Summary
Продемонстрирована новая методика реконструкции кровотока в гетеротопной модели трансплантации сердца брюшной мыши.
Abstract
Хирургическая техника гетеротопной абдоминальной трансплантации сердца у мышей является стандартной моделью для исследований в области трансплантационной иммунологии. Здесь представлена установленная методика реконструкции модифицированного кровотока в гетеротопической модели абдоминальной трансплантации сердца. Этот метод использует интраторакическую нижнюю полую вену (IIVC) вместо легочной артерии донорского сердца для анастомоза нижней полой вены реципиента. Это облегчает и улучшает показатели успеха при трансплантации брюшного сердца у мышей.
Introduction
Хирургическая методика гетеротопной абдоминальной трансплантации сердца у мышей представляет собой стандартную модель для исследований в области трансплантационной иммунологии1,2,3. Тем не менее, это очень сложно выполнить, и это означает ограничение на широкое использование этой модели4,5.
При традиционной трансплантации сердца мыши (THTx) донорская аорта и брюшная аорта реципиента анастомозируются, в то время как легочная артерия анастомозируется к реципиенту нижней полой вене6,7,8.
В этой модифицированной технике трансплантации сердца мыши донорская аорта анастомозируется к брюшной аорте реципиента, а донор IIVC анастомозируется к реципиенту нижней полой вене(3,4,6) (Рисунок 2 и Рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами директивы 2010/63/EU Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях (одобрено Этическим комитетом, #G1071/09).
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная подготовка, анестезия, послеоперационный уход и мониторинговые работы такие же, как и в традиционных хирургических методах1,2,4. Мыши BALB/c служили донорами сердца, а C57BL/6J — реципиентами трансплантата. Мыши были в возрасте 8-12 недель, весили ~ 30 г при трансплантации и были размещены в стандартных условиях.
1. Подготовительные шаги
- Для анестезии давайте мышам ингаляционный изофлуран (2%) до тех пор, пока они не заснут, с последующими внутрибрюшинными инъекциями кетамина (100 мг/кг) + ксилазина (10 мг/кг) + ацепромазина (2 мг/кг). При послеоперационном обезболивание применяют Метамизол (200 мг/кг) п.о. и Карпрофен (5 мг/кг) с.c..
ПРИМЕЧАНИЕ: Применение антибиотиков было намеренно воздержано, так как эти вещества могут влиять на иммунологические реакции. - Для хирургии используйте набор микроскопических инструментов, включая микрона ножницы, микрощипцы, держатель иглы и микро гемостатические зажимы. Также необходима электрохирургическая ручка. Выполняйте швы с использованием нейлонов типов 7/0er, 10/0er и 4/0er.
- Поместите мышь в коробку для ингаляции изофлурана (2%) в течение 40-60 секунд. Определяют глубину анестезии, сжимая лапу пинцетом. Если наблюдается полное отсутствие реакции на этот раздражитель, переходите к следующему шагу.
- Как только мышь уснет, взвесьте мышь.
- Нанесите внутрибрюшинную инъекцию кетамина (100 мг/кг) + ксилазина (10 мг/кг) + ацепромазина (2 мг/кг) анестезированной мыши.
- Обрежим брюшной мех и положите мышь на операционный стол. Выполните дезинфекцию с использованием повидона йодида 3 раза, затем правильно задрапируйте мышь с помощью фенестрированного хирургического полотенца.
2. Процедура работы донора
- Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу от шеи до нижней части живота и отшелушить весь слой кожи до средней линии обеих подмышечных вмести.
- С помощью ножниц разрезайте мышцы брюшной стенки и осторожно переместите внутренние органы влево (с м. по мнению оператора). Оберните внутренние органы соленой впитанной марлей, чтобы безопасно обнажить нижнюю полую вену.
- Используйте шприц 1 мл для введения 0,4 мл раствора гепарина (содержит 500 ЕД гепарина) медленно в нижнюю полую вену и подождите 1 минуту, прежде чем вытащить иглу.
- Вытащите иглу и используйте микронарезами, чтобы разрезать как нижнюю полую вену, так и брюшную аорту, чтобы ускорить экссангинацию.
- Используйте ножницы, чтобы открыть грудную полость, выполнив U-образный разрез; полностью обнажают сердце, легкие и все грудные кровеносные сосуды.
