हाइपोथर्मिक परिसंचरण गिरफ्तारी 8 के विभिन्न तापमान श्रेणियों को वर्गीकृत करने के लिए एक मानकीकृत रिपोर्टिंग प्रणाली का प्रस्तावकिया। मस्तिष्क के इलेक्ट्रोएंसेफलोग्राफी और मेटाबोलिज्म अध्ययन के आधार पर, उन्होंने हाइपोथर्मिया को चार स्तरों में विभाजित किया: गहरा हाइपोथर्मिया (≤ 14 डिग्री सेल्सियस), गहरी हाइपोथर्मिया (14.1-20 डिग्री सेल्सियस), मध्यम हाइपोथर्मिया (20.1-28 डिग्री सेल्सियस), और हल्के हाइपोथर्मिया (28.1-34 डिग्री सेल्सियस)। विशेषज्ञ आम सहमति एक स्पष्ट और एक समान वर्गीकरण प्रदान की है, अध्ययन और अधिक तुलनीय होने की अनुमति और अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक परिणाम प्रदान करते हैं । टीएच द्वारा प्रदान की गई यह सुरक्षा कोशिकाओं की मेटाबोलिक गतिविधि को कम करने की अपनी क्षमता पर आधारित है, और उच्च ऊर्जा वाले फॉस्फेट खपत9,10की उनकी दर को सीमित करती है। हालांकि, मायोकार्डियल सुरक्षा में टीएच की भूमिका विवादास्पद है और हाइपोथर्मिया की डिग्री के आधार पर कई प्रभाव हो सकते हैं।

Myocardial I/R अच्छी तरह से सेल apoptisis11के साथ होने के लिए जाना जाता है । हाल की रिपोर्टों में देखा गया है कि प्रोग्राम कार्डियोमायोसाइट मौत ओपन हार्ट सर्जरी के दौरान बढ़ जाती है, और परिगलन के साथ मेल खा सकती है, जिससे मृत मायोकार्डियल कोशिकाओं की संख्या12बढ़ जाती है । इसलिए, कार्डियोमायोसाइट एपोप्टोसिस को कम करना नैदानिक अभ्यास में एक उपयोगी चिकित्सीय दृष्टिकोण है। माउस एट्रियल एचएल-1 कार्डियोमायोसाइट मॉडल में, चिकित्सकीय हाइपोथर्मिया को 13 रिफ्यूजन13के दौरान साइटोक्रोम सी और एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण कारक (एआईएफ) के माइटोकॉन्ड्रियल रिलीज को कम करने के लिए दिखाया गया था। हालांकि, एपोप्टोसिस को विनियमित करने में तापमान का प्रभाव विवादास्पद है और हाइपोथर्मिया की डिग्री पर निर्भर प्रतीत होता है। कूपर और उनके सहयोगियों ने देखा कि एक नॉर्थोथर्मिक कार्डियोपल्मोनरी बाईपास नियंत्रण समूह की तुलना में, गहरी हाइपोथर्मिक परिसंचरण गिरफ्तारी के साथ सूअरों से मायोकार्डियल ऊतक की एपोप्टोसिस दर14में वृद्धि हुई थी । इसके अलावा, कुछ अध्ययनों के परिणामों ने सुझाव दिया है कि गहरी हाइपोथर्मिया एपोप्टोसिस मार्ग को सक्रिय कर सकता है, जबकि कम आक्रामक हाइपोथर्मिया मार्ग12,15,16को बाधित करता प्रतीत होता है। इस परिणाम का कारण इस्कीमिक चोट से जुड़े जटिल प्रभावों और तंत्र की समझ की कमी के कारण हो सकता है जिसके द्वारा तापमान मायोकार्डियल ऊतक को प्रभावित करता है। इसलिए, तापमान सीमा जिस पर एपोप्टोसिस बढ़ाया या तनु है, उसे सटीक रूप से परिभाषित किया जाना चाहिए।

