Summary
Per un'analisi meccanicistica approfondita della sintesi dell'RNA del virus respiratorio sincrezionale (RSV), segnalamo un protocollo di utilizzo della fosfoproteina chaperone (P) per la coespressione della nucleoproteina priva di RNA (N0)per il successivo assemblaggio in vitro dei nucleocapsidi specifici del virus (NC).
Abstract
L'uso di un autentico modello di RNA è fondamentale per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell'RNA virale che può guidare sia la scoperta meccanicistica che lo sviluppo di saggi in virologia. Il modello di RNA dei virus dell'RNA a senso negativo non commentati (NNS), come il virus respiratorio sincrezionale (RSV), non è una molecola di RNA da sola ma piuttosto un complesso di ribonucleoproteina encapsidata di nucleoproteina (N). Nonostante l'importanza dell'autentico modello di RNA, la generazione e l'assemblaggio di un tale complesso di ribonucleoproteina rimangono sofisticati e richiedono una spiegazione approfondita. La sfida principale è che l'RSV N sovraespresso si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare particelle casuali simili a nucleocapside (NCLP). Qui, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere N (N0)privo di RNA prima co-esprimendo N con una fosfoproteina chaperone (P), quindi assemblando N0 con oligo di RNA con la sequenza di RNA specifica della RSV per ottenere nucleocapsidi specifici del virus (NC). Questo protocollo mostra come superare la difficoltà nella preparazione di questo complesso di ribonucleoproteina virale tradizionalmente impegnativo.
Introduction
I virus dell'RNA a senso negativo (NNS) non commentati includono molti agenti patogeni umani significativi, come rabbia, Ebola e virus respiratorio sincrezionale (RSV)1,2. Rsv è la principale causa di malattie respiratorie come bronchiolite e polmonite nei bambini piccoli e negli adulti più grandi in tutto ilmondo 3. Attualmente, non sono disponibili vaccini efficaci o terapie antivirali per prevenire o trattare RSV4. Come parte del ciclo di vita, il genoma RSV funge da modello per la replicazione da parte dell'RNA polimerasi dipendente dall'RNA RSV per produrre un antigenoma, che a sua volta funge da modello per generare un genoma di progenie. Sia il genoma che l'antigenoma RNA sono interamente racchiusi dalla nucleoproteina (N) per formare i nucleocapsidi (NC)3. Poiché gli NC fungono da modelli sia per la replicazione che per la trascrizione da parte della RSV polimerasi, un adeguato assemblaggio NC è fondamentale affinché la polimerasi ottenga l'accesso ai modelli per la sintesi dell'RNA5. È interessante notare che, sulla base delle analisi strutturali delle polimerasi virali NNS, si ipotizza che diverse N proteine si dissociano transitoriamente dagli NC per consentire l'accesso della polimerasi e ricombinate all'RNA dopo la sintesi dell'RNA6,7,8,9,10,11,12.
Attualmente, il test di polimerizzazione dell'RNA RSV è stato stabilito utilizzando polimerasi RSV purificata su brevi modelli di RNAnudo 13,14. Tuttavia, le attività della RSV polimerasi non raggiungono ottimale, come osservato nei prodotti non processivi e abortivi generati dalla RSV polimerasi quando si utilizzano modelli di RNA nudi. La mancanza di NC con RNA specifico del virus è una barriera primaria per l'ulteriore comprensione meccanicistica della sintesi dell'RNA RSV. Pertanto, l'utilizzo di un autentico modello di RNA diventa un'esigenza critica per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell'RNA RSV. Le strutture note delle particelle nucleocapside-simili (NCLP) da RSV e altri virus NNS RNA rivelano che gli RNA negli NCLP sono RNA cellulari casuali o RNA genomiche virali medie15,16,17,18,19. Insieme, l'ostacolo principale è che N si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare NCLP quando N è sovraespresso nelle celle ospiti.
