Summary
Uma nova técnica para reconstrução do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração de camundongo heterotópico é demonstrada.
Abstract
A técnica cirúrgica de transplante de coração abdominal heterotópico em camundongos é um modelo padrão para pesquisa em imunologia de transplante. Aqui, é apresentada a técnica estabelecida para uma reconstrução modificada do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico. Este método utiliza a veia cava intratorácica inferior (IIVC) em vez da artéria pulmonar do coração doador para a anastomose para a cava vena inferior do receptor. Está facilitando e melhorando as taxas de sucesso para transplante de coração abdominal em camundongos.
Introduction
A técnica cirúrgica de transplante de coração abdominal heterotópico em camundongos representa um modelo padrão para pesquisa em imunologia de transplante1,2,3. No entanto, é muito desafiador realizar e isso implica uma restrição ao uso generalizado deste modelo4,5.
No transplante tradicional de coração de camundongo (THTx), a aorta doadora e a aorta abdominal receptora são anastomosas enquanto a artéria pulmonar é anastomosada para o receptor inferior vena cava6,7,8.
Nesta técnica modificada de transplante de coração de camundongo, a aorta doadora é anastomosada ao receptor abdominal aorta e o doador IIVC é anastomosado ao receptor vena cava inferior(3,4,6) ( Figura2 e Figura 3).
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo as diretrizes da diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre proteção de animais usados para fins científicos (Comitê de Ética aprovado, #G1071/09).
NOTA: O trabalho de preparação preliminar, anestesia, assistência pós-operatória e monitoramento são os mesmos realizados nos métodos cirúrgicos tradicionais1,2,4. Os camundongos BALB/c serviram como doadores cardíacos e C57BL/6J como receptores de transplante. Os camundongos tinham idade entre 8 e 12 semanas, pesavam~30 g no transplante e estavam alojados em condições padrão.
1. Etapas preparatórias
- Para anestesia, dê isoflurane inalador de camundongos (2%) até dormirem, seguidos de injeções intraperitoneais de cetamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg). Para analgesia pós-operatória, aplique Metamizol (200 mg/kg) p.o. e Carprofen (5 mg/kg) s.c..
NOTA: A aplicação de antibióticos foi abstendo-se de propósito, pois essas substâncias podem influenciar as respostas imunológicas. - Para cirurgia, use um conjunto de instrumentos microscópicos, incluindo uma micro-tesoura, micro-fórceps, um suporte de agulha e grampos micro hemostáticos. Uma caneta eletrocirúrgica também é necessária. Realize suturas usando tipos de nylon 7/0er, 10/0er e 4/0er.
- Coloque o mouse em uma caixa para inalação de isoflurane (2%) por 40-60 segundos. Determine a profundidade da anestesia apertando a pata com pinças. Se houver uma completa falta de resposta para este estímulo, vá para o próximo passo.
- Uma vez que o rato tenha adormecido, pese o rato.
- Aplique uma injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg) no rato anestesiado.
- Corte a pele abdominal e coloque o rato na mesa de operação. Realize a desinfecção usando iodeto povidone por 3 vezes, em seguida, drape adequadamente o rato usando uma toalha cirúrgica fenestrated.
2. Procedimento de operação do doador
- Use uma tesoura para cortar a pele do pescoço até o abdômen inferior, e retire toda a camada da pele até a linha média de ambas as axilares.
- Use uma tesoura para cortar os músculos da parede abdominal e mover suavemente as vísceras para a esquerda (da visão do operador). Enrole as vísceras com uma gaze salina imbibed para expor com segurança a cava vena inferior.
- Use uma seringa de 1 mL para injetar 0,4 mL da solução de heparina (contém heparina U de 500 U) lentamente na cava vena inferior e espere 1 minuto antes de puxar a agulha.
- Puxe a agulha e use uma micro-tesoura para cortar tanto a veia cava inferior quanto a aorta abdominal para acelerar a exsanguinação.
- Use uma tesoura para abrir a cavidade torácica realizando um corte em forma de u; expor completamente o coração, pulmões e todos os vasos sanguíneos do tórax.
- Expor a aorta torácica, cortar 1/2 do lúmen e, em seguida, cortar a veia pulmonar para facilitar a irrigação e a drenagem.