हाइपोथर्मिया की प्रभावकारिता से जुड़े तंत्रों की बेहतर समझ हासिल करने और मनुष्यों में इसके कार्यान्वयन के लिए तर्कसंगत आधार प्रदान करने के लिए, वीवो स्थितियों के समान संस्कृति स्थिति की पहचान करना आवश्यक है जो प्रजनन तरीके से नैदानिक स्थिति के लिए देखी गई क्षति के समान नुकसान का उत्पादन कर सकता है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने की दिशा में एक आवश्यक कदम कार्डियोमायोसाइट एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए इष्टतम शर्तों को स्थापित करना है। तदनुसार, वर्तमान अध्ययन में, हमने सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव प्रयोगों के बारे में पद्धतिगत विवरणों का पता लगाया, जो इस्केमिया-रिफ्यूजन के विट्रो मॉडल में एक फेसियल है। इसके अलावा, हमने कार्डियोमायोसाइट एपोप्टोसिस पर विभिन्न हाइपोक्सिक-इस्कीमिक समय के प्रभाव का मूल्यांकन किया, और विट्रो में सेल एपोप्टोसिस पर विभिन्न तापमान स्थितियों के प्रभाव के बारे में हमारी परिकल्पना को सत्यापित किया।

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Protocol

वाणिज्यिक अभिकर्णों और उपकरणों के बारे में जानकारी सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध है।

AC16 मानव कार्डियोमायोसाइट सेल लाइन एसवी 40-रूपांतरित मानव फाइब्रोब्लास्ट17के साथ वयस्क वेंट्रिकुलर हार्ट ऊतक से प्राथमिक कोशिकाओं के संलयन से ली गई थी, जो ब्लूएफबीओ (शंघाई, चीन) से खरीदी गई थी। सेल लाइन कार्डियोमायोसाइट्स की विशेषता कई जैव रासायनिक और रूपात्मक विशेषताओं को विकसित करती है। इसके अलावा, सेल लाइन का व्यापक रूप से विट्रो18, 19में मायोकार्डियल क्षति और मायोकार्डियल कार्य का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग कियाजाताहै।

1. सेल संस्कृति

नोट: बेसल कल्चर मीडियम में सीरम-फ्री डल्बेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% कार्डियक मायोसाइट ग्रोथ सप्लीमेंट और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन सॉल्यूशन शामिल हैं । उपयोग से पहले माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस और प्रीवार्म को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

  1. क्रायोप्रेवरीवित ह्यूमन कार्डियोमायोसाइट (एचसीएम) कोशिकाओं को लिक्विड नाइट्रोजन से निकालें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में गल लें।
  2. धीरे से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में शीशी हिला (<1 मिनट) जब तक केवल बर्फ का एक छोटा सा टुकड़ा शीशी में रहता है ।
  3. शीशी को बाँझ लैमिनार प्रवाह हुड में स्थानांतरित करें। 70% शराब में डूबा एक कपास की गेंद के साथ शीशी के बाहर पोंछें।
  4. गल कोशिकाओं वाले अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्रीवार्म्ड पूर्ण विकास मध्यम ड्रॉपवाइज के 4 एमएल स्थानांतरित करें।
  5. 10 मिनट के लिए 200 × जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। अपकेंद्रित्र के बाद सुपरनेट को त्यागें और पैलेट को कंप्लीट मीडियम के 5 एमएल में रीसस्ट करें।
  6. 95% हवा और 5% सीओ2के साथ एक वातावरण के तहत एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखें।
    नोट: प्रयोगों के लिए कोशिकाओं की कटाई से पहले, कोशिकाओं को लगभग 60-70% तक पहुंचने तक बढ़ने की अनुमति है ।

2. ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव (OGD) मॉडल की स्थापना

नोट: अध्ययन अवधि से दो घंटे पहले, सीरम मुक्त माध्यम के साथ विकास माध्यम की जगह, और कोशिकाओं को 5% सीओ 2 के साथ एक वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर2घंटे के लिए एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में फिर से आपूर्ति की गई ।

  1. माध्यम को 6-अच्छी प्लेट से हटाएं और कोशिकाओं को फास्फेट बफर खारा (पीबीएस) से तीन बार धोएं।
  2. ताजा चीनी मुक्त DMEM के 2 एमएल अच्छी तरह से जोड़ें।
  3. 95% एन 2, 5% सीओ2,और 0.1% O 2 पर 1,2, 4, 8, 12, या 16 घंटे के मिश्रण के साथ एक वातावरण के तहत एक तीन गैस इनक्यूबेटर में एक निरंतर तापमान पर कोशिकाओं संस्कृति।
  4. हाइपोक्सिया उपचार के बाद, माध्यम को 6-अच्छी प्लेट से हटाएं और कोशिकाओं को पीबीएस (पीएच 7.4) से तीन बार धोएं।
  5. प्रति अच्छी तरह से पूर्ण डीएमईएम का 2 एमएल जोड़ें।
  6. 95% हवा और 5% सीओ2के साथ एक वातावरण के तहत एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखें।