Per superare questo ostacolo, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere prima RNA-free (N0) e assemblare N0 con autentico RNA genomico virale in NCLP20. Il principio di questo protocollo è quello di ottenere una grande quantità di N (N 0) ricombinare n (N0)co-esprimere N con un chaperone, il dominio N-terminale della fosfoproteina RSV (PNTD). L'N0P purificato potrebbe essere stimolato e assemblato in NCLP aggiungendo oligo di RNA specifici per RSV, e durante il processo di assemblaggio, il chaperone PNTD viene spostato dopo l'aggiunta di oligo di RNA.
Qui, dettagliamo un protocollo per la generazione e l'assemblaggio di NC specifici dell'RNA RSV. In questo protocollo, descriviamo la clonazione molecolare, la preparazione proteica, l'assemblaggio in vitro e la convalida dell'assemblaggio complesso. Evidenziamo la strategia di clonazione per generare costrutti bi-cistronici per la coespressione proteica per la clonazione molecolare. Per la preparazione delle proteine, descriviamo le procedure di coltura cellulare, estrazione proteica e purificazione del complesso proteico. Quindi discutiamo il metodo per l'assemblaggio in vitro degli NC specifici dell'RNA RSV. Infine, utilizziamo la cromatografia ad esclusione di dimensione (SEC) e la microscopia elettronica a macchia negativa (EM) per caratterizzare e visualizzare gli NCLP assemblati.
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Protocol
1. Clonazione molecolare
NOTA: La clonazione indipendente ligasi (LIC) è stata utilizzata per creare un costrutto di coespressione bi-cistronica RSV plasmide. Il LIC è un metodo sviluppato nei primi anni '90, che utilizza l'attività 3'-5' Exo della DNA polimerasi T4 per creare sporgenze con complementarietà tra il vettore e l'inserto del DNA21,22. I costrutti sono stati realizzati utilizzando il DNA vettoriale 2BT-10, che consiste in un tag 10x His all'N-terminale dell'Open Reading Frame (ORF) (Figura 1).
- Eseguire la linearizzazione dei vettori LIC utilizzando la digestione SSPI.
- Unire 10 μL di tampone SSPI 10X, 4 μL di enzima SSPI ad una concentrazione di 5 U/μL, il volume equivalente di 5 μg di DNA miniprep vettoriale e ddH sterileda 2O a 100 μL.
- Incubare il digest per 3 ore a 37 °C.
- Eseguire il digest su un gel di agarosio all'1,0% per l'estrazione del DNA vettoriale.
- Utilizzare un kit di estrazione del gel per eseguire l'estrazione e la purificazione. Sospendere il volume finale del DNA vettoriale in 30 μL di ddH2O e conservarlo a -20 °C.
- Preparare gli inserti del DNA per N1-391 e P1-126 utilizzando il primer avanti N1-391, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer e P1-126 Reverse Primer(Tabella 1).
NOTA: C'è una sovrapposizione sufficiente con il vettore linearizzato per garantire una temperatura di fusione compresa tra 55 °C e 60 °C. Per il primer inverso, c'è sufficiente sovrapposizione con il filamento complementare inverso del vettore linearizzato per lo stesso motivo.- Eseguire l'amplificazione PCR dell'inserto del DNA utilizzando le condizioni della tabella 2 e della tabella 3.
- Estrarre l'inserto del DNA amplificato. Eseguire i prodotti PCR del passaggio precedente su un gel di agarosio all'1,0%, quindi estrarre e purificare le bande mediante estrazione del gel. Sospendere il volume finale del DNA estratto in 15 μL di ddH2O.
- T4 DNA polimerasi trattamento del vettore e inserire DNA(tabella 4).
NOTA: Il trattamento deve essere eseguito separatamente per il DNA vettoriale e il DNA inserito.- Incubare la miscela per 40 minuti a temperatura ambiente. Quindi, inattivare termicamente la polimerasi a 75 °C per 20 minuti. Conservare la miscela di reazione a -20 °C.
- Ricottura del vettore LIC e del vettore di inserimento.
- Impostare un controllo negativo con 2 μL di DNA vettoriale LIC e 2 μL di ddHsterile 2O.
