Summary
För djupgående mekanistisk analys av respiratoriska syncytial virus (RSV) RNA syntes, rapporterar vi ett protokoll om att använda förkläde fosfoprotein (P) för coexpression av RNA-fria nukleoprotein (N0)för efterföljande in vitro montering av virus-specifika nucleocapsids (NCs).
Abstract
Användningen av en autentisk RNA-mall är avgörande för att främja den grundläggande kunskapen om viral RNA-syntes som kan vägleda både mekanistisk upptäckt och analysutveckling inom virologi. RNA-mallen för icke-segmenterade NNS-RNA-virus (negative-sense), såsom respiratoriskt syncytial virus (RSV), är inte en RNA-molekyl ensam utan snarare ett nukleoprotein (N) inkapslat ribonukleoproteinkomplex. Trots vikten av den autentiska RNA mallen, generation och montering av en sådan ribonucleoprotein komplex förblir sofistikerad och kräver djupgående klargörande. Den största utmaningen är att den överuttryckta RSV N binder icke-specifikt till cellulära RNAs för att bilda slumpmässiga nukleocapsidliknande partiklar (NCLPs). Här etablerade vi ett protokoll för att erhålla RNA-fria N (N0) först genom att samreage uttrycka N med ett förkläde fosfoprotein (P), sedan montera N0 med RNA oligos med den RSV-specifika RNA-sekvensen för att erhålla virusspecifika nukleocapsids (NCs). Detta protokoll visar hur man kan övervinna svårigheten vid beredningen av detta traditionellt utmanande virala ribonukleoproteinkomplex.
Introduction
Icke-segmenterade NNS-RNA-virus (Negative Sense) inkluderar många signifikanta mänskliga patogener, såsom rabies, ebola och respiratoriskt syncytial virus (RSV)1,2. RSV är den främsta orsaken till luftvägssjukdom som bronkiolit och lunginflammation hos små barn och äldre vuxna över helavärlden 3. För närvarande finns inga effektiva vacciner eller antivirala behandlingar tillgängliga för att förebygga eller behandla RSV4. Som en del av livscykeln fungerar RSV-genomet som mall för replikering av RSV RNA-beroende RNA-polymeras för att producera ett antigenom, som i sin tur fungerar som mall för att generera ett avkommagenom. Både genom- och antigenom-RNAs är helt inkapslade av nukleoproteinet (N) för att bilda nukleokapslarna (NCs)3. Eftersom NCs fungerar som mallar för både replikering och transkription av RSV-polymerasen, är korrekt NC-sammansättning avgörande för att polymerasen ska få tillgång till mallarna för RNA-syntes5. Intressant nog, baserat på de strukturella analyserna av NNS virala polymeraser, är det hypotetiskt att flera N-proteiner övergående dissocierar från NCs för att tillåta tillgång till polymeras och återbindas till RNA efter RNA-syntesen6,7,8,9,10,11,12.
För närvarande har RSV RNA polymerisationsanalys etablerats med renad RSV-polymeras på korta nakna RNA-mallar13,14. RSV-polymerasens aktiviteter når dock inte optimalt, vilket observerats i de icke-processiva och abortiva produkter som genereras av RSV-polymerasen vid användning av nakna RNA-mallar. Bristen på NC med virusspecifikt RNA är en primär barriär för ytterligare mekanistisk förståelse av RSV RNA-syntesen. Därför blir användning av en autentisk RNA-mall ett kritiskt behov av att främja den grundläggande kunskapen om RSV RNA-syntes. De kända strukturerna hos nukleocapsidliknande partiklar (NCLPs) från RSV och andra NNS RNA-virus avslöjar att RNAs i NCLPs antingen är slumpmässiga cellulära RNAs eller genomsnittliga virala genomiska RNAs15,16,17,18,19. Tillsammans är det största hindret att N binder icke-specifikt till cellulära RNAs för att bilda NCLPs när N är överuttryckt i värdcellerna.
För att övervinna detta hinder etablerade vi ett protokoll för att få RNA-fri (N0)först och montera N0 med autentiskt viralt genomiskt RNA i NCLPs20. Principen för detta protokoll är att erhålla en stor mängd rekombinant RNA-fritt N (N0)genom att samremonera N med ett förkläde, N-terminaldomänen för RSV fosfoprotein (PNTD). Den renade N0P kunde stimuleras och monteras i NCLPs genom att lägga till RSV-specifika RNA oligos, och under monteringsprocessen förskjuts förkläde PNTD vid tillsats av RNA oligos.