3. समय-तापमान प्रोटोकॉल

नोट: कार्डियक सर्जरी के दौरान एक मानक समय-तापमान प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है, जैसा कि पहलेअन्य 20,21द्वारा वर्णित है। एचसीएमएस का इलाज निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार(चित्रा 1):टाइमपॉइंट 1 (टी 1) प्रेरण के अंत को इंगित करता है, टाइमपॉइंट 2 (टी 2) रखरखाव के अंत को इंगित करता है और समय बिंदु 3 (टी 3) रीवार्मिंग के अंत को इंगित करता है। निरंतर नॉर्म्सथर्मिक स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस) के तहत बनाए गए नियंत्रण कोशिकाओं का विश्लेषण करें। तापमान की स्थिति एक त्रिकोणीय गैस इनक्यूबेटर का उपयोग करके बनाई जाती है, जो सटीक तापमान विनियमन की अनुमति देता है।

  1. प्रयोगों से दो घंटे पहले, संस्कृति माध्यम को 6-अच्छी प्लेट से हटा दें और प्रति अच्छी तरह से ताजा सीरम-मुक्त डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें।
  2. 5%सीओ2 के साथ वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को फिर से इनक्यूबेट करें।
  3. 2 घंटे के बाद, माध्यम को 6-अच्छी प्लेट से हटा दें और कोशिकाओं को पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ तीन बार धोएं।
  4. ताजा सीरम मुक्त DMEM के 2 एमएल अच्छी तरह से जोड़ें।
  5. ट्राई-गैस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को फिर से कम करें।
    नोट: असेकीकृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए माध्यम को बदलें।
  6. तुरंत संस्कृति व्यंजन एक त्रिकोणीय गैस इनक्यूबेटर रखकर तापमान बदल जाते हैं।
  7. ठंडा करने के 1 घंटे के बाद, जल्दी से 6-अच्छी प्लेट से माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से 2 मिलील ताजा चीनी-मुक्त डीएमईएम जोड़ें।
  8. एक वातावरण के तहत एक त्रिकोणीय गैस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति जिसमें 95% एन2,5% सीओ2,और 0.1% O2 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए हाइपोक्सिया स्थापित करने के लिए शामिल हैं।
  9. नीचे वर्णित तापमान सेट करें।
    नोट: प्रोटोकॉल कम तापमान वाले उपचार के 10 घंटे के साथ शुरू होता है, जिसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस तक 2 घंटे के लिए एक रेरर्मिंग चरण और नॉर्मोथर्मिया (37 डिग्री सेल्सियस) का 24 h होता है। हर समय बिंदु पर, विश्लेषण के लिए तीन पेट्री व्यंजन हटा दिए जाते हैं।
  10. कम तापमान उपचार के बाद, 6-अच्छी प्लेट से माध्यम को एस्पिरेट करें और तीन बार पीबीएस (पीएच 7.4) से धोएं।
  11. प्रति अच्छी तरह से पूर्ण डीएमईएम का 2 एमएल जोड़ें।
  12. 95% हवा और 5% सीओ2के साथ एक वातावरण के तहत एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखें।

4. CCK-8 व्यवहार्यता परख

  1. उपयोग से पहले 0.25% ट्राइप्सिन-एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) समाधान और पीबीएस को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. माध्यम को एस्पिरेट करें, पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें और फिर कुएं की दीवार के साथ 0.25% ट्राइपसिन के 0.5 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक लगभग सभी एचसीएमएस अलग (लगभग 1 मिनट) हैं।
  3. ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए कुओं में डीएमईएम पूर्ण माध्यम का 1 एमएल जोड़ें।
  4. सेल निलंबन को 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए 500 × जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा एचसीएमएस को गोली दें। पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  5. सेल निलंबन (5000 कोशिकाओं/ एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए प्लेट को प्रीइनक्यूबेट करें (37 डिग्री सेल्सियस पर)
  6. विभिन्न उपचार समूहों को उत्पन्न करने के लिए 96-अच्छी प्लेटों में सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करें।
  7. एक इनक्यूबेटर में उचित समय (16 एच) के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  8. प्लेट के प्रत्येक कुएं में सीके-8 समाधान के 10 माइक्रोल जोड़ें।
  9. इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए थाली को इनक्यूबेट करें।
  10. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम पर अवशोषण को मापें।
    सावधानी: सावधान रहें कि कुओं में बुलबुले पेश न करें, क्योंकि वे ओडी पढ़ने के माप में हस्तक्षेप करते हैं।