- Combinare 2 μL di DNA inserto e 2 μL di DNA vettoriale LIC dalle precedenti reazioni di DNA polimerasi T4 in un tubo da 0,2 ml.
- Eseguire la reazione di ricottura a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Temprare la reazione con 1,3 μL di EDTA ad una concentrazione di 25 mM.
- Trasformare la reazione in 100 μL di cellule competenti E. coli Top10 e placcarle su una piastra di selezione di ampicillina23,24.
- Identificare i costrutti positivi.
- Preparare la soluzione di miniprep plasmide. Questo può essere fatto attraverso la raccolta della colonia e l'inoculazione nei media LB. Di solito, 3 colonie sono sufficienti.
- Incubare la miscela durante la notte a 37 °C.
- Centrifugare la miscela a 4.560 x g per 10 minuti e scartare il supernatante.
- Rimescolare i pellet in 250 μL di tampone P1 e preparare miniprep plasmidi utilizzando un kit di miniprep di spin.
- Condurre un'analisi di digestione del prodotto miniprep utilizzando AseI o altri enzimi di restrizione.
- Caricare campioni su gel di agarosio allo 0,8% ed eseguire il plasmide digerito. Analizzare il gel sotto una lampada UV.
- Utilizzare un servizio di sequenziamento per convalidare la sequenza del prodotto positivo.
- Ottenere l'inserto del DNA di coespressione.
- Eseguire PCR per ottenere N1-391 e P1-126 utilizzando i modelli 2BT-10 N1-391 e 2BT-10 P1-126 costruiti in precedenza.
- Eseguire il PCR 1st per ottenere N1-391 dal costrutto 2BT-10 N1-391 utilizzando le condizioni PCR nelle tabelle 2 e Table 3 con il primer N1-391 Forward e il Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Eseguire il 2° PCR per ottenere P1-126 dal costrutto 2BT-10 P1-126 utilizzando il primer Forward: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́ e il primer inverso P1-126 (utilizzare le condizioni PCR nelle tabelle 2 e 3). - Infine, eseguire sovrapposizioni PCR sui prodotti misti delle precedenti 2 reazioni PCR per fondere N1-391 e P1-126. Utilizzare il primerN 1-391 Forward e il primer P1-126 Reverse. Utilizzare le condizioni PCR nelle tabelle 5 e 6.
- Unire il vettore e l'inserto del DNA.
- Trattare il prodotto PCR sovrapposto con T4 DNA polimerasi seguendo il protocollo nella fase 1.3.
- Ricottura del vettore LIC e del prodotto PCR seguendo il protocollo nel passaggio 1.4.
- Identificare i costrutti positivi seguendo il protocollo nel passaggio 1.5.
2. Espressione e purificazione proteica
NOTA: Utilizzare E. coli per il costrutto bi-cistronico della coespressione di N e P. Coltura le cellule a 37 °C, ma eseguire l'espressione a temperatura ridotta (16 °C) durante la notte. Purificare i complessi proteici attraverso una combinazione di colonna di cobalto, scambio ionico e cromatografia ad esclusione di dimensioni (Figura 2).
- Utilizzare il ceppo E. coli BL21(DE3) per la produzione di proteine. Coltivare 4 colture cellulari L a 37 °C in mezzo LB (Luria Broth) fino a quando OD600 raggiunge 0,6.
- Abbassare la temperatura a 16 °C. Un'ora dopo, indurre l'espressione con 0,5 mM isopropil 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) durante la notte.
- Centrifugare le cellule a 4.104 x g per 25 minuti e quindi scartare il supernatante.
- Rimescolare il pellet cellulare in 200 mL di tampone di lisi A (fosfato di sodio 50 mM, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazolo, 10% glicerolo e 0,2% NP40). Utilizzare 50 mL di tampone di lisi per rimescolare il pellet cellulare da 1 L di coltura cellulare.
