Summary
演示了异位小鼠心脏移植模型中血液回路重建的新技术。
Abstract
小鼠异位性腹部心脏移植手术技术是移植免疫学研究的标准模型。在这里，介绍了异位性腹部心脏移植模型中经过修饰的血液回路重建的既定技术。这种方法使用胸内低静脉卡瓦（IIVC），而不是供体心脏的肺动脉，用于接受者低等静脉卡瓦的解剖。它促进和提高小鼠腹部心脏移植的成功率。
Introduction
小鼠异位性腹部心脏移植手术技术是移植免疫学1、2、3研究的标准模型。然而，这是非常具有挑战性的执行，这涉及到限制广泛使用这种模型4，5。
在传统的小鼠心脏移植（THTx）中，供体主动脉和接受者腹部主动脉为肛门，而肺动脉为接受者低维纳卡瓦6、7、8。
在这种修改后小鼠心脏移植技术中，供体主动脉与接受者腹部主动脉分离，供体IIVC与接受者低劣的静脉卡瓦（3、4、6）（图2和图3）有关。
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Protocol
所有动物实验都是按照欧洲议会2010/63/欧盟关于保护用于科学目的的动物的指令（伦理委员会批准，#G1071/09）的指导方针进行的。
注：初步准备、麻醉、术后护理和监测工作与传统手术方法1、2、4相同。BALB/c 小鼠充当心脏捐献者，C57BL/6J 担任移植接受者。小鼠的年龄为8-12周，移植时体重约30克，在标准条件下被安置。
1. 准备步骤
- 对于麻醉，给小鼠吸入异氟烷 （2%）直到他们入睡，然后进行氯胺酮（100毫克/千克）+西拉津（10毫克/千克）+丙丙酮（2毫克/千克）的腹膜注射。对于术后镇痛，应用甲基佐尔（200毫克/千克）和卡洛芬（5毫克/千克）.c。
注：抗生素的应用是故意放弃的，因为这些物质可能会影响免疫反应。 - 手术时，使用一组微观仪器，包括微剪刀、微钳、针架和微止血夹。电外科笔也是必要的。使用 7/0er、10/0er 和 4/0er 尼龙类型执行缝合。
- 将鼠标放在一个盒子中，用于异氟素吸入 （2%）40-60秒用钳子挤压爪子，确定麻醉的深度。如果完全没有对这种刺激措施作出反应，就进入下一步。
- 老鼠一睡着，就称鼠标。
- 在麻醉小鼠身上注射氯胺酮（100毫克/千克）+xylazine（10毫克/千克）+乙丙氨酸（2毫克/千克）。
- 夹住腹部毛皮，将鼠标放在手术台上。使用碘化物进行消毒3次，然后使用受费的手术毛巾正确地将小鼠披上。
2. 捐赠人操作程序
- 使用剪刀将皮肤从颈部切到下腹部，并将皮肤的整个层剥落到两个轴线的中线。
- 使用剪刀切割腹部壁的肌肉，并轻轻地将内脏移到左侧（从操作员的角度）。用盐水吸收纱布包裹内脏，安全地暴露劣质的维纳卡瓦。
- 使用 1 mL 注射器将肝素溶液的 0.4 mL（包含 500 U 肝素）缓慢地注入下静脉卡瓦，等待 1 分钟后再拔出针头。
- 拔出针头，用微剪刀切割劣质静脉卡瓦和腹部主动脉，加速脱血。
- 使用剪刀通过执行 U 形切口打开胸腔;完全暴露心脏，肺和所有的胸部血管。
- 露出胸动脉，切开1/2的流明，然后切肺静脉，以方便灌溉和排水。
- 将灌溉管插入胸动脉开口，注射至少 2 mL 的 4 °C 冷组织丁 - 色氨酸 - 酮细胞性心肌梗塞溶液 （Custodiol HTK 溶液）9， 直到肺静脉流出完全清晰，心脏完全停止跳动。
- 拔出灌溉管，分离胸骨。
- 使用微型剪刀去除胸腺，并稍微剥去主动脉拱周围的脂肪。
- 使用直和弯曲的钳子用10/0的缝合线暴露和盖上动脉脉冲的躯干（在主动脉拱的右侧）。
- 使用微钳分离附着在 IIVC 上的脂肪和结缔组织，用 7/0 缝合将上部静脉卡瓦（在主动脉的左侧）暴露并盖上，并用微型剪刀将其切成结条。
- 在主动脉拱门、IIVC 和两个动脉下面的心脏底部缝一条 7/0 的缝合线。然后利口肺动脉分支和静脉肺血管。
- 使用微剪刀尽可能解剖主动脉拱门、连结下方的肺血管和隔膜附近的IIVC。把心脏从胸口取出。
- 将外植捐赠者的心脏放入 4 °C 冷 HTK 心胸溶液中，并暂时保存。
3. 收件人操作程序
注：初始操作步骤与之前显示的供体小鼠类似，包括麻醉和消毒。
- 以横向方式进行腹部皮肤切割，使用盐水溶液用湿纱布覆盖腹部器官。
- 使用微钳暴露劣质静脉卡瓦和腹部主动脉，并释放他们从周围的脂肪组织。
- 使用微钳在肾血管下方（侧向或静脉/主动脉下）上盖或电化侧分支容器。