- Обнажите грудную аорту, отрежьте 1/2 просвета, а затем перережьте легочную вену, чтобы облегчить орошение и дренаж.
- Вводят в отверстие грудной аорты оросительную трубку, вводят не менее 2 мл холодного гистидин-триптофана-кетоглутарата раствора кардиоплегии (раствор Custodiol HTK)9 до тех пор, пока отток легочной вены не будет полностью очищен и сердце полностью перестанет биться.
- Вытащите оросительную трубку и отсоедте грудину.
- Используйте микросульчицы, чтобы удалить тимус и слегка удалить жир вокруг дуги аорты.
- Используйте прямые и изогнутые щипцы для обнажения и перевязания ствола легочной артерии (с правой стороны дуги аорты) швом 10/0.
- Используйте микрощипцы для отделения жира и соединительной ткани, прикрепленной к IIVC, обнажите и обложите верхнюю полую вену (на левой стороне дуги аорты) швом 7/0 и используйте микроножницы, чтобы разрезать ее за лигированием.
- Сделайте шов 7/0 вокруг основания сердца под дугой аорты, IIVC и обеими ушными раковинами. Затем перевязывают ветви легочной артерии и венозные сосуды легких.
- Используйте микроножницы для трансектирования дуги аорты как можно более дистально, легочных сосудов под лигатурой и IIVC возле диафрагмы. Удалите сердце из грудной клетки.
- Поместите сердце эксплантированного донора в холодный раствор HTK для кардиоплегии HTK при температуре 4 °C и временно сохраните.
3. Порядок работы получателя
ПРИМЕЧАНИЕ: Начальные этапы операции аналогичны тем, которые были показаны ранее для мыши-донора, включая анестезию и дезинфекцию.
- Выполнить порез кожи живота поперечно, накрыть органы брюшной полости влажной марлей с использованием физиологического раствора.
- Используйте микрощипцы, чтобы обнажить нижнюю полую вену и брюшную аорту и освободить их от окружающей жировой ткани.
- Используйте микрощипцы для лигирования или электрокаутеризации боковых ветвей сосудов (боковых или под веной /аортой) ниже почечных сосудов.
- Используйте щипцы-зажимы-аппликаторы для размещения двух микрохемостатических зажимов в брюшной части вены/аорты, идущих справа, оставляя расстояние более 1 см для обеих аорты/вен, чтобы обеспечить пространство для построения анастомоза между ними.
- Используйте микроножницы, чтобы сделать разрез в аорте немного ближе к нижнему зажиму, чем к верхнему зажиму. В качестве альтернативы, используйте иглу 30 G, чтобы сделать небольшое отверстие и открыть его микроножницами.
- Расположите мышь-получателя так, чтобы аорта была обращена к оператору с полой веной на другой стороне. Затем поместите сердце в брюшную полость и накройте его небольшой мокрой марлевой подушечкой.
- Используйте шов 10/0 для адаптации и сшивания донорской аорты к аорте реципиента, начинающейся каудально, сделайте узел и продолжайте бегущим швом к верхней части разреза (около 4-5 швов). Затем переверните сердце вправо (с зрения субъекта), снова накройте его и продолжайте шов с левой стороны до достижения каудального конца и завязывайте его.
- Используйте оросительную трубку для инъекции не менее 0,5 мл раствора кардиоплегии HTK 4 °C для промывки IIVC донора.
- С помощью микронарезами вырезать круглое отверстие на брюшной нижней полой вене реципиента, которое должно иметь тот же размер донорского просвета IIVC. Разрез должен располагаться над анастомотическим отверстием аорты. Сделайте разрез вен больше, чем разрез аорты.
- Используйте шов 10/0, чтобы пришить донора IIVC к полой вене реципиента, начиная с каудально. Завяжите узел и выполните бегущий шов до тех пор, пока не будет достигнута верхняя часть разреза. Наложим пять швов и продолжим шов слева. Наконец, завяжите узел в хвостовом углу, и осторожно затяните (будьте осторожны, чтобы не тянуть слишком туго).
- Поместите небольшие части гемостатической губки вокруг вен и анастомозов аорты.
- Используйте щипцы-зажимы аппликатора, чтобы удалить сначала нижние, а затем верхние микро-гемостатические зажимы и промыть брюшную полость 38,0 ° C закаленным 0,9% хлоридом натрия.