- Insira um tubo de irrigação na abertura da aorta torácica, injete pelo menos 2 mL de 4 °C frio histidine-triptofano-cetoglutarate solução cardioplegia (solução HTK custodiol)9 até que o fluxo de veia pulmonar esteja completamente claro e o coração pare completamente de bater.
- Retire o tubo de irrigação e desprende o esterno.
- Use micro tesoura para remover o timo e para tirar ligeiramente a gordura ao redor do arco aórtico.
- Use fórceps retos e curvas para expor e ligar o tronco da arteria pulmonalis (no lado direito do arco aórtico) com uma sutura 10/0.
- Use micro fórceps para separar a gordura e o tecido conjuntivo ligado ao IIVC, expor e ligar a veia cava superior (no lado esquerdo do arco aórtico) com uma sutura 7/0 e usar micro tesouras para cortá-la atrás da ligadura.
- Faça uma sutura 7/0 ao redor da base do coração sob o arco aórtico, o IIVC, e ambos os aurículos. Em seguida, liga os ramos da artéria pulmonar e vasos pulmonares venosos.
- Use micro tesouras para transectar o arco aórtico o mais distal possível, os vasos pulmonares sob a ligadura e o IIVC perto do diafragma. Tire o coração do peito.
- Coloque o coração do doador explantado em uma solução de cardioplegia HTK fria de 4 °C e preserve temporariamente.
3. Procedimento de operação do destinatário
NOTA: As etapas iniciais de operação são semelhantes às mostradas anteriormente para o rato doador, incluindo anestesia e desinfecção.
- Realize o corte da pele abdominal de forma transversal, cubra os órgãos abdominais com uma gaze molhada usando solução salina.
- Use micro fórceps para expor a veia cava inferior e a aorta abdominal e libertá-los do tecido adiposo circundante.
- Use micro fórceps para ligadurar ou eletrocauterizar vasos laterais (laterais ou sob a veia/aorta) abaixo dos vasos renais.
- Use fórceps aplicadores de clipe para posicionar dois grampos micro hemostáticos na parte abdominal da veia/aorta provenientes da direita deixando mais de 1 cm de distância para a aorta/veia para garantir espaço para a construção da anastomose entre eles.
- Use micro tesoura para fazer uma incisão na aorta um pouco mais perto do grampo inferior do que do grampo superior. Alternativamente, use uma agulha de 30 G para fazer um pequeno furo e abra-a com micro tesoura.
- Posicione o mouse receptor para que a aorta esteja voltada para o operador com a veia cava do outro lado. Em seguida, coloque o coração na cavidade abdominal e cubra-o com uma pequena almofada de gaze molhada.
- Use uma sutura 10/0 para adaptar e costurar a aorta do doador na aorta receptora começando caudally, fazer um nó e proceder com uma sutura correndo até o topo da incisão (cerca de 4-5 pontos). Em seguida, vire o coração para a direita (do ponto de vista do sujeito), cubra-o novamente e continue a sutura no lado esquerdo até chegar ao final caudal e nó-lo.
- Use um tubo de irrigação para injetar pelo menos 0,5 mL de solução de cardioplegia HTK de 4 °C para lavar o IIVC do doador.
- Use micro-tesoura para cortar um orifício redondo na veia cava inferior abdominal do receptor, que deve ter o mesmo tamanho do lúmen IIVC dos doadores. A incisão deve estar localizada acima da abertura anastomótica aórtica. Faça a incisão da veia maior que a incisão aórtica.
- Use uma sutura 10/0 para costurar o doador IIVC para o receptor vena cava começando caudally. Amarre um nó e realize uma sutura de corrida até que o topo da incisão seja atingido. Use cinco pontos e continue a sutura à esquerda. Por fim, amarre um nó no canto da cauda e aperte cuidadosamente (tenha cuidado para não puxar muito apertado).
- Coloque as pequenas partes da esponja hemostática ao redor da veia e anastomoses aórticos.
- Use fórceps aplicadores de clipe para remover primeiro os grampos micro-hemostáticos superiores e enxaguar a cavidade abdominal com 38,0°C temperado 0,9% cloreto de sódio.
- Use micro fórceps para tirar a esponja hemostática.
- Observe os batimentos cardíacos do coração transplantado.
