Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA) - Hücresel Kinetiği Ölçmek için Çok Yönlü Bir Teknik

doi: 10.3791/62025 Published: March 18, 2021

Summary

Mikropatterned diziler kullanılarak tek hücrelerden floresan muhabir zaman kurslarının alınması için bir yöntem sunuyoruz. Protokolde, tek hücreli dizilerin hazırlanması, canlı hücre tarama zaman atlamalı mikroskopinin kurulumu ve çalışması ve otomatik önseçim, görsel kontrol ve yapıştırma alanı başına hücre entegre floresan zaman kurslarının izlenmesi için açık kaynaklı bir görüntü analiz aracı açıklanmaktadır.

Abstract

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA), yüksek verimdeki tek tek hücrelerden floresan sinyallerinin zaman akışlarını toplamak için çok yönlü bir yöntemdir. Genel olarak, kültürlü hücrelerden tek hücreli zaman kurslarının kazanılması hücre hareketliliği ve hücre şekillerinin çeşitliliği ile engellenir. Yapışkan mikro diziler tek hücreli koşulları standartlaştırır ve görüntü analizini kolaylaştırır. LISCA, tek hücreli mikroarrayları tarama zaman atlamalı mikroskopi ve otomatik görüntü işleme ile birleştirir. Burada, tek hücreli floresan zamanı derslerini LISCA formatında almanın deneysel adımlarını açıklıyoruz. Gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) için mRNA kodlaması kullanarak mikropatterned bir diziye yapışan hücreleri transfect ediyoruz ve tarama zaman atlamalı mikroskopi ile paralel olarak yüzlerce hücrenin eGFP ekspresyon kinetiğini izliyoruz. Görüntü veri yığınları, tek hücreli floresan süresi kursları oluşturmak için floresan yoğunluğunu seçilen hücre konturları üzerinde entegre eden yeni geliştirilen yazılım tarafından otomatik olarak işlenir. mRNA transfection sonrası eGFP ifade süresi derslerinin, mRNA'nın ifade ve bozulma oranlarını ortaya koyan basit bir kinetik çeviri modeli ile iyi tanımlandığını gösteriyoruz. Lisca'nın sinyal kesme apoptoz bağlamında birden fazla belirtecin olay süresi korelasyonları için daha fazla uygulaması tartışılmıştır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Son yıllarda tek hücreli deneylerin önemi belirginleşmiştir. Tek hücrelerden elde edilen veriler, hücreden hücreye değişkenliğin araştırılmasına, hücre içi parametre korelasyonlarının çözülmesine ve topluluk ölçümlerinde gizli kalan hücresel kinetiklerin tespitine izin verir1,2,3. Binlerce tek hücrenin hücresel kinetiğini paralel olarak araştırmak için, hücrelerin birkaç güne kadar birkaç saatlik bir zaman diliminde standart koşullar altında izlenmesini sağlayan yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır ve ardından nicel veri analizi 4. Burada, mikro yapılandırılmış dizilerin kullanımını zaman atlamalı mikroskopi ve otomatik görüntü analizi ile birleştiren Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesini (LISCA) sunuyoruz.

Mikro yapılandırılmış tek hücreli diziler üretmek için çeşitli yöntemler oluşturulmuş ve literatür5,6'da yayınlanmıştır. Burada, Mikro Ölçekli Plazma Tarafından Başlatılan Protein Desenlemesini (μPIPP) kısaca açıklıyoruz. μPIPP kullanarak tek hücreli dizi imalatının ayrıntılı bir protokolü de referans7'debulunur. Tek hücreli dizilerin kullanımı, her hücre için tanımlanmış mikroçevirtiler sunan standartlaştırılmış yapışma noktalarına binlerce hücrenin hizalanmasına olanak tanır ve böylece deneysel değişkenlik kaynağını azaltır (Şekil 1A). Tek hücreli diziler, çeşitli hücresel süreçleri belirtmek için amaçlanan floresan belirteçlerin zaman akışlarını izlemek için kullanılır. Tarama zaman atlamalı modunda uzun süreli mikroskopi, tek hücreli dizilerin geniş bir alanını izlemenize ve böylece birkaç saat hatta gün boyunca yüksek aktarım hızına sahip tek hücreli verileri örneklemenize olanak tanır. Bu, dizinin her konumundan zaman çizgisi görüntü yığınları oluşturur (Şekil 1B). Büyük miktarda görüntü verisini azaltmak ve istenen tek hücreli floresan süresi derslerini verimli bir şekilde çıkarmak için, hücrelerin konumlandırılmasından yararlanan otomatik görüntü işleme gereklidir (Şekil 1C).

LISCA'nın zorluğu, deneysel protokolleri ve hesaplama araçlarını hücresel kinetiğin nicel ve tekrarlanabilir verilerini üreten yüksek verimli bir test oluşturacak şekilde uyarlamaktır. Bu yazıda, bireysel yöntemlerin ve bunların bir LISCA testinde nasıl birleştirildiklerinin adım adım bir açıklamasını sunuyoruz. Örnek olarak, yapay mRNA teslimatından sonra geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) ekspresyonunun zaman seyrini tartışıyoruz. mRNA teslimini izleyen eGFP ifadesi, reaksiyon hızı denklemleri modelleme çevirisi ve mRNA'nın bozulması ile açıklanmaktadır. eGFP konsantrasyonunun zaman akışı için model işlevinin zaman içinde her bir hücre için floresan yoğunluğunun LISCA okumasına takılması, mRNA bozulma hızı gibi model parametrelerinin en iyi tahminlerini verir. Temsili bir sonuç olarak, iki farklı lipid bazlı transfeksiyon ajanının mRNA teslimat verimliliğini ve parametre dağılımlarının nasıl farklılık gösterir olduğunu tartışıyoruz.