Här beskriver vi ett protokoll för generering och montering av RSV RNA-specifika NCs. I detta protokoll beskriver vi molekylär kloning, proteinberedning, in vitro-montering och validering av den komplexa sammansättningen. Vi lyfter fram kloningsstrategin för att generera bi-cistronic konstruktioner för protein coexpression för molekylär kloning. För proteinberedning beskriver vi förfarandena för cellkultur, proteinutvinning och rening av proteinkomplexet. Sedan diskuterar vi metoden för in vitro-montering av de RSV RNA-specifika NCs. Slutligen använder vi storleksuteslutning kromatografi (SEC) och negativ fläck elektronmikroskopi (EM) för att karakterisera och visualisera de monterade NCLPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Molekylär kloning
OBS: Ligase Independent Cloning (LIC) användes för att göra en RSV bi-cistronic coexpression konstruktion plasmid. LIC är en metod som utvecklades i början av 1990-talet och som använder 3'-5' Exo-aktiviteten hos T4 DNA-polymerasen för att skapa överhäng med komplementaritet mellan vektorn och DNA-insatsen21,22. Konstruktionerna gjordes med 2BT-10 vektor-DNA, som består av en 10x Hans tagg vid N-terminalen i Open Reading Frame (ORF) (Figur 1).
- Utför linjärisering av LIC-vektorer med hjälp av SSPI-matsmältningen.
- Kombinera 10 μL SSPI 10X-buffert, 4 μL SSPI-enzym vid en koncentration av 5 U/μL, motsvarande volym på 5 μg vektorminiprep-DNA och steril ddH2O till 100 μL.
- Inkubera smältan i 3 timmar vid 37 °C.
- Kör smältan på en 1,0% agarose gel för extraktion av vektor-DNA.
- Använd ett gelextraktionskit för att utföra extraktion och rening. Suspendera den slutliga volymen vektor-DNA i 30 μL ddH2O och lagra den vid -20 °C.
- Förbered DNA-skären för N1-391 och P1-126 med N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer och P1-126 Reverse Primer (Tabell 1).
OBS: Det finns tillräcklig överlappning med den linjäriserade vektorn för att säkerställa en smälttemperatur på mellan 55 °C och 60 °C. För den omvända primern finns det tillräcklig överlappning med den omvända kompletterande delen av den linjäriserade vektorn av samma anledning.- Utför PCR-förstärkning av DNA-insatsen med hjälp av förhållandena i tabell 2 och tabell 3.
- Extrahera det förstärkta DNA-inlägget. Kör PCR-produkterna från föregående steg på en 1,0% agarose gel, extrahera sedan och rena banden genom gelextraktion. Suspendera den slutliga volymen extraherat DNA i 15 μL ddH2O.
- T4 DNA-polymerasbehandling av vektor och sätt in DNA (Tabell 4).
OBS: Behandlingen måste utföras separat för vektor-DNA och insatsens DNA.- Inkubera blandningen i 40 minuter vid rumstemperatur. Värm sedan polymerasen vid 75 °C i 20 minuter. Förvara reaktionsblandningen vid -20 °C.
- Glödgning LIC vektor och insatsen vektor.
- Ställ in en negativ kontroll med 2 μL LIC vektor-DNA och 2 μL sterilt ddH2O.
- Kombinera 2 μL infogat DNA och 2 μL LIC-vektor-DNA från de tidigare T4 DNA-polymerasreaktionerna i ett 0,2 ml-rör.
- Utför glödgningsreaktionen vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Släcker reaktionen med 1,3 μL EDTA vid en koncentration av 25 mM.
- Omvandla reaktionen till 100 μL E. coli Top10 kompetenta celler och plätera dem på en ampicillin urvalsplatta23,24.
- Identifiera de positiva konstruktionerna.
- Förbered plasmid miniprep-lösningen. Detta kan göras genom koloniplockning och vaccination i LB-media. Vanligtvis är 3 kolonier tillräckliga.
- Inkubera blandningen över natten vid 37 °C.
- Centrifugera blandningen vid 4 560 x g i 10 minuter och kassera supernaten.
- Återanvänd pelletsen i 250 μL P1-buffert och förbered plasmidminipreps med hjälp av ett spinnminiprep-kit.