- 使用夹式施用钳子将两个微止血夹子放置在静脉/主动脉的腹部部分，从右侧向主动脉/静脉留下超过 1 厘米的距离，以确保它们之间形成解剖学的空间。
- 使用微型剪刀将切口切入主动脉，比上夹子更接近下夹。或者，使用 30 G 针做一个小孔，并用微型剪刀打开。
- 定位接收鼠标，使主动脉面向操作员，另一侧有静脉卡瓦。然后将心脏放入腹腔，用一个小湿纱布垫盖住它。
- 使用 10/0 缝合来调整和缝合接受者主动脉开始，打个结，然后进行运行缝合到切口的顶部（约 4-5 针）。接下来，将心脏翻转到右侧（从受试者的角度来看），再次盖住它，并继续在左侧的缝合，直到达到结尾并打结。
- 使用灌溉管注入至少 0.5 mL 的 4 °C HTK 心胸溶液，以冲洗捐赠者的 IIVC。
- 使用微剪刀在接受者的腹部劣质静脉卡瓦上切一个圆孔，该洞应具有与捐赠者IIVC流明相同的大小。切口应位于主动脉解剖开口上方。使静脉切口大于主动脉切口。
- 使用 10/0 缝合缝合缝供体 IIVC 到接受者静脉卡瓦开始。打个结，执行运行缝合，直到切口的顶部达到。使用五针，继续左侧的缝合。最后，在尾角打个结，小心紧绷（小心不要拉得太紧）。
- 将止血海绵的小部分放在静脉和主动脉解剖周围。
- 使用夹式施用钳子先去除下部，然后去除上部微止血夹，然后用 38.0°C 的钢化 0.9% 氯化钠冲洗腹腔。
- 使用微钳带走止血海绵。
- 观察移植心脏的心跳。
- 使用钳子将肠子放回腹腔和两层缝合（腹部肌肉，其次是皮肤），用4/0的缝合关闭腹部伤口。
- 将小鼠放入氧气和温度控制工作站室（如 INVIVO2-400），为移植的小鼠提供温暖富氧的环境，等待小鼠醒来。
- 对于术后镇痛，手术后直接给甲基佐尔200毫克/千克。手术后4小时和16小时给甲基佐尔200毫克/千克每os+卡洛芬（5毫克/千克）s.c。在进一步的随访中，在手术后连续三天每24小时给移植的小鼠一次.c（5毫克/千克）的卡洛芬（5毫克/千克）。
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Representative Results
在这里，介绍了一种经过改进的小鼠异位腹部心脏移植技术，该技术以前在我们的实验室中已经开发出来，并且在过去16年中被证明是有用的。此前，据报道，在总共40例静脉卡瓦到静脉卡瓦（V-V组）相比，40例传统肺动脉静脉卡瓦（P-V组）解剖程序4（表1），船舶解剖病在V-V组服用20.8±1.3分钟， 明显低于P-V组（27.5±1.3分钟，第0.01页<）。暖缺血时间、总接受者手术时间和术后心脏重复时间分别为25.5±1.2分钟、42.0±1.5分钟和1.1±0.2分钟，也明显缩短了传统P-V组（全部p<0.05）（图1）。 尽管这种模型10、11的长期存活率没有差异，但这种修改后的技术促进了小鼠腹部心脏移植，从而减少了温暖的缺血和移植的心脏跳动时间。
关于这些先前公布的数据，以及我们在过去16年中使用该模型的经验，我们建议关键操作步骤应花费有限时间，以确保成功率>90%4。因此，如果采集供体心脏的时间不超过60分钟，则达到最佳效果，冷缺血时间应限制在最大40分钟，IIVC解剖的构建不应超过15分钟，因为这与减少的温暖缺血时间直接相关。
图1。两种操作技术之间的程序时间比较（每个操作技术 =40，均值 + SE），请单击此处查看此图的较大版本。
图2。捐赠心脏准备采用传统（a、左上）和修改后的（b、左下）小鼠心脏移植模式。 面板 a 和 b 中的照片描绘了主动脉 （A）、肺动脉 （PA）、右中庭 （RA）、左中庭 （LA） 和供体心脏的触角内低温静脉卡瓦 （IIVC）。请注意 PA 与 IIVC 的船长差异。面板 c 显示为异位腹部 HTX 准备的接收器坐席。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。改性模型的血管解剖： 主动脉（A）、胸内劣维纳卡瓦（IIVC）、腹部劣质静脉瘤（aivc）、腹部主动脉（aa）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4。肺动脉 （PA） 和心内劣质静脉卡瓦 （IIVC） 的血管长度演示。请单击此处查看此图的较大版本。