- Use fórceps para colocar os intestinos de volta na cavidade abdominal e suturas de duas camadas (músculos abdominais seguidos pela pele) para fechar a ferida abdominal com uma sutura 4/0.
- Coloque os ratos em uma câmara de estação de trabalho de controle de oxigênio e temperatura (por exemplo, INVIVO2-400) para fornecer um ambiente quente e rico em oxigênio para os ratos transplantados se recuperarem, esperar que os ratos acordem.
- Para analgesia pós-operatória, dê diretamente metamizol 200 mg/kg por sistema operacional após a operação. Quatro e 16 horas após a operação dão metamizol 200 mg/kg por os+ Carprofen (5mg/kg) s.c. No acompanhamento posterior, dê Carprofen (5 mg/kg) s.c aos camundongos transplantados a cada 24 horas por três dias consecutivos após a operação.
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Representative Results
Aqui, é apresentada uma técnica modificada de transplante de coração abdominal heterotópico em camundongos que já foi desenvolvido anteriormente em nosso laboratório e que se mostrou útil nos últimos 16 anos. Anteriormente, foi relatado que no total 40 casos de vena cava para veia cava (grupo V-V) em comparação com 40 casos da artéria pulmonar tradicional para vena cava (grupo P-V) procedimento de anastomose4 (Tabela 1) o vaso anastomose levou 20,8±1,3 min no grupo V-V, que foi significativamente menor do que no grupo P-V (27,5±1,3 min, p<0,01). O tempo de isquemia quente, o tempo total de operação do receptor e o tempo de repetição do coração pós-operatório, que foram 25,5±1,2 min, 42,0±1,5min e 1,1±0,2 min, respectivamente, também foram significativamente encurtados do que o observado no tradicional grupo P-V (todos<0,05) (Figura 1). Embora não haja diferenças para as taxas de sobrevivência de longa data neste modelo10,11, a técnica modificada facilitou o transplante abdominal de coração em camundongos, resultando tanto em uma isquemia quente reduzida quanto em tempo de requesteria cardíaca enxertado.
Com relação a esses dados publicados anteriormente e à nossa experiência com este modelo nos últimos 16 anos, recomendamos que as principais etapas de operação devem levar um tempo limitado para garantir uma taxa de sucesso de >90%4. Portanto, os resultados ideais são alcançados se a colheita do coração doador não demorar mais do que 60 minutos, o tempo de isquemia fria deve ser limitado a 40 minutos no máximo, e a construção da anastomose IIVC não deve demorar mais do que 15 minutos, pois isso está diretamente associado a um tempo reduzido de isquemia quente.
Figura 1. Comparação dos tempos de procedimento entre as duas técnicas de operação (n =40 cada, média + SE) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Preparação cardíaca doadora utilizando o modelo tradicional (a, superior esquerdo) e o modelo modificado (b, inferior esquerdo) de transplante de coração de rato. As fotografias nos painéis a e b retratam a aorta (A), a artéria pulmonar (PA), o átrio direito (RA), o átrio esquerdo (LA) e a veia cava inferior intratorácica (IIVC) do coração doador. Observe a diferença no comprimento do vaso do PA em relação ao IIVC. O painel c mostra o situs receptor preparado para o HTX abdominal heterotópico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Anastomose vascular do modelo modificado: aorta (A), veia cava inferior intratorácica (IIVC), veia cava inferior abdominal (aivc), aorta abdominal (aa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Demonstração do comprimento do vaso para a artéria pulmonar (PA) e a veia cava inferior intratorácica (IIVC). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Forma fisiológica de trompete no final da veia cava inferior intratorácica. Aorta (A), veia cava inferior intratorácica (IIVC), átrio direito (RA), átrio esquerdo (LA). A seta dupla vermelha esquerda à esquerda destaca o diâmetro e o círculo vermelho à direita a estrutura da forma de trompete. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Vena cava para vena cava (novo método) | Pulmonar A para vena cava (método tradicional) | |
| Aquisição de doadores (min) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| Operação do destinatário (min) | 42.0 + 1.5 | 48,6 + 1,4** |
| Anastomose do navio (min) | 20.8 + 1.3 | 27,5 + 1,3** |
| Isquemia fria (min) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| Isquemia quente (min) | 25.5 + 1.2 | 32,6 + 1,3** |
| Rebeat pós-operatório (min) | 1.1 + 0.2 | 2.1 + 0.4* |
| Taxa de sucesso | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0.05 | ||
| **P < 0,01. |
Mesa 1. Comparação de Distribuições de Tempo e Resultados Iniciais em Duas Operações (n - 40, média + SE)
Reimpresso de Wu, K., Zhang, J., Fu, J., Wu, S., Philipp, T., Uwe, H., Kribben, A. e Witzke, técnica O. Novel para reconstrução de circuito sanguíneo no modelo de transplante de coração de rato. Microcirurgia. 26, 594-598 (2006).
