Summary
Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.
Abstract
Özgün bir RNA şablonunun kullanımı, virolojide hem mekanistik keşif hem de tahlil gelişimine rehberlik edebilecek viral RNA sentezinin temel bilgisini ilerletmek için kritik öneme sahiptir. Solunum sinsitial virüsü (RSV) gibi nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüslerinin RNA şablonu, tek başına bir RNA molekülü değil, nükleoprotein (N) kapsüllenmiş ribonikötoprotein kompleksidir. Otantik RNA şablonunun önemine rağmen, böyle bir ribonükleoprotein kompleksinin üretimi ve montajı sofistike kalır ve derinlemesine aydınlatma gerektirir. Asıl zorluk, aşırı ifade edilen RSV N'nin rastgele nükleocapsid benzeri parçacıklar (NCLP'ler) oluşturmak için özellikle hücresel RNA'lara bağlanmamasıdır. Burada, önce N'yi bir refakatçi fosfoprotein (P) ile birlikte ifade ederek RNA içermeyen N (N0)elde etmek için bir protokol oluşturduk, daha sonra virüse özgü nükleokapsidler (NC' ler) elde etmek için RSV'ye özgü RNA dizisi ile RNA oligos ile N0'ı birleştirdik. Bu protokol, geleneksel olarak zorlu olan bu viral riboniklioprotein kompleksinin hazırlanmasındaki zorluğun nasıl üstesinden gelindiğini göstermektedir.
Introduction
Nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüsleri kuduz, Ebola ve solunum senksiyal virüs (RSV)1,2gibi birçok önemli insan patojenini içerir. RSV, dünya çapında küçük çocuklarda ve yaşlı yetişkinlerde bronşiolit ve zatürre gibi solunum yolu hastalıklarının önde gelen nedenidir3. Şu anda, RSV4'üönlemek veya tedavi etmek için etkili bir aşı veya antiviral tedavi bulunmamaktadır. Yaşam döngüsünün bir parçası olarak, RSV genomu, RSV RNA bağımlı RNA polimerazının bir antigenom üretmek için çoğaltma şablonu olarak hizmet eder ve bu da bir soy genomu oluşturmak için şablon görevi görür. Hem genom hem de antigenom RNA'ları, nükleocapsidleri (NC' ler) oluşturmak için tamamen nükleoprotein (N) tarafından kapsüllenir3. NC'ler RSV polimeraz tarafından hem çoğaltma hem de transkripsiyon için şablonlar olarak hizmet verdiğinden, polimerazın RNA sentezi 5 şablonlarına erişmesi için uygunNCmontajı çok önemlidir. İlginçtir ki, NNS viral polimerazlarının yapısal analizlerine dayanarak, birkaç N proteininin, RNA sentezi 6 ,7,8,9,10,11,12'densonra polimerazın erişimine izin vermek için NC'lerden geçici olarak ayrıştıği varsayılıyor.
Şu anda, RSV RNA polimerizasyon tahlilleri, kısa çıplak RNA şablonları13 , 14üzerinde saflaştırılmış RSV polimeraz kullanılarak kurulmuştur. Bununla birlikte, RSV polimerazının faaliyetleri, çıplak RNA şablonları kullanılırken RSV polimeraz tarafından üretilen işlemsel olmayan ve iptal edici ürünlerde gözlendiği gibi optimale ulaşmaz. Virüse özgü RNA ile NC eksikliği, RSV RNA sentezinin daha fazla mekanistik anlaşılması için birincil engeldir. Bu nedenle, özgün bir RNA şablonu kullanmak, RSV RNA sentezinin temel bilgisini ilerletmek için kritik bir ihtiyaç haline gelir. RSV ve diğer NNS RNA virüslerinden gelen nükleapsid benzeri parçacıkların (NCLP' ler) bilinen yapıları, NCLP'lerdeki RNA'ların rastgele hücresel RNA'lar veya ortalama viral genomikRNA'lar 15 , 16,17,18,19olduğunu ortaya koymaktadır. Birlikte, ana engel, N ana hücrelerde aşırı ifade edildiğinde N'nin NCLP'leri oluşturmak için özellikle hücresel RNA'lara bağlanmamasıdır.
