Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית כדי ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNA ביציות בודדות במהלך התבגרות במבחנה.
Abstract
אירועים הקשורים התבגרות גרעינית ביצית תוארו היטב. עם זאת, הרבה פחות ידוע על המסלולים המולקולריים והתהליכים המתרחשים בציטופלסמה כהכנה להפריה ורכישה של totipotency. במהלך התבגרות ביצית, שינויים בביטוי גנים תלויים אך ורק בתרגום והשפלה של RNAs שליח אימהי (mRNAs) ולא על שעתוק. ביצוע תוכנית התרגום, אם כן, ממלא תפקיד מפתח בביסוס יכולת התפתחותית ביצית לקיים התפתחות עובר. מאמר זה הוא חלק מהתמקדות בהגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי המתרחשת במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה. במאמר שיטה זו, מוצגת אסטרטגיה ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNAs היעד במהלך התבגרות ביצית במבחנה. כאן, כתב Ypet הוא התמזגו לאזור 3' לא מתורגם (UTR) של הגן של עניין ולאחר מכן מיקרו מוזרק לתוך ביציות יחד עם קידוד mRNA polyadenylated עבור mCherry לשלוט עבור נפח מוזרק. על ידי שימוש במיקרוסקופיה של זמן לשגות כדי למדוד הצטברות כתב, שיעורי התרגום מחושבים במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית. כאן תוארו הפרוטוקולים לבידוד והזרקה של ביציות, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים, באמצעות כתב UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' כדוגמה.
Introduction
ביצית יונקים בוגרת עוברת שינויים מהירים כהכנה להפריה ורכישה של טוטיפופוטנציה. שינויים אלה חיוניים כדי לקיים התפתחות עוברית לאחר ההפריה. למרות האירועים הקשורים התבגרות גרעינית מתוארים היטב יחסית, הרבה פחות ידוע על התהליכים המולקולריים ואת המסלולים בציטופלסמה ביצית. במהלך השלבים הסופיים של התבגרות ביצית, ביציות שקטות שעתוק, וביטוי גנים תלוי לחלוטין בתרגום mRNA והשפלה1,2. הסינתזה של חלבונים קריטיים ליכולת התפתחותית, אם כן, מסתמכת על תוכנית של תרגום מתוזמן של mRNAs ארוכי טווח שעברו סינתזה מוקדם יותר במהלך צמיחת ביצית1,3. כחלק מהתמקדות בהגדרת תוכנית זו של תרגום mRNA אימהי שבוצע במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה, מאמר זה מציג אסטרטגיה ללמוד את ההפעלה והדיכוי של התרגום של mRNAs אימהי היעד ביציות בודדות במהלך אימהות מיוטית במבחנה.
בשיטה זו, מסגרת הקריאה הפתוחה של YPet משובטת במעלה הזרם של UTR 3 ' של תמליל העניין. לאחר מכן, mRNAs קידוד כתב זה מוזרק מיקרו לתוך ביציות יחד עם mRNAs polyadenylated קידוד mCherry כדי לשלוט על נפח מוזרק. הצטברות הכתב נמדדת במהלך התבגרות מיוטית במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה של זמן לשגות. הצטברות של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- mCherry נרשמת ביציות בודדות, ואותות YFP מתוקנים על ידי הרמה של mCherry מוזרק במשותף. לאחר רכישת נתונים, שיעורי תרגום מחושבים עבור מרווחי זמן שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית במבחנה על ידי חישוב השיפוע של העקומה המתקבל על ידי התאמת עקומה.
גישה זו מספקת כלי לאישור ניסיוני של שינויים בתרגום של mRNAs אנדוגני נבחרים. בנוסף, שיטה זו מקלה על אפיון של אלמנטים רגולטוריים השולטים בתרגום במהלך התבגרות מיוטית ביצית על ידי מניפולציה של אלמנטים cis-תקינה של 3 ' UTR של mRNAs היעד4,5,6. מניפולציה של אורך הזנב פולי(A) גם מאפשר תובנה לתוך פעילות אדניאלאז / deadenylase ביציות5. Mutagenesis של אלמנטים cis-acting או immunoprecipitation RNA יכול לשמש כדי ללמוד אינטראקציות עם חלבונים מחייבים RNA קוגנט6,7. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות רכיבים חיוניים של תוכנית התרגום כי הם קריטיים עבור יכולת התפתחותית ביצית על ידי מדידת יעד 3 ' תרגום UTR במודלים הקשורים לירידה באיכות ביצית 8,9,10. נייר שיטה זה מציג ניסוי מייצג שבו ביציות של עכברי C57/BL6 בני 21 יום הוזרקו במיקרו עם כתב Ypet מותך UTR 3 ' של IL-7. ההתקנה והפרוטוקול להזרקת ביצית, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים תוארו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליכים הניסיוניים שבהם מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (פרוטוקול AN182026).
1. הכנת אמצעי תקשורת
- הוסף את כל הרכיבים, כמתואר בטבלה 1, כדי להפוך את אוסף ביציות הבסיסי בינוני בינוני התבגרות ביצית בינוני. עבור מדיום האוסף הבסיסי, הגדר את ה- pH ל- 7.4. עבור מדיום איסוף והתבגרות, להוסיף 3 מ"ג / מ"ל של אלבומין סרום שור (BSA) ו 1 μM cilostamide ביום השימוש.