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Discussion
A técnica cirúrgica do transplante de coração abdominal heterotópico em camundongos é muito desafiadora e isso implica uma restrição ao uso generalizado deste modelo.
Uma das desvantagens da técnica convencional é o comprimento limitante da artéria pulmonar do doador (PA). É geralmente de cerca de 2 mm de comprimento, enquanto o comprimento do IIVC do coração doador usado em nosso modelo é geralmente de cerca de 1 cm (Figura 2). Isso significa que, no modelo modificado, a anastomose IIVC oferece uma visão mais clara do situs de operação, possibilitando uma melhor cirurgia de anastomoses e prevenindo o desenvolvimento indesejado de suturas muito rigorosas ou mesmo lesões prejudiciais dos vasos(Figura 4). Tanto a construção do PA quanto a anastomose IIVC são desafiadoras até mesmo para operadores experientes. O PA é muito delicado e de paredes finas e o IIVC é ainda mais fino e potencialmente mais frágil em camundongos. Portanto, os operadores precisam estar atentos a essa restrição e devem aplicar cautela ao suturar o IIVC. No entanto, neste ponto é importante ressaltar que, embora a parede do vaso IIVC seja muito fina, tem a grande vantagem de que o comprimento do vaso não está associado à tensão à conexão dos vasos sanguíneos, tornando assim a aplicação de uma sutura precisa mais fácil e menos propensa a um dano. Uma vez que a aplicação cautelosa e segura das suturas do navio são muito críticas para um resultado de operação bem-sucedido, recomenda-se uma ampliação do situs de 10 a 20 vezes.
Além disso, o final do segmento torácico do IIVC forma uma estrutura típica em forma de trompete(Figura 5). Seu diâmetro de abertura maior representa uma das razões importantes e benéficas pelas quais o IIVC pode ser escolhido. Seu uso facilita a aplicação de uma anastomose suficiente. Isso reduz tanto a dificuldade da operação quanto o tempo de operação.
Um possível evento que pode comprometer o resultado do procedimento de transplante representa uma trombose da anastomose do vaso, muitas vezes promovida por uma estenose. Embora em nosso modelo o comprimento da embarcação aumente de propósito, isso não foi associado à formação de trombos. A anstomose em forma de trombeta do IIVC também pode exercer um efeito positivo, reduzindo consideravelmente a ocorrência de uma estenose anastomótica. Portanto, para este procedimento não é necessária uma heparinização pós-transplant.
Uma análise prévia do método de anastomose IVC-aivc revelou diversas vantagens e melhorias quando comparadas com a técnica convencional10. Com relação a esses resultados e do ponto de vista retrospectivo de nossa experiência de longa data4,10,12,13, esta técnica resulta tanto em uma isquemia quente reduzida quanto em tempo de rebeating do coração enxertado. Embora não haja diferenças para as taxas de sobrevivência de longa data para este modelo10,a técnica modificada aqui apresentada está facilitando a reconstrução do vaso anostomótico, reduzindo assim a dificuldade de transplante abdominal de coração em camundongos. O treinamento e a aplicação deste modelo podem, portanto, melhorar a acessibilidade e a aplicação generalizada do transplante abdominal de coração em camundongos para fins imunológicos e de pesquisa cardíaca.
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Disclosures
nenhum.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Yun Xu por sua ajuda como dublador, Dr. Med. Jianhua Peng por sua ajuda na edição de vídeo e Dr. Annika Kuckhahn por seus comentários e apoio. Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) para promover colaborações internacionais (HO2581/4-1 para AH), e pela Fundação Nacional de Ciência da China (NSFC; #81760291 à FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
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