Figure 1
Şekil 1: (A) mikro desenli tek hücreli dizileri (B) tarama zaman atlamalı mikroskopi ve (C) kaydedilen görüntü serilerinin otomatik görüntü analizini birleştiren LISCA iş akışının gösterimi. Tek hücreli diziler, faz kontrastı görüntüsünün yanı sıra eGFP ifade hücrelerinin floresan görüntüsünde(A)görülebileceği gibi, mikropattern üzerindeki hücrelerin düzenlenmesine yol açan hücre itici ara alana sahip iki boyutlu bir hücre yapışkan kare deseni oluşur. Tüm mikro yapılandırılmış alan, bir dizi konumda(B)tekrar tekrar görüntü alan bir tarama zaman atlamalı modunda görüntülenir. Kaydedilen görüntü serileri, zaman içinde hücre başına floresan yoğunluğunu(C)okumak için işlenir. Ölçek çubukları: 500 μm (A), 200 μm (C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figure 2
Şekil 2: Tek hücreli mikroarrayları (A) tarama zaman atlamalı mikroskopi (B) ile birleştiren veri toplama. Zaman atlamalı deneyin hazırlanmasında, 2D mikropattern yapışıklık karelerine sahip tek hücreli bir dizi hazırlanır (1), ardından hücre tohumlama ve hücrelerin mikropattern (2) üzerindeki hizalanması ve zaman atlamalı ölçüm sırasında sıvı kullanımı sağlayan altı kanallı slayta bir perfüzyon sisteminin bağlanması (3). Tarama zaman atlamalı bir deney kurulur (4) ve hücreler zaman atlamalı deney sırasında perfüzyon sistemi üzerinden bir mRNA lipoplex çözeltisi enjekte ederek mikroskopta transkripsiyon edilir (5). Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Mikro yapılandırılmış tek hücreli dizi imalatı (Şekil 2A)

  1. μPIPP dizi imalatı için gerekli malzemeleri hazırlayın.
    1. pH 7.4'te steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
    2. 25 °C'de en az 18 MΩcm dirençle steril ultra saf su hazırlayın.
    3. PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) çalışma solüsyonlarını 150 mM NaCl ve 10 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) içeren ultra saf suda 2 mg/mL PLL-PEG konsantrasyonu ile hazırlayın.
    4. Yüzey kaplaması için hücre dışı matris protein çözeltisi hazırlayın: PBS'de 1 mg/mL fibronektin (FN).
    5. Fotolithografi8 ile üretilen ve yeniden kullanılabilir bir ana olarak işlev gören bir mikropattern ile silikon gofret hazırlayın. Mikropattern, her biri 6 mm genişliğe ve 18 mm yüksekliğe sahip altı şerit halinde düzenlenmiş, 30 μm kenar uzunluğuna, 12 μm derinliğe ve 60 μm kareler arası mesafeye sahip karelerden oluşur.
  2. Polidimetilsiloksinan (PDMS) monomerini %9 çaprazlinker (kütle %) ile karıştırın silikon elastomer kiti kullanarak ve bir kurutucu kullanarak kabarcıksız olana kadar yaklaşık 30 dakika degas. Silikon gofret kabaca 3-5 mm kalınlığında pdms tabakası ile dök ve kabarcıksız olana kadar yaklaşık 30 dakika boyunca tekrar gazdan arındırın.
    1. PDMS'yi en az 4 saat iyileştirmek için PDMS ile silikon gofretleri 50 °C'de bir fırına koyun.
  3. PDMS damgalarını kesin.
    1. Bir neşter kullanın ve altı mikropattern çizgi içeren PDMS katmanı bir PDMS başyapıtından kesin.
    2. PDMS şaheserini mikropattern yukarı bakacak şekilde bir banka yerleştirin.
    3. PDMS şaheserinin altı mikropattern şeridinin her birini bir jiletle PDMS damgasına kesin. Desenli alanın bir kısmını keserek PDMS damgalarının kenarlarının açık olmasına dikkat edin.
  4. PDMS damgalarını altı kanallı bir slaydın kapak kapağına yerleştirin (Şekil 3-1).
    1. Kaplamasız bir kapak kılıfı kullanın ve kapak kapağının koruma folyosunu dikkatlice çizerek altı kanallı slaytın kanal konumlarını işaretleyin. Daha sonra kapak kapağını koruma folyosu aşağı bakacak şekilde tezgaha yerleştirin.
    2. PDMS damgalarını mikropattern aşağı bakacak şekilde işaretli kanal konumlarındaki kapak kılıflarına cımbız kullanarak yerleştirin.
    3. Mikroskop altında PDMS damgalarının ekini kontrol edin. Bir PDMS damgası kapak altlığa tamamen iliştirilmişse, temas halindeki kareler ara alandan daha koyu görünür. PDMS damgasının kapak kılıfı içine bağlanması mikropattern kalitesi için çok önemlidir.
  5. Üzerinde altı PDMS damgası bulunan kapak sapını bir plazma temizleyicisine yerleştirin ve PDMS pulları ile kapak hidrofilik arasındaki yüzeyleri yapmak için oksijen plazması (basınç 0,2 mbar, 3 dakika boyunca~40W) ile tedavi edin ( Şekil 3-2).
  6. Mikropattern imalatının diğer tüm adımlarını bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. PLL-PEG çözeltisinin 15 μL'sini kullanın ve her PDMS damgasının yanında bir damla pipet kullanın, böylece PLL-PEG çözeltisi PDMS damgasının hidrofilik desenine emilir(Şekil 3-3). PLL-PEG'in oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
  7. 1 mL ultra saf suyu üzerinde PDMS pulları ile kapak boyunca durulayın ve cımbız kullanarak PDMS damgalarını çıkarın (Şekil 3-4). Daha sonra kapak kapağını 1 mL ultra saf su ile ikinci kez durulayın ve kurumasına izin verin.
  8. Kapak kapağı tamamen kuruduğunda, kapak kılıfı için altı kanallı yapışkan bir slayt yapıştırın (Şekil 3-4). Mikropatlanmış alanların kanalların alt kısmına hizalanmış olmasına dikkat edin.
  9. Yapıştırma karelerini FN ile işlevselleştirin.
    1. Her kanala 40 μL PBS doldurun.
    2. PBS'de 100 μg/mL FN çözümü hazırlayın.
    3. Her kanala 40 μL FN çözeltisi ekleyin(Şekil 3-5). FN çözeltisini, bir rezervuardan 40 μL çıkararak ve homojen bir çözelti üretmek için aynı kanalın karşı rezervuara 3 kez ekleyerek kanaldaki PBS ile iyice karıştırın. FN çözeltisini oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Her kanalı 120 μL PBS ile üç kez yıkayın (Şekil 3-6).
  10. Desen kalitesini kontrol etmek için, 9.2 adımında floresan etiketli bir FN kullanın. (Şekil 4A).
    NOT: PLL-PEG ve FN substrata birlikte bağlı olmadığı ve desenin kalitesi zamanla düşebileceğinden, μPIPP dizisini hücre tohumlamadan en fazla bir gün önce hazırlamanızı öneririz. Hazırlanan μPIPP dizisini buzdolabında saklayın.