2. הכנת קידוד mRNA עבור UTR של Ypet-3' ו- mCherry
- להשיג את 3′ רצפי UTR של mRNAs של עניין.
הערה: עבור מחקר זה, רצפים התקבלו בעבר מן העכבר ביצית cDNA. - עיצוב פריימרים כדי להגביר את היעד 3 ' UTRs מ oocyte cDNA וחלקים של pcDNA 3.1 וקטור המכיל רצף קידוד Ypet, תג V5-epitope, ו מקדם T7.
- להגביר באמצעות ערכת פולימראז DNA נאמנות גבוהה. הפעל את מוצרי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) על ג'ל כדי לבדוק אם השברים יש את הגודל הנכון, לגזור את הרצועות, ולחלץ את ה- DNA מן הג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.
- נתיך את שברי ה- PCR לווקטור באמצעות ערכת שיבוט PCR.
הערה: שברי PCR דגירו על קרח במשך 4 שעות כדי להקל על תהליך רקומבינציה יעיל יותר. זאת בניגוד להוראות היצרן, הממליצות על זמן דגירה של 45 דקות בלבד. - Transfect שברי PCR לתוך חיידקים מוסמכים 5-α Escherichia קולי.
- מוסיפים את התערובת ואת plasmid לחיידקים, ואת הדגירה על הקרח במשך 30 דקות.
- מחממים את התערובת ואת plasmid על ידי הצבת התערובת באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 s, ומיד להתקרר על הקרח במשך 3 דקות.
- הוסף 500 μL של מרק סופר אופטימלי עם דיכוי קטבוליט (SOC) בינוני דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (69 °F).
- סובב למטה ב 7000 × g במשך 2 דקות, ולהסיר את רוב supernatant. Resuspend וצלחת על צלחת אגר מרק לוריא (LB) עם אנטיביוטיקה הבחירה המתאימה.
הערה: Carbenicillin שימש במחקר זה. - דגירה לילה ב 37 °C (69 °F). לבודד את המושבות על ידי לחיצה קלה על קצה פיפטה על אחת המושבות והנחת אותו 3 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם / מ"ל של קרבניצילין. דגירה עבור 12-24 שעות ב 37 °C (69 °F).
- לחלץ את ה-DNA של פלסמידים באמצעות ערכת בידוד DNA פלסמיד על פי הוראות היצרן ולאשר את הרצפים באמצעות ריצוף DNA.
- עבור UTR 'Ypet/3':
- הפק תבנית PCR ליניארית עבור שעתוק במבחנה. השתמש פריימר קדימה במעלה הזרם של רצף Ypet פריימר הפוך עם 20 שאריות thymine נוספות. ראה טבלה 2 עבור הרצף של UTR Ypet/IL-7 3' ואת הרצפים של פרייומרים קדימה והפוך.
הערה: שאריות תימין נוספות אלה יוסיפו אוליגו(A) ל- mRNA הליניארי לאחר שעתוק במבחנה . - במבחנה לתמלל את מוצר PCR באמצעות ערכת תמלול T7 על פי הוראות היצרן.
- לטהר את RNA משלים וכתוצאה מכך (cRNA) באמצעות ערכת ניקוי שעתוק על פי הוראות היצרן.
- יש לרכך את ה-cRNA המטוהר במים נטולי RNAse, למדוד ריכוז ולהעריך את השלמות על ידי אלקטרופורזה אגרוזית. יש לאחסן ב-80°C.
- הפק תבנית PCR ליניארית עבור שעתוק במבחנה. השתמש פריימר קדימה במעלה הזרם של רצף Ypet פריימר הפוך עם 20 שאריות thymine נוספות. ראה טבלה 2 עבור הרצף של UTR Ypet/IL-7 3' ואת הרצפים של פרייומרים קדימה והפוך.
- עבור mCherry:
- הפק תבנית PCR ליניארית עבור שעתוק במבחנה באמצעות אנזים הגבלת נאמנות גבוהה; השתמש באנזים ההגבלה mfEI-HF אם משכפל דוגמה זו. לעכל במאגר עיכול לילה ב 37 °C (60 °F).
- הפעל ג'ל כדי לטהר את הדגימה, ולחלץ את ה- DNA הליניארי באמצעות ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.
- במבחנה לתמלל את מוצר PCR באמצעות ערכת תמלול T7 על פי הוראות היצרן.
- פוליאדנילאט cRNA (150-200 נוקלאוטידים) באמצעות ערכת זנב פולי(A) על פי הוראות היצרן.
- לטהר את cRNA וכתוצאה מכך באמצעות ערכת ניקוי שעתוק על פי הוראות היצרן.
- יש לרכך את ה-cRNA המטוהר במים נטולי RNAse, למדוד ריכוזי mRNA ולהעריך את שלמות ההודעה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. יש לאחסן ב-80°C.
3. הליך ניסיוני
הערה: סקירה סכמטית של הזרקת מיקרו ביצית ומיקרוסקופיה של זמן לשגות לאחר מכן ניתנת באיור 1.
- יום 1
- תוך-אופן להזריק עכברים בני 21 יום עם 5 IU של גונדוטרופין סרום של סוסה בהריון כדי לקדם את צמיחת זקיק לשלבantral 11.
- יום 3
- אוסף ביציות
- להקריב עכברים 44-48 שעות לאחר priming כדי לאסוף את השחלות, ומניחים אותם בצלחת פטרי פלסטיק עם מדיום אוסף ביציות בסיסי.