5. एपोप्टोसिस विश्लेषण के लिए फ्लो साइटोमेट्री

  1. चरण 4.2-4.4 का पालन करके ट्राइपसिनाइजेशन और अपकेंद्रित्र चरणों को करें।
    नोट: कोशिकाओं को EDTA के बिना ट्रिप्सिन के साथ काटा जाता है। एपोप्टोसिस का आकलन करने के लिए, फ्लोटिंग और अनुयायी दोनों कोशिकाओं को एकत्र किया जाता है।
  2. 1000 × जी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस के 1 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें।
  3. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। एक पिपेट का उपयोग करके, ट्राइपन ब्लू-इलाज सेल निलंबन के 100 माइक्रोन को हीमोसाइटोमीटर में स्थानांतरित करें। एक हाथ टैली काउंटर का उपयोग करना, 16 वर्गों के एक सेट में जीवित, अन दाग कोशिकाओं की गिनती और फिर PBS का उपयोग करने के लिए १×१०७ कोशिकाओं/मिलीलीटर पर एक सेल निलंबन उत्पन्न करते हैं ।
  4. सेल निलंबन के 200 μL प्राप्त (5 × 105 -1 × 106 कोशिकाओं) ।
  5. 1000 × जी पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज और एनेक्सलिन वी-फिटसी बाध्यकारी समाधान में गोली को फिर से खर्च करें।
  6. कोशिकाओं को डाई करने के लिए एनेक्सटिन वी-फिटसी के 5 माइक्रोन जोड़ें।
  7. सेल निलंबन में प्रोपिडियम आयोडाइड के 10 माइक्रोल जोड़ें।
  8. धीरे-धीरे कोशिकाओं को मिलाएं और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए उन्हें इनक्यूबेट करें।
    नोट: कोशिकाओं को धुंधला सुधार करने के लिए इनक्यूबेशन के दौरान 2-3 बार फिर से निलंबित कर रहे हैं ।
  9. प्रवाह साइटोमीटर शुरू करें और सुनिश्चित करें कि सॉफ्टवेयर उचित रूप से काम कर रहा है।
  10. फ्लो साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर में दो डॉट प्लॉट खिड़कियां खोलें।
  11. सेल मलबे और/या उनके आकार और दानेदारता के मामले में झुरमुट को बाहर करने के लिए वाई धुरी पर एक्स एक्सिस और साइड बिज़्ड लाइट (एसएससी) पर आगे बिखरे हुए प्रकाश (एफएससी) का चयन करें ।
  12. पीई (590 मिमी) डिटेक्शन चैनल और फिटसी (530 मिमी) का चयन करें, जिसका उपयोग कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए किया जाता है।
  13. फ्लो साइटोमीटर पर ब्लैंक (एचसीएमएस जो रंगे नहीं गए हैं) सैंपल ट्यूब रखें।
  14. क्लिक करें रिकॉर्ड खाली नमूना ट्यूब में निलंबन से कणों को इकट्ठा करने के लिए और फिर पहले डॉट प्लॉट में आगे के विश्लेषण के लिए सेल आबादी गेट ।
  15. ट्यूब सपोर्ट आर्म पर सिंगल दाग वाले नमूनों को रखें। निलंबन से कणों को इकट्ठा करने के लिए रिकॉर्ड पर क्लिक करें और फिर पहले डॉट प्लॉट में आगे के विश्लेषण के लिए सेल आबादी को गेट करें।
  16. अन्य नमूना ट्यूबों में एचसीएमएस ले लीजिए और फ्लोरेसेंस चैनलों के वोल्टेज को समायोजित करके माप का अनुकूलन करें।
    नोट: प्रयोग के दौरान अन दाग और एकल दाग वाले नमूनों का उपयोग क्षतिपूर्ति नियंत्रण के रूप में किया जाता है ।
  17. प्रत्येक नमूना ट्यूब के आंकड़े प्रदर्शित करें और प्रत्येक नमूने के एपोप्टोसिस की दर की गणना करें।