Figure 3
Şekil 3: μPIPP ile tek hücreli mikroarray imalatı. (1) Yüzeyde üç boyutlu mikropattern yapıya sahip PDMS pulları altı kanallı bir slaytın kapak kapağı üzerine düzenlenir. (2) Üzerinde PDMS damgaları bulunan kapak, yüzeyleri hidrofilik hale getirmek için oksijen plazması ile muamele edilir. (3) PLL-PEG eklenir. Kılcal kuvvetler tarafından mikroyapıya emilir ve yüzeylerin PDMS damga hücresi iticisi tarafından kapsanmamasını sağlar. (4) Kapak, kalan PLL-PEG'i çıkarmak için su ile durulanır. Daha sonra PDMS damgaları kaldırılır ve altı kanallı yapışkan bir slayt kapak kapağına yapıştırılır. (5) Hücre dışı matrisin bir proteini olan fibronektin, PLL-PEG hücre yapıştırıcısı olmayan alanları yapmak için eklenir. (6) Altı kanallı slayt fosfat tamponlu salin ile yıkanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Hücre tohumlama (Şekil 2A)

NOT: Aşağıdaki yıkama adımları için, ilgili sıvıyı bir rezervuara ekleyin ve ardından bir kanalın karşı rezervuarından eşit miktarda sıvı çıkarın.

  1. Her kanalı 120 μL 37 °C tam takviyeli hücre büyüme ortamı ile yıkayın. Hücre süspansiyonu eklemeden önce, sadece kanalların orta ile doldurulmasını sağlayın, ancak rezervuarlarla doldurulmamasını sağlayın.
  2. HuH7 hücrelerini hücre geçişi için standart protokolünüzü izleyerek bir hücre kültürü şişesinden ayırın ve hücre süspansiyon konsantrasyonunu 4 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın.
  3. 40 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve bir rezervuardan 40 μL çıkararak ve homojen bir hücre dağılımına ulaşmak için 3 kez aynı kanalın karşı rezervuara ekleyerek hücre büyüme ortamını hücre süspansiyonu ile karıştırın (Şekil 4B).
  4. Sadece kanalın hücre süspansiyonu ile doldurulması için kanaldan 40 μL süspansiyonu çıkarın.
  5. Slaydı bir inkübatöre koyun ve faz kontrastlı bir mikroskop kullanarak tohumlamadan sonra hücre yapışıklığı 1 saat kontrol edin.
  6. 120 μL 37 °C sıcak hücre büyüme ortamı ekleyin.
  7. Ancak, mikropattern üzerinde hücresel öz organizasyonu etkinleştirmek için inkübatörde 3 saat daha slayt (Şekil 4C).

Figure 4
Şekil 4: μPIPP dizisinin hücresel olarak kendi kendini organizasyonu ve kalite kontrolü. (A) Mikro yapılandırılmış yüzey, hücre itici polimer ile çevrili kırmızı renkte gösterilen kare FN kaplı yapışma lekelerinden oluşur. (B) Hücre tohumlamadan sonra, HuH7 hücreleri rastgele dağıtılır ve (C) esas olarak 4 saat boyunca yapışma noktalarına yapışır. İzinle yeniden basıldı 7. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Perfüzyon sistemi (Şekil 2A)

NOT: Perfüzyon sisteminin kullanımı sadece zaman atlamalı ölçüm sırasında reaktiflerin veya floresan belirteçlerin eklenmesi gerekiyorsa gereklidir. İhtiyaçlarınıza bağlı olarak, her kanalı ayrı bir perfüzyon sistemine bağlayabilir veya aynı perfüzyon sistemine seri olarak birkaç kanal bağlayabilirsiniz. Perfüzyon sistemlerinin sayısı bağımsız deneysel koşulların sayısına karşılık gelir. Tüpleri steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabinine bağlayın ve perfüzyon sistemine hava kabarcıklarının dahil edilmesini önleyin. Perfüzyon sistemi kullanılmazsa, zaman atlamalı ölçümden önce reaktifleri/işaretleyicileri bir biyogüvenlik kabinine ekleyin. Perfüzyon sistemi şirket içinde üretilmiştir, kullanılan malzeme Malzeme Tablosundalistelenmiştir. Perfüzyon sisteminin montajı daha önceaçıklanmıştır 9.

  1. 1 mL şırınna (yedek sporn ile) kullanın ve şırınnayı 1 mL 37 °C hücre büyüme ortamı ile doldurun.
  2. Şırındıcı vanayı kullanarak giriş tüpüne bağlayın ve tüpü orta ile doldurun.
  3. Giriş tüpünü bir kanalın rezervuarı ile bağlayın ve hava kabarcıklarının sıkışmadığından emin olun.
  4. Bu perfüzyon sistemine seri olarak başka bir kanal bağlamak için, mevcut kanalın giriş borusunun karşısındaki rezervuara bir seri konektör bağlayın. Bir sonraki kanala geçin ve seri konektörün serbest ucunu rezervuarlarından birine bağlayın.
  5. Gerekli sayıda kanal seri olarak bağlanana kadar önceki adımları yineleyin.
  6. Çıkış tüpünü doğrudan mevcut kanalın serbest rezervuara bağlayın. Perfüzyon sisteminin sızmadığını kontrol etmek için bağlı tüpü orta ile doldurun.
  7. Slaydın altı kanalı da bir perfüzyon sistemine bağlanana kadar önceki adımları yineleyin.
  8. Bağlı perfüzyon sistemlerine sahip slaydı daha fazla kullanıma kadar inkübatöre geri yerleştirin veya zaman atlamalı ölçüm için önceden 37 °C'ye ısıtılmış mikroskobun ısıtma odasına yerleştirin.