图5。生理喇叭形状在触角内劣质静脉卡瓦的末端。 主动脉 （A）， 触角内劣质静脉卡瓦 （IIVC）， 右中庭 （RA）， 左中庭 （LA）.左边的左红色双箭头突出显示直径，右侧的红色圆圈突出喇叭形状的结构。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 维纳卡瓦到维纳卡瓦（新方法） | 肺A到静脉卡瓦（传统方法） | |
| 捐助者采购（最小） | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| 收件人操作（最小） | 42.0 + 1.5 | 48.6 + 1.4** |
| 血管解剖（分钟） | 20.8 + 1.3 | 27.5 + 1.3** |
| 冷缺血症（分钟） | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| 温暖的缺血症（分钟） | 25.5 + 1.2 | 32.6 + 1.3** |
| 重新击败术后（分钟） | 1.1 + 0.2 | 2.1+0.4* |
| 成功率 | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0.05 | ||
| **P < 0.01。 |
表1。两个操作中的时间分布和初始结果的比较（n - 40，平均 + SE）
转载自吴、K、张、J、福、J、吴、S、菲利普、T.、Uwe、H.、克里本、A.和威茨克，O.小鼠心脏移植模型中血液回路重建的新技术。显微外科。26, 594-598 (2006).
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Discussion
小鼠异位心脏移植手术技术极具挑战性，这涉及到这种模式的广泛应用受到限制。
传统技术的缺点之一是捐赠者肺动脉（PA）的长度有限。它通常长度约为2毫米，而我们模型中使用的供体心脏IIVC的长度一般约为1厘米（图2）。这意味着，在修改后的模型中，IIVC肛门切除术提供了更清晰的视线，使肛门手术得到改善，并防止过于严格的缝合线，甚至损害血管的病变的不理想发展（图4）。PA 和 IIVC 解剖学的构建甚至对经验丰富的操作员来说都是具有挑战性的。PA是非常微妙和薄壁和IIVC更薄，可能更脆弱的小鼠。因此，运营商需要意识到这一限制，并在购买 IIVC 时应谨慎行事。然而，在这一点上，必须强调，虽然IIVC血管壁非常薄，但它具有巨大的优势，即血管长度与血管连接的张力无关，从而使精确缝合的应用更容易，也更不容易损坏。由于容器缝合线的谨慎和安全应用对于成功运行结果至关重要，建议将坐姿放大 10 到 20 倍。
此外，IIVC胸腔部分的结束形成了一个典型的喇叭形状的结构（图5）。其较大的开口直径是选择IIVC的重要和有利原因之一。它的使用有助于应用足够的解剖。这既减少了操作的难度，也减少了操作时间。
可能损害移植过程结果的事件是血管解剖的血栓形成，通常由狭窄促进。虽然在我们的模型中，船只的长度确实故意增加，但这与血栓的形成无关。IIVC的喇叭形状的解剖也可能产生积极的影响，同时大大减少造影狭窄的发生。因此，对于此程序，不需要后移植肝素化。
先前对IVC-aivc解剖方法的分析显示，与传统技术10相比，有几个优点和改进。关于这些结果，从我们长期经验4，10，12，13的回顾的角度来看，这项技术的结果既减少了温暖的缺血和重新拍打时间的嫁接心脏。尽管这种模型10的长期存活率没有差异，但这里提出的修改技术有助于血管的重建，从而降低小鼠腹部心脏移植的难度。因此，这种模式的培训和应用可以改善小鼠腹心移植在免疫学和心脏研究目的中的可及性和广泛应用。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们感谢徐云博士作为配音演员彭建华博士对视频编辑的帮助，感谢安妮卡·库克哈恩博士对她的评价和支持。这项工作部分得到了德国研究基金会（DFG）的支持，以促进国际合作（HO2581/4-1对AH）和中国国家科学基金会（NSFC;#81760291到FJ）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
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