Bu engeli aşmak için, önce RNA içermeyen (N0)elde etmek ve N0'ı otantik viral genomik RNA ile NCLPs20'ye monte etmek için bir protokol oluşturduk. Bu protokolün prensibi, RSV fosfoprotein (PNTD)N-terminal etki alanı olan N'yi bir refakatçi ile birlikte ifade ederek büyük miktarda rekombinant RNA içermeyen N (N0)elde etmektir. Saflaştırılmış N0P, RSV'ye özgü RNA oligos eklenerek UYARılabilir ve NCLP'lere monte edilebilir ve montaj işlemi sırasında, RNA oligos ilavesi üzerine refakatçi PNTD yer değiştirir.
Burada, RSV RNA'ya özgü NC'lerin üretimi ve montajı için bir protokol detaylandırıyoruz. Bu protokolde moleküler klonlama, protein hazırlama, in vitro montaj ve karmaşık montajın doğrulanmasını tarif ediyoruz. Moleküler klonlama için protein koexpressyonu için bi-cistronic yapılar oluşturmak için klonlama stratejisini vurguluyoruz. Protein hazırlama için hücre kültürü, protein ekstraksiyonu ve protein kompleksinin saflaştırılması prosedürlerini açıklıyoruz. Daha sonra RSV RNA'ya özgü NC'lerin in vitro montajı yöntemini tartışıyoruz. Son olarak, monte edilen NCLP'leri karakterize etmek ve görselleştirmek için boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve negatif leke elektron mikroskopisi (EM) kullanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Moleküler klonlama
NOT: Ligase Bağımsız Klonlama (LIC), RSV bi-cistronic coexpression yapı plazmid yapmak için kullanılmıştır. LIC, 1990'ların başında geliştirilen ve vektör ile DNA kesici ucu 21 , 22 arasında tamamlayıcılık ile çıkıntılar oluşturmak için T4 DNA polimerazının3'-5'Exo aktivitesini kullanan bir yöntemdir. Yapılar, Açık Okuma Çerçevesinin (ORF) N-terminalini 10x His etiketinden oluşan 2BT-10 vektör DNA'sı kullanılarak yapılmıştır (Şekil 1).
- SSPI sindirimi kullanarak LIC vektörlerinin doğrusallaştırılması gerçekleştirilir.
- 10 μL SSPI 10X tamponu, 4 μL SSPI enzimini 5 U/μL konsantrasyonda, eşdeğer hacimde 5 μg vektör miniprep DNA'yı ve steril ddH2O ila 100 μL'yi birleştirin.
- Sindirimi 37 °C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.
- Vektör DNA'sının çıkarılması için% 1.0 agarose jel üzerinde sindirimi çalıştırın.
- Ekstraksiyon ve saflaştırma yapmak için bir jel ekstraksiyon kiti kullanın. Vektör DNA'sının son hacmini 30 μL ddH2O'da askıya alın ve -20 °C'de saklayın.
- N1-391 Forward Primer,N 1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer ve P1-126 Reverse Primer(Tablo1) kullanarak DNA kesici uçlarınıN 1-391 ve P 1-126 için hazırlayın.
NOT: 55 °C ile 60 °C arasında bir erime sıcaklığı sağlamak için doğrusal vektörle yeterli örtüşır. Ters astar için, aynı nedenle doğrusallaştırılmış vektörün ters tamamlayıcı teli ile yeterli örtük vardır.- Tablo 2 ve Tablo 3'tekikoşulları kullanarak DNA kesici ucunun PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
- Güçlendirilmiş DNA kesici uçlarını çıkarın. PCR ürünlerini önceki adımdan % 1.0 agarose jel üzerinde çalıştırın, ardından bantları jel ekstraksiyonu ile ayıklayın ve arındırın. Çıkarılan DNA'nın son hacmini 15 μL ddH2O'da askıya alın.
- Vektör ve insert DNA'nın T4 DNA polimeraz tedavisi (Tablo 4).
NOT: Vektör DNA'sı ve kesici uç DNA'sı için tedavi ayrı ayrı yapılmalıdır.- Karışımı oda sıcaklığında 40 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, polimerazı 75 ° C'de 20 dakika boyunca ısı devre dışı bırakın. Reaksiyon karışımını -20 °C'de saklayın.
- LIC vektörü ve kesici uç vektörü tavla.
- 2 μL LIC vektör DNA'sı ve 2 μL steril ddH2O ile negatif bir kontrol kurun.
- Önceki T4 DNA polimeraz reaksiyonlarından 2 μL kesici uç DNA'sı ve 2 μL LIC vektör DNA'sını 0,2 mL'lik bir tüpte birleştirin.