6. माइटोकॉन्ड्रियल डीपोलराइजेशन असेसमेंट

  1. चरण 4.2-4.4 का पालन करके ट्राइपिनाइजेशन और अपकेंद्रित्र करें।
  2. कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम के 500 माइक्रोल में पुनर्व्यवित करें, और फिर कोशिका घनत्व को समायोजित करें 1 × 105 - 6 × 106 कोशिकाओं में समायोजित करें
  3. प्रत्येक ट्यूब में जेसी-1 कार्य समाधान का 0.5 एमएल जोड़ें।
  4. कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, जेसी-1 धुंधला बफर तैयार करने के लिए आसुत पानी के 4 एमएल के लिए 5× जेसी-1 धुंधला बफर के 1 एमएल जोड़ें ।
  5. इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 600 × जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
  6. सुपरनेट को त्यागें और जेसी-1 धुंधला बफर के 1 एमसीएल में गोली को फिर से रखें।
  7. तीन बार 6.5 से 6.6 चरण दोहराएं।
  8. 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में बर्फ-ठंडे धुंधला बफर के 1 एमएल में एचसीएमएस को फिर से खर्च करें और 30 मिनट के भीतर विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें।
  9. कोशिकाओं में जेसी-1 डाई की फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए पीई (590 एनएम) डिटेक्शन चैनल और फिटसी (530 एनएम) का चयन करें।
    नोट: चरण 5.10-5.17 का पालन करके प्रवाह साइटोमीटर सेट करें।

7. प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों परख

  1. चरण 4.2-4.4 का पालन करके ट्राइपिनाइजेशन और अपकेंद्रित्र करें।
  2. 10 μM DCFDA के साथ संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं दाग और 1 × 106-1 × 107 कोशिकाओं के लिए सेल घनत्व समायोजित
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. धीरे से कोशिकाओं को पिपेट अप/नीचे हर 3-5 मिनट ।
  5. इनक्यूबेशन के बाद कोशिकाओं को सीरम मुक्त कोशिका संस्कृति माध्यम से तीन बार धोएं।
  6. 5.10-5.17 चरणों का पालन करके एक प्रवाह साइटोमीटर पर कोशिकाओं का विश्लेषण करें।
    नोट: डीसीएफ 488 एनएम पर उत्साहित है और उत्सर्जन तीव्रता 530 एनएम पर मापा गया है।

8. कैस्पास 3/ कैपपास 8 गतिविधि का मापन

  1. चरण 4.2-4.4 का पालन करके ट्राइपिनाइजेशन करें।
  2. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 × जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए।
  3. प्रति 2 × 106 कोशिकाओं में 100 μl lysate बफर जोड़ें।
  4. बर्फ पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं Lyse।
  5. आइस बाथ में 15 मिनट तक इनक्यूबेटिंग करने के बाद, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.6 ×10 4 x ग्राम पर नमूना अपकेंद्री करें।
  6. उपयोग के लिए एक बर्फ-ठंडी अपकेंद्रित्र ट्यूब में सुपरनेट को स्थानांतरित करें।
    नोट: नमूने में प्रोटीन एकाग्रता कम से कम 1-3 मिलीग्राम/
  7. एसी-डेवड-पीएनए (2 mM) निकालें और उपयोग के लिए इसे आइस बाथ पर रखें।
  8. एंजाइम-लेबल प्लेट में बफर समाधान के 40 μL को सही ढंग से जोड़ें, नमूने के 80 माइक्रोन जोड़ें, और अंत में एसी-डीवड-पीएनए (2 mM) के 10 माइक्रोन जोड़ें।
  9. 120 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें।
  10. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक माइक्रोप्लेट रीडर पर A405 मूल्य मापा।
    नोट: caspase-3/caspase-8 द्वारा उत्पन्न पीएनए द्वारा उत्पादित अवशोषण नमूने से खाली नियंत्रण के A405 मूल्य घटाकर गणना की जाती है ।