- בזהירות לפתוח את זקיקי antral על ידי ביצוע חתך קטן בקיר הזקיק עם מחט 26 G. בודד ביציות (COCs) סגורות קומולוס שלמות עם מספר שכבות של תאי קומולוס באמצעות פיפטה זכוכית המופעלת בפה.
- השתמש פיפטה קטנה יותר (מעט גדול יותר מאשר הקוטר של ביצית), מכנית denude COCs על ידי pipetting חוזר.
הערה: לחלופין, בצע מיקרו-הזרקה על COCs שלמים. - באמצעות פיפטה גדולה יותר, לשאוף את ביציות denuded ומניחים אותם בצלחת פטרי עם מדיום התבגרות בתוספת 1 מיקרומטר של מעכב phosphodiesterase, cilostamide, כדי למנוע חידוש של התבגרות מיוטית12. מניחים את המנה באינקובטור במשך 2 שעות כדי לאפשר את ביציות להתאושש מן הלחץ הנגרמת על ידי בידוד של ביציות מן הזקיקים.
- הזרקת מיקרו ביצית
- הכן את מחטי ההזרקה על ידי הצבת צינור נימי זכוכית בורוסיליקט באורך 10 ס"מ במשיכה מכנית. להזרקה אופטימלית, כופפו את קצה המחט בזווית של 45° בעזרת חוט מחומם.
- מכינים מנות פוליסטירן עם 20 טיפות μL של מדיום אוסף ביציות בסיסי, ומכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל.
- הכן תערובת כתבים על ידי הוספת 12.5 מיקרוגרם / μL Ypet-3 ' UTR ו 12.5 מיקרוגרם / μL mCherry. הכינו נפח גדול יותר ובצעו אליקוטים לניסויים עתידיים כדי להבטיח ריכוזי כתבים דומים. לאחסן aliquots אלה ב -80 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, צנטריפוגה הראשונה aliquot במשך 2 דקות ב 20,000 x g, ולהעביר צינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
הערה: צנטריפוגה זו תמנע ממחט ההזרקה להיסתום על ידי אגרגטים פוטנציאליים בתמהיל הכתבים. - לטעון את מחט ההזרקה על ידי נימי עם כ 0.5 μL של תערובת כתב.
- מניחים את פיפטה מחזיק מחט הזרקה טעונה לתוך המחזיקים, ומיקום טיפה של מדיום אוסף ביצית. לשאוף חלק מהמדיום לתוך פיפטה מחזיקה.
- פתח את מחט ההזרקה על ידי הקשה בעדינות על זה נגד פיפטה מחזיק.
- מניחים ביציות בטיפה של מדיום איסוף בסיסי, ומזריקים 5-10 pL של תערובת הכתבים.
- דגירה ביציות במדיום התבגרות עם 1 μM cilostamide עבור 16 שעות כדי לאפשר את אות mCherry לרמה.
- הכינו צלחת פטרי שתשמש למיקרוסקופיה של זמן לשגות עם לפחות שתי טיפות 20 μL של מדיום התבגרות לכל כתב מוזרק: טיפה אחת עם 1 μM cilostamide לשליטה פרופאז אני נעצר ביציות טיפה אחת ללא cilostamide עבור ביציות התבגרות. מכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל ומניחים באינקובטור.
- מיקרוסקופיה של זמן לשגות
- לאחר הדגירה המוקדמת, להסיר את ביציות מוזרק מן החממה, ולשטוף אותם ארבע פעמים במדיום התבגרות ללא cilostamide. שמור כמה ביציות במדיום התבגרות עם 1 μM cilostamide כקבוצת ביקורת oocyte 1-נעצר פציצות.
- מעבירים את ביציות מוזרק טיפות בהתאמה שלהם על צלחת מיקרוסקופ זמן לשגות שהוכן בעבר. Cluster את ביציות באמצעות פיפטה זכוכית סגורה (פיפטה סגורה ניתן להכין על ידי החזקת הקצה בלהבה במשך כמה שניות).
הערה: קיבוץ באשכולות של ביציות מסייע במניעת תנועתן במהלך ההקלטה. - מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ המצוידת במערכת תאורת דיודה פולטת אור ובמה ממונעת המצוידת בתא סביבתי המתוחזק ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. כדי לשכפל מחקר זה, השתמש בפרמטרים הבאים: ערכת מסננים: שיקוף dichroic YFP / CFP / mCherry 69008BS; ערוץ YFP (עירור (לשעבר): S500/20 × 49057; פליטה (EM): D535/30 m 47281), mערוץ שרי (לשעבר: 580/25 × 49829; אם: 632/60 מטר).
- הזן את ההגדרות המתאימות לניסוי זמן לשגות (ראה טבלה של חומרים עבור התוכנה המשמשת במחקר זה): לחץ על יישומים | רכישה רב ממדית. בחר את הכרטיסיה הראשית הראשונה ובחר timelapse, מיקומי שלבים מרובים, ו אורכי גל מרובים.
- בחר את הכרטיסיה שמירה כדי להזין את המיקום שבו יש לשמור את הניסוי.
- בחר את הכרטיסיה Timelapse כדי להזין את מספר נקודות הזמן, משך הזמן ומרווח הזמן.
הערה: משך הניסוי תלוי במינים החייתיים שנחקרו, שכן התזמון של התבגרות מיוטית ביצית שונה בין מינים. בניסוי זה עם ביציות עכבר, ביציות נרשמו כל 15 דקות במשך 16 שעות. - בחר את שלבהכרטיסיה . הפעל את brightfield ואתר את מיקום ביציות על-ידי פתיחת חלון חדש על-ידי בחירה באפשרות רכוש | רכישת | הצג בשידור חי. לאחר איתור ביציות, חזור לחלון רכישה רב-ממדית והקש + כדי להגדיר את מיקום ביציות.
- בחר את אורכי הגלשל הכרטיסיה והגדר 3 אורכי גל שונים עבור brightfield (חשיפה 15 אלפיות השנייה), YFP (חשיפה של 150 אלפיות השנייה עבור UTR Ypet/IL7 3' ) ו- mCherry (חשיפה של 75 אלפיות השנייה עבור UTR Ypet/IL7 3').
הערה: התאם את החשיפה עבור כל כתב UTR Ypet/3' בהתבסס על רמת הצטברות הכתבים ונפח ההזרקה. ודא שאות YFP נופל במרכז טווח הזיהוי בתחילת הניסוי כדי למנוע הערכת חסר או רוויה במקרה של הפעלת תרגום. עבור mCherry, להתאים את החשיפה עבור כל אצווה של mCherry כמו האות תלוי במספר נוקלאוטידים אדנין שנוספו במהלך הליך polyadenylation. בגלל השונות ביעילות פוליאדנילציה, להשתמש באותה אצווה של mCherry בניסויים שונים להשוואה טובה יותר בין ניסויים. - התחל את ניסוי לשגות זמן על ידי לחיצה על לרכוש. ראו איור 2 והקובץ המשלים לקבלת דוגמה להקלטה של זמן לשגות ביצית אחת.
- ניתוח תרגום UTR של Ypet-3'
- לניתוח זה (ראה טבלת חומרים עבור התוכנה המשמשת במחקר זה), בצע שתי מדידות אזור עבור כל ביצית: ביצית עצמה-לחץ על אזור אליפסה להקיף את ביצית- ואזור קטן קרוב ביצית לשמש חיסור רקע-לחץ על אזור מלבני.
הערה: ודא כי ביציות לא לצאת מהאזור שנבחר במהלך הקלטת זמן לשגות. שים לב במיוחד למיקום מדידת האזור סביב שחול גוף הקוטב, שכן הדבר גורם לתנועה ביצית ועלול לעוות את ההקלטה. - יצא את נתוני מדידת האזור לגיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה תחילה על פתח יומן רישום ולאחר מכן על רשום נתונים כדי לייצא את תוכנת ניתוח הנתונים.
- עבור כל ביצית בודדת ועבור כל נקודות הזמן הנמדדות, הפחת את מדידת אזור הרקע ממדידת אזור ביצית. עשה זאת עבור אורכי גל של YFP ו- mCherry בנפרד.
- רשום את התזמון של התמוטטות ורידים נביטיים (GVBD) והבלטת גוף הקוטב (PBE) לעיון מאוחר יותר.
הערה: אל תכלול ביציות עכבר מתבגרות כאשר GVBD עולה על 2 שעות. - התווה ביטוי YFP ו- mCherry לאורך זמן עבור כל ביצית כדי לבדוק חריגים.
הערה: זו צריכה להיות עקומה חלקה, אם זה לא זה עשוי להצביע על כך ביצית זז במהלך ההקלטה. - עבור כל ביצית בודדת, חשב ביטוי mCherry ממוצע עבור עשר נקודות הזמן האחרונות של ההקלטה. עבור כל נקודת זמן, חלק את ביטוי YFP בביטוי mCherry הממוצע לביטוי mCherry לתיקון עבור אמצעי אחסון מוזרק כדי להשיג יחס YFP/mCherry בכל נקודת זמן עבור כל ביצית בודדת.
- חשב שיעורי תרגום עבור מרווח זמן מסוים על-ידי התאמת שיפוע העקומה על-ידי רגרסיה ליניארית. להעריך את ההבדלים בשיעורי התרגום באמצעות מסקנה סטטיסטית.
- לניתוח זה (ראה טבלת חומרים עבור התוכנה המשמשת במחקר זה), בצע שתי מדידות אזור עבור כל ביצית: ביצית עצמה-לחץ על אזור אליפסה להקיף את ביצית- ואזור קטן קרוב ביצית לשמש חיסור רקע-לחץ על אזור מלבני.
- אוסף ביציות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denuded prophase אני נעצר ביציות של עכברי C57/BL6 בן 21 יום הוזרקו עם תערובת כתב המכיל mRNA קידוד כתב Ypet התמזגו 3 ' UTR של IL-7 ו mRNA קידוד mCherry. YFP ו- mCherry expression נרשמו ב-39 ביציות, מתוכן 30 התבגרו, ו-9 נעצרו בהפצה I כשליטה שלילית. שלושה ביציות התבגרות לא נכללו לניתוח כי הם גם היו GVBD מעוכב (N = 2) או הועבר בצלחת במהלך ההקלטה (N = 1). איור 3 מציג את ביטוי mCherry ו- YFP בפרופאז I וביצית התבגרות. איור 4 מציג ביטוי YFP של ביציות התבגרות מתוקן עבור ביטוי mCherry מישורי (ביטוי mCherry ממוצע ב 10 נקודות הזמן האחרונות) כדי לתקן עבור עוצמת הקול מוזרק. שיעורי התרגום של הכתב נמדדו על-ידי התאמת עקומה (רגרסיה ליניארית) לערכי YFP/mCherry ב-prophase I ובביציות התבגרות במהלך 0-2 השעה הראשונה או 8-10 שעות לאחר שחרור cilostamide (איור 5A). הצטברות הכתב אינה פועלת לפי דפוס ליניארי, כפי שעולה מהבדל משמעותי בשיעורי התרגום בין 0-2 שעות ל- 8-10 שעות לאחר שחרור cilostamide (p<0.0001; איור 5B). לכן, תוצאות אלה מצביעות על הפעלה של תרגום IL-7 במהלך התבגרות מיוטית ביצית.
איור 1: סקירה סכמטית של ההליך הניסיוני. Oligoadenylated Ypet/3' UTR ו polyadenylated mRNA קידוד mCherry מוזרקים מיקרו לתוך ביציות denuded של עכברים 21 יום C57/BL6. אוציטים הם טרום דגירה במשך 16 שעות cilostamide המכיל מדיום התבגרות כדי לאפשר לאות mCherry להגיע לרמה. לאחר הדגירה המוקדמת, הקלטת זמן לשגות מתחילה שבו ביציות נשמרים בינוני עם cilostamide כדי ליצור קבוצת ביקורת פרופאז אני נעצר או שוחרר במדיום ללא cilostamide להתבגר. קיצורים: UTR = אזור לא מתורגם; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; fw פריימר = פריימר קדימה; rev פריימר = פריימר הפוך; אמפר = עמידות לאמפצילין; פוליאנה = פוליאדניל; אוליגואה = אוליגואדניל; GV = גרגר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה להקלטה בודדת של זמן לשגות ביצית. ברייטפילד, YFP, והקלטות mCherry של ביצית אחת מוזרק עם mRNAs קידוד Ypet / Interleukin-7 ' UTR ו polyadenylated mCherry ב prophase אני, MI (6 שעות לאחר שחרור cilostamide), ו MII (15 שעות לאחר שחרור cilostamide). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; GV = גרגר; MI = מטפאזה I; MII = מטפאזה II. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אותות YFP ו- mCherry המתועדים על-ידי מיקרוסקופיה של מעידה בזמן. אותות YFP ו- mCherry של ביציות מוזרקים עם Ypet /IL7' Ypet/IL7 3' UTR ו- mRNA מקודד פוליאדנייט mCherry. אוציטים הוחזקו במדיום עם cilostamide כדי ליצור קבוצת ביקורת דחף I-arrested (N = 9) או שוחררו במדיום ללא cilostamide כדי לאפשר התבגרות (N = 30). נתונים הם מדידות ביציות בודדות. קיצורים: IL-7 = אינטרלוקין-7; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אות YFP תוקן עבור רמת mCherry שהוזרקו במשותף. אותות YFP של prophase אני נעצר ביציות התבגרות תוקנו עבור נפח מוזרק על ידי חלוקת אות YFP על ידי האות mCherry הממוצע של 10 נקודות הזמן האחרונות. יחסי YFP/mCherry אינדיבידואליים עבור (A) פרופה I-נעצר ביציות ו - (B) ביציות התבגרות ומשמעות ± שגיאה סטנדרטית של ממוצע YFP / mCherry היחסים של (C) פרופה I-נעצר ו (D) ביציות התבגרות. קיצורים: YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; GVBD = התמוטטות גרגר נבטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שיעורי תרגום מחושבים במהירות של 0-2 שעות ו- 8.10 שעות של התבגרות. (A) אותות חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) של ביציות בודדות מתוקנות עבור mCherry (YFP/mCherry) ב- 0-2 שעות או 8-8-8-2 10 שעות לאחר שחרור cilostamide ו - (B) שיעורי תרגום (כלומר ± שגיאת תקן של הממוצע) כפי שחושב על ידי התאמת עקומה (רגרסיה ליניארית) ערכי YFP / mCherry ב 0-2 שעות ו 8-10 שעות לאחר שחרור cilostamide. הנתונים נותחו באמצעות מבחן t דו-זנבי לא משוכך. *עמ' < 0.0001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: דוגמה להדחקת התרגום: Oosp2. נתונים שנותחו מחדש של ניסוי שבו ביציות הוזרקו עם Ypet-Oosp2 3′ UTR ו polyadenylated mRNA קידוד mCherry. אותות YFP של prophase I-arrested (N = 63) וביציות התבגרות (N = 72) תוקנו עבור נפח מוזרק על ידי חלוקת אות YFP על ידי האות mCherry הממוצע של 10 נקודות הזמן האחרונות. נתוני ביטוי YFP ו- mCherry הושגו באמצעות מנורת קשת קסנון, בניגוד לניסוי IL-7 שבו נעשה שימוש במקור אור LED. הנתונים מייצגים את השגיאה הסטנדרטית ± הממוצע של מדידות ביציות בודדות ופורסמו בעבר בלונג ואח'. 5. קיצורים: YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; Oosp2 = חלבון מופרש ביצית 2; UTR = אזור לא מתורגם; IL-7 = אינטרלוקין-7; LED = דיודה פולטת אור; GVBD = התמוטטות גרגר נבטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: השפעת החשיפה למיקרו-הזרקה ופלואורסצנטיות על תזמון GVBD ו-PBE. תזמון של GVBD ו- PBE של ביציות שהיו גם מיקרו מוזרק ונחשף פלואורסצנטי (מוזרק), או לא מוזרק ולא חשוף פלואורסצנטי (לא מוזרק). נתונים הם מדידות ביציות בודדות. הנתונים נותחו באמצעות הבדיקה הדו-זנבית הלא משוינת. *עמ<0.001. קיצורים: GVBD = פירוק גרגר; PBE = שחול גוף הקוטב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מדיום אוסף ביציות בסיסי | ||
| רכיב | עבור 500 מ"ל | |
| HEPES שונה נשר בינוני חיוני מינימלי | 7.1 גרם (7.1 גרם) | |
| סודיום ביקרבונט | 252 מ"ג | |
| נתרן פירובט | 1.15 מ"ל | |
| פניצילין/סטרפטומיצין 100x | 5 מ"ל | |
| מים מזוקקים אולטרה-סגולים (אינוויטרוגן, 10977-015) | עד 500 מ"ל | |
| מדיום התבגרות | ||
| רכיב | עבור 500 מ"ל | |
| MEM אלפא 1x | עד 500 מ"ל | |
| נתרן פירובט | 1.15 מ"ל | |
| פניצילין/סטרפטומיצין 100x | 5 מ"ל | |
טבלה 1: הכנת מדיה. רשימת הרכיבים שיש להוסיף להכנת מדיום בסיסי של איסוף ביציות ובינוני התבגרות ביציות.
| רצף | |||||
| איפט/אינטרלוקין-7 3' UTR | גאגאקטקטגטקטגטקטגאגאטגאג GCTAGטאגקטג'יגקטגקטגקטגגגה אגגקטגטקטקג'יגה-גטג אקאגטקגגגאגגאגגהגאגקטקטג אאגקטגקטגטגקטגקאקאגאגקטג'יג'יגה-קרטגמקקטג GGCTACGGGGGTGTGTCGGGGGGGTACCCCCAקטאגגקטקטקהאטקה AGAGCGCCATGGGGGGGגגאגגקטקטטקאגאקה צטקאגאגאגגגאגגאגטגהאגטגהאגה אגגקטגקטקאגקאקטקטגקטגקאגאגטגטאקטאק אקצ'אקאגטגטגקטקטקגגאגקאקטקאגאט CCGGCACAACATCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGגקטקטאקגאגאקאקאגאקהאקאצ'ק קטרג'יג'יגג'קCCGTGCTGGCTGCGACACACACACTACTACTACTGACTACTACTACTCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAGGGGGGGGGGTGCTGGGAGTTCCTCCGGGCC GGקאטקאקאקטגאגגקטקטאטאגאגאטקטגאגאטגאגתכתאקטאגאגאטקטאגאגטאגאטקט CCCTCTCCTCגטקג'קטג'קאטג'גטגקטגאגאק אטגטאגטאקהקטאגאגאקטאקטקקאקאג אגאטקטגאטגאטקטאגקאגהאגאטג אגאטגאגאגאקאקאגאגגקטגקטגקטקטאטאקAA צ'טאקאגאטאטגאטגקאטקטאטהאג'קטוראג'קטורטהאג'קטוראגאטאקאטאגאטאגאטאקטגאטאקאט טאקאקטאקאגטקאאגטגקטגCTCTC אאאאטגאטגטגטאגאטאגאטקטגאטגאטגאגאטקטגטאג אקטגאגאטקטגגקטקטגאטגאטגאטגקטקטגאג אגגקאהאגאגקטאקאקאטאגטאגאטאגאטגטאקה קטאקטאגטאגהאגאטאטאטהאגאטאגטאגאגקטאט טקאגאטקטגקטגאטגאטגקטגקטגאטגטגטג גטגטאטהאגאגטאקטאקטגאגטאקטגה טטקאטאגאטאגאטאטהאגאטאטגטאגטטאטהאטגטאגטטגטאגטטגטטאטאטגטטאטגטטהאטגטטגטטאטאטגטט טגקטקטקטגCTCTCTCTCTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTCTATCTCTATTATA אטטקטטקטאקאטג'גטגאטקטאקטטאגאגאטגאטקטאטגאטקטאק TGTCAGGTTCTCTCTCTCTGGGGTTקטקטגקטקטגאטקטקטגאטגאק אטקטאקטקקטגטגאגקטאטאגטג אאקקטאט טקטגטאגTCאטג'טג'טאטאגאגאגטג קאאטגטקטאטגאטקטאטטגטגקטקטקטגטטקט GTATATGCCTTAATTTTGTAGAGGTCTCTGTCTTקטקטקטגאטגאטגאגאטה טגטגטאגאגאגקאהאטקטגאגטגאטגקטג טקאגג'גטגגקטגקטגגאטגאטגאגגתקטגקגגקגגק אטגקטגטגטאגקטגקטCTCTCTTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTCTCTCTCTCTCTACTGTGG טקאגאטג'גטאטקאטקאטגאגאטגאטקטאטקאטאטקאט גסקאגאאאגקטקטקטגטגקאקאטאגטאטאטאטאטאגאטאגאקטאקטאטגטאגקט טCGATAACTTCCTTAGATAקטקטגTCTCCTCTCTגאגאטאגטה AGCCCTTAGCTAGCGAACTAGGTCקטגטגטגאטקטאטקטגאגקטגאט GGCTCTACCAATTגאקאטקטגאטגאגקאאטאגאטאט |
||||
| פריימר קדימה | גאגאאקקטגקטאק | ||||
| הפוך פריימר | טטטטטטטטטטטאטהאטקטקטאטג CCAAAATC |
||||
טבלה 2: דוגמה לכתב ורצפי פריימר רצף של כתב YFP/IL7 3'UTR ורצפים של פריימרים קדימה והפוך ששימשו להפקת תבנית PCR ליניארית לתעתיק במבחנה.
