Summary
Una técnica nueva para la reconstrucción del circuito de sangre en un modelo abdominal heterotopic del trasplante del corazón del ratón se demuestra.
Abstract
La técnica quirúrgica del trasplante abdominal heterotopic del corazón en ratones es un modelo estándar para la investigación en inmunología del trasplante. Aquí, la técnica establecida para una reconstrucción modificada del circuito de sangre en un modelo abdominal heterotopic del trasplante del corazón se presenta. Este método utiliza la vena cava inferior intratorácica (IIVC) en vez de la arteria pulmonar del corazón dispensador de aceite para la anastomosis a la vena cava inferior del recipiente. Está facilitando y mejorando las tasas de éxito para el trasplante de corazón abdominal en ratones.
Introduction
La técnica quirúrgica de trasplante de corazón abdominal heterotópico en ratones representa un modelo estándar para la investigación en inmunología detrasplantes 1,2,3. Sin embargo, es muy difícil de realizar y esto implica una restricción al uso generalizado de este modelo4,5.
En el trasplante tradicional de corazón de ratón (THTx), la aorta donante y la aorta abdominal receptora se anastomómosis mientras que la arteria pulmonar se anastomó al receptor de la vena cava inferior6,7,8.
En esta técnica modificada de trasplante de corazón de ratón, la aorta del donante se anastomó a la aorta abdominal receptora y el IIVC donante se anastomó a la vena cava inferior receptora(3,4,6) (Figura 2 y Figura 3).
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos (comité ético aprobado, #G1071/09).
NOTA: La preparación preliminar, la anestesia, la atención postoperatoria y el trabajo de monitoreo son los mismos que se realizan en los métodos quirúrgicos tradicionales1,2,4. Los ratones BALB/c sirvieron como donantes del corazón y C57BL/6J como recipientes del trasplante. Los ratones tenían entre 8 y 12 semanas, pesaban ~ 30 g en el trasplante y fueron alojados en condiciones estándar.
1. Pasos preparatorios
- Para la anestesia, dé a los ratones isoflurano inhalativo (2%) hasta que se duermen, seguido de inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg). Para la analgesia postoperatoria, aplicar Metamizol (200 mg/kg) p.o. y Carprofeno (5 mg/kg) s.c..
NOTA: La aplicación de antibióticos se abstuvo a propósito ya que estas sustancias pueden influir en las respuestas inmunológicas. - Para la cirugía, use un conjunto de instrumentos microscópicos que incluyen una micro-tijera, micro-pinzas, un porta agujas y micro abrazaderas hemostáticas. Una pluma electroquirúrgica también es necesaria. Realice las suturas usando los tipos de nylon 7/0er, 10/0er y 4/0er.
- Coloque el ratón en una caja para la inhalación de isoflurano (2%) durante 40-60 segundos. Determine la profundidad de la anestesia exprimiendo la pata con pinzas. Si hay una falta completa de respuesta para este estímulo, vaya al siguiente paso.
- Una vez que el ratón se ha quedado dormido, pesar el ratón.
- Aplique una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg) al ratón anestesiado.
- Recorte el pelaje abdominal y coloque el ratón en la mesa de operaciones. Realice la desinfección usando yoduro de povidona durante 3 veces, luego cubra correctamente el ratón usando una toalla quirúrgica fenestrada.
2. Procedimiento de operación del donante
- Use tijeras para cortar la piel desde el cuello hasta la parte inferior del abdomen y desprenda la capa completa de la piel hasta la línea media de ambas axilas.
- Use tijeras para cortar los músculos de la pared abdominal y mueva suavemente las vísceras hacia la izquierda (desde la vista del operador). Envuelva las vísceras con una gasa salina imbuyda para exponer con seguridad la vena cava inferior.
- Use una jeringa de 1 ml para inyectar 0,4 ml de la solución de heparina (contiene 500 U de heparina) lentamente en la vena cava inferior y espere 1 minuto antes de sacar la aguja.
- Saque la aguja y use una microescojera para cortar tanto la vena cava inferior como la aorta abdominal para acelerar la exsanguinación.
- Use tijeras para abrir la cavidad torácica realizando un corte en forma de U; exponer completamente el corazón, los pulmones y todos los vasos sanguíneos del pecho.
- Exponga la aorta torácica, corte 1/2 de la luz y luego corte la vena pulmonar para facilitar la irrigación y el drenaje.
