एक एकल Oocyte रिपोर्टर परख का उपयोग कर इन विट्रो परिपक्वता के दौरान मातृ mRNA अनुवाद के कार्यक्रम को परिभाषित
Summary
यह प्रोटोकॉल इन विट्रो परिपक्वता के दौरान एकल ओसाइट्स में एमआरएनए अनुवाद के नियमन का अध्ययन करने के लिए एक रिपोर्टर परख का वर्णन करता है।
Abstract
ओसाइट परमाणु परिपक्वता से जुड़ी घटनाओं को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है । हालांकि, निषेचन और totipotency के अधिग्रहण की तैयारी में साइटोप्लाज्म में होने वाले आणविक रास्तों और प्रक्रियाओं के बारे में बहुत कम जाना जाता है। oocyte परिपक्वता के दौरान, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन विशेष रूप से ट्रांसक्रिप्शन के बजाय मातृ दूत आरएनए (mRNAs) के अनुवाद और गिरावट पर निर्भर करता है। इसलिए, अनुवाद कार्यक्रम का निष्पादन भ्रूण विकास को बनाए रखने के लिए ओसाइट विकासात्मक क्षमता स्थापित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह पेपर मातृ एमआरएनए अनुवाद के कार्यक्रम को परिभाषित करने पर ध्यान केंद्रित करने का हिस्सा है जो मेइटिक परिपक्वता के दौरान और ओसाइट-टू-ज़िगोट संक्रमण पर होता है। इस विधि पत्र में, इन विट्रो ओसाइट परिपक्वता के दौरान लक्ष्य mRNAs के अनुवाद के नियमन का अध्ययन करने के लिए एक रणनीति प्रस्तुत की जाती है। यहां, एक Ypet रिपोर्टर ब्याज के जीन के 3 ‘ अअनुवादित क्षेत्र (यूटीआर) के लिए जुड़ा हुआ है और फिर माइक्रो-इंजेक्शन मात्रा के लिए नियंत्रित करने के लिए mCherry के लिए पॉलीडैनील mRNA एन्कोडिंग के साथ एक साथ oocytes में इंजेक्शन । रिपोर्टर संचय को मापने के लिए समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, अनुवाद दरों की गणना ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान विभिन्न संक्रमणों पर की जाती है। यहां, oocyte अलगाव और इंजेक्शन, समय चूक रिकॉर्डिंग, और डेटा विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल वर्णित किया गया है, Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3 ‘ UTR रिपोर्टर एक उदाहरण के रूप में उपयोग कर ।
Introduction
एक पूरी तरह से विकसित स्तनधारी ओसाइट निषेचन और टोटिपेंसी के अधिग्रहण की तैयारी में तेजी से परिवर्तन से गुजरता है। निषेचन के बाद भ्रूणीय विकास को बनाए रखने के लिए ये परिवर्तन आवश्यक हैं। यद्यपि परमाणु परिपक्वता से जुड़ी घटनाओं को अपेक्षाकृत अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, लेकिन ओसाइट साइटोप्लाज्म में आणविक प्रक्रियाओं और रास्तों के बारे में बहुत कम जाना जाता है। ओसाइट परिपक्वता के अंतिम चरण के दौरान, ओसाइट्स ट्रांसक्रिप्शनली रूप से चुप होते हैं, और जीन अभिव्यक्ति पूरी तरह से एमआरएनए अनुवाद और गिरावट1,2पर निर्भर है। विकासात्मक क्षमता के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन का संश्लेषण, इसलिए, लंबे समय तक रहने वाले एमएचआरएन के समय पर अनुवाद के कार्यक्रम पर निर्भर करता है जिसे ओसाइट विकास1,3के दौरान पहले संश्लेषित किया गया है। मेयोटिक परिपक्वता के दौरान और ओसाइट-टू-ज़िगोट संक्रमण के दौरान निष्पादित मातृ एमआरएनए अनुवाद के इस कार्यक्रम को परिभाषित करने पर ध्यान केंद्रित करने के हिस्से के रूप में, यह पेपर विट्रो मेइटिक परिपक्वता के दौरान एकल ओसाइट्स में लक्षित मातृ एमएचएनए के अनुवाद के सक्रियण और दमन का अध्ययन करने की रणनीति प्रस्तुत करता है।
इस विधि में, वाईपेट ओपन रीडिंग फ्रेम को ब्याज की ट्रांसक्रिप्ट के 3 ‘यूटीआर’ के ऊपर क्लोन किया जाता है। इसके बाद, इस रिपोर्टर को एन्कोडिंग करने वाले एमआरएएनए को इंजेक्शन की मात्रा के लिए नियंत्रित करने के लिए पॉलीडीनेलेटेड एमआरएएनए एन्कोडिंग एमसीएचरी के साथ एक साथ ओसाइट्स में माइक्रो-इंजेक्ट किया जाता है। रिपोर्टर संचय समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इन विट्रो ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान मापा जाता है। पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) और रीचेरी का संचय व्यक्तिगत ओसाइट्स में दर्ज किया जाता है, और वाईएफपी संकेतों को सह-इंजेक्शन मचेरी के पठार स्तर द्वारा ठीक किया जाता है। डेटा अधिग्रहण के बाद, वक्र-फिटिंग द्वारा प्राप्त वक्र की ढलान की गणना करके इन विट्रो ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान विभिन्न समय अंतराल के लिए अनुवाद दरों की गणना की जाती है।
यह दृष्टिकोण चयनित अंतर्जात आरएएनए के अनुवाद में परिवर्तनों की प्रयोगात्मक पुष्टि करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। इसके अलावा, यह विधि नियामक तत्वों के लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है जो लक्ष्य एमआरएएनए4,5,6 के 3 ‘ यूटीआर के सीआईएस-नियामक तत्वों में हेरफेर करके ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान अनुवाद कोनियंत्रितकरते हैं। पॉली (ए) पूंछ की लंबाई में हेरफेर भी oocytes5में adenylase/डेडनेलीज गतिविधि में अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है । सीआईएस-अभिनय तत्वों या आरएनए इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के म्यूटेनेसिस का उपयोग कॉग्नेट आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन6,7के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस विधि का उपयोग अनुवाद कार्यक्रम के आवश्यक घटकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो कम ओसाइट गुणवत्ता 8,9,10से जुड़े मॉडलों में लक्ष्य 3 ‘ यूटीआर अनुवाद को मापकर ओसाइट विकासात्मक क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह विधि कागज एक प्रतिनिधि प्रयोग प्रस्तुत करता है जहां 21 दिन पुराने C57/BL6 चूहों के denuded oocytes माइक्रो एक Ypet रिपोर्टर के साथ इंजेक्शन दिया गया है आईएल-7 के 3 ‘ UTR को जुड़े । ओसाइट इंजेक्शन, समय-चूक रिकॉर्डिंग और डेटा विश्लेषण के लिए सेटअप और प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत विधि इन विट्रो ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान विभिन्न संक्रमणों पर लक्ष्य एमआरएनए के अनुवाद और दमन का अध्ययन करने की रणनीति का वर्णन करती है। आईएल-7, ओसाइट द्वारा जारी एक साइटोकिन जो ओसाइ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनआईएच आर01 GM097165, GM116926 और यूनिस कैनेडी श्रिवर एनआईसीएचडी नेशनल सेंटर्स फॉर ट्रांसलेशनल रिसर्च इन रिप्रोडक्शन एंड इन कॉन्वर्टी P50 HD055764 का समर्थन किया गया था। एनरिको एम डाल्डेलो को लालोर फाउंडेशन से फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था और नटजा जी जे कॉस्टरमैन को नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ) से रूबिकॉन फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
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