קובץ משלים: חלבון פלואורסצנטי צהוב(YFP) והקלטת זמן לשגות mCherry. הקלטות YFP ו- mCherry של ביצית אחת מוזרקת עם mRNAs קידוד Ypet / Interleukin-7 ' UTR ו polyadenylated mCherry. ערוץ YFP (לשעבר: S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), mערוץ שרי (לשעבר: 580/25 × 49829; אם: 632/60 מטר). ביציות נרשמו כל 15 דקות עבור 16 שעות (7 מסגרות / שנייה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת מתארת אסטרטגיה ללמוד הפעלה והדחקה של תרגום mRNA היעד במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית במבחנה ביצית. IL-7, ציטוקינים שפורסמו על ידי ביצית שעשויים להיות מעורבים בתקשורת תא ביצית8,13, נבחר לצורך תיאור שיטה זו. IL-7 ידוע להיות מתורגם יותר ויותר במהלך התבגרות ביצית8 ומאפשר הדמיה טובה של הפעלה תרגום בשיטה זו. עם זאת, אם התרגום מתרחש בקצב קבוע לאורך כל הניסוי, הצטברות של כתב תעקוב אחר דפוס ליניארי, ושיעורי התרגום בתחילת הניסוי ובסופו יהיו דומים. מסקנה זו יכולה להיות מאומתת על ידי טוב של התאמה (R) של רגרסיה ליניארית דרך מרווח ההקלטה כולו. דיכוי בתרגום הכתבים יציג את עצמו כמישור של אות YFP.
דוגמה לדיכוי של תרגום UTR 3 ', ניתן למצוא במחקר של Luong et al. 5, שבו המחברים מדווחים על דיכוי של חלבון מופרש ביצית 2 (Oosp2) במהלך התבגרות מיוטית ביצית. נתונים אלה נותחו מחדש ומוצגים באיור 6. ביציות ההתבגרות מראות רמה של אות YFP, המצביע על דיכוי התרגום, בעוד שקבוצת הביקורת של prophase I-arrested עוקבת אחר דפוס ליניארי של הצטברות כתבים, המציין שיעורי תרגום דומים בתחילת הניסוי ובסופו. כאשר לומדים דיכוי של תרגום, חשוב במיוחד לכלול קבוצת ביקורת prophase I-arrested כדי להבטיח כי הרמה של אות YPF אינו מוסבר על ידי ירידה באיכות ביצית בשל תנאי תרבות ירודים, ובכך לאשר את הכדאיות של ביציות. הצטברות של הכתב יכול להיות מאומת על ידי PCR כמותי הפוך שעתוק באמצעות פריימרים עבור YFP או על ידי סופג המערבי על ידי ניצול תג V5-epitope הכלול בכתב בפרוטוקול זה.
הרמה של אות YFP לא יכול להיות אך ורק בשל דיכוי מוסדר באופן פעיל של תרגום, אבל יכול להיות מוסבר גם על ידי השפלה של הכתב במהלך התקדמות מיוטית ביצית. זה עשוי לשקף חוסר יציבות של mRNA אנדוגני, אשר חיוני למעבר ביטוי הגנום העוברי14,15,16. אפשרות זו יכולה להיות מאומתת על ידי מדידת רמות תעתיק גנים היעד בשלב prophase אני לעומת metaphase II שלב כדי לאשר את היציבות של mRNAs. בעת הכנת oocyte cDNA, עדיף להשתמש בהקסאמר אקראי priming על oligo-dT priming. השיטה האחרונה מציגה הבדלים לכאורה ברמות תעתיק גנים שעשויים לשקף הבדלים באורך הפולי(A) של תעתיקים אלה ולא הבדלים בפועל ברמות התמליל7.
ישנן מספר שיטות ללמוד תרגום mRNA אנדוגני רחב הגנום בביצית העכבר. שיטות אלה כוללות פרופיל פוליזום7,17,18 ו RiboTag / RNA-Seq5,19,20. פרופיל ריבוזום היא שיטה נוספת לחקר תרגום גנום רחב כי שימש שמרים, שהוא אורגניזם מודל נוסף המשמש לחקר מיוזיס21,22. עם זאת, ניתוחים אלה הגנום כולו ללמוד תרגום mRNA בעכבר דורשים שימוש 150-200 ביציות לכל מדגם בעוד מספר ביציות זמין לניתוח מוגבל בדרך כלל. בדיקה חד-פעמית של ביצית המתוארת בזאת להערכת תרגום של 3 ' UTR של mRNAs היעד משלים ניתוחים גנומיים רחבים של תרגום, כפי שהוא מאפשר אפיון של אלמנטים של UTR 3 'המסדירים את תוכנית התרגום במהלך התבגרות מיוטית ביצית4,5,6. בעבר, מבחנים מבוססי לוציפראז שימשו להערכת תרגום של 3 ' UTR של mRNAs היעד10,20,23 כפי שהוא שיטה רגישה מאוד הדורשת רק כמה ביציות לכל מדגם; עם זאת, ביציות צריך להיות lysed כדי לזהות את כמות לוציפראז במדגם.