- Inserte un tubo de irrigación en la abertura de la aorta torácica, inyecte al menos 2 mL de 4 °C de solución de cardioplejía de histidina-triptófano-cetoglutarato frío (solución de Custodiol HTK)9 hasta que el flujo de salida de la vena pulmonar esté completamente despejado y el corazón deje de latir por completo.
- Saque el tubo de riego y suelte el esternón.
- Use micro tijeras para eliminar el timo y para quitar ligeramente la grasa alrededor del arco aórtico.
- Use fórceps rectos y curvos para exponer y ligar el tronco de la arteria pulmonalis (en el lado derecho del arco aórtico) con una sutura de 10/0.
- Use micro fórceps para separar la grasa y el tejido conectivo unidos al IIVC, exponga y ligar la vena cava superior (en el lado izquierdo del arco aórtico) con una sutura de 7/0 y use micro tijeras para cortarla detrás de la ligadura.
- Haga una sutura de 7/0 alrededor de la base del corazón debajo del arco aórtico, el IIVC y ambas aurículas. Luego ligar las ramas de la arteria pulmonar y los vasos pulmonares venosos.
- Use micro tijeras para transectar el arco aórtico lo más distal posible, los vasos pulmonares debajo de la ligadura y el IIVC cerca del diafragma. Retire el corazón del pecho.
- Coloque el corazón del donante explantado en una solución de cardioplejía HTK fría a 4 °C y reserve temporalmente.
3. Procedimiento de operación del destinatario
NOTA: Los pasos iniciales de la operación son similares a los mostrados previamente para el ratón donante, incluyendo anestesia y desinfección.
- Realice el corte de la piel abdominal de manera transversal, cubra los órganos abdominales con una gasa húmeda usando solución salina.
- Use micro fórceps para exponer la vena cava inferior y la aorta abdominal y liberarlos del tejido graso circundante.
- Use micro fórceps para ligar o electrocauterizar los vasos de la rama lateral (laterales o debajo de la vena/aorta) debajo de los vasos renales.
- Use pinzas aplicadoras para colocar dos pinzas micro hemostáticas en la parte abdominal de la vena/aorta que vienen de la derecha dejando más de 1 cm de distancia para ambas aorta/vena para asegurar el espacio para la construcción de la anastomosis entre ellas.
- Use micro tijeras para hacer una incisión en la aorta un poco más cerca de la abrazadera inferior que de la abrazadera superior. Alternativamente, use una aguja de 30 G para hacer un pequeño agujero y ábralo con micro tijeras.
- Coloque el ratón receptor de modo que la aorta esté frente al operador con la vena cava en el otro lado. Luego coloque el corazón en la cavidad abdominal y cúbralo con una pequeña gasa húmeda.
- Use una sutura 10/0 para adaptar y suturar la aorta donante a la aorta receptora comenzando caudalmente, haga un nudo y proceda con una sutura corriente hasta la parte superior de la incisión (aproximadamente 4-5 puntos de sutura). A continuación, voltee el corazón hacia la derecha (desde la vista del sujeto), cúbralo de nuevo y continúe la sutura en el lado izquierdo hasta llegar al extremo caudal y anótelo.
- Use un tubo de riego para inyectar al menos 0,5 mL de solución de cardioplejía HTK de 4 °C para eliminar el IIVC del donante.
- Utilice micro-tijeras para cortar un agujero redondo en la vena cava inferior abdominal del receptor, que debe tener el mismo tamaño de los donantes iivc lumen. La incisión debe estar ubicada por encima de la abertura anastomótica aórtica. Haga que la incisión venosa sea más grande que la incisión aórtica.
- Utilice una sutura de 10/0 para coser el IIVC donante a la vena cava receptora comenzando caudalmente. Ate un nudo y realice una sutura corriente hasta que se alcance la parte superior de la incisión. Use cinco puntos de sutura y continúe la sutura a la izquierda. Finalmente, ate un nudo en la esquina de la cola y apriete cuidadosamente (tenga cuidado de no tirar demasiado apretado).
- Coloque las pequeñas partes de la esponja hemostática alrededor de la vena y las anastomosis aórticas.
- Use pinzas del aplicador de clip para quitar primero las abrazaderas micro-hemostáticas inferiores y luego superiores y enjuague la cavidad abdominal con cloruro de sodio al 0,9% templado a 38,0 °C.