- Lyse le cellule per sonicazione per 15 minuti, 3 secondi e 3 secondi di riposo. Quindi centrifugare le cellule a 37.888 x g per 40 min.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa congelando le cellule prima della sonicazione in un congelatore a -80 °C. - Caricare il supernatante in una colonna di gravità cobalto (diametro x lunghezza: 2,5 cm x 10 cm) con ~10mL di perline pre-equilibrate con 5-10 volumi di colonna (CV) di tampone di lysis.
- Lavare la colonna con 5 CV di tampone B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glicerolo e 5 mM imidazolo) e 5 CV di tampone C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glicerolo e 5 mM imidazolo).
- Elute la proteina dalle perline usando 2 CV di tampone D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl e 250 mM imidazole).
- Diluire la proteina eluita 5x con tampone QA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% Glicerolo) per la colonna Q.
- Lavare i 5 mL della colonna Q con tampone QA per equilibrare la colonna, quindi caricare il campione diluito nella colonna Q utilizzando la pompa peristaltica (ad esempio Rabbit).
- Caricare la colonna Q nella macchina HPLC insieme al buffer QA e al buffer QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glicerolo). Impostare la portata come 1 mL/min.
- Eseguire il programma di "lavaggio della pompa" per lavare la macchina con tampone QB seguito da buffer QA (1-2 CV/ciascuno). Impostare il flusso di sistema su 3 mL/min.
- Impostare UV1 su 280 nm e UV2 su 260 nm. Utilizzare una piastra a pozzo profondo 96 per raccogliere le frazioni.
- Elute proteine utilizzando un gradiente graduale di agente di eluizione (QB Buffer) applicando 3-4 CV di ogni concentrazione, aumentando la percentuale del 5% ogni volta a partire dallo 0% QB. Ilcomplesso proteicoN 0 P eserà al 15% di QB Buffer.
- Una volta eluito tutta la proteina, lavare la colonna con 100% QB Buffer (2 CV).
- Isolare la proteina mediante filtrazione in gel Superdex 200 Aumentare la colonna 10/300 GL (diametro x lunghezza: 1,0 cm x 30 cm) ed equilibrare con tampone E (20 mM HEPES pH 7,4 e 200 mM NaCl).
- Analizza le frazioni contenenti proteine di SDS-PAGE.
3. Assemblaggio in vitro del NC specifico del virus
NOTA: L'assemblaggio in vitro del NC specifico per RSV (N:RNA) è stato eseguito incubando il complesso N0P preparato con oligo di RNA. Quindi, la cromatografia SEC è stata utilizzata per separare il complesso di assemblaggio dalla N0P e dall'RNA in eccesso (Figura 2).
- Mescolare e incubare il complesso purificato N0P con oligo di RNA con il rapporto molecolare di 1:1,5 a temperatura ambiente per 1 ora, di solito 1 mL della proteina N0P con una concentrazione di 1 mg / mL è sufficiente per il passo successivo. Impostare il campione di controllo, che contiene solo la stessa quantità di proteina N0P.
- Pre-equilibrare la filtrazione in gel Superdex 200 Aumentare la colonna 10/300 GL con il tampone E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
- Centrifugare il campione con 21.130 x g per 15 minuti, rimuovere eventuali precipitazioni e caricare il supernatante nella colonna SEC.
- Confrontare le immagini di cromatografia SEC del campione di assemblaggio N:RNA e del campione di controllo N0P, combinare il rapporto A260/A280 per identificare quali picchi sono l'N-RNA assemblato, N0P e l'RNA libero.
- Raccogliere le frazioni di picco, eseguire il gel SDS-PAGE o creare griglie.
- Per il complesso di N-RNA di assemblaggio, raccogliere tutte le frazioni del picco di N-RNA, fare l'estrazione dell'RNA ed eseguire il gel Urea-PAGE per ricontrollare la lunghezza dell'RNA specifico, che è lo stesso di miscelato e incubato al primo passo.