אחרים השתמשו 3 ' UTR / ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP) כתב כדי להעריך הצטברות GFP ב ביציות עכבר חי4. עם זאת, בניסויים אלה נעשה שימוש רק בשתי נקודות זמן: תחילת הדגירה (prophase I) וסוף הדגירה (מטפאזה II). זה מקטין מאוד את כוח המדידות ומגביר את האפשרות לטעויות. נתונים קינטיים מספקים מדידות מדויקות בהתבסס על קצבים (נקודות מרובות) ומגדירים במדויק את הזמן שבו מתרחשת הפעלה או דיכוי תרגום. בנוסף, לא ניתן להעריך את דיכוי התרגום בנקודות זמן בודדות אלה, מה שעלול להוביל למסקנה לא מדויקת. לכן, שיטה זו הותאמה על ידי החלת מיקרוסקופיה לשגות זמן כדי להעריך הצטברות כתב UTR Ypet/3' לאורך התבגרות במבחנה של ביציות עכבר5,6,9. באמצעות אסטרטגיה זו, ניתן ללמוד תרגום במעברים שונים במהלך התבגרות ביצית.
ישנם מספר היבטים חשובים על שיטה זו לשקול. ראשית, הכתבים המשמשים כוללים זנב אוליגו(א) שמחדלו מפחית במידה ניכרת את הצטברות הכתבים. זה יכול להיות בגלל תרגום ירד, כמו גם כתב mRNA לערער את היציבות24,25. במהלך הדגירה מראש ב prophase I, תרגום של בדיקה oligoadenylated מתאים לשקף את קצב התרגום של mRNA אנדוגני5. שנית, חשוב להבין כי עלייה במספר ההקלטות או משך החשיפה לפלואורסצנטיות עלולה לגרום לפוטוטוקסיות ובכך לפגוע באיכות ביצית. למרות שהניסוי הנוכחי אימץ מרווחי זמן של 15 דקות, ניתן להקטין את קצב הדגימה כאשר יש להשתמש בחשיפה גבוהה לפלואורסצנטיות במקרה של ביטוי עיתונאי נמוך.
כדי להגביל את כמות phototoxicity, מקור אור LED קר שימש, אשר דורש עירור קצר יותר26. כדי להעריך השפעות פוטוטוקסיות פוטנציאליות ביציות, התזמון של GVBD ו- PBE הושווה ביציות שהוזרקו במיקרו ונחשפו לפלואורסצנטיות או שלא הוזרקו ולא נחשפו לפלואורסצנטיות. השילוב של הזרקת מיקרו וחשיפה לפלואורסצנטיות נמצא כעיכוב קל של GVBD (p<0.001), בעוד שהעיתוי של PBE היה דומה (איור 7).
שיטה זו שימשה כדי ללמוד אלמנטים רגולטוריים תרגום של UTR 3 ' במהלך התבגרות מיוטית ביוט במבחנה. באופן דומה, זה עשוי לשמש גם כדי ללמוד פונקציונלי 5 ' אלמנטים UTR חיוני לוויסות התרגום או ללמוד תרגום במהלך הפריה במבחנה ביצית. למרות ששיטה זו הוחלה על ביציות אדם ועכבר, היא חלה גם על מינים אחרים של בעלי חיים. מכיוון שסקר זה מבוצע ביציות בודדות, הוא מתאים במיוחד לשימוש במינים מונו-ביוץ שבהם מספר הביציות הזמינות לניתוח מוגבל. בניגוד לשימוש ביציות מנודות, יישום נוסף של טכניקה זו הוא הזרקת הכתב לתוך ביציות סגורות קומולוס, כמו תאים cumulus לשחק תפקיד מרכזי ברגולציה של תוכנית תרגום8,10,27. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי ביציות סגורות קומולוס נוטים יותר להתרחק ממטוס ההקלטה במהלך הניסוי לעומת ביציות מנודות בגלל התנועה של תאי קומולוס במהלך הרחבת COC. הדבר עלול לגרום לשיעור גדול יותר של ביציות שיש להחריג מניתוח. בעתיד, ניתן יהיה להשתמש בתוכנה למעקב אחר תאים המסוגלת לעקוב אחר מיקומי x, y ו- z של ביציות ב droplet, דבר שעשוי לפתור בעיה זו.
לסיכום, בדיקה מתארת של כתב ביצית יחיד מייצגת אסטרטגיה לחקור את תוכנית התרגום שבוצעה במעבר ביצית לזיגוטה. ידע מוגבר בתוכנית תרגום זו יכול לספק רמזים חשובים על הרגולציה המולקולרית של יכולת התפתחותית ביצית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM097165, GM116926 ו יוניס קנדי שרייבר NICHD המרכזים הלאומיים למחקר תרגום רבייה ועקרות P50 HD055764 למרקו קונטי. אנריקו מ. דלדלו נתמך על ידי מלגת קרן לור ונטסיה ג'יי קוסטרמן נתמכה על ידי מלגת רוביקון מארגון המחקר המדעי של הולנד (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