- Use micro- esponjas para quitar la esponja hemostática.
- Observe los latidos del corazón trasplantado.
- Use fórceps para volver a colocar los intestinos en la cavidad abdominal y suturas de dos capas (músculos abdominales seguidos de piel) para cerrar la herida abdominal con una sutura de 4/0.
- Coloque a los ratones en una cámara de estación de trabajo de control de oxígeno y temperatura (por ejemplo, INVIVO2-400) para proporcionar un ambiente cálido y rico en oxígeno para que los ratones trasplantados se recuperen, espere a que los ratones se despierten.
- Para la analgesia postoperatoria, dé directamente Metamizol 200 mg/kg por os después de la operación. Cuatro y 16 horas después de la operación dan Metamizol 200 mg/kg por os+ Carprofen (5mg/kg) s.c. En el seguimiento posterior, dé Carprofeno (5 mg/kg) s.c a los ratones trasplantados cada 24 horas durante tres días consecutivos después de la operación.
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Representative Results
Aquí, una técnica modificada del trasplante abdominal heterotopic del corazón en ratones que se ha desarrollado previamente en nuestro laboratorio y ha probado útil por los 16 años pasados se presenta. Previamente, se informó que en total 40 casos de vena cava a vena cava (grupo V-V) en comparación con 40 casos del procedimiento tradicional de anastomosis de arteria pulmonar a vena cava (grupo P-V)4 (Tabla 1)la anastomosis del vaso tomó 20,8±1,3 min en el grupo V-V, que fue significativamente más corto que en el grupo P-V (27,5±1,3 min, p<0,01). El tiempo de isquemia caliente, el tiempo total de operación del receptor y el tiempo de repetición del corazón postoperatorio, que fueron de 25,5±1,2 min, 42,0±1,5min y 1,1±0,2 min, respectivamente, también se acortaron significativamente de lo observado en el grupo P-V tradicional (todo p<0,05) (Figura 1). A pesar de que no hay diferencias para las tasas de supervivencia a largo plazo en este modelo10,11,la técnica modificada facilitó el trasplante de corazón abdominal en ratones, lo que resulta tanto en una isquemia caliente reducida como en un tiempo de rebeating cardíaco injertado.
Con respecto a estos datos publicados anteriormente y nuestra experiencia con este modelo en los últimos 16 años, recomendamos que los pasos clave de la operación deben tomar una cantidad limitada de tiempo para garantizar una tasa de éxito de >90%4. Por lo tanto, se logran resultados óptimos si la recolección del corazón del donante no toma más de 60 min, el tiempo de isquemia fría debe limitarse a 40 min como máximo, y la construcción de la anastomosis iivc no debe tomar más de 15 min ya que esto se asocia directamente con un tiempo de isquemia caliente reducido.
Figura 1. Comparación de los tiempos de procedimiento entre las dos técnicas de operación (n = 40 cada una, media + SE) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Preparación del corazón del donante utilizando el modelo de trasplante de corazón de ratón tradicional (a, superior izquierdo) y modificado (b, abajo a la izquierda). Las fotografías en los paneles a y b representan la aorta (A), la arteria pulmonar (PA), la aurícula derecha (AR), la aurícula izquierda (AL) y la vena cava inferior intratorácica (IIVC) del corazón del donante. Observe la diferencia en la longitud de los buques del PA en comparación con el IIVC. El panel c muestra el situs receptor preparado para el HTX abdominal heterotopic. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3. Anastomosis vascular del modelo modificado: aorta (A), vena cava inferior intratorácica (IIVC), vena cava inferior abdominal (aivc), aorta abdominal (aa). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4. Demostración de la longitud del recipiente para la arteria pulmonar (PA) y la vena cava inferior intratorácica (IIVC). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5. Forma fisiológica de la trompeta en el extremo de la vena cava inferior intratorácica. Aorta (A), vena cava inferior intratorácica (IIVC), aurícula derecha (AR), aurícula izquierda (AL). La flecha doble roja izquierda a la izquierda resalta el diámetro y el círculo rojo a la derecha la estructura de la forma de la trompeta. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| Vena cava a vena cava (nuevo método) | A pulmonar a la vena cava (método tradicional) | |
| Adquisición de donantes (min.) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| Operación de destinatario (min)Recipient operation (min) | 42.0 + 1.5 | 48,6 + 1,4** |
| Anastomosis de los vasos (min)Vessel anastomosis (min) | 20.8 + 1.3 | 27,5 + 1,3** |
| Isquemia fría (min) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| Isquemia caliente (min) | 25.5 + 1.2 | 32,6 + 1,3** |
| Rebeat postoperación (min) | 1.1 + 0.2 | 2,1 + 0,4* |
| Tasa de éxito | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0,05 | ||
| **P < 0.01. |
Tabla 1. Comparación de distribuciones de tiempo y resultados iniciales en dos operaciones (n - 40, media + SE)
Reprinted from Wu, K., Zhang, J., Fu, J., Wu, S., Philipp, T., Uwe, H., Kribben, A. and Witzke, O. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. microcirugía. 26, 594-598 (2006).