- Tavlama reaksiyonlarını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca gerçekleştirin.
- Reaksiyonu 25 mM konsantrasyonda 1,3 μL EDTA ile söndür.
- Reaksiyonu 100 μL E. coli Top10 yetkin hücrelere dönüştürün ve ampisilin seçim plakası23,24üzerine plakalayın.
- Pozitif yapıları tanımlayın.
- Plazmid miniprep çözeltisini hazırlayın. Bu, LB medyasında koloni toplama ve aşılama yoluyla yapılabilir. Genellikle, 3 koloni yeterlidir.
- Karışımı 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Karışımı 4.560 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
- Peletleri 250 μL P1 tamponunda yeniden biriktirin ve bir spin miniprep kiti kullanarak plazmid minipreps hazırlayın.
- AseI veya diğer kısıtlama enzimlerini kullanarak miniprep ürününün sindirim analizini yapın.
- Örnekleri% 0.8 agarose jel üzerine yükleyin ve sindirilen plazmidi çalıştırın. Jeli bir UV lambası altında analiz edin.
- Pozitif ürünün sırasını doğrulamak için bir sıralama hizmeti kullanın.
- İfade DNA ekini alın.
- Şablon olarak daha önce oluşturulmuş2BT-10 N 1-391 ve 2BT-10 P 1-126'yı kullanarak N 1-391 ve P1-126'yı elde etmek için PCR gerçekleştirin.
- N1-391 Forward astar ve Ters Astar 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATCAATGCGGCCG ile Tablo 2 ve Tablo 3'teki PCR koşullarını kullanarak 2BT-10 N 1-391 yapısından N 1-391 elde etmek için 1st PCR'yi gerçekleştirin
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - İleri astarı kullanarak2BT-10 P 1-126 yapısından P1-126 elde etmek için 2nd PCR'ı gerçekleştirin: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́ ve P1-126 Ters astar (Tablo 2 ve Tablo 3'tekiPCR koşullarını kullanın). - Son olarak, N1-391 ve P 1-126'yı birleştirmek için önceki2PCR reaksiyonunun karışık ürünlerinde çakışarak PCR gerçekleştirin. N1-391 İleri astarı ve P1-126 Ters astarı kullanın. Tablo 5 ve Tablo 6'dakiPCR koşullarını kullanın.
- Vektöre ve DNA kesici ucuna katılın.
- 1.3. adımdaki protokolü takiben üst üste binen PCR ürününü T4 DNA polimeraz ile tedavi edin.
- Adım 1.4'teki protokolü izleyen LIC vektör ve PCR ürününü tavla.
- Adım 1.5'te protokolü izleyen pozitif yapıları tanımlayın.
2. Protein ekspresyyürü ve saflaştırma
NOT: Hem N hem de P'nin ekspresyonunun iki cistronic yapısı için E. coli kullanın, hücreleri 37 °C'de kültüre edin, ancak ifadeyi bir gecede azaltılmış sıcaklıkta (16 °C) gerçekleştirin. Kobalt sütunu, iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisinin bir kombinasyonu ile protein komplekslerini arındırın (Şekil 2).
- Protein üretimi için E. coli BL21(DE3) suşunu kullanın. OD600 0,6'ya ulaşana kadar LB (Luria Broth) ortamında 37 °C'de 4 L hücre kültürü yetiştirin.
- Sıcaklığı 16 °C'ye düşür. Bir saat sonra, bir gecede 0,5 mM izopropil 1-thio-D-galaktopyranoside (IPTG) ile ifadeye neden olur.
- Hücreleri 25 dakika boyunca 4.104 x g'da santrifüj edin ve ardından süpernatantı atın.
- Hücre peletlerini 200 mL lizis tamponU A'da (50 mM sodyum fosfat, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, %10 gliserol ve%0.2 NP40) yeniden biriktirin. Hücre peletlerini 1 L hücre kültüründen yeniden kullanmak için 50 mL lizis arabelleği kullanın.
- Hücreleri sonication ile 15 dakika, 3 saniye açık ve 3 saniye kapalı olarak lyse. Daha sonra 40 dakika boyunca 37.888 x g'da santrifüj hücreleri.
NOT: Protokol, sonikasyondan önce hücrelerin -80 °C dondurucuda dondurulmasıyla duraklatılabilir. - Süpernatantı, 5-10 sütun hacmi (CV) lizis tamponu ile önceden dengelenmiş ~10mL boncuk içeren bir kobalt yerçekimi sütununa (çap x uzunluk: 2,5 cm x 10 cm) yükleyin.