4. Fare griglie di macchie negative
NOTA: La microscopia elettronica a macchia negativa (EM) è un metodo in cui le molecole vengono adsorbiti in una pellicola di carbonio e quindi incorporati in uno strato di atomi di metallo pesante. La macchia negativa EM produce un elevato contrasto dell'immagine, rendendo facile la vedere e allineando computazalmente le particelle. Un altro vantaggio è che l'adsorbimento delle particelle in una pellicola di carbonio di solito induce le molecole ad aderire alla griglia con pochi orientamenti preferiti. Quando le molecole hanno un orientamento simile, è facile separarle in classi strutturalmente distinte. La macchia negativa EM è quindi la tecnica appropriata per guidare la preparazione delcampione 25,26 (Figura 3).
- Microonde o calore 5 mL di ddH2O in un piccolo bicchiere di vetro usando un riscaldatore di tungsteno fino a quando non bolle.
- Pesare 37,5 mg di formato uroril e aggiungere a 5 mL di ddH 2 Oriscaldatoper fare una soluzione di colorazione in formato 0,75% di uranil. Mescolare sotto un becher coperto di foglio di alluminio per proteggere dalla luce.
- Aggiungere 4 μL di 10 M NaOH alla soluzione di colorazione e continuare a mescolare per 15 minuti, protetti dalla luce.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 mm in una provetta.
- Utilizzare la scarica luminosa per rendere idrofile le reti EM continue rivestite di carbonio27.
NOTA: Le griglie sono posizionate all'interno di una camera collegata a un alimentatore. Quando viene applicata l'alta tensione, il gas all'interno della camera ionizza e gli ioni caricati negativamente si depositano sulle reti di carbonio per renderli idrofili. - Tagliare e piegare una striscia di parafilm. Pipetta 2 gocce di 40 μL del tampone su un lato del parafilm e pipetta altre 2 gocce di 40 μL di soluzione di colorazione sull'altro lato.
- Per realizzare le griglie di carbonio EM, applicare 3 μL di campione proteico per 1 minuto.
- Asciugare le griglie contro una carta assorbente.
NOTA: Le griglie vengono lavate 2 volte con tampone e 1x con la soluzione di colorazione in formato 0,75% di uranil cancellato dopo ogni passaggio. - Tenere la superficie della griglia nella seconda goccia dello 0,75% di soluzione di colorazione in formato uranil per 30 secondi.
- Asciugare la griglia contro una carta assorbente per rimuovere la soluzione di macchia in eccesso e lasciare asciugare la griglia all'aria.
- Archiviare le griglie nella casella della griglia prima dell'imaging.
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Representative Results
Purificazione della proteina N0P priva di RNA
Con questo protocollo, è possibile ottenere un complesso eterodimerico solubile RSV N0P su larga scala. L'intera lunghezza della parte terminale N e N delle proteine P è stata co-espressa con 10X His-Tag sulla proteina N in E. coli. N0P è stato purificato usando una colonna di cobalto, scambio ionico e cromatografia ad esclusione di dimensioni. N0P contiene sia il terminale N che N a tutta lunghezza P, ma non contiene RNA cellulare basato sull'assorbanza UV A260/A280 ratio20 (Figura 4).
Assemblaggio di N-RNA e controllo con macchia negativa
Abbiamo quindi dimostrato che l'N 0 Ppurificato potevaessere stimolato e assemblato in particelle simili a nuceloplasmidi (NNP) incubando con specifici oligo di RNA. Gli NNP sono stati assemblati incubando l'N0P con oligo di RNA con il rapporto di 1:1,5 a temperatura ambiente per 1 ora e quindi corrono attraverso la colonna di filtrazione del gel. Quando il complesso N:RNA si forma, mostra tre picchi: il picco 1st è N:RNA, il 2° picco è N0P, e il picco 3rd è l'RNA libero in eccesso. La frazione più alta del picco N:RNA crea le griglie di macchie negative per il controllo con EM20 (Figura 5).