4. Zaman atlamalı mikroskopi (Şekil 2B)

NOT: Uzun süreli ölçümler için 37 °C'lik sabit bir sıcaklığı ve sabit bir CO2 seviyesini koruyun. CO2'yebağımlı hücre büyüme ortamına alternatif olarak, gaz inkübasyon sistemine gerek olmayan L15 ortamını kullanın.

NOT: Nicel görüntüleme için, arka plan floresanını azaltmak için zaman atlamalı ölçüm sırasında fenol kırmızısı olmayan hücre büyüme ortamını kullanın ve zaman atlamalı protokolün aynı ayarlarını ve teknik çoğaltmalar için aynı mikroskobu kullanın.

  1. 10x objektif ve uygun floresan filtreleri kullanarak, 750 ms pozlama süreleri (kameraya bağlı olarak), konum listesinde ardışık döngüler arasında 10 dakika zaman aralığı ve 30 saat gözlem süresi ile faz kontrastı görüntüsünü ve floresan görüntüsünü kaydetmek için bir zaman atlamalı protokol ayarlayın.
  2. Altı kanallı slaydı, hücrelerle birlikte 37 °C ılık ısıtma odasının numune tutucusunda tek hücreli dizilere yerleştirin. Perfüzyon sistemleri altı kanallı slayda bağlıysa, altı kanallı slaydın sıvı değişimi sırasında hareket ettirmediğine emin olmak için tüpleri bir miktar bant kullanarak sahne alanına sabitleyin. Sıvı atıkları toplamak için çıkış tüplerinin serbest uçlarını 15 mL reaksiyon tüpünün bir deliğinden geçirin.
  3. Tarama zaman atlamalı ölçümü için konum listesini ayarlayın. Konum listesi aracılığıyla ardışık döngüler arasında tanımlanan zaman aralığında konum sayısının taranabildiğinden emin olun. 10x hedefle, kamera çipi boyutuna bağlı olarak toplam mikropattern alanı taramak için kanal başına 10-30 pozisyon ayarlanabilir.
  4. Zaman atlamalı ölçüme başlayın. Uzun süreli ölçümlerin daha iyi görüntü kalitesi için otomatik odak düzeltme sistemi kullanın.

5. Floresan işaretleyici - mRNA transfection (Şekil 2B)

NOT: Bir boru sistemi ile bağlanan iki kanaldaki transfeksiyon için toplam 600 μL transfeksiyon karışımına ihtiyaç vardır (bir kanal için 300 μL). Belirtilen birimler, bağlı iki kanaldaki bir transfection'a başvurur.

  1. Serum azaltılmış ortamda 1 μL transfeksiyon maddesi seyrelterek bir transfeksiyon maddesi çözeltisi hazırlayın ve çözeltinin oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatmasını bırakın.
  2. 150 μL serum azaltılmış ortamda eGFP için 300 ng mRNA kodlamasını seyrelterek bir mRNA çözeltisi hazırlayın.
  3. MRNA çözeltisine 150 μL transfeksiyon maddesi çözeltisi ekleyerek transfeksiyon karışımını hazırlayın ve iyice karıştırın. Transfection karışımını oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya bırakın.
  4. Transfeksiyon karışımının inkübasyonu sırasında bir şırınna kullanarak boru sistemini 1 mL 37 °C sıcak PBS ile yıkayın. Tüpleri yıkırken mikroskop aşamasının hareket etmediğinden emin olun. Gerekirse zaman atlamalı ölçümü duraklatın.
  5. Transfeksiyon karışımını 300 μL serum azaltılmış ortam ekleyerek 0,5 ng/μL'lik son mRNA konsantrasyonuna seyreltin.
  6. Boru sistemini bir şırıng kullanarak transfeksiyon karışımı ile yıkayın ve mRNA lipoplexes'in 1 saat kuluçkaya yatmasına izin verin (gerekirse zaman atlamalı ölçümü duraklatın).
  7. Transfeksiyon inkübasyonunu durdurun ve bir şırınna kullanarak 1 mL 37 °C sıcak tam takviyeli hücre büyüme ortamı ile yıkayarak ilişkisiz mRNA lipoplexes'i boşaltın (gerekirse zaman atlamalı ölçümü duraklatın).

6. Görüntü analizi ve floresan okuma

  1. Görüntü analizini ilk kez çalıştırırken, "Python'da Otomatik Mikroyapı Analizi" (PyAMA) açık kaynaklı yazılımın0.1.6 sürümünü, orada verilen talimatlara göre belirtilen konum 10'dan yükleyin.
  2. Görüntü kanallarının (faz kontrastı ve floresan) çok görüntülü 16 bit TIFF dosyaları olarak kullanılabildiğine emin olun. Gerekirse, bunları uygun şekilde dönüştürün.
  3. PyAMA'yı başlatın ve analiz için görüntüleri açmak için Yığını aç... üzerine tıklayın.
  4. Açılacak her çok resimli TIFF dosyası için Aç'ı tıklatın ve dosyayı iletişim kutusunun sol tarafındaki yüklü dosyalar listesinde görüntülenecek şekilde seçin (Şekil 5-1).
  5. Analize dahil etmek için kanalları işaretleyin. Her kanal için aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. Yüklenen dosyalar listesinden kanalı içeren TIFF dosyasını seçin.
    2. Yeni kanal eklebölümünde, TIFF dosyasında kanalın dizinini seçin. Dizin oluşturma sıfır tabanlıdır; ilk kanalda dizin 0, ikinci kanalda dizin 1 vb. vardır.
    3. Kanal türünü seçin. İlgili görüntü kanalları için Faz karşıtlığı veya Floresan'ı ve hücre konturlarını gösteren ikili kanal için Segmentasyon'u seçin.
    4. İsteğe bağlı olarak, farklı floresan kanallarını ayırt etmek için kanalın bir etiketini girin: eGFP ve DAPI.
    5. Kanalı yapılandırdıktan sonra Ekle 'yitıklatın.
  6. Eklenen tüm kanallar iletişim kutusunun sağ tarafındaki kanal listesinde görüntülendiğinde, yığını yüklemek için Tamam'ı tıklatın.
  7. Aşama kontrastı görüntülerine (Şekil 5 -2)dayalı hücre tanıma için PyAMA'nın yerleşik segmentasyon algoritmasını kullanarak segmentasyon gerçekleştirmek için Araçlar | Binarize... ve binarized kanalı ile NumPy dosyası için bir dosya adı girin.
    NOT: Geçerli sürümde, binarized kanalın yüklenmesi için tüm kanalların yeniden yüklenmesi gerekir.
  8. Floresan kanalında arka plandüzeltmesi 11 yapmak için (Şekil 5-3), floresan kanalının ve segmentasyon kanalının yüklendiğinden emin olun. Segmentasyon kanalı yüklenmemişse, otomatik segmentasyon için bir faz kontrastı kanalının yüklendiğinden emin olun. "Arka Plan düzeltme araçları..." > gidin. ve düzeltilmiş floresan kanalı ile elde edilen TIFF dosyası için bir dosya adı seçin.
    NOT: Geçerli sürümde, arka planda düzeltilen kanalın yüklenmesi için tüm kanalların yeniden yüklenmesi gerekir.
  9. Önceden seçilmiş hücreleri (Şekil 5-4) ve entegre floresan sinyallerini (Şekil 5-5) zaman dilimleri arasında kaydırarak, sol taraftaki kanal menüsünde listelenen kanalları görüntüleyerek ve floresan zaman derslerini vurgulamak için hücrelere tıklayarak inceleyin (Şekil 1C). Uygun olmayan, yapışma noktasıyla sınırlı olmayan veya başka bir hücreye bağlı hücreleri daha fazla analizden dışlamak için hücre seçimini kullanın. Shift tuşuna basıp hücreyi tıklatarak veya hücreyi vurgulayıp Enter tuşunabasarak hücre seçimini okuma için değiştirin.
  10. Dosya | tıklayarak hücre alanı ve entegre floresan için tek hücreli zaman derslerini kaydedin (Şekil 5-6) Kaydedilecek dizini kaydedip seçme.