- Kolonu 5 CV B tamponu ile yıkayın (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, %10 gliserol ve 5 mM imidazol) ve 5 CV tampon C (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, %10 gliserol ve 5 mM imidazol).
- 2 CV tampon D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl ve 250 mM imidazol) kullanarak boncuklardan proteini elute edin.
- Q sütunu için eluted proteini 5x QA tamponu (50 mM Tris-HCl pH 8.0, % 5 Gliserol) ile seyreltin.
- Sütunu dengelemek için 5 mL Q sütununu QA arabelleği ile yıkayın, ardından seyreltilmiş numuneyi peristaltik pompayı (örneğin Tavşan) kullanarak Q sütununa yükleyin.
- Q sütununu QA tamponu ve QB tamponu (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, %5 gliserol) ile birlikte HPLC makinesine yükleyin. Akış hızını 1 mL/dk olarak ayarlayın.
- Makineyi QB tamponu ve ardından QA tamponu (her biri 1-2 CV) ile yıkamak için "pompa yıkama" programını çalıştırın. Sistem akışını 3 mL/dak olarak ayarlayın.
- UV1'i 280 nm'ye ve UV2'yi 260 nm'ye ayarlayın. Kesirleri toplamak için 96 derin kuyu plakası kullanın.
- Her konsantrasyonun 3-4 CV'sini uygulayan, her seferinde% 0 QB'den başlayarak yüzdeyi% 5 artıran, adım adım bir elüasyon maddesi (QB Tamponu) gradyanı kullanarak proteinleri elute edin. N0P protein kompleksi %15 QB Tamponda çıkacaktır.
- Tüm protein ele geçirildikten sonra, sütunu% 100 QB Tampon (2 CV) ile yıkayın.
- Proteini jel filtrasyonu ile izole edin Superdex 200 Arttır 10/300 GL kolonu (çap x uzunluk: 1,0 cm x 30 cm) ve E tamponu (20 mM HEPES pH 7,4 ve 200 mM NaCl) ile dengele.
- Protein içeren fraksiyonları SDS-PAGE ile analiz edin.
3. Virüse özgü NC'nin in vitro montajı
NOT: RSV'ye özgü NC'nin (N:RNA) in vitro montajı, hazırlanan N0P kompleksinin RNA oligos ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirildi. Daha sonra, montaj kompleksini N0P ve fazla RNA'dan ayırmak için SEC kromatografisi kullanılmıştır (Şekil 2).
- Saflaştırılmış N0P kompleksini 1 saat boyunca oda sıcaklığında 1:1,5 moleküler oranı ile RNA oligo ile karıştırın ve kuluçkaya yatırın, genellikle 1 mg / mL konsantrasyondaN 0P proteininin 1 mL'si bir sonraki adım için yeterlidir. Yalnızca aynı miktarda N0P proteini içeren kontrol örneğini ayarlayın.
- Jel filtrasyon Superdex 200 Arttırıcı 10/300 GL sütununu E tamponu (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl) ile önceden dengelenin.
- Numuneyi 15 dakika boyunca 21.130 x g ile santrifüjlayın, herhangi bir yağışı kaldırın ve süpernatantı SEC sütununa yükleyin.
- N:RNA montaj örneğinin ve N0P kontrol örneğinin SEC kromatografi görüntülerini karşılaştırın, hangi tepelerin birleştirilmiş N-RNA,N 0P ve serbest RNA olduğunu belirlemek için A 260 /A280 oranını birleştirin.
- Tepe kesirlerini toplayın, SDS-PAGE jelini çalıştırın veya ızgaralar yapın.
- Montaj N-RNA kompleksi için, N-RNA zirvesinin tüm fraksiyonlarını toplayın, RNA ekstraksiyonunu yapın ve ilk adımda karıştırılmış ve inkübe edilmiş olan belirli RNA'nın uzunluğunu iki kez kontrol etmek için Üre PAGE jelini çalıştırın.