- Используйте микрощипцы, чтобы убрать гемостатическую губку.
- Наблюдайте за сердцебиением пересаженное сердце.
- Используйте щипцы, чтобы вернуть кишечник обратно в брюшную полость, и двухслойные швы (мышцы живота, за которыми следует кожа), чтобы закрыть брюшную рану швом 4/0.
- Поместите мышей в камеру рабочей станции контроля кислорода и температуры (например, INVIVO2-400), чтобы обеспечить теплую и богатую кислородом среду для восстановления пересаженного мышей, подождите, пока мыши проснутся.
- Для послеоперационного обезболивания непосредственно введите Метамизол 200 мг/кг в секунду после операции. Через четыре и 16 часов после операции дают Метамизол 200 мг/кг на ОС+ Карпрофен (5 мг/кг) с.c. При дальнейшем последующем следовании вдавайте карпрофен (5 мг/кг) с.c трансплантированных мышам каждые 24 часа в течение трех последовательных дней после операции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь представлена модифицированная методика гетеротопной абдоминальной трансплантации сердца у мышей, которая была ранее разработана в нашей лаборатории и доказала свою полезность в течение последних 16 лет. Ранее сообщалось, что в общей сложности в 40 случаях анастомоза полой вены к полой вене (группа V-V) по сравнению с 40 случаями традиционной процедуры анастомоза легочной артерии к полой вене (группа P-V)4 (таблица 1)анастомоз сосудов занял 20,8±1,3 мин в группе V-V, что было значительно короче, чем в группе P-V (27,5±1,3 мин, p<0,01). Время теплой ишемии, общее время работы реципиента и послеоперационное время повторения сердца, которые составляли 25,5±1,2 мин, 42,0±1,5 мин и 1,1±0,2 мин соответственно, также были значительно сокращены, чем наблюдалось в традиционной группе P-V (все p<0,05)(рисунок 1). Несмотря на то, что в этой модели10, 11нет различий в долгосрочных показателях выживаемости, модифицированная техника облегчила трансплантацию брюшного сердца у мышей, что привело как к уменьшению теплой ишемии, так и к времени перебивания сердца.
Что касается этих ранее опубликованных данных и нашего опыта работы с этой моделью в течение последних 16 лет, мы рекомендуем, чтобы ключевые шаги по эксплуатации заняли ограниченное количество времени, чтобы обеспечить показатель успеха >90%4. Поэтому оптимальные результаты достигаются, если сбор донорского сердца занимает не более 60 мин, время холодной ишемии должно быть ограничено максимум 40 минами, а построение анастомоза IIVC не должно занимать дольше 15 мин, так как это напрямую связано с уменьшением времени теплой ишемии.
Рисунок 1. Сравнение времени процедуры между двумя методами работы (n = 40 каждый, среднее значение + SE) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Препарат донорского сердца с использованием традиционной (a, вверху слева) и модифицированной (b, нижний левый) модели трансплантации сердца мыши. На фотографиях на панелях a и b изображены аорта (A), легочная артерия (PA), правое предсердие (RA), левое предсердие (LA) и внутриторакального нижнего полого вены (IIVC) донорского сердца. Обратите внимание на разницу в длине судна PA по сравнению с IIVC. Панель c показывает реципиентный situs, подготовленный для гетеротопического абдоминального HTX. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Сосудистый анастомоз модифицированной модели: аорта (А), внутриторакальная нижняя полая вена (IIVC), брюшная нижняя полая вена (aivc), брюшная аорта (aa). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Демонстрация длины сосудов для легочной артерии (ПА) и внутриторакального нижнего полого вена (IIVC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Физиологическая форма трубы на конце внутриторакального нижнего полого вена. Аорта (А), внутриторакально нижняя полая вена (IIVC), правое предсердие (РА), левое предсердие (ЛА). Левая красная двойная стрелка слева выделяет диаметр, а красный круг справа - структуру формы трубы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Vena cava to vena cava (новый метод) | От легочной А до полой вены (традиционный метод) | |
| Закупки доноров (мин) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| Операция получателя (мин.) | 42.0 + 1.5 | 48,6 + 1,4** |
| Анастомоз сосудов (мин) | 20.8 + 1.3 | 27,5 + 1,3** |
| Холодная ишемия (мин) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| Теплая ишемия (мин) | 25.5 + 1.2 | 32,6 + 1,3** |
| Rebeat после операции (мин) | 1.1 + 0.2 | 2,1 + 0,4* |
| Процент успеха | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0.05 | ||
| **P < 0,01. |
Таблица 1. Сравнение временных распределений и начальных результатов в двух операциях (n - 40, среднее + SE)
Перепечатано из Wu, K., Zhang, J., Fu, J., Wu, S., Philipp, T., Uwe, H., Kribben, A. and Witzke, O. Новая техника реконструкции кровотока в модели трансплантации сердца мыши. микрохирургия. 26, 594-598 (2006).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хирургическая техника гетеротопной трансплантации брюшного сердца у мышей очень сложна, и это означает ограничение широкого использования этой модели.