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Discussion
La técnica quirúrgica del trasplante abdominal heterotopic del corazón en ratones es muy desafiadora y esto implica una restricción al uso extenso de este modelo.
Una de las desventajas de la técnica convencional es la longitud limitante de la arteria pulmonar del donante (AF). Suele ser de unos 2 mm de longitud, mientras que la longitud del IIVC del corazón donante utilizado en nuestro modelo suele ser de unos 1 cm(Figura 2). Esto significa que en el modelo modificado, la anastomosis IIVC ofrece una visión más clara de la operación situs permitiendo una mejor cirugía de anastomosis y previniendo el desarrollo no deseado de suturas demasiado estrictas o incluso lesiones dañinas de los vasos(Figura 4). Tanto la construcción de la PA como la anastomosis IIVC son un desafío incluso para los operadores experimentados. El PA es muy delicado y de paredes delgadas y el IIVC es aún más delgado y potencialmente más frágil en ratones. Por lo tanto, los operadores deben ser conscientes de esta restricción y deben tener precaución al suturar el IIVC. Sin embargo, en este punto es importante destacar que aunque la pared del vaso iivc es muy delgada, tiene la gran ventaja de que la longitud del vaso no está asociada con la tensión a la conexión del vaso sanguíneo, lo que hace que la aplicación de una sutura precisa sea más fácil y menos propensa a un daño. Puesto que el uso cauteloso y seguro de las suturas del recipiente es muy crítico para un resultado acertado de la operación, una ampliación del situs del doblez 10 a 20 se recomienda.
Además, la terminación del segmento torácico del IIVC forma una estructura típica en forma de trompeta (Figura 5). Su diámetro de apertura más grande representa una de las razones importantes y beneficiosas por las que se puede elegir el IIVC. Su uso facilita la aplicación de una anastomosis suficiente. Esto reduce tanto la dificultad de la operación como el tiempo de operación.
Un acontecimiento posible que pueda comprometer el resultado del procedimiento del trasplante representa una trombosis de la anastomosis del recipiente, fomentada a menudo por una estenosis. Aunque en nuestro modelo la longitud del vaso aumenta a propósito, esto no se asoció con la formación de trombos. La anastomosis en forma de trompeta del IIVC puede también ejercer un efecto positivo mientras que reduce grandemente el acontecimiento de una estenosis anastomótica. Por lo tanto, para este procedimiento no es necesaria una heparinización postrasplante.
Un análisis previo del método de anastomosis IVC-aivc reveló varias ventajas y mejoras en comparación con la técnica convencional10. Con respecto a estos resultados y desde el punto de vista retrospectivo de nuestra larga experiencia4,10,12,13,esta técnica resulta tanto en una isquemia caliente reducida como en un tiempo de rebeating del corazón injertado. A pesar de que no hay diferencias en las tasas de supervivencia a largo plazo para este modelo10,la técnica modificada que se presenta aquí está facilitando la reconstrucción del vaso anostomótico reduciendo así la dificultad del trasplante de corazón abdominal en ratones. Por lo tanto, el entrenamiento y la aplicación de este modelo pueden mejorar la accesibilidad y la aplicación generalizada del trasplante de corazón abdominal en ratones con fines de investigación inmunológica y cardíaca.
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Disclosures
ninguno.
Acknowledgments
Agradecemos a la Dra. Yun Xu por su ayuda como actriz de voz, a la Dra. med. Jianhua Peng por su ayuda en la edición de video y a la Dra. Annika Kuckhahn por sus comentarios y apoyo. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) para promover colaboraciones internacionales (HO2581/4-1 a AH), y la Fundación Nacional de Ciencia de China (NSFC; #81760291 a FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
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