4. Negatif leke ızgaraları yapma
NOT: Negatif leke elektron mikroskopisi (EM), moleküllerin bir karbon filme adsorbe edildiği ve daha sonra ağır metal atom tabakasına gömdürüldürü bir yöntemdir. Negatif leke EM, yüksek görüntü kontrastı üreterek parçacıkları görmeyi ve hesaplamalı olarak hizalamayı kolaylaştırır. Diğer bir avantaj, parçacıkların bir karbon filme adsorpsiyonunun genellikle molekülleri az tercih edilen yönelimlerle ızgaraya yapışmaya teşvik etmesidir. Moleküller benzer bir yönelimde olduklarında, onları yapısal olarak farklı sınıflara ayırmak kolaydır. Negatif leke EM bu nedenle numune hazırlamaya rehberlik etmek için uygun tekniktir25,26 ( Şekil3).
- Mikrodalga fırın veya ısı 5 mL ddH2O küçük bir cam beherde Tungsten ısıtıcı kullanarak kaynayana kadar ısıtın.
- 37,5 mg uranil formatını tartın ve % 0,75 uranil formatlı boyama çözeltisi yapmak için 5 mL ısıtılmış ddH2O ekleyin. Işıktan korumak için alüminyum folyo kaplı bir beherin altına karıştırın.
- Boyama çözeltisine 4 μL 10 M NaOH ekleyin ve ışıktan korunarak 15 dakika karıştırmaya devam edin.
- Çözeltiyi 0,22 mm'lik bir filtreden test tüpüne filtreleyin.
- Sürekli karbon kaplı EM ızgaralarını hidrofilik hale getirmek için kızdırma deşarjı kullanın27.
NOT: Şebekeler, bir güç kaynağına bağlı bir odanın içine yerleştirilir. Yüksek voltaj uygulandığında, odanın içindeki gaz iyonize olur ve negatif yüklü iyonlar hidrofilik hale getirmek için karbon şebekelerinde birikir. - Bir parafilm şeridini kesin ve katlayın. Parafilm'in bir tarafında 40 μL tamponun pipet 2 damlası ve diğer tarafa 40 μL boyama çözeltisinin 2 damlası daha boru.
- EM karbon ızgaralarını yapmak için 1 dakika boyunca 3 μL protein örneği uygulayın.
- Izgaraları bir şişkin kağıda karşı şişirin.
NOT: Izgaralar tampon ile 2x ve her adımdan sonra şişirilmiş% 0.75 uranil formatlı boyama çözeltisi ile 1x yıkanır. - Izgara yüzeyini %0,75 uranil formatlı boyama çözeltisinin ikinci damlasında 30 saniye tutun.
- Fazla leke çözeltisini çıkarmak ve ızgaranın havayla kurumasını sağlamak için ızgarayı bir şişkin kağıda karşı şişirin.
- Görüntülemeden önce ızgaraları kılavuz kutusunda saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA içermeyen N0P proteininin saflaştırılması
Bu protokol ile büyük ölçekli çözünür heterodimerik RSV N0P kompleksi elde edilebilir. P proteinlerinin N ve N terminal kısmının tam uzunluğu, E. coli'dekiN proteini üzerinde 10X His-Tag ile birlikte ifade edildi. N0P kobalt kolonu, iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. N0P hem tam uzunlukta N hem de N terminali P içerir, ancak UV emici A 260 / A280 oranı20(Şekil 4)temel alan hücresel RNA içermez.
N-RNA montajı ve negatif leke ile kontrol
Daha sonra saflaştırılmış N0P'nin uyarılabileceğini ve belirli RNA oligosları ile inkübe edilerek Nuceloplasmid benzeri parçacıklara (NCLP' ler) monte edilebileceğini gösterdik. NCLP'ler, N 0 P'nin oda sıcaklığında1:1,5oranıyla RNA oligos ile 1 saat boyunca inkübe ederek monte edildi ve daha sonra jel filtrasyon kolonunun içinden geçirildi. N:RNA karmaşık formları, üç tepe gösterir: 1st tepe N:RNA, 2nd tepe N0P ve 3rd tepe aşırı ücretsiz RNA' dır. N:RNA zirvesinin en yüksek kısmı EM20 ile kontrol etmek için negatif leke ızgaralarını oluşturur (Şekil 5).