- Genomföra en matsmältningsanalys av miniprep-produkten med AseI eller andra restriktionsenzymer.
- Ladda prover på 0,8% agarose gel och kör den smälta plasmiden. Analysera gelén under en UV-lampa.
- Använd en sekvenseringstjänst för att validera sekvensen av den positiva produkten.
- Få coexpression DNA-insatsen.
- Utför PCR för att erhålla N1-391 och P1-126 med den tidigare konstruerade 2BT-10 N1-391 och 2BT-10 P1-126 som mallar.
- Utför 1st PCR för att erhålla N1-391 från 2BT-10 N1-391-konstruktionen med PCR-förhållandena i tabell 2 och tabell 3 med N1-391 Framåt primer och omvänd primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGGGCG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Utför2:a PCR för att erhålla P1-126 från 2BT-10 P1-126-konstruktionen med hjälp av framåtprimer: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́och P1-126 Reverse primer (använd PCR-villkoren i tabell 2 och tabell 3). - Slutligen, utför överlappning PCR på de blandade produkterna av de tidigare 2 PCR-reaktionerna för att slå samman N1-391 och P1-126. Använd N1-391 Forward primer och P1-126 Reverse primer. Använd PCR-villkoren i tabell 5 och tabell 6.
- Sammanfoga vektorn och DNA-insatsen.
- Behandla pcr-produkten med T4 DNA-polymeras enligt protokollet i steg 1.3.
- Anneal LIC vektor och PCR produkt följer protokollet i steg 1.4.
- Identifiera de positiva konstruktionerna efter protokollet i steg 1.5.
2. Proteinuttryck och rening
OBS: Använd E. coli för den bicistroniska konstruktionen av samuttryck av både N och P. Odla cellerna vid 37 °C, men utför uttrycket vid en reducerad temperatur (16 °C) över natten. Rena proteinkomplexen genom en kombination av koboltkolonn, jonutbyte och storleksuteslutning av kromatografi (figur 2).
- Använd E. coli BL21(DE3) stam för proteinproduktion. Odla 4 L cellkulturer vid 37 °C i LB (Luria Broth) medium tills OD600 når 0,6.
- Sänk temperaturen till 16 °C. En timme senare, inducera uttrycket med 0,5 mM isopropyl 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) över natten.
- Centrifugera cellerna vid 4 104 x g i 25 min och kassera sedan supernaten.
- Återanvänd cellpellets i 200 ml lysbuffert A (50 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, 10% glycerol och 0, 2% NP40). Använd 50 ml lysbuffert för att återanvända cellpelletsen från 1 L cellkultur.
- Lysa cellerna genom ultraljudsbehandling i 15 min, 3 sekunder på och 3 sekunder av. Sedan centrifugceller på 37 888 x g i 40 min.
OBS: Protokollet kan pausas genom att frysa cellerna före ultraljudsbehandling i en -80 °C frys. - Ladda supernatanten i en koboltgravitationskolonn (diameter x längd: 2,5 cm x 10 cm) med ~10mL pärlor förjämförda med 5-10 kolumnvolymer (CV) lysbuffert.
- Tvätta kolonnen med 5 CV buffert B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glycerol och 5 mM imidazol) och 5 CV buffert C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glycerol och 5 mM imidaz).
- Eluera proteinet från pärlorna med 2 CV buffert D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl och 250 mM imidazol).
- Späd det eluterade proteinet 5x med QA-buffert (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glycerol) för Q-kolumnen.
- Tvätta 5 ml Q-kolonnen med QA-buffert för att balansera kolonnen och ladda sedan det utspädda provet i Q-kolonnen med hjälp av den peristaltiska pumpen (t.ex. kanin).
- Ladda Q-kolumnen i HPLC-maskinen tillsammans med QA-buffert och QB-buffert (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1,5 M NaCl, 5% glycerol). Ställ in flödeshastigheten som 1 ml/min.
- Kör programmet "pumptvätt" för att tvätta maskinen med QB-buffert följt av QA-buffert (1-2 CV/var). Ställ in systemflödet på 3 ml/min.
- Ställ in UV1 på 280 nm och UV2 till 260 nm. Använd en 96 djupbrunnsplatta för att samla upp fraktionerna.
- Elute proteiner med en stegvis gradient av elueringsmedel (QB Buffer) som applicerar 3-4 CV för varje koncentration, vilket ökar andelen med 5% varje gång från 0% QB. N0P proteinkomplex kommer ut vid 15% QB Buffer.