Figura 1. L'illustrazione delle costruzioni plasmide. un. La costruzione della RSV N1-391; B. Il costrutto dell'RSV P1-126; C. Il costrutto bi-cistronico per la coespressione di N1-391 e P1-126. Il primo gene RSV N1-391, il secondo gene RSV P1-126, il gene resistente agli antibiotici (AmpR) e i promotori sono evidenziati rispettivamente in scatole gialle, ciano, rosa e arancioni. In sintesi, gli inserti genetici dell'RSV N1-391 e dell'RSV P1-126 sono costruiti separatamente e assemblati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Diagramma di flusso della purificazione del complesso proteico N1-391P1-126. Delinea l'inoculazione e la crescita su larga scala della coltura cellulare di E. coli e la raccolta della cellula mediante centrifugazione. Seguiti dalla lisi cellulare, i campioni proteici sono purificati dalla cromatografia di affinità (cioè colonna Co2+), cromatografia a scambio ionico (cioè colonna Q) e cromatografia SEC (Gel Filtration Size Exclusion). I campioni proteici vengono ulteriormente analizzati dal gel SDS-PAGE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Preparazione di griglie EM di macchie negative per l'imaging. A. Glow scarica le griglie. B. Viene visualizzata la procedura per le griglie di colorazione negativa. Le pinzette vengono utilizzate per raccogliere una griglia, seguita dall'applicazione del campione proteico per 1 minuto. Le griglie sono macchiate di carta assorbente. La griglia viene lavata due volte con tampone e due volte con la soluzione di colorazione in formato 0,75% di uranil. Le griglie vengono tenute nella seconda caduta della soluzione di colorazione per 30 secondi. Le griglie vengono macchiate dopo ogni lavaggio e asciugate all'aria dopo l'blotting finale. C. Le griglie sono memorizzate nella casella della griglia per l'imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Risultati rappresentativi della copurificazione del complesso N1-391P1-126. un. Profilo SEC di N1-391P1-126. B. Profilo SEC dell'assieme N1-391P1-126 con RNA. C. Il gel SDS-PAGE mostra la proteina N solo per il complesso N-RNA e le bande sia per le proteine N che P del complesso N1-391P1-126. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Immagini rappresentative dell'N-RNA. A e B sono rappresentative immagini EM di macchia negativa di N-RNA dal picco N1-391-RNA nella Figura 4. I complessi N-RNA sono macchiati secondo la procedura descritta nella figura 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Primer | |||
| N1-391 Avanti | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Retromarcia | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Avanti | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Retromarcia | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3' | ||
La tabella 1. Sequenze primer.
| Amplificazione PCR dell'inserto del DNA | |
| 15 μL | Tampone di reazione 10x Pfu polimerasi |
| 3 μL | Primer avanti (concentrazione di 100 μM) |
| 3 μL | Primer inverso (concentrazione di 100 μM) |
| 15 μL | miscela dNTP a concentrazione di 2,5 mM |
| 6 μL | Il DNA plasmide contiene il gene di N o P (100ng/ μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polimerasi a 2,5U/μL |
| Volume da riempire a 150 μL | Sterile ddH2O |
La tabella 2. Amplificazione PCR dei reagenti inserti del DNA.
| Ampliazione PCR dell'inserto del DNA | |||
| passo | Ore | temperatura | Cicli |
| denaturazione | 4 min. | 95ºC | 1 |
| denaturazione | 45 secondi. | 95ºC | 30 |
| ricottura | 30 secondi. | 62ºC | |
| Estensione* | 90 secondi. | 72ºC | |
| estensione | 10 min. | 72ºC | 1 |
| tenere | ∞ | 4ºC | 1 |
| La miscela di 150 μL può essere eseguita in tre reazioni PCR separate (3 x 50μL). | |||
| *Per la DNA polimerasi di Pfu, 1 kb/min è la velocità consigliata per la fase di estensione. Qui, entrambe le lunghezze del gene N1-391 o del gene P1-126 sono più corte di 1,5 Kb. | |||
| Pertanto, sono stati utilizzati 90 secondi per il passaggio di estensione. | |||
La tabella 3. Amplificazione PCR del programma di termociclismo inserto dna.