Одним из недостатков обычной методики является предельная длина легочной артерии (ПА) донора. Обычно он составляет около 2 мм длины, тогда как длина IIVC донорского сердца, используемого в нашей модели, обычно составляет около 1 см(рисунок 2). Это означает, что в модифицированной модели анастомоз IIVC предлагает более четкое представление об операции situs, что позволяет улучшить хирургию анастомозов и предотвратить нежелательное развитие слишком строгих швов или даже повреждение поражений сосудов(рисунок 4). Как конструкция ПА, так и анастомоз IIVC являются сложными даже для опытных операторов. ПА очень тонкий и тонкостенный, а IIVC еще тоньше и потенциально более хрупкий у мышей. Поэтому операторы должны знать об этом ограничении и должны проявлять осторожность при накладывания швов IIVC. Однако на этом этапе важно подчеркнуть, что, хотя стенка сосуда IIVC очень тонкая, она имеет большое преимущество в том, что длина сосуда не связана с напряжением соединения кровеносного сосуда, тем самым делая нанесение точного шва более легким и менее склонным к повреждению. Поскольку осторожное и безопасное наложение швов сосуда очень важно для успешного исхода операции, рекомендуется увеличение ситуса от 10 до 20 раз.
Кроме того, окончание грудного сегмента IIVC образует типичную трубчатую структуру(рисунок 5). Его больший диаметр отверстия представляет собой одну из важных и благотворных причин, почему можно выбрать IIVC. Его применение облегчает применение достаточного анастомоза. Это снижает как сложность операции, так и время работы.
Возможное событие, которое может поставить под угрозу результат процедуры трансплантации, представляет собой тромбоз анастомоза сосуда, часто способствующего стенозу. Хотя в нашей модели длина сосуда действительно увеличивается специально, это не было связано с образованием тромбов. Трубчатый анастомоз IIVC также может оказывать положительный эффект, значительно уменьшая возникновение анастомотического стеноза. Поэтому для этой процедуры посттрансплантационная гепаринизация не нужна.
Предыдущий анализ метода анастомоза IVC-aivc выявил ряд преимуществ и улучшений по сравнению с обычной методикой10. По отношению к этим результатам и с ретроспективной точки зрения нашего многолетнего опыта4,10,12,13,эта методика приводит как к уменьшению теплой ишемии, так и к времени перебития привитого сердца. Несмотря на то, что для этой модели10нет различий в долгосрочных показателях выживаемости, модифицированная методика, представленная здесь, облегчает реконструкцию аностомотического сосуда, тем самым уменьшая сложность трансплантации брюшного сердца у мышей. Таким образом, обучение и применение этой модели может улучшить доступность и широкое применение абдоминальной трансплантации сердца у мышей для иммунологических, а также кардиологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
никакой.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Юнь Сюй за ее помощь в качестве актера озвучивания, д-ра мед. Цзяньхуа Пэна за ее помощь в редактировании видео и доктора Анники Кукхан за ее комментарии и поддержку. Эта работа была частично поддержана Немецким исследовательским фондом (DFG) для содействия международному сотрудничеству (HO2581/4-1 to AH) и Национальным научным фондом Китая (NSFC; #81760291 FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
- Corry, R., Winn, H., Russell, P. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26, 223-228 (2013).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
- Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423 (2014).
- Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
- Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
- Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
- Türk, T. R., et al. Reduction of chronic graft injury with a new HTK-based preservation solution in a murine heart transplantation model. Cryobiology. 64 (3), 273-278 (2012).