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Representative Results

एचसीएमएस की व्यवहार्यता पर ओजीडी एक्सपोजर का प्रभाव सीकेई-8 परख द्वारा निर्धारित किया गया था। नियंत्रण समूह में देखे गए इसकी तुलना में, समय-निर्भर तरीके(चित्रा 2 ए)में सेल व्यवहार्यता में काफी कमी आई थी। रिफ्यूजन के बाद अलग-अलग समय पर एचसीएमएस की एपोप्टोसिस दरों ने एक विशिष्ट प्रवृत्ति दिखाई, जहां 0 से 16 घंटे तक, एपोप्टोसिस दरों में धीरे-धीरे वृद्धि हुई और 16 एच टाइम पॉइंट(चित्रा 2B)पर अधिकतम दर तक पहुंच गई। 12 घंटे के लिए ओजीडी के रूप में ~ 50% द्वारा सेल गतिविधि कम, 12 एच OGD बाद के प्रयोगों में सेल क्षति को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

बाद में हमने एपोप्टोसिस की प्रक्रिया पर तापमान के प्रभाव की जांच की। ओजीडी समूह में देखे गए लोगों की तुलना में, हाइपोथर्मिया(चित्रा 3B)के साथ इलाज किए गए तीन समूहों में व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत अधिक था। इसके अलावा, डीप हाइपोथर्मिया समूह की कोशिकाओं में ओजीडी समूह की तुलना में सबसे अधिक व्यवहार्यता (>92%), 2.1 गुना अधिक थी। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों से पता चला है कि हाइपोथर्मिया ने ओजीडी शर्तों(चित्रा 3ए और 3 सी)के तहत एचसीएमएस के एपोप्टोसिस को रोका। क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन एपोप्टोसिस से जुड़ा हुआ है, इसलिए हमने माइटोकॉन्ड्रियल विकारों का आकलन करने के लिए अतिरिक्त डेटा प्राप्त किया। इंट्रासेलुलर आरओएस के स्तर को डीसीएफएच-डीए परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। ओजीडी समूह में देखे गए हाइपोथर्मिया उपचार की तुलना में एचसीएमएस(चित्रा 4 ए)में इंट्रासेलुलर आरओएस के स्तर में कमी आई। इसके अलावा जेसी-1 धुंधला होने से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की क्षमता का पता चला। OGD उपचार के बाद, जेसी-1 के लाल फ्लोरेसेंस काफी कम हो गया था, और हरे रंग की फ्लोरेसेंस में काफी वृद्धि हुई थी। इसके विपरीत, हाइपोथर्मिया उपचार ने ओजीडी-प्रेरित प्रभाव को काफी बाधित किया और लाल को बड़े मार्जिन(चित्रा 4B)द्वारा हरे अनुपात में बढ़ा दिया। इसके अलावा, हाइपोथर्मिया उपचार(चित्रा 4सी, 4डी)के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं में कैस्पास 3/कैस्पा-8 की कमी भी देखी गई।