Figure 5
Şekil 5: PyAMA kullanılarak hızlandırılmış görüntü serilerinin otomatik görüntü işlemesi. (1) Her görüntüleme pozisyonu için faz kontrastı ve floresan görüntü serileri içe aktarılır. (2) Hücre konturları faz kontrastı görüntü yığınındaki segmentasyona göre belirlenir. (3) Floresan görüntülere arka plan düzeltmesi uygulanır. (4) Hücre konturları zaman içinde izlenir ve dışa aktarma için önceden seçilir. (5) Floresan yoğunluğu izlenen hücre hatlarına göre entegre edilir. (6) Tek hücreli hücre alanları ve entegre floresan yoğunlukları değerlendirilir ve her hücre için zaman kursları ihraç edilir. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. mRNA transfeksiyondan sonra çeviri kinetiğini analiz etmek için, daha önce Reiser ve ark.12tarafından açıklandığı gibi her tek hücreli zaman kursuna biyokimyasal oran denklemlerine dayalı bir çeviri modeli takın. Bu çalışmada kullanılan veriler ve kod herkese açıktır13.
  2. Her tek hücreli zaman kursu için, mRNA bozulma hızını ve çeviri başlangıcının zaman noktasını temsil eden çeviri modelinin tahmini sığdırma parametrelerini alın. Temsili sonuçlar bölümünde örnek bir veri kümesi ele alınmıştır.
  3. Hücre popülasyonları içindeki hücreden hücreye değişkenliği araştırmak için çeşitli deneysel koşullar için parametrelerin en iyi tahminlerinin dağılımları üzerinde daha fazla analiz yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LISCA yaklaşımı, floresan zaman kurslarını tek hücrelerden verimli bir şekilde toplamayı sağlar. Temsili bir örnek olarak, transfection sonrası tek hücreli eGFP ifadesini ölçmek için LISCA yönteminin nasıl uygulandığını özetliyoruz. LISCA deneyinin verileri, verimli mRNA ilaçlarının geliştirilmesi için önemli olan mRNA doğum kinetiğini değerlendirmek için kullanılır.

Özellikle iki lipid tabanlı mRNA dağıtım sisteminin çeviri başlangıç noktası ve tek hücre düzeyindeki ifade oranı açısından farklı etkisini gösteriyoruz. Hücreleri kültüre ettik ve partiyi iki popülasyona ayırdık. Bir subpopülasyon, protokol bölümünde açıklandığı gibi lipoplexes ile transkriptüs ile enfekte edildi. Diğer subpopülasyon, aynı son mRNA konsantrasyonuna sahip aynı mRNA kullanılarak, ancak mikroakışkan karıştırma12kullanılarak üretilen teslimat sistemi olarak lipid nanopartikülleri (LNP) ile transkrömedlenmiştir. Farklı bir lipit bileşimi ve lippoplexes ve LNP'lerin mRNA dağıtım sistemlerinin farklı imalatı nedeniyle, alım kinetiği etkilenmelidir. LISCA yöntemini kullanarak transfection sonrası çeviri başlangıcının t0 zaman noktasını ve hücrelerin transfected mRNA moleküllerinin m 0 ürününe ve çeviri oranına bağlı olan eGFP'yi ne kadar güçlü ifade ettiğini ölçüyoruz. Bu iki parametreyi elde etmek için şekil 6A'daçizilen üç aşamalı bir çeviri modeline uyuyoruz. mRNA moleküllerinin sitozolde t0 zaman noktasında başarılı bir şekilde salınmasından sonra, mRNA k TL oranı ile floresan olmayan doymamış eGFP G* 'ye çevrilir. Doymamış G* hız kM ila eGFP Gile olgunlaşır, floresan yoğunluğu zaman atlamalı ölçüm sırasında ölçülür. mRNA'nın yanı sıra (doymamış ve olgunlaşmış) eGFP zamanla δ ve γ ilgili bozulma oranlarıyla bozulur. Model sıradan diferansiyel denklemlerle tanımlanır ve G için analitik çözüm parametre tahmini için bir model işlevi olarak kullanılır. Model işlevi, Şekil 6B'de gösterildiği gibi tek hücreli zaman kurslarının her birine örnek zaman kursları (gri) ve ilgili uyumlarla (yeşil) donatılmıştır. Şekil 6C'de çeviri başlangıcının t0 zaman noktasının histogramlarını ve lipoplex transfected hücrelerin ifade oranı m0kTL'yi gösteriyoruz. Her iki parametre de her hücre için tahmin edildiğinden, bu parametrelerin korelasyonu scatterplot'ta gösterildiği gibi analiz edilebilir(Şekil 6D, mavi veri) ve LNP'lerle (kırmızı) transfected hücrelerle karşılaştırılabilir. Şekil 6D'degösterildiği gibi, LNP'lerle enfekte olan hücreler lipoplexes ile enfekte olmuş hücrelere kıyasla hücreden hücreye değişkenlik gösterir ve popülasyon ortalaması daha hızlı bir çeviri başlangıcının yanı sıra daha yüksek bir ifade oranı gösterir (siyah anahatlı kalın noktalar).