- När allt protein har eluerats, tvätta kolonnen med 100% QB-buffert (2 CV).
- Isolera proteinet med gelfiltrering Superdex 200 Öka 10/300 GL-kolonnen (diameter x längd: 1,0 cm x 30 cm) och jämvikt med buffert E (20 mM HEPES pH 7,4 och 200 mM NaCl).
- Analysera proteinhaltiga fraktioner av SDS-PAGE.
3. In vitro-montering av den virusspecifika nc
OBS: In vitro-sammansättningen av den RSV-specifika NC (N:RNA) utfördes genom att inkubera det beredda N0P-komplexet med RNA-oligos. Sedan användes SEC-kromatografi för att skilja monteringskomplexet från N0P och överskott av RNA (Figur 2).
- Blanda och inkubera det renade N0P-komplexet med RNA-oligo med det molekylära förhållandet 1:1,5 vid rumstemperatur i 1 timme, vanligtvis är 1 ml av proteinet N0P med en koncentration av 1 mg/ml tillräckligt för nästa steg. Ställ in kontrollprovet, som bara innehåller samma mängd N0P-protein.
- Förjämför gelfiltreringen Superdex 200 Öka 10/300 GL-kolonnen med bufferten E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
- Centrifugera provet med 21 130 x g i 15 minuter, ta bort eventuell nederbörd och ladda supernaten till SEC-kolumnen.
- Jämför SEC-kromatografibilderna av N:RNA-monteringsprovet och N0P-kontrollprovet, kombinera förhållandet A260/A280 för att identifiera vilka toppar som är det monterade N-RNA, N0P och gratis RNA.
- Samla toppfraktionerna, kör SDS-PAGE-gelén eller gör galler.
- För monteringen N-RNA-komplexet, samla alla fraktioner av N-RNA-topp, gör RNA-extraktionen och kör Urea-PAGE-gelen för att dubbelkolla längden på specifika RNA, vilket är detsamma som blandat och inkuberat i första steget.
4. Göra negativa fläcknät
OBS: Negativ fläckelektronmikroskopi (EM) är en metod där molekylerna adsorberas till en kolfilm och sedan bäddas in i ett lager av tungmetallatomer. Negativ fläck EM ger en hög bildkontrast, vilket gör det enkelt att se och beräkningsjustera partiklarna. En annan fördel är att adsorptionen av partiklarna till en kolfilm vanligtvis inducerar molekylerna att hålla sig till nätet med få föredragna orienteringar. När molekylerna är i en liknande orientering är det lätt att dela upp dem i strukturellt distinkta klasser. Negativ fläck EM är således den lämpliga tekniken för att vägleda provberedning25,26 (figur 3).
- Mikrovågsugn eller värm 5 ml ddH2O i en liten glasbägare med en Volframvärmare tills den kokar.
- Väg 37,5 mg uranylformat och tillsätt till 5 ml uppvärmd ddH2O för att göra en 0,75% uranylformatfärgningslösning. Rör under en aluminiumfolie täckt bägare för att skydda mot ljus.
- Tillsätt 4 μL 10 M NaOH till färglösningen och fortsätt att röra om i 15 minuter, skyddad från ljuset.
- Filtrera lösningen genom ett filter på 0,22 mm till ett provrör.
- Använd glödurladdning för att göra de kontinuerliga kolbelagda EM-nätenhydrofila 27.
OBS: Gallret placeras inuti en kammare som är ansluten till en strömförsörjning. När hög spänning appliceras joniseras gasen i kammaren och de negativt laddade jonerna deponeras på kolnäten för att göra dem hydrofila. - Klipp och vik en parafilmsremsa. Rör 2 droppar 40 μL av bufferten på ena sidan av parafilmen och rör ytterligare 2 droppar 40 μL färglösning på andra sidan.
- För att göra EM-kolnäten, applicera 3 μL proteinprov i 1 minut.
- Blot gallret mot ett blotting papper.
OBS: Gallret tvättas 2x med buffert och 1x med 0,75% uranylformatfärgningslösningen blottad efter varje steg. - Håll gallerytan i den andra droppen på 0,75% uranylformatfärgningslösning i 30 sekunder.
- Blot gallret mot ett blotting papper för att ta bort överflödig fläcklösning och låt gallret lufttorka.
- Förvara rutnäten i rutnätsboxen före avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rening av RNA-fritt N0P-protein
Med detta protokoll kan ett storskaligt lösligt heterodimeriskt RSV N0P-komplex erhållas. Hela längden på N och N terminal del av P proteiner uttrycktes tillsammans med 10X His-Tag på N proteinet i E. coli. N0P renades med hjälp av en kobolt kolumn, jon utbyte och storlek uteslutning kromatografi. N0P innehåller både N- och N-plint i full längd men innehöll inte cellulärt RNA baserat på UV-absorbansen A260/A280 förhållande20 (Figur 4).
Montering av N-RNA och kontroll med negativ fläck
Vi visade sedan att den renade N0P kunde stimuleras och monteras i Nuceloplasmid-liknande partiklar (NCLPs) genom att inkubera med specifika RNA oligos. NCLPs monterades genom att inkubera N0P med RNA oligos med förhållandet 1:1.5 vid rumstemperatur i 1 timme och sedan springa genom gelfiltreringskolonnen. När N:RNA-komplexet bildas visar det tre toppar:1: a toppen är N: RNA, den2: a toppen är N0P, och 3rd-toppen är överskottsfritt RNA. Den högsta fraktionen av N:RNA-toppen skapar de negativa fläckrutnäten för kontroll med EM20 (Figur 5).
Figur 1. Illustrationen av plasmidkonstruktionerna. A. Konstruktionen av RSV N1-391; B. Konstruktionen av RSV P1-126; C. Bi-cistronic konstruktionen för coexpression av N1-391 och P1-126. Den första genen RSV N1-391, den andra genen RSV P1-126, den antibiotikaresistenta genen (AmpR) och promotorerna markeras i gula, cyan,rosa respektive orange lådor. Sammanfattningsvis är geninsatserna i RSV N1-391 och RSV P1-126 konstruerade separat och monterade. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Flödesschemat för reningen av proteinkomplexet N1-391P1-126. Den beskriver inokuleringen och storskaliga uppvuggningar av E. coli-cellkulturen och skördar cellen genom centrifugation. Följt av celllys renas proteinproverna av affinitetskromatografi (dvs. Co2+-kolumn), jonutbytekromatografi (dvs. Q-kolumn) och uteslutning av gelfiltreringsstorlek (SEC) kromatografi. Proteinproverna analyseras vidare av SDS-PAGE-gelén. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3. Förberedelse av negativa fläck EM rutnät för avbildning. A. Glow släpper ut gallret. B. Proceduren för negativa färgning rutnät visas. Pincetterna används för att plocka upp ett galler, följt av applicering av proteinprovet i 1 minut. Gallret är blottat med blottingpapper. Gallret tvättas två gånger med buffert och två gånger med 0,75% uranylformat färglösning. Gallret hålls i den andra färgningslösningen i 30 sekunder. Gallret blottas efter varje tvätt och lufttorkas efter den slutliga blottningen. C. Gallret lagras i rutnätsboxen för avbildning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Representativa resultat av samköpet av N1-391P1-126-komplexet. A. SEC-profilen på N1-391P1-126. B. SEC-profilen för församlingen N1-391P1-126 med RNA. C. SDS-PAGE-gelén visar N-proteinet endast för N-RNA-komplexet och banden för både N- och P-proteiner i N1-391P1-126-komplexet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. Representativa bilder av N-RNA. A och B är representativa negativa fläck EM-bilder av N-RNA från N1-391-RNA-toppen i figur 4. N-RNA-komplexen färgas med hjälp av det förfarande som beskrivs i figur 3. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Grundfärger | |||
| N1-391 Framåt | 5'-TAKTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Omvänd | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Framåt | 5'-TAKTCCAATCCAATGCAATGGAAAGTTCGCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Omvänd | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTTTTTCCTCGTAGC-3' | ||
Tabell 1. Primersekvenser.
| PCR-förstärkning av DNA-insats | |
| 15 μL | 10x Pfu polymeras reaktionsbuffert |
| 3 μL | Framåtprimer (100 μM koncentration) |
| 3 μL | Omvänd primer (100 μM koncentration) |
| 15 μL | dNTP-blandning vid 2,5 mM koncentration |
| 6 μL | Plasmid-DNA innehåller genen N eller P (100ng/ μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu-polymeras vid 2,5U/μL |
| Volym att fylla till 150 μL | Steril ddH2O |
Tabell 2. PCR-förstärkning av DNA-skärreagenser.
| PCR-amplicering av DNA-insats | |||
| steg | Tid | temperatur | Cykler |
| denaturering | 4 min. | 95 ºC | 1 |
| denaturering | 45 sekunder. | 95 ºC | 30 |
| Glödgning | 30 sekunder. | 62 ºC | |
| Tillägg* | 90 sekunder. | 72 ºC | |
| förlängning | 10 min. | 72 ºC | 1 |
| hålla | ∞ | 4 ºC | 1 |
| Blandningen på 150 μL kan köras i tre separata PCR-reaktioner (3 x 50 μL). | |||
| *För Pfu DNA-polymerasen är 1 kb/min den rekommenderade hastigheten för förlängningsfasen. Här är både längden på N1-391-genen eller P1-126-genen kortare än 1,5 kb. | |||
| Således användes 90 sekunder för förlängningssteget. | |||
Tabell 3. PCR-förstärkning av DNA-skär termocykleringsprogram.
| T4 DNA-polymerasbehandling | |
| 10 x Buffert | 2 μL |
| Vektor/sätt in DNA (0.1 pmol vektor eller 0.2 pmol insats) | 5 μL |
| dNTP* vid 25 mM | 2 μL |
| DTT på 100 mM | 1 μL |
| T4 DNA-polymeras (LIC-kvalificerad) | 0,4 μL (1,25 U) |
| Steril ddH2O | 9,6 μL |
| *dGTP användes för vektorn, och dCTP användes för insatsen DNA. | |
Tabell 4. T4 DNA-polymerasbehandling.
| Överlappa PCR | |
| 15 μL | 10 X Pfu polymeras reaktionsbuffert |
| 3 μL | Framåt primer (100 μM) |
| 3 μL | Omvänd primer (100 μM) |
| 15 μL | dNTP Mix (2,5 mM) |
| 3 μL | DNA från 1st rund PCR som innehåller genen N1-391 (100 ng/μL ) |
| 3 μL | DNA från1:a runda PCR som innehåller genen P1-126 (100 ng/μL ) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu-polymeras (2,5 U/μL) |
| Volym att fylla till 150 μL | Steril ddH2O |
Tabell 5. Överlappa PCR-reagenser.
| Överlappa PCR | |||
| steg | Tid | temperatur | Cykler |
| denaturering | 4 min. | 95 °C | 1 |
| denaturering | 45 sekunder. | 95 °C | 30 |
| Glödgning | 30 sekunder. | 62 °C | |
| Tillägg* | 2 min. | 72 °C | |
| förlängning | 10 min. | 72 °C | 1 |
| hålla | ∞ | 4 °C | 1 |
| Blandningen på 150 μL kan köras i tre separata PCR-reaktioner (3 x 50 μL). | |||
| *För Pfu DNA-polymerasen är 1 kb/min den rekommenderade hastigheten för förlängningsfasen. Här är den totala längden på genen N1-391 och P1-126 kortare än 2,0 kb. Således användes 2 minuter för förlängningssteget. | |||
Tabell 6. Överlappa PCR termocykleringsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kända nukleocapsidliknande partikelstrukturerna (NCLP) av de icke-segmenterade negativa RNA-virusen (NNS) visar att de monterade NCLPs är det komplexa N med värdulära RNAs när de överuttrycks i bakteriella eller eukaryota uttryckssystem15,16,17,18,19. Tidigare studier har försökt få RNA gratis N med en mängd olika metoder, såsom RNase A matsmältning, hög salttvätt eller justering av olika pH-buffertar för att ta bort de ospecificerade cellulära RNAs28,29. Ingen av ovanstående metoder kan dock användas för montering av virusspecifika NCs. För att få den RNA-fria RSV N försökte vi också en kombination av metoder, inklusive RNase A-matsmältning, hög salt (1,5M NaCl) tvätt, justering av buffert pH från pH 5,0 till pH 9,0, proteindenaturering och omjustering. Efter många misslyckade försök kunde vi fortfarande inte få RNA-fria N med ovanstående metoder. Vi kommer kortfattat att diskutera försöken och de potentiella orsakerna.
En metod för att få RNA-fria N är att smälta värdcellulära RNA i monterade NCLPs med RNase A. I VSV, inkubationen av den renade NCLP med RNase A vid en slutlig koncentration av 1mg/ml vid 37 °C i 1 h helt avlägsnade RNA från NC28. Renade tomma oligomeric N inkuberades sedan med poly-A (250-nt eller längre) i ett molar förhållande på 1:5 i närvaro av RNase hämmare. Analys av RNA isolerade från rekonstituerade N:poly-A visade att RNA var ungefär 90 nt lång. Detta föreslog att RNA utanför nukleoproteinet är mottagliga för ospecificerad matsmältning av den förorenade RNase A från föregående steg. Strategin för RNase En matsmältning för att ta bort RNA lyckades inte när den tillämpades på RSV. Detta kan bero på två skäl. Först kommer förorenade RNase A att smälta det RSV-specifika RNA, som därefter kommer att inkuberas och monteras med N. För det andra är effektiviteten hos RNase A-matsmältningen mycket lägre i RSV. Detta beror på att RNAs monteras olika i olika NNS-virus. De kända kristallstrukturerna i N: RNA visar att RNA binder utanför NC i VSV, men inuti NC i RSV30,31. Konfigurationen av RNA-bindning inåt hos NC kan leda till låg effektivitet för RNase A att komma åt och smälta.
En annan metod för att få RNA-fria N är att göra de trunkeringar som skär både N-terminalmotivet (N-armen) och C-terminalmotivet (C-armen) av N. Emellertid kan denna trunkerade RNA-fria N inte användas för att montera med RNA in i en stabil NC, därför att N-beväpna av N viks in i dess neighboring underenheter, genom att interagera med C-terminaldomänen (CTD) av den prejudikat N-underenheten. Den förlängda C-armen är placerad på CTD för nästa N-underenhet31.
En ytterligare metod för att få RNA-fria N är att förbereda mutant N. Till exempel visade resultatet som erhållits av Galloux et al. att RSV RNA-fritt N0P-komplex kunde erhållas genom coexpression av en K170A/ R185A dubbel N-mutant med N-ändstationen P i bakterier32. Det har dock två potentiella problem för ytterligare strukturella karakteriseringar. Ett problem är den låga stabiliteten i detta mutantkomplex vid höga koncentrationer. Den andra frågan är att mutantkomplexet förlorade RNA-bindningsförmågan, som inte kan användas i nästa steg av monteringen.
Trots de enorma utmaningarna har vi etablerat och optimerat protokollet för att få virusspecifika NCs med hjälp av coexpression av N med ett förkläde P. Nyligen är en annan framgångsrik metod att göra en chimerisk fusionskonstruktion kodning för P1-50-TEV-N1-405-8xHis för MeV33,34. N0P kan erhållas efter TEV protease klyvning. Renheten hos N0P beror på effektiviteten hos TEV-klyvningar, som skär den chimeriska fusionen mellan N- och P-protein.
Istället för att använda den chimeriska fusionsmetoden designade vi en bi-cistronic coexpression-konstruktion. Specifikt har coexpressionkonstruktionerna i N0P-komplexet utformats och konstruerats i två öppna läsramar, bestående av hela längden på N (1-391) med en 10x His-tag vid N-terminal i den första ORF och N-terminalpeptiderna (1-126) från P i den andra ORF20. Kortfattat är det övergripande förfarandet för N0P-reningen att rena hans taggade N0P och N-RNA från cellulära lysisprover med koboltpärlor, ta bort det ospecificerade RNA och N:cellular RNA-komplexet med Q-kolumn och få ett rent N0P-komplex med SEC-kolumnen. I SEC-steget kan förhållandet mellan A260/ A280 övervakas och dubbelkontrolleras med RNA-extraktion från N0P-toppfraktionerna.
Kollektivt, i detta protokoll, är de mest kritiska stegen strategin att utforma konstruktionen av coexpression av N0P-komplex och använda en serie affinitet och jonutbyteskolumn för att separera RNA-fria N0P-komplexet från de andra N-cellulära RNA-komplexen. Effektiviteten i coexpression-strategin för att få N0P-komplex är relativt låg; cirka 50% N-protein är fortfarande N-cellulärt RNA-komplex. Protokollet kan också tillämpas för att få RNA gratis N0P och montering med specifikt RNA med N för att få N: RNA-komplex av andra NNS-virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskningsprogram i Liang-laboratoriet vid Emory stöds av US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) under tilldelningsnummer R01GM130950 och Research Start-Up Fund vid Emory University School of Medicine. Författaren erkänner medlemmarna i Liang-laboratoriet för hjälpsamt stöd och kritisk diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