Figure 1
चित्रा 1: प्रायोगिक प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट। एचसीएमएस का इलाज निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया: टाइम पॉइंट 1 (टी 1) प्रेरण के अंत (2h के लिए ठंडा) इंगित करता है; टाइम पॉइंट 2 (टी 2) रखरखाव के अंत (वांछित तापमान पर 10h के लिए हाइपोथर्मिया) को इंगित करता है; और टाइम पॉइंट 3 (टी 3) रीवार्मिंग के अंत को इंगित करता है (37 डिग्री सेल्सियस तक दो एच के लिए रीवार्मिंग)। तापमान वांछित तापमान पर बनाए रखा गया था: हल्के हाइपोथर्मिया के लिए 34 डिग्री सेल्सियस, मध्यम हाइपोथर्मिया के लिए 31 डिग्री सेल्सियस, और गंभीर हाइपोथर्मिया के लिए 17 डिग्री सेल्सियस। सतत मानदंडों (37 डिग्री सेल्सियस) के तहत बनाए गए नियंत्रण कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। तापमान की स्थिति एक त्रिकोणीय गैस इनक्यूबेटर का उपयोग कर बनाया गया था, जो सटीक तापमान विनियमन के लिए अनुमति देता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सीकेई-8 और एनेक्सटिन वी/पीआई परख द्वारा सेल व्यवहार्यता और एपोप्टोसिस का मूल्यांकन । (क) कोशिका व्यवहार्यता परख का उपयोग करके कोशिका व्यवहार्यता को मापा गया था । (ख) ऑपॉप्टोसिस का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था । * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05,***p< 0.001 बनाम सामान्य समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: हाइपोथर्मिया उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता और एपोप्टोसिस का मूल्यांकन। (A)सेल एपोप्टोसिस का पता फ्लो साइटोमेट्री द्वारा लगाया गया था। (ख)एपोप्टोसिस का मात्रात्मक विश्लेषण। (ग)सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके कोशिका व्यवहार्यता को मापा गया था। **p < 0.01,***p< 0.001 बनाम सामान्य समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और कैस्पाज़-3 कैस्पास-8 गतिविधि का विश्लेषण। एक इंट्रासेलुलर आरओएस स्तर। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का बी क्वांटिफिकेशन। (सीएंडडी) कैस्पे-8/कैस्पास-3 गतिविधि का अनुमान एलिसा किट का उपयोग करके लगाया गया था । * पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001 बनाम ओजीडी समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत सहित अक्षुण्ण पशुओं की जटिलताएं अक्सर आई/आर चोट के विशिष्ट घटकों के विस्तृत अध्ययन को रोकती हैं । इसलिए, एक इन विट्रो सेल मॉडल स्थापित करना आवश्यक है जो वीवो में इस्केमिया के बाद आणविक परिवर्तनों को सटीक रूप से प्रतिबिंबित कर सके। ओजीडी मॉडलों पर शोध पहले13,22और कई अत्याधुनिक तरीकों की स्थापना की गई है23,24. ओजीडी मॉडल की तैयारी प्रक्रिया में दो प्रमुख कदम शामिल हैं: ऑक्सीजन अभाव और ग्लूकोज अभाव। वर्तमान अध्ययन में, ग्लूकोज-मुक्त माध्यम में कोशिका को ̈टग करके ग्लूकोज वंचन किया गया था, और ऑक्सीजन अभाव नाइट्रोजन के साथ प्रतिस्थापन द्वारा प्राप्त किया गया था, जो वर्तमान में ओजीडी मॉडल25, 26तैयार करने के लिए एक अच्छी तरह सेस्थापितविधि है। हालांकि, सेल प्रकार के आधार पर, दो कारकों पर विचार किया जाना चाहिए, जिसमें: 1) सेल सीडिंग घनत्व और 2) ओजीडी एक्सपोजर की अवधि शामिल है। संलग्न कोशिकाओं की संख्या जितनी अधिक होगी, ओजीडी तनाव के प्रतिरोध को मजबूत किया जाता है, जैसे कि ओजीडी से पहले सीडिंग की अवधि महत्वपूर्ण है। HCMs (2 ×१० ५ कोशिकाओं/कुओं) 6 में वरीयता प्राप्त थे-अच्छी तरह से थाली के लिए 30-34h से पहले OGD, जिस पर समय कोशिकाओं लगभग ६५% ढुलमुल थे । उच्च कोशिका घनत्व कोशिकाओं पर ओजीडी के प्रभाव को कम करेगा। इसके अलावा, धोने के चरणों के दौरान कोशिकाओं के नुकसान की क्षमता को कम करना महत्वपूर्ण है। ओजीडी एक्सपोजर की अवधि का प्रभाव ओजीडी मॉडल की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में एक और महत्वपूर्ण कारक है। उदाहरण के लिए, दवाओं के सुरक्षात्मक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, एक अवधि का चयन करना उचित है जो उपचार के बिना 40-50% सेल मृत्यु का कारण बनता है। यदि सेल मृत्यु बहुत चरम है, उदाहरण के लिए, 80%, तो पुनर्विश्लेमेंट्री के सुरक्षात्मक प्रभाव की मात्रा बताना चुनौतीपूर्ण होगा। एचसीएमएस के लिए, 12 घंटे के लिए ओजीडी के संपर्क में आने से 42% सेल डेथ हुई। इसलिए, बाद के प्रयोगों में, सेल क्षति को प्रेरित करने के लिए 12 घंटे के ओजीडी उपचार का उपयोग किया गया था।