Bu iki veri kümesi, LISCA'nın mRNA transfection sonrası çeviriyi incelemek için nasıl kullanılabileceğinin sadece bir örneğidir. Daha fazla araştırma yapılabilir örneğin mRNA dizi modifikasyonlarına bağlı mRNA stabilitesi 14, çeşitli muhabir protein stabiliteleri 15veya siRNA aracılı mRNA bozulması 16.

Figure 6
Şekil 6: Tek hücreli eGFP çeviri kinetiğinin veri analizi. (A) mRNA teslimatından sonra muhabir protein eGFP'nin çeviri kinetiği, ilgili parametrelerle üç aşamalı reaksiyon hızı denklemi ile tanımlanabilir. (B) Model, transfeksiyon başlangıcının zaman noktası ( t 0 ) ve ifade oranı ( m0kTL) gibi model parametrelerini tahmin etmek için her tek hücreli eGFP ifade süresi kursuna (gri izler) (yeşil izler) monte edilir, mRNA teslim etkinliğini ölçmek için iki parametre. (C) Transfection başlangıç zamanı ve ifade hızı için parametre dağılımı histogramları. (D) Parametreler her hücre için tahmin edilirken, bu parametrelerin dağılım grafiği parametre korelasyonunu gösterir. Küçük noktalar tek bir hücrenin parametrelerini temsil eder. Çizim, mRNA LNP'leri (kırmızı) ve mRNA lipoplexes (mavi) ile enfekte olmuş hücreleri gösterir. Siyah anahatlı kalın noktalar ilgili nüfus ortalamasına karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada LISCA'yı hücre içi floresan etiketlerin hücresel kinetiğini tek hücreli düzeyde takip etmek için çok yönlü bir teknik olarak tanımladık. Başarılı bir LISCA denemesi gerçekleştirmek için, protokol bölümünün açıklanan adımlarının her biri ayrı ayrı oluşturulmalı ve ardından tüm adımlar birleştirilmelidir. LISCA'nın üç ana yönünün her biri çok önemli adımlara sahiptir.

Tek hücreli mikroarray imalatı
Mikroarrayın kalitesi çok önemlidir, çünkü mikroarray üzerindeki hücresel hizalama sadece diğer tüm deneysel adımlar için önemli değildir, aynı zamanda veri kalitesi üzerinde de etkilidir. Bu nedenle, desenin geometrisi ve imalat yöntemi kullanılan hücrelere göre uyarlanmalıdır. Bu makalede tartışılan temsili sonuçlar, karaciğer karsinom hücre hattı HuH7 ile (30 μm)2 kare desen üzerine hizalanmış olarak oluşturulmuştır. Bu desen geometrisi A549 veya HEK293 gibi diğer hücre hatları için de uygundur. BEAS-2B gibi daha büyük hücreler için, 35 μm kenar uzunluğuna ve 80 μm kareler arası mesafeye sahip daha büyük bir kare desen kullanılabilir. Açıklanan tohumlama prosedürü HuH7 hücreleri için optimize edilmiştir, ancak diğer birçok yapışık hücreye uyarlanabilir17. Örneğin, bazı hücre çizgileri, uzun hücreler aracılığıyla hücre hücresi temaslarını önlemek için yapışıklık noktalarının farklı boyutlarına ihtiyaç duyar veya yapışıklık noktaları arasında daha büyük aralıklara ihtiyaç duyar.

Mikropattern, yapıştırma alanı standart kültür yemeklerinde bir hücrenin ortalama alanını kabaca karşılayacak şekilde ayarlanmalıdır. Geometri yuvarlak veya kare olabilir ve hücre canlılığının ölçülebilir bir etkisi yoktur. Hücre hareketleri, hücrelerin genellikle döndüğünün görüldüğü yuvarlak desene kıyasla kareli bir desen üzerinde daha kısıtlı görünüyor. Yeni hücre hatları ilk kez kullanıldığında ayrı canlılık testi önerilir. Yapışıklık noktalarının yüksek doluluğuna ulaşmak ve aynı zamanda yapışıklık noktalarının çift doluluklarını en aza indirmek için belirli hücre hatları için tohum yoğunluğunun ayarlanması gerekir. Genellikle, yapıştırma alanı başına hücre sayısının ortaya çıkan doluluğu Poisson istatistiklerini izler ve sıfır, bir veya ikidir. Bu nedenle toplam doluluk% 60 ila% 80 arasında çift kişilik dolulukları önlemek için hedeflenmelidir17. Tohumlama protokolünün tohumlu hücre sayısı ve tohumlama ile ilk yıkama adımı arasındaki süre ile ilgili olarak uyarlanmış olması gerekebilir. Örneğin, tohumlamadan 30 dakika sonra 1 h yerine bir yıkama adımı (protokol bölüm 2 Hücre tohumlamanın 5 ve 6 numaralı adımlarına bakın) çift meşgul yapışıklık noktalarının sayısını azaltacak, aynı zamanda HuH7 hücreleri için toplam dolu yapışıklık noktalarının sayısını azaltacaktır.

Bir boru sisteminin kanal kaydıraklarına bağlanması zorunlu olmadığı için, en uygun konsantrasyon ve kuluçka süresini kontrol etmek için bir boru sistemi kullanmadan bir reaktif veya floresan işaretleyicinin kullanımını sağlamak daha kolaydır. İlgi çekici reaktif/işaretleyici için uygun bir protokol oluşturulduktan sonra, boru sistemi iş akışına dahil edilebilir.