Şekil 1. Plazmid yapılarının illüstrasyonu. A. RSV N1-391'inyapısı; B. RSV P1-126'nınyapısı; C. N1-391 ve P 1-126'nın birlikte ifade için iki cistronic yapısı. İlk gen RSVN 1-391, ikinci gen RSV P1-126, antibiyotiğe dirençli gen (AmpR) ve promotörler sırasıyla sarı, siyan, pembe ve turuncu kutularda vurgulanır. Özetle, RSV N1-391 ve RSV P1-126'nın gen uçları ayrı ayrı inşa edilir ve monte edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Protein kompleksi N1-391 P 1-126'nınsaflaştırılmasının akış çizelgesi. E. coli hücre kültürünün aşılanması ve büyük ölçekli büyümelerini ve hücrenin santrifüjleme ile hasatını özetler. Hücre lizizinin ardından protein örnekleri benzeşim kromatografisi (yani Co2+ sütunu), iyon değişimi kromatografisi (yani Q sütunu) ve jel filtrasyon boyutu dışlama (SEC) kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Protein örnekleri SDS-PAGE jel tarafından daha fazla analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Görüntüleme için negatif leke EM ızgaralarının hazırlanması. A. Işıltı ızgaraları boşaltır. B. Negatif boyama ızgaraları için prosedür gösterilir. Cımbız, bir ızgarayı almak için kullanılır, ardından protein örneğini 1 dakika boyunca uygular. Izgaralar şişkin kağıtla şişirilmiş. Izgara iki kez tamponla ve iki kez % 0,75 uranil formatlı boyama çözeltisi ile yıkanır. Izgaralar ikinci boyama çözeltisi damlasında 30 saniye tutulur. Izgaralar her yıkamadan sonra şişirilir ve son şişkinlik sonrası havayla kurutulur. C. Izgaralar görüntüleme için ızgara kutusunda saklanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. N1-391 P 1-126kompleksinin birlikteleştirilmesinin temsili sonuçları. A. SEC profiliN 1-391P1-126. B. RNA'lı N1-391P1-126 derlemesinin SEC profili. C. SDS-PAGE jeli, N proteinini sadece N-RNA kompleksi için ve N1-391 P 1-126kompleksinin hem N hem de P proteinleri için bantları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. N-RNA'nın temsili görüntüleri. A ve B, Şekil 4'tekiN1-391-RNA zirvesinden N-RNA'nın temsili negatif leke EM görüntüleridir. N-RNA kompleksleri Şekil 3'teaçıklanan prosedür kullanılarak lekelenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Astar | |||
| N1-391 İleri | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Ters | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGCCTTTT-3' | ||
| P1-126 İleri | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Ters | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTTTTTCCTCGTAGC-3' | ||
Tablo 1. Astar dizileri.
| DNA kesici ucunun PCR amplifikasyonu | |
| 15 μL | 10x Pfu polimeraz reaksiyon tamponu |
| 3 μL | İleri astar (100 μM konsantrasyon) |
| 3 μL | Ters astar (100 μM konsantrasyon) |
| 15 μL | 2,5 mM konsantrasyonda dNTP karışımı |
| 6 μL | Plazmid DNA N veya P (100ng / μL) genini içerir |
| 7 μL | DMSO |
| 3 μL | 2,5U/μL'de Pfu polimeraz |
| 150 μL'ye kadar doldurulacak hacim | Steril ddH2O |
Tablo 2. DNA kesici uç reaktiflerinin PCR amplifikasyonu.
| DNA kesici ucunun PCR amplikasyonu | |||
| adım | Saat | sıcaklık | Döngü |
| Denatürasyon | 4 dk. | 95 ºC | 1 |
| Denatürasyon | 45 saniye. | 95 ºC | 30 |
| Tavlama | 30 saniye. | 62 ºC | |
| Uzantı* | 90 saniye. | 72 ºC | |
| uzantı | 10 dk. | 72 ºC | 1 |
| tutmak | ∞ | 4 ºC | 1 |
| 150 μL karışımı üç ayrı PCR reaksiyonunda (3 x 50μL) çalıştırılabilir. | |||
| *Pfu DNA polimeraz için uzatma aşaması için önerilen hız 1 kb/dk'dır. Burada hem N1-391 geninin hem de P1-126 geninin uzunlukları 1,5 Kb'tan kısadır. | |||
| Böylece uzatma adımı için 90 saniye kullanıldı. | |||
Tablo 3. DNA kesici uç termosiklon programının PCR amplifikasyonu.
| T4 DNA polimeraz tedavisi | |
| 10 x Arabellek | 2 μL |
| Vektör/Kesici Uç DNA 'sı (0,1 pmol vektör veya 0,2 pmol kesici uç) | 5 μL |
| dNTP* 25 mM'de | 2 μL |
| 100 mM'de DTT | 1 μL |
| T4 DNA polimeraz (LIC nitelikli) | 0,4 μL (1,25 U) |
| Steril ddH2O | 9,6 μL |
| *vektör için dGTP, kesici uç DNA'sı için dCTP kullanılmıştır. | |
Tablo 4. T4 DNA polimeraz tedavisi.