वीवो और इन विट्रो वातावरण के बीच हाइपोथर्मिक काइनेटिक्स में अंतर के कारण, कार्डियोमायोसाइट मॉडल के लिए हाइपोथर्मिया प्रेरण का इष्टतम दृष्टिकोण और तंत्र अस्पष्ट बना हुआ है। पिछले कुछ दशकों में, कम तापमान पर कार्डियोमायोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए कई इन विट्रो मॉडल विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, जना क्रेच एट अल ने इस्केमिया-रिपरफ्यूजन13के बाद मायोकार्डियल एपोप्टोसिस पर तापमान के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक मध्यम हाइपोथर्मिया सेल मॉडल की स्थापना की। यद्यपि कई अध्ययनों ने शीतलन के शारीरिक प्रभावों पर ध्यान केंद्रित किया है, फिर भी बड़ी संख्या में हानिकारक दुष्प्रभाव होते हैं जो27के दौरान होते हैं। पिछले अध्ययनों के परिणामों से पता चला है कि रेवेटरिंग अलग कार्डियोमायोसाइट्स27,28में संकुचन दोष पैदा कर सकता है । इसलिए, तापमान और रीवार्मिंग की गति विशेष रूप से आवश्यक है। तापमान के प्रभाव को कड़ाई से नियंत्रित करने के लिए, हमने कार्डियक सर्जरी के दौरान उपयोग किए जाने वाले मानक समय-तापमान प्रोटोकॉल को लागू किया, जैसा कि पहले20,21उल्लेख किया गया था। इस मॉडल में, तापमान को आवश्यक तापमान सीमा के भीतर सटीक रूप से नियंत्रित किया जाता है, जिसमें तीन चरण शामिल हैं: 1) कूलिंग अवधि (1 एच); 2) तापमान बनाए रखने की अवधि (10 घंटे); और 3) तापमान रीवार्मिंग अवधि (2 घंटे) । इसके अलावा, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले तापमान हल्के (34 डिग्री सेल्सियस), मध्यम (31 डिग्री सेल्सियस), और गंभीर (17 डिग्री सेल्सियस) कम तापमान,पिछले प्रकाशनों29,30, 31में उपयोग किए जाने वाले लोगों के बराबर हैं। अंत में, हमने कार्डियोमायोसाइट एपोप्टोसिस इन विट्रो पर विभिन्न तापमान स्थितियों के प्रभावों के बारे में अपनी परिकल्पना का भी परीक्षण किया। जैसा कि अपेक्षित था, परिणामों से पता चला है कि तापमान ने आरओएस के स्तर को काफी कम कर दिया, एमएमपी को बहाल किया, और कैस्पा-8/कैस्पास-3 गतिविधि में कमी आई ।

हम जानते हैं कि यह अध्ययन एक गैर-अनुबंधीय सेल लाइन और इन विट्रो मॉडल दोनों का उपयोग करके किया गया था, जो शरीर के किसी भी तरल पदार्थ से प्रभावित नहीं था। इन सीमाओं के बावजूद, हाइपोथर्मिया उपचार के परिणामस्वरूप सेल एपोप्टोसिस में महत्वपूर्ण सुधार वीवो अध्ययन सहित आगे की जांच करने के महत्व पर जोर देता है। इसलिए, इस मॉडल का उपयोग हाइपोथर्मिक कार्डियोप्रोटेक्शन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें हाइपोथर्मिया के साथ उपयोग के लिए पूरक चिकित्सा के विकास के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (81970265, 81900281,81700288), चाइना पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (2019M651904) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; और चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFC1101001, 2017YFC1308105)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC cell apoptosis detection kit Bio-Technology,China C1062M
Cardiac myocyte growth supplement Sciencell,USA 6252
Caspase 3 activity assay kit Bio-Technology,China C1115
Caspase 8 activity assay kit Bio-Technology,China C1151
DMEM, no glucose Gibco,USA 11966025
Dulbecco's modified eagle medium Gibco,USA 11960044
Fetal bovine serum Gibco,USA 16140071
Flow cytometry CytoFLEX,USA B49007AF
Human myocardial cells BLUEFBIO,China BFN60808678
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 Bio-Technology,China C2006
Penicillin/Streptomycin solution Gibco,USA 10378016
Reactive oxygen species assay kit Bio-Technology,China S0033S
Three-gas incubator Memmert,Germany ICO50
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco,USA 25200056

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