| Trattamento della DNA polimerasi T4 | |
| 10 x Buffer | 2 μL |
| DNA vettoriale/inserto (0,1 pmol vettore o inserto 0,2 pmol) | 5 μL |
| dNTP* a 25 mM | 2 μL |
| DTT a 100 mM | 1 μL |
| T4 DNA polimerasi (qualificata LIC) | 0,4 μL (1,25 U) |
| Sterile ddH2O | 9,6 μL |
| *dGTP è stato usato per il vettore, e dCTP è stato utilizzato per l'inserto DNA. | |
La tabella 4. Trattamento T4 DNA polimerasi.
| Sovrapporre pcr | |
| 15 μL | 10 X Tampone di reazione della polimerasi di Pfu |
| 3 μL | Primer in avanti (100 μM) |
| 3 μL | Primer inverso (100 μM) |
| 15 μL | Mix dNTP (2,5 mM) |
| 3 μL | DNA da 1st rotondo PCR che contengono il gene N1-391 (100 ng/μL) |
| 3 μL | DNA da 1st rotondo PCR che contengono il gene P1-126 (100 ng/μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polimerasi (2,5 U/μL) |
| Volume da riempire a 150 μL | Sterile ddH2O |
La tabella 5. Sovrapporre reagenti PCR.
| Sovrapporre pcr | |||
| passo | Ore | temperatura | Cicli |
| denaturazione | 4 min. | 95 °C | 1 |
| denaturazione | 45 secondi. | 95 °C | 30 |
| ricottura | 30 secondi. | 62 °C | |
| Estensione* | 2 min. | 72 °C | |
| estensione | 10 min. | 72 °C | 1 |
| tenere | ∞ | 4 °C | 1 |
| La miscela di 150 μL può essere eseguita in tre reazioni PCR separate (3 x 50 μL). | |||
| *Per la DNA polimerasi di Pfu, 1 kb/min è la velocità consigliata per la fase di estensione. Qui, la lunghezza totale del gene N1-391 e P1-126 è inferiore a 2,0 Kb. Pertanto, sono stati utilizzati 2 minuti per la fase di estensione. | |||
La tabella 6. Sovrapporre il programma di termociclismo PCR.
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Discussion
Le strutture note di particelle nucleocapside-simili (NCLP) dei virus RNA a senso negativo non commentati (NNS) mostrano che gli NLP assemblati sono il complesso N con RNA cellulari ospiti quando sovraespresso nei sistemi di espressione batterica o eucariotica15,16,17,18,19. Studi precedenti hanno tentato di ottenere l'N privo di RNA con una varietà di metodi, come la digestione RNasi A, il lavaggio del sale alto o la regolazione di diversi tamponi di pH per rimuovere gli RNA cellulari non specifici28,29. Tuttavia, nessuno dei metodi di cui sopra può essere utilizzato con successo per l'assemblaggio dei NC specifici del virus. Per ottenere l'RSV N privo di RNA, abbiamo anche provato una combinazione di metodi, tra cui la digestione RNasi A, il lavaggio ad alto sale (1,5 M NaCl), regolando il pH tampone dal pH 5.0 al pH 9.0, la denaturazione proteica e la rinaturazione. Dopo molte prove fallite, non siamo ancora riusciti a ottenere N privo di RNA con i metodi di cui sopra. Discuteremo brevemente i tentativi e le potenziali ragioni.
Un metodo per ottenere N privo di RNA è quello di digerire l'RNA cellulare host negli NCLP assemblati con RNasi A. Nel VSV, l'incubazione dell'NCLP purificato con RNasi A ad una concentrazione finale di 1 mg/ml a 37 °C per 1 h ha completamente rimosso l'RNA dal NC28. L'oligomerico vuoto purificato N è stato quindi incubato con poli-A (250-nt o più) in un rapporto molare di 1:5 in presenza di inibitori della RNasi. L'analisi dell'RNA isolato dalla N:poli-A ricostituita ha mostrato che l'RNA era lungo circa 90 nt. Ciò suggerì che l'RNA al di fuori della nucleoproteina è suscettibile alla digestione aspecifica da parte della RNasi A contaminata dal passo precedente. La strategia della digestione RNasi A per rimuovere l'RNA non ha avuto successo se applicata alla RSV. Ciò può essere dovuto a due motivi. In primo luogo, la RNasi A contaminata digerirà l'RNA specifico della RSV, che verrà successivamente incubato e assemblato con N. In secondo luogo, l'efficienza della digestione RNasi A è molto più bassa in RSV. Questo perché gli RNA si assemblano in modo diverso in diversi virus NNS. Le strutture cristalline conosciute di N:RNA mostrano che l'RNA si lega al di fuori del NC in VSV, ma all'interno del NC in RSV30,31. La configurazione dell'associazione dell'RNA verso l'interno del NC può portare a una bassa efficienza per la RNasi A per accedere e digerire.