Zaman atlamalı mikroskopi
Bir diğer önemli adım da zaman atlamalı ölçümün ayarlarıdır. Örneğin, floresan ve fototoksiklik etkilerinin fotobleaching önlemek için floresan belirteci için pozlama süresi dikkatlice seçilmelidir, ancak yine de iyi bir floresan sinyali sağlamak. Hızlandırılmış kurulumun bir diğer önemli parametresi, büyük ölçüde gözlenen hücresel kinetiklere bağlı olan mekansal ve zamansal çözünürlüğün en uygun kombinasyonudur. Yüksek zamansal çözünürlüğe ihtiyaç duyulursa, mikroarraydaki sadece daha az sayıda pozisyon iki zaman noktası arasında taranabilir, bu da taranan gözlem alanını azaltır ve böylece istatistikleri de azaltır. Gözlem alanı ayrıca sadece taranan konumların sayısına değil, aynı zamanda kameranın bir görüş alanının hedefine ve boyutuna da bağlıdır. Verilen örnekte, çeviri kinetiğini gözlemlemek için 10x amaç kullanılarak 10 dakikalık bir zaman çözünürlüğü yeterlidir. Bu kombinasyon, kamera çipinin boyutuna, mikroskop aşamasının hızına ve görüntüleme kanallarının sayısına (örneğin, faz kontrastı ve eGFP floresan) bağlı olarak zaman noktası başına 70-100 pozisyonu taramaya izin verir.

Görüntü işleme
Hücreler bir dizide konumlandıkça hücre başına toplam floresan analizi kolaylaştırıldı. Bununla birlikte, tek hücreli floresan zaman kurslarının, özellikle de sinyal-gürültü oranının (SNR) kalitesi, görüntü serisindeki hücre floresan yoğunluklarının entegrasyonu için kullanılan algoritmaya bağlıdır. PyAMA yazılım aracının görüntü işleme adımları Şekil 5'te gösterilmiştir. Tek hücreli floresan okuma için entegrasyon alanlarının belirlenmesi özellikle önemlidir, çünkü canlı hücrelerin hücre konturu zamana göre değişir. PyAMA, floresan yoğunluğunu yerleşik bir segmentasyon algoritması tarafından belirlenebilen bir hücre konturu üzerinde entegre eder. Bir alternatif, mikropatterngeometrisi 12,16'ya göre sabit sınırlara entegre etmek olacaktır. PyAMA'nın geçerli sürümü, faz kontrastı görüntü kanalının piksel mahallelerinin standart sapmasındaki bir eşiğe göre görüntü segmentasyonu gerçekleştirir. Segmentasyon sonuçları harici yazılımdan da içe aktarılabilir. Gelecekteki sürümler için, makine öğrenimi ve sabit sınırlar üzerinden tümleştirmeye dayalı segmentasyon için yerel destek planlanır.

PyAMA, hem floresan görüntüsünün hem de seçilen hücrelerin floresan zaman kurslarının görsel olarak incelenmesini sağlayan bir arayüz kullanarak aykırı hücreleri veya anormal zaman kurslarını filtrelemeyi sunar (Şekil 1C). Analizden dışlanabilecek hücrelere örnek olarak bölünme veya apoptoz uygulanan veya bir yapışıklık bölgesinin dışında bulunan hücreler verilebilir. İzleme algoritması tarafından yanlışlıkla tek bir hücre olarak tanınan birden çok hücrenin toplanması, zaman kurslarının tek hücrelerden kaynaklandığından emin olmak için filtrelenmeleri gerekir. PyAMA, anormal hücreleri filtrelemek için gereken manuel etkileşim miktarını azaltmak için bir hücre ön seçimi gerçekleştirir. Ön seçim, ön seçimin yanlışlıklarını telafi etmek için seçilen hücrelerin zaman derslerini dışa aktarmadan önce elle incelenebilir ve düzeltilebilir. PyAMA'nın geçerli sürümünün ön seçimi, hücre boyutunun hücre toplamalarının seçimini kaldırması için bir eşiği temel haline dayanır. Gelecekteki sürümler için, yukarıda açıklanan anormal hücre örnekleri de dahil olmak üzere daha fazla ölçüte izin veren ek bir makine öğrenimi tabanlı ön seçim planlanmaktadır.

Özetle, LISCA yaklaşımı, tek hücreli floresan zaman kurslarını verimli bir şekilde toplamak için tek hücreli diziler kullanmaktadır. Hücreleri mikrofabrik yapışıklık alanlarına hapsetmek izleme ve görüntü analizini kolaylaştırır. Ayrıca, hücreler standartlaştırılmış lokal mikroçevreksiyonlarda kültürlenir ve bu nedenle transfeksiyon için lipid nanopartikülleri gibi ajanlara maruz kaldıklarında tek tip yüzey alanı ile sunulur. Bu yönü özellikle bir popülasyondaki hücresel heterojenlik araştırıldığında faydalıdır. Burada açıklanan μPIPP tekniği, protein desenlerinin düzenli mikroarrayları ile sonuçlanan birçok mikrofabrikasyon tekniğinden biridir. Okuyucu, alternatif imalat süreçleri olarak mikrokontact baskı, fotolithografik yaklaşımlar ve yumuşak litografiyi inceleyen literatüre atıfta bulunulmaktadır6. Hücre çizgisine bağlı olarak, biri veya diğeri desenleme tekniği tercih edilebilir. Deneylerimizde, μPIPP tekniği hücresel kendi kendine sıralama nedeniyle hücrelerin tohumlanması sonrasında iyi konumlandırılmış hücreler gösterdi, bu da PEGylated alanında artık hücre yapışkanlığına dayanır, böylece hücreler rastgele geçişte arama yapabilsin ve farklı olarak daha büyük yapışkanlıkla protein hedef dizilerine yayılabilsin17.