| PCR ile örtün | |
| 15 μL | 10 X Pfu polimeraz reaksiyon tamponu |
| 3 μL | İleri astar (100 μM) |
| 3 μL | Ters astar (100 μM) |
| 15 μL | dNTP Karışımı (2,5 mM) |
| 3 μL | N1-391 (100 ng/μL) genini içeren 1st yuvarlak PCR'den DNA |
| 3 μL | P1-126 (100 ng/μL) genini içeren 1st yuvarlak PCR'den DNA |
| 7 μL | DMSO |
| 3 μL | Pfu polimeraz (2,5 U/μL) |
| 150 μL'ye kadar doldurulacak hacim | Steril ddH2O |
Tablo 5. PCR reaktifleriyle örtün.
| PCR ile örtün | |||
| adım | Saat | sıcaklık | Döngü |
| Denatürasyon | 4 dk. | 95 °C | 1 |
| Denatürasyon | 45 saniye. | 95 °C | 30 |
| Tavlama | 30 saniye. | 62 °C | |
| Uzantı* | 2 dk. | 72 °C | |
| uzantı | 10 dk. | 72 °C | 1 |
| tutmak | ∞ | 4 °C | 1 |
| 150 μL karışımı üç ayrı PCR reaksiyonunda (3 x 50 μL) çalıştırılabilir. | |||
| *Pfu DNA polimeraz için uzatma aşaması için önerilen hız 1 kb/dk'dır. Burada, N1-391 ve P1-126 genlerinin toplam uzunluğu 2,0 Kb'den kısadır. Böylece uzatma adımı için 2 dakika kullanıldı. | |||
Tablo 6. PCR termosiklon programıyla örtüşme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüslerinin bilinen nükleocapsid benzeri parçacık (NCLP) yapıları, birleştirilmiş NCLP'lerin bakteriyel veya ökaryotik ifade sistemlerinde aşırı ifade edildiğinde konak hücresel RNA'lara sahip karmaşık N olduğunu göstermektedir15,16,17,18,19. Önceki çalışmalar, RNase A sindirimi, yüksek tuz yıkama veya spesifik olmayan hücresel RNA'ları çıkarmak için farklı pH tamponlarını ayarlamak gibi çeşitli yöntemlerle RNA ücretsiz N almaya çalıştı28,29. Ancak, yukarıdaki yöntemlerin hiçbiri virüse özgü NC'lerin montajı için başarıyla kullanılamaz. RNA içermeyen RSV N'yi elde etmek için, RNase A sindirimi, yüksek tuz (1.5M NaCl) yıkama, tampon pH'ı pH 5.0'dan pH 9.0'a ayarlama, protein denatürasyonu ve yeniden doyma gibi yöntemlerin bir kombinasyonunu da denedik. Birçok başarısız denemeden sonra, yukarıdaki yöntemlerle hala RNA içermeyen N alamadık. Girişimleri ve olası nedenleri kısaca tartışacağız.
RNA içermeyen N elde ederek, RNase A ile birleştirilmiş NCLP'lerde konak hücresel RNA'yı sindirmek bir yöntemdir. VSV'de, saflaştırılmış NCLP'nin RNase A ile 37 °C'de 1mg/ml'lik son konsantrasyonda inkübasyonu 1 saat boyunca RNA'yı NC28'dentamamen çıkardı. Saflaştırılmış boş oliyomerik N daha sonra RNaz inhibitörlerinin varlığında 1:5 molar oranında poli-A (250 nt veya daha uzun) ile inkübe edildi. Yeniden inşa edilen N:poly-A'dan izole edilen RNA'nın analizi, RNA'nın yaklaşık 90 nt uzunluğunda olduğunu gösterdi. Bu, nükleoprotein dışındaki RNA'nın önceki adımdan kontamine RNase A tarafından spesifik olmayan sindirime duyarlı olduğunu ileri sürmektedir. RNA'yı kaldırmak için RNase A sindirim stratejisi RSV'ye uygulandığında başarılı olmadı. Bunun iki nedeni olabilir. İlk olarak, kontamine RNase A, daha sonra inkübe edilecek ve N ile birleştirilecek olan RSV'ye özgü RNA'yı sindirecektir. İkincisi, RNase A sindiriminin verimliliği RSV'de çok daha düşüktür. Bunun nedeni, RNA'ların farklı NNS virüslerinde farklı şekilde bir araya toplanmasıdır. N:RNA'nın bilinen kristal yapıları, RNA'nın VSV'de NC'nin dışına, ancak RSV30,31'deNC'niniçinebağlandığını göstermektedir. RNA bağlamasının NC'nin içe doğru yapılandırılması, RNase A'nın erişmesi ve sindirmesi için düşük verimliliğe yol açabilir.
RNA içermeyen N elde etmek için başka bir yöntem, hem N-terminal motifini (N-kol) hem de N'nin C-terminal motifini (C-kolu) kesen kesilmeleri yapmaktır. Ancak, bu kesilmiş RNA içermeyen N, RNA ile kararlı bir NC'ye birleştirmek için kullanılamaz, çünkü N'nin N kolu, emsal N alt biriminin C terminali etki alanı (CTD) ile etkileşime girerek komşu alt birleşimlerine katlanır. Uzatılmış C kolu bir sonraki N alt birliğininCTD'si 31'eyerleştirilmiştir.
RNA içermeyen N almak için ek bir yöntem mutant N hazırlamaktır. Örneğin, Galloux ve arkadaşları tarafından elde edilen sonuç, RSV RNA ücretsiz N0P kompleksinin, bakteri32'deP'nin N-terminusu ile bir K170A / R185A çift N mutantının birlikte ifade edilmesiyle elde edilebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, daha fazla yapısal niteleme için iki potansiyel sorunu vardır. Bir konu, bu mutant kompleksinin yüksek konsantrasyonlarda düşük stabilitesi. Diğer sorun, mutant kompleksinin bir sonraki montaj adımında kullanılamayan RNA bağlama yeteneğini kaybetmesidir.
Muazzam zorluklara rağmen, bir refakatçi ile N'nin ifadesini kullanarak virüse özgü NC'ler elde etmek için protokolü oluşturduk ve optimize ettik P. Son zamanlarda, bir başka başarılı yöntem, MeV33,34için P1-50-TEV-N1-405-8xHis için bir kimerik füzyon konstrüksiyon kodlaması yapmaktır. N0P, TEV proteaz dekoltesi sonrası elde edilebilir. N 0 P'nin saflığı,Nve P proteini arasındaki kimerik füzyonu kesen TEV bölünmelerinin verimliliğine bağlıdır.
Kimerik füzyon yöntemini kullanmak yerine, iki cistronic coexpression yapısı tasarladık. Özellikle, N 0 P kompleksinin ifade yapıları, ilk ORF'de N terminalinde10xHis etiketine sahip N 'nin (1-391) tam uzunluğunu ve ikinci ORF20'deP'den N-terminal peptitlerini (1-126) içeren iki açık okuma çerçevesinde tasarlanmış ve tasarlanmıştır. Kısaca, N0P saflaştırmanın genel prosedürü, etiketli N0P ve N-RNA'sını kobalt boncuklu hücresel lizis örneklerinden arındırmak, spesifik olmayan RNA ve Q sütunlu N:hücresel RNA kompleksini çıkarmak ve SEC sütunu ile saf bir N0P kompleksi elde etmektir. SEC adımında, A260/A280 oranı N0P tepe fraksiyonlarından RNA ekstraksiyonu ile izlenebilir ve iki kez kontrol edilebilir.
Toplu olarak, bu protokolde, en kritik adımlar, N 0 P kompleksinin birlikte ifadesinin inşasını tasarlama ve RNA ücretsizN0P kompleksini diğer N hücresel RNA komplekslerinden ayırmak için bir dizi benzeşim ve iyon değişimi sütunu kullanma stratejisidir. N0P kompleksini elde etmek için ifade stratejisinin verimliliği nispeten düşüktür; yaklaşık % 50 N proteini hala N hücresel RNA kompleksidir. Protokol ayrıca RNA ücretsiz N0P almak ve diğer NNS virüslerinin N:RNA kompleksini elde etmek için N ile belirli RNA ile montaj için de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Emory'deki Liang laboratuvarındaki araştırma programları, ABD Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından R01GM130950 ödül numarası altında ve Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Araştırma Başlangıç Fonu tarafından desteklenmektedir. Yazar, Liang laboratuvarı üyelerini yararlı destek ve eleştirel tartışma için kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