Un altro metodo per ottenere N privo di RNA è quello di realizzare le troncazioni che tagliano sia il motivo N-terminale (N-braccio) che il motivo C-terminale (braccio C) di N. Tuttavia, questo N troncato privo di RNA non può essere usato per assemblare con l'RNA in un NC stabile perché il braccio N di N è piegato nelle sue subunità vicine interagendo con il dominio C-terminale (CTD) della precedente N subunità. Il braccio C esteso è posizionato sul CTD della successiva subunità N31.
Un metodo aggiuntivo per ottenere N privo di RNA è quello di preparare il mutante N. Ad esempio, il risultato ottenuto da Galloux et al. Tuttavia, ha due potenziali problemi per ulteriori caratterizzazioni strutturali. Un problema è la bassa stabilità di questo complesso mutante ad alte concentrazioni. L'altro problema è che il complesso mutante ha perso l'abilità di legame dell'RNA, che non può essere usata nella fase successiva dell'assemblaggio.
Nonostante le enormi sfide, abbiamo stabilito e ottimizzato il protocollo per ottenere NC specifici del virus utilizzando la coespressione di N con un chaperone P. Recentemente, un altro metodo di successo è quello di creare una codifica di costruzione a fusione chimerica per P1-50-TEV-N1-405-8xHis per MeV33,34. N0P può essere ottenuto dopo la scissione della proteasi TEV. La purezza di N0P dipende dall'efficienza delle scissioni TEV, che tagliano la fusione chimerica tra la proteina N e P.
Invece di utilizzare il metodo di fusione chimerica, abbiamo progettato un costrutto di coespressione bi-cistronica. In particolare, i costrutti dicoespressionedel complesso N 0 P sono stati progettati e progettati in due telai di lettura aperti, comprendenti l'intera lunghezza di N (1-391) con un His-tag 10x a N-terminale nel primo ORF e i peptidi N-terminali (1-126) da P nel secondo ORF20. In breve, la procedura complessiva della purificazione N0P è purificare N0P e N-RNA con tag His-tagged dai campioni di lysis cellulare con perline di cobalto, rimuovere l'RNA non specifico e il complesso di RNA N:cellulare con colonna Q e ottenere un complesso N0P puro con la colonna SEC. Nella fase SEC, il rapporto di A260/A280 può essere monitorato e ricontrollato con l'estrazione dell'RNA dallefrazioni di piccoN 0 P.
Collettivamente, in questo protocollo, i passaggi più critici sono la strategia per progettare la costruzione della coespressione del complesso N0P e usando una colonna di affinità di serie e scambio ioniale per separare il complesso N0P privo di RNA dagli altri complessi di RNA N-cellular. L'efficienza della strategia di coespressione per ottenere il complesso N0P è relativamente bassa; circa il 50% delle proteine N è ancora complesso di RNA N-cellulare. Il protocollo può anche essere applicato per ottenere N0P privo di RNA e l'assemblaggio con RNA specifico con N per ottenere un complesso N:RNA di altri virus NNS.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
I programmi di ricerca nel laboratorio Liang di Emory sono supportati dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) degli Stati Uniti, dal National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio R01GM130950 e dal Research Start-Up Fund presso la Emory University School of Medicine. L'autore riconosce i membri del laboratorio Liang per il supporto utile e la discussione critica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
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