LISCA, keyfi floresan belirteçlerinin çok sayıda tek hücreli zaman kursunun alınmasına izin verir. Floresan sinyallerinin tek hücre düzeyinde analizi, toplu deneylerin aksine, bozulmamış tek hücreli zaman kursları verir ve hücreden hücreye değişkenliği ortaya koymaktadır. Hücresel heterojenlik, apoptoz18 , 19,20gibi hücre kaderi kararlarında önemli bir rol oynar. Bu bağlamda, lisca yaklaşımını yakın zamanda iki floresan kanalı kullanarak genişlettik, iki hücresel olayın zamansal korelasyonlarının herhangi bir zamanda analizini sağlayan hücre-ölüm sinyali basamak19. Bu araştırma alanında LISCA, akış sitometrisi ölçümlerine alternatif olarak kendini sunun. Akış samotmetrisi inkar edilemez şekilde daha hızlı bir iş akışı sağlar ve genellikle daha büyük istatistikler sağlarken, veriler belirli bir zamanda elde edilir. Tam zamanlı bağımlılıklar kinetik parametrelerin tahminlerini verir ve farklı floresan sinyaller arasındaki zamansal korelasyonları ortaya koymaktadır, aksi takdirde erişilmeleri zordur. Birden fazla floresan kanalı kullanmak için, kurulum otomatik filtre tekerlekleri veya birden fazla kamera gerektirir. Bu durumda ayrıca tek hücreli FRET analizi uygulanabilir olmalı ve floresan etiketli moleküller arasındaki yakınlık için zaman çözümlenmiş çalışmalara olanak sağlamalıdır. LISCA gibi görüntü tabanlı analizin bir dezavantajı, görsel kontrollere ve aykırı algılamaya bağlı emektir. Burada makine öğrenimi araçları veri işlemeyi kolaylaştırabilir ve tam otomatik veri analizine izin verebilir. Gelecekte, otomatik mikroskopi platformları, hızlı dizi mikrofabrikasyonu ve yapay zeka kullanılarak, LISCA'nın verimi ve uygulanabilirliği önemli ölçüde artırılabilir. Ayrıca, mikroakışkan ekstraksiyon 21ve tek hücreli genomik kullanılarak olağandışı floresan yanıtları gösteren hücrelerin daha sonra analizleri ilaç endüstrisinde sık karşılaşılamaktadır. Bu makalede sunulan protokol, hücresel süreçlerin kinetiğini tek hücreli çözünürlük ve yeterli istatistiklerle inceleme talebine uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Alman Bilim Vakfı'nın (DFG) İşbirlikçi Araştırma Merkezi (SFB) 1032'ye verdiği hibelerle desteklendi. Almanya Federal Eğitim, Araştırma ve Teknoloji Bakanlığı'nın (BMBF) 05K2018-2017-06716 Medisoft kooperatif projesi kapsamındaki desteğinin yanı sıra Bayerische Forschungsstiftung'dan bir hibe de minnetle kabul edilmektedir. Anita Reiser, Nicel Biyobilim münih Enstitüsü (QBM) aracılığıyla bir DFG Bursu tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing  Fisher Scientific 10178071
baking oven Binder 9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x Nikon MRH20100
Desiccator Roth NX07.1
Eclipse Ti-E Nikon
eGFP mRNA Trilink L-7601
Female Luer to Tube Connector MEDNET FTL210-6005
Fetal bovine serum Thermo Fisher 10270106
Fibronectin Yo Proteins 663
Filter set eGFP AHF F46-002
Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing Fisher Scientific 11768088
HEPES (1 M) Thermo Fisher 15630080
Incubation Box Okolab OKO-H201
incubator Binder 9040-0012
L-15 without phenol red Thermo Fisher 21083027
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher 11668027
Male Luer in-house fabricated consisting of teflon
Male Luer to Tube Connector MEDNET MTLS210-6005 alternative to in-house fabricated male luers
NaCl (5 M) Thermo Fisher AM9760G
Needleless Valve to Male Luer Connector MEDNET NVFMLLPC
NIS Elements Nikon Imaging software Version 5.02.00
NOA81 Thorlabs NOA81 Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO pco
Phosphate buffered saline (PBS) in-house prepared
Plasma Cleaner Diener Femto Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) SuSoS AG
silicon wafer mit mircorstructures in-house fabricated
Sola Light Engine Lumencor
sticky slide VI 0.4  ibidi 80608
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 1673921
Tango 2 Märzhäuser 00-24-626-0000
Ultrapure water in-house prepared
uncoated coverslips ibidi 10813
Injekt-F Solo, 1 mL Omilab 9166017V with replacement sporn

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141, (4), 559-563 (2010).
  2. Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  3. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459, (7245), 428-432 (2009).
  4. El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on chips. Nature. 442, (7101), 403-411 (2006).
  5. Segerer, F. J., et al. Versatile method to generate multiple types of micropatterns. Biointerphases. 11, (1), 011005 (2016).
  6. Piel, M., Théry, M. Micropatterning in cell biology, part A/B/C. Elsevier. (2014).
  7. Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols. Ertl, P., Rothbauer, M. Springer. New York. 41-54 (2018).
  8. Picone, R., Baum, B., McKendry, R. Methods in cell biology. 119, Elsevier. 73-90 (2014).
  9. Reiser, A. Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).
  10. Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. Available from: https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama (2020).
  11. Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. Available from: https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773 (2020).
  12. Reiser, A., et al. Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection. Integrative Biology. 11, (9), 362-371 (2019).
  13. Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection". Zenodo. Version 1.0 (2019).
  14. Ferizi, M., et al. Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays. Lab on a Chip. 15, (17), 3561-3571 (2015).
  15. Fröhlich, F., et al. Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection. NPJ systems biology and applications. 4, (1), 1-12 (2018).
  16. Krzysztoń, R., et al. Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077 (2019).
  17. Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. Cellular self-organization on micro-structured surfaces. Soft Matter. 10, (14), 2397-2404 (2014).
  18. Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays. Microarrays. 5, (2), 8 (2016).
  19. Murschhauser, A., et al. A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death. Communications Biology. 2, (1), 1-11 (2019).
  20. Chatzopoulou, E. I., et al. Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody. Analyst. 141, (7), 2284-2295 (2016).
  21. Sztilkovics, M., et al. Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy. Scientific Reports. 10, (1), 1-13 (2020).
Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA) - Hücresel Kinetiği Ölçmek için Çok Yönlü Bir Teknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. (169), e62025, doi:10.3791/62025 (2021).More

Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics. J. Vis. Exp. (169), e62025, doi:10.3791/62025 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter