Summary
该协议描述了记者在体外成熟期间研究单卵母细胞 mRNA 翻译的调节。
Abstract
与卵母细胞核成熟有关的事件已经很好地描述了。然而，对于细胞质中为受精和获得托蒂能做准备而发生的分子通路和过程，人们所知甚少。在卵母细胞成熟期间，基因表达的变化完全取决于母体信使RNA（mRNA）的转化和降解，而不是转录。因此，实施转化计划对建立卵母细胞发育能力以维持胚胎发育起着关键作用。本文是重点定义母体mRNA翻译程序的一部分，该程序发生在母体成熟和卵母细胞到卵母细胞的过渡阶段。在本方法论文中，提出了研究 体外 卵母细胞成熟期间目标mRNA翻译的调控策略。在这里，一个Ypet记者被融合到利益基因的3'未翻译区域（UTR），然后微注入卵母细胞与多基化mRNA编码为mCherry控制注射量。通过使用延时显微镜测量记者的积累，在卵母细胞成熟期间，在不同的过渡中计算翻译率。在这里，使用Ypet/插话-7（IL-7）-3'UTR记者为例，描述了卵母细胞分离和注射、延时记录和数据分析的协议。
Introduction
一个完全生长的哺乳动物卵母细胞在准备受精和获得托蒂波特时经历了快速变化。这些变化对于受精后维持胚胎发育至关重要。虽然与核成熟相关的事件描述得相对较好，但关于卵母细胞细胞质中的分子过程和通路的了解却要少得多。在卵母细胞成熟期的最后阶段，卵母细胞是转录沉默的，基因表达完全依赖于mRNA的转化和降解1，2。因此，蛋白质的合成对发育能力至关重要，它依赖于在卵母细胞生长1、3早期合成的长寿mRNA的定时翻译程序。作为确定母体mRNA翻译程序的一部分，在母细胞成熟和卵母细胞到卵母细胞的过渡期间执行，本文提出了一个策略，研究在体外美化成熟期间单卵母mRNA在单卵母细胞中的活化和抑制。
在这种方法中，YPet开读帧被克隆到3'UTR的感兴趣成绩单上游。接下来，mRNA编码本报记者是微注入卵母细胞与多基化mRNA编码mCherry控制注射量。使用延时显微镜 测量体外 卵母细胞成熟期间的记者积累。黄色荧光蛋白 （YFP） 和 mCherry 的积累记录在单个卵母细胞中，YFP 信号通过共同注入的 mCherry 的稳定水平进行校正。数据采集后，通过计算曲线拟合获得的曲线斜率， 计算体外 卵母细胞成熟期间的不同时间间隔的翻译率。
此方法提供了一个工具，以实验性地确认所选内源 mRNA 的翻译更改。此外，该方法还通过操纵目标 mRNA 4、5、6 的 3' UTR 的 cis-监管元素，促进控制卵母细胞成熟期间翻译的监管元素的定性。操纵多（A）尾长度也允许洞察腺酶/死细胞5的活动。cis-代理元素或RNA免疫沉淀的突变可用于研究与同位素RNA结合蛋白6，7的相互作用。此外，该方法还可用于通过测量与卵母细胞质量下降8、9、10相关的模型中的目标 3' UTR 翻译来识别对卵母细胞发育能力至关重要的翻译程序的基本组件。本方法论文提出了一个具有代表性的实验，其中21天大的C57/BL6小鼠的卵母细胞被微注射与IL-7的3'UTR融合的Ypet记者。介绍了卵母细胞注射、延时记录和数据分析的设置和协议。
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Protocol
涉及动物的实验程序得到了旧金山加州大学动物护理和使用委员会（AN182026号协议）的批准。
1. 媒体准备
- 添加表 1中描述的所有组件，使基本的卵母细胞收集介质和卵母细胞成熟介质。对于基本的收集介质，将 pH 设置为 7.4。对于收集和成熟介质，在使用当天添加 3 毫克/mL 的牛血清白蛋白 （BSA） 和 1 μM 西洛酰胺。
2. 为 Ypet-3' UTR 和 M 樱桃准备 mRNA 编码
- 获取感兴趣的 mRNA 的 3+ UTR 序列。
注：对于这项研究，序列以前是从小鼠卵母细胞cDNA获得的。 - 设计引物，以放大目标 3' UTR 从卵母细胞 cDNA 和部分 pcDNA 3.1 向量包含 Ypet 编码序列，V5-epitope 标签和 T7 促进器。
- 使用高保真DNA聚合酶试剂盒放大。在凝胶上运行聚合酶链反应 （PCR） 产品，以检查碎片是否有正确的尺寸，切出带子，并根据制造商的说明使用凝胶提取套件从凝胶中提取 DNA。
- 使用 PCR 克隆套件将 PCR 片段融合到向量中。
注：PCR碎片在冰上孵育4小时，以促进更高效的重组过程。这与制造商的说明相反，制造商建议的孵化时间仅为 45 分钟。 - 将 PCR 片段传输到合格 的 5-α 大肠杆菌 。
- 将混合物和质粒加入细菌中，在冰上孵育30分钟。
- 将混合物放入42°C的水浴中加热45秒，并立即在冰上冷却3分钟，从而冲击混合物和质粒。
- 添加 500 μL 的超级最佳肉汤与卡塔博利特抑制 （SOC） 介质和孵育 1 小时在 37 °C.
- 在 7000 × g 下旋转 2 分钟，并去除大部分超自然。用适当的选择抗生素在卢里亚兄弟 （LB） agar 板上重新喷射和板。
注：卡贝尼西林在这项研究中使用。 - 在37°C的夜间孵化。 通过轻轻按压其中一个殖民地的移液器尖端，并将其放置在 3 毫升的 LB 介质中，并配有 100μg/mL 的苯甲酸酯，从而隔离殖民地。在 37 °C 时孵化 12-24 小时。
- 根据制造商的说明，使用质粒DNA分离套件提取质粒的DNA，并通过DNA测序确认序列。
- 对于伊佩特/3' UTR：
- 生成用于体外转录的线性 PCR 模板。使用 Ypet 序列上游的前进引物和带有 20 个额外胸腺残留物的反向引物。有关 Ypet/IL-7 3' UTR 的序列以及前进和反向引物的序列，请参阅表 2。
注意：这些额外的胸腺残留物 将在体外转录后将寡头（A）添加到线性mRNA中。 - 体外 根据制造商的说明使用 T7 转录套件转录 PCR 产品。
- 根据制造商的说明，使用转录清理套件净化由此产生的互补RNA （cRNA）。
- 在无RNASe水中清除纯化的cRNA，测量浓度，并通过糖电泳评估完整性。储存在−80°C。
- 生成用于体外转录的线性 PCR 模板。使用 Ypet 序列上游的前进引物和带有 20 个额外胸腺残留物的反向引物。有关 Ypet/IL-7 3' UTR 的序列以及前进和反向引物的序列，请参阅表 2。
- 对于樱桃：
- 使用高保真度限制酶生产 用于体外 转录的线性 PCR 模板;如果复制此示例，请使用限制酶 mfEI-HF。在37°C的消化缓冲区中消化过夜。
- 运行凝胶来净化样品，并根据制造商的说明使用凝胶提取套件提取线性DNA。
- 体外 根据制造商的说明使用 T7 转录套件转录 PCR 产品。
- 根据制造商的说明，使用聚（A）尾矿套件对 cRNA （150-200 核苷酸） 进行聚聚苯乙烯酸化。
- 根据制造商的说明，使用转录清理套件净化由此产生的 cRNA。
- 在无RNASe水中清除纯化的cRNA，测量mRNA浓度，并通过凝胶电泳评估消息完整性。储存在−80°C。
3. 实验程序
注： 图1中给出了卵母细胞微注射和随后延时显微镜的示意图概述。
- 第 1 天
- 在腹腔内给21天大的老鼠注射5IU的怀孕母马血清性腺激素，以促进卵泡生长到蚂蚁期11。
- 第3天
- 卵母细胞集合
- 牺牲小鼠44-48小时后，启动收集卵巢，并把它们放在一个塑料培养皿与基本的卵母细胞收集介质。
- 小心地打开心角毛囊，用26G针在毛囊壁上做一个小切口。使用口腔操作的玻璃移液器，将完整的积聚封闭卵母细胞 （COCs） 与几层积聚细胞分离。
- 使用较小的移液器（略大于卵母细胞的直径），并通过重复的管道反复机械地去除 COC。
注：或者，对完好无损的 COC 进行微注射。 - 使用更大的移液器，吸气凹陷的卵母细胞，并把它们放在一个培养皿与成熟介质补充1μM的磷柴油酶抑制剂，西洛斯塔米德，以防止恢复美化成熟12。将菜放在孵化器中2小时，让卵母细胞从卵泡中分离卵母细胞所引起的压力中恢复过来。
- 卵母细胞微注射
- 将10厘米长的薄膜玻璃毛细管放入机械拉力器中，准备注射针头。为了获得最佳注射效果，请使用加热灯丝以 45° 角弯曲针尖。
- 用20μL基本卵母细胞收集介质液滴准备聚苯乙烯菜肴，用轻质矿物油覆盖液滴。
- 通过添加 12.5 微克/μL Ypet-3' UTR 和 12.5 微克/μL mCherry 来准备记者组合。准备更大的体积，并为未来的实验制作别名，以确保类似的记者浓度。将这些别名存储在-80°C。 解冻后，先在20，000 x g下将离心机离心机进行2分钟，并转移到新的微中线管中。
注意：这种离心将防止注射针被记者组合中的潜在聚合物堵塞。 - 用毛细毛虫装载注射针，约0.5μL的记者混合。
- 将手持的移液器和加载的注射针放入支架中，并放置在卵母细胞收集介质的液滴中。将一些介质吸进手持式移液器中。
- 轻轻敲击注射针，使其贴在握住的移液器上，打开注射针。
- 将卵母细胞放在基本收集介质的液滴中，并注入5-10 pL的记者混合。
- 在成熟介质中用1μM西洛酰胺孵育卵母细胞16小时，使mCherry信号稳定下来。
- 准备一个培养皿，用于延时显微镜与至少两个20μL液滴的成熟介质为每个注射记者：一个液滴与1μM西洛酰胺控制前阶段I逮捕卵母细胞和一个液滴没有西洛酰胺成熟卵母细胞。用轻质矿物油盖住液滴，放在孵化器中。
- 延时显微镜
- 预孵化后，从孵化器中取出注射的卵母细胞，并在成熟介质中清洗四次，无氯酰胺。将一些卵母细胞保持在成熟介质中，以1μM西洛酰胺作为前阶段I-逮捕卵母细胞控制组。
- 将注射的卵母细胞转移到先前准备的延时显微镜盘上各自的液滴中。使用封闭的玻璃移液器将卵母细胞聚集在一起（封闭的移液器可以通过将尖端保持在火焰中几秒钟来准备）。
注意：将卵母细胞聚集在一起有助于防止它们在录制过程中的移动。 - 将盘子放在显微镜下，配备发光二极管照明系统和配备环境室的电动舞台，保持在37°C和5%的二氧化碳。要复制此研究，请使用以下参数：筛选器集：二色镜 YFP/CFP/m樱桃 69008BS;YFP 通道（激励（前）：S500/20 × 49057;排放（EM）：D535/30米47281）、M樱桃通道（前：580/25×49829：Em： 632/60m）。
- 输入延时实验的相应设置（参见本研究中使用的软件 材料表 ）：单击 应用|多维采集。选择第一个选项卡 主 选项卡并选择 延时、多个阶段位置和 多个波长。
- 选择" 保存 "选项卡以输入应保存实验的位置。
- 选择选项卡 延时 输入时间点、持续时间和时间间隔的数目。
注：延时实验的持续时间取决于所研究的动物物种，因为卵母细胞成熟的时间因物种而异。在这个实验中，小鼠卵母细胞每15分钟记录一次，每次16小时。 - 选择选项卡 阶段。打开明亮的场，通过选择获取|打开新窗口，定位卵母细胞的位置 获取|显示现场。一旦卵母细胞被定位，切换回 多维采集 窗口，并按 + 设置卵母细胞的位置。
- 选择选项卡 波长，并为亮场设置 3 个不同的波长（曝光 15 毫秒）、YFP（Ypet/IL7 3' UTR 的曝光 150 ms）和 mCherry（Ypet/IL7 3' UTR 的曝光 75 毫秒）。
注：根据记者积累水平和注射量调整每位Ypet/3'UTR记者的曝光率。确保 YFP 信号在实验开始时位于检测范围的中心，以防止在激活翻译时低估或饱和。对于 mCherry，调整每批 mCherry 的暴露，因为信号取决于聚苯乙烯化过程中添加的腺苷核苷酸的数量。由于聚苯乙烯化效率的变化，在不同的实验中使用同一批mCherry，以便更好地比较实验。 - 通过单击 "获取"开始时间推移实验。请参阅 图 2 和 补充文件 ，了解单个卵母细胞中延时记录的示例。
- Ypet-3'UTR 翻译分析
- 对于此分析（参见本研究中使用的软件 的材料表 ），为每个卵母细胞执行两个区域测量：卵母细胞本身-点击 椭圆区域 并环绕卵母细胞-和一个小区域靠近卵母细胞，用于背景减法-点击 矩形区域。
注意：确保卵母细胞在延时记录期间不会移出选定的区域。特别注意极地体挤压周围区域测量的位置，因为这会导致卵母细胞运动，并可能扭曲记录。 - 首先单击 "打开日志"， 然后单击 日志数据 以导出数据分析软件，将区域测量数据导出到电子表格中。
- 对于每个单独的卵母细胞和所有测量的时间点，从卵母细胞区域测量中减去背景区域测量。分别针对YFP和m樱桃波长这样做。
- 记录细菌囊泡破裂 （GVBD） 和极地身体挤压 （PBE） 的时间，供以后参考。
注意：当GVBD超过2小时时，排除成熟的鼠标卵母细胞。 - 绘制YFP和m樱桃表达随着时间的推移，每个卵母细胞检查离群值。
注意：这应该是一个平滑的曲线，如果不是这样，这可能表明卵母细胞在录制过程中移动。 - 对于每个单独的卵母细胞，计算记录最后十个时间点的平均 mCherry 表达。对于每个时间点，将 YFP 表达按平均 mCherry 表达法进行除以以更正注入的体积，以便在每个每个卵母细胞的每个时间点获得 YFP/m 樱桃比。
- 通过线性回归来安装曲线的斜率，计算特定时间间隔的翻译率。使用统计推论评估翻译率的差异。
- 对于此分析（参见本研究中使用的软件 的材料表 ），为每个卵母细胞执行两个区域测量：卵母细胞本身-点击 椭圆区域 并环绕卵母细胞-和一个小区域靠近卵母细胞，用于背景减法-点击 矩形区域。
- 卵母细胞集合
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Representative Results
21天大C57/BL6小鼠的被否定的阶段I-逮捕卵母细胞被注射了含有mRNA编码的记者组合，将Ypet记者融合到IL-7的3'UTR和mRNA编码mCherry。YFP和mCherry表达记录在39个卵母细胞中，其中30个已经成熟，9个在序言I中作为负控制被捕。三个成熟的卵母细胞被排除在分析之外，因为它们要么有延迟的GVBD（N+2），要么在录制过程中在盘子里移动（N=1）。 图3 显示了M樱桃和YFP表达在第一阶段和成熟的卵母细胞。 图4 显示YFP表达成熟卵母细胞纠正为稳定mCherry表达（平均mCherry表达在最后10个时间点）纠正注射量。记者的翻译率是通过曲线拟合（线性回归）在第一阶段和在西洛酰胺释放后的第一个0-2小时或8-10小时内成熟卵母细胞的YFP/mCherry值（图5A）来衡量的。记者的积累不遵循线性模式，如西洛酰胺释放后0-2 h和8-10h的翻译速率显著差异（p<0.0001： 图5B）。因此，这些结果表明，在卵母细胞成熟期间IL-7翻译的激活。
图1：实验过程的原理图概述。 奥利戈德尼拉特 Ypet/3' UTR 和多基化 mRNA 编码 mCherry 被微注入 21 天大的 C57/BL6 小鼠的凹陷卵母细胞中。卵母细胞在含有成熟介质的西洛酰胺中预孵育16小时，使mCherry信号到达高原。预孵化后，开始进行延时记录，卵母细胞要么与氯酰胺一起保存在介质中，以创建一个前阶段I-逮捕对照组，要么以无氯酰胺的介质释放成熟。缩写：UTR=未翻译区域;YFP = 黄色荧光蛋白;fw引号=前引号：转速引门=反向引门：安普 =安培素耐药性;聚A=聚苯乙烯：寡头+寡头腺素;GV=细菌囊泡。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：单个卵母细胞延时记录示例。 布莱特菲尔德， Yfp， 和 mCherry 记录的单个卵母细胞注入 mrna 编码 Ypet / Interleukin - 7 3' Utr 和多酰胺 mCherry 在序言 I， MI （6 小时后氯酰胺释放） 和 MII （15 小时后氯酰胺释放） 。比例栏 =25 μm。缩写：YFP = 黄色荧光蛋白;GV=细菌囊泡;MI=元相I：MII=元相II。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：YFP和mCherry信号通过延时显微镜记录。 YFP 和 mCherry 信号的卵母细胞注入寡头叶酸酯叶/IL7 3' UTR 和多基化 mRNA 编码 m 樱桃。卵母细胞要么与西洛酰胺保持在中等，以产生一个前一阶段I-逮捕对照组（N=9），要么以无氯酰胺的介质释放，以允许成熟（N=30）。数据是单个卵母细胞测量。缩写：IL-7=交代-7：YFP=黄色荧光蛋白。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：YFP 信号更正为共同注入的 mCherry 级别。通过将YFP信号除以最后10个时间点的平均mCherry信号，纠正了YFP信号的序I逮捕和成熟卵母细胞的注入量。（A ） 前一阶段I-逮捕卵母细胞和（B）成熟卵母细胞的单独YFP/m樱桃比率，平均±标准误差（C）前一阶段I-逮捕和（D）成熟卵母细胞。缩写：YFP = 黄色荧光蛋白;GVBD=细菌囊泡分解。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：在0-2小时和8-10小时成熟时计算转化率。 （A） 黄荧光蛋白（YFP）信号的单卵母细胞纠正为mCherry（YFP/mCherry）在0-2小时或8-10 h 后氯酰胺释放和（B）翻译率 （平均±标准误差） 计算曲线拟合 （线性回归） YFP/mCherry 值在 0-2 h 和 8-10 h 后氯酰胺释放.使用未修复的双尾 t 测试对数据进行了分析。*p<0.0001。请单击此处查看此图的较大版本。
图6： 压制翻译的例子： Oosp2 . 重新分析了一个实验的数据，其中卵母细胞被注射了Ypet-Oosp2 3+ UTR和多基化mRNA编码mCherry。通过将YFP信号除以最后10个时间点的平均mCherry信号，纠正了YFP信号的序I-逮捕（N=63）和成熟卵母细胞（N=72）的注射量。YFP 和 mCherry 表达数据是使用 Xenon Arc 灯获得的，这与使用 LED 光源的 IL-7 实验不同。数据表示单个卵母细胞测量平均值的平均±标准误差，并曾发表在《龙》等人的论文中。5. 缩写：YFP = 黄色荧光蛋白;Oosp2 =卵母细胞分泌蛋白质2;UTR=未翻译区域;IL-7=插话-7：LED= 发光二极管;GVBD=细菌囊泡分解。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：微注射和荧光暴露对GVBD和PBE时间的影响。GVBD 和 PBE 的卵母细胞的时机，这些卵母细胞要么被微注射并暴露在荧光（注射）中，要么未注射，不暴露于荧光（未注射）。数据是单个卵母细胞测量。使用未修复的双尾t测试对数据进行了分析。*p<0.001。缩写：GVBD = 细菌囊泡分解;PBE=极地身体挤压。请单击此处查看此图的较大版本。
| 基本卵母细胞收集介质 | ||
| 元件 | 对于 500 mL | |
| HEPES 修改了最低基本中等鹰 | 7.1 克 | |
| 碳酸氢钠 | 252毫克 | |
| 苯丙酸钠 | 1.15升 | |
| 青霉素/链霉素 100倍 | 5升 | |
| 超纯蒸馏水（英创，10977-015） | 高达500升 | |
| 成熟介质 | ||
| 元件 | 对于 500 mL | |
| MEM阿尔法1倍 | 高达500升 | |
| 苯丙酸钠 | 1.15升 | |
| 青霉素/链霉素 100倍 | 5升 | |
表1：媒体准备。 需要添加的组件列表，以准备基本的卵母细胞收集介质和卵母细胞成熟介质。
| 序列 | |||||
| 伊佩特/因特卢金-7 3' UTR | 加加卡克特克塔克卡格 格塔克特克特加克特加特加特卡奇克特克卡卡特加加格加 阿加格特·卡奇格特·格特克特·卡加特·加格 阿卡格特卡格特加格加格格加格格加克加克卡格特克特克 阿格特克卡卡格卡格茨克特 格特克塔克格特克塔克卡加克特卡 阿加格GCC卡茨加格特克特克特卡加卡 卡塔卡加加格特加格特加格加加卡茨加 阿格卡特卡加卡卡卡特克特加卡 阿加卡格特卡卡加特 中国民航总局 卡奇加克克茨克特克卡塔克塔克塔卡加格茨克 特卡加加卡加特克特加克特加奇 格卡特卡卡加格·卡加加克塔加塔加特·特克特加格塔格塔克塔 中信科技 阿格塔卡加特卡特加克 阿格特卡特加特克特克特克特卡塔加特 阿加特加特加卡加加特加加特克特卡加塔卡 卡塔卡加特·塔特卡特克特卡卡特克特 塔卡卡阿格塔卡加特加特卡加特克 阿特加塔塔·卡特加特加特加特格 行动加特加特加格特加特加塔特克特加特塔克特加加特塔克 阿加格塔格塔格塔格卡特卡卡特加特塔加塔卡 卡塔克塔格塔加加塔加塔加塔 特卡阿加塔克塔特加 特卡特加塔特 塔格卡特克特克塔 阿泰特卡特卡塔克特加塔克塔克 特加格特·卡加格特·格特加特·加特加特·加特加特·卡特加特·卡塔格特·加卡奇 阿塔特塔卡加特卡加塔加法加塔克塔克塔加加 阿卡塔塔特克塔格塔克塔克塔加加卡茨加格 卡塔特格塔加塔卡特塔卡加特卡塔克塔 格塔塔格特格塔塔克特格特克塔加卡塔 特格塔加特·加特加塔格特·格格特·加特卡特卡特 特卡卡卡格特加克卡特克塔克特加特加特克 阿泰格卡特格特克·卡特克·克茨克特·卡塔克特克特卡格特克 塔卡加塔格塔特卡特加卡卡特塔格特卡塔塔卡特 格卡加卡格特·卡卡特加卡特塔卡特加特 特加塔克塔卡塔卡卡特克特加加特格塔 阿格塔克塔克加加格卡特克特格特格塔加塔克特加格特格特加 格克塔卡特加塔特 |
||||
| 前进引门 | 加加恰克特克塔克 | ||||
| 反向引门 | 塔克 卡塔克 |
||||
表2：用于生成线性 PCR 模板进行体外转录的 YFP/IL7 3'UTR 记者的记者和引物序列的示例以及用于生成线性 PCR 模板的前进和反向引物序列。
补充文件：黄色荧光蛋白（YFP）和 mCherry 延时记录。 YFP 和 mCherry 延时记录的单个卵母细胞注入 mRNA 编码 Ypet/插话-7 3' UTR 和多面体的 mCherry。YFP 频道（前：S500/20 × 49057;Em： D535/30 m 47281）， mCherry 通道 （Ex： 580/25 × 49829;Em： 632/60m）。卵母细胞每15分钟记录16小时（7帧/秒）。 请单击此处下载此文件。
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Discussion
提出的方法描述了一种策略，研究在体外卵母细胞成熟期间不同过渡时对目标mRNA的活化和抑制。IL-7，一种细胞因子释放的卵母细胞，可能涉及卵母细胞-cumulus细胞通信8，13，被选择用于描述这种方法。IL-7 在卵母细胞成熟8期间被越来越多地翻译，并且允许使用此方法对转化激活进行良好的可视化。但是，如果在整个实验中以恒定的速度进行翻译，则记者的积累将遵循线性模式，并且实验开始和结束时的翻译率将相似。此结论可以通过整个录制间隔的线性回归的拟合 （R） 的善良来验证。记者翻译中的压制将呈现为YFP信号的稳定。
在龙等人的研究中，可以发现一个压制3'UTR翻译的例子。5，作者报告在卵母细胞成熟期间抑制卵母细胞分泌蛋白质2（Oosp2）。这些数据经过重新分析，并显示在 图6中。成熟的卵母细胞显示YFP信号的稳定，表示对翻译的压制，而前一阶段I-逮捕对照组遵循记者积累的线性模式，这表明在实验的开始和结束时的翻译率相似。在研究抑制翻译时，特别重要的是要包括一个第一阶段的控制组，以确保YPF信号的稳定性不会因为文化条件差而导致卵母细胞质量下降，从而确认卵母细胞的生存能力。使用 YFP 的引言或使用本协议中记者包含的 V5 表皮标签进行西式印迹，可以通过定量反转录 PCR 验证记者的积累。
YFP信号的稳定可能不仅仅是由于对翻译的积极调控压制，也可以解释为记者在卵母细胞美化过程中的退化。这可能反映了内源性mRNA的不稳定，这对向胚胎基因组表达14、15、16的过渡至关重要。这种可能性可以通过测量第一阶段与元相II阶段的目标基因转录水平来验证，以确认mRNA的稳定性。在准备卵母细胞 cDNA 时，最好使用随机六角形启动而不是寡头- dT 启动。后一种方法在基因成绩单水平上存在明显差异，这些成绩单的多（A）长度可能反映差异，而不是成绩单水平7的实际差异。
有几种方法可以研究小鼠卵母细胞中全基因组内源性mRNA翻译。这些方法包括多体分析7，17，18和里博塔格/RNA-Seq 5，19，20。核糖体分析是研究酵母中使用的全基因组转化的另一种方法，是另一种用于研究肌瘤21，22的模型生物体。然而，这些研究小鼠mRNA翻译的全基因组分析要求每个样本使用150-200个卵母细胞，而可用于分析的卵母细胞数量通常有限。此处描述的单卵母细胞检测，以评估目标 mRNA 的 3' UTR 的翻译，以补充全基因组的翻译分析，因为它允许在卵母细胞成熟4、5、6期间调节翻译程序的 3' UTR 元素的特征。过去，基于路西法酶的检测用于评估目标 mRNA10、20、23的3' UTR 的翻译，因为它是一种非常敏感的方法，每个样本只需要几个卵母细胞：然而，卵母细胞需要被解体，以检测样本中的路西法酶量。
其他人则使用3'UTR/绿色荧光蛋白（GFP）记者来评估活小鼠卵母细胞4中的GFP积累。然而，在这些实验中，只使用了两个时间点：孵化的开始（第一阶段）和潜伏的结束（元相II）。这大大降低了测量的功率，增加了出错的可能性。动能数据提供基于速率（多个点）的准确测量，并准确定义发生转化激活或压制的时间。此外，不能在这些单一时间点评估对翻译的压制，这可能导致不准确的结论。因此，通过应用延时显微镜来评估Ypet/3'UTR记者在整个小鼠卵母细胞5、6、9的体外成熟过程中的积累，对该方法进行了调整。通过使用此策略，可以研究卵母细胞成熟期间不同过渡时的翻译。
关于这种方法，需要考虑几个重要的方面。首先，使用的记者包括一个寡头（A）尾巴，其遗漏大大减少了记者的积累。这可能是由于翻译减少以及记者mRNA破坏稳定24，25。在序期I的预孵化过程中，寡头基基末端探针的翻译进行调整，以反映内源性mRNA5的翻译率。其次，必须认识到，荧光暴露的录音次数或持续时间的增加可能会诱发光毒性，从而损害卵母细胞的质量。虽然目前的实验采用了15分钟的间隔，但当在低记者表达的情况下必须使用高荧光照射时，采样率可以降低。
为了限制光毒性，使用了冷 LED 光源，这需要更短的激发26。为了评估卵母细胞的潜在光毒性影响，在卵母细胞中比较了GVBD和PBE的时机，这些卵母细胞要么微注射，要么暴露在荧光下，要么没有注射，也没有暴露在荧光下。微注射和荧光暴露的组合被发现稍微延迟GVBD（p<0.001），而PBE的时间是相似的（图7）。
该方法用于研究体外卵母细胞成熟期间3'UTR的转化调节元素。同样，它也可用于研究功能5'UTR元素，对翻译的调节或研究体外卵母细胞受精过程中的翻译至关重要。虽然这种方法已经应用于人类和小鼠卵母细胞，但它也适用于其他动物物种。由于本记者测定是在单卵母细胞中进行的，因此特别适合用于单卵细胞物种，其中可供分析的卵母细胞数量有限。与使用凹陷的卵母细胞相反，这项技术的另一个应用是将记者注射到积聚封闭的卵母细胞中，因为积聚细胞在翻译程序8、10、27的调控中起着重要作用。然而，应该考虑到，与凹陷的卵母细胞相比，积聚封闭的卵母细胞更有可能在实验期间离开记录平面，因为积聚细胞在COC扩张过程中的运动。这可能导致更大比例的卵母细胞必须排除在分析之外。将来，可能会使用能够跟踪液滴中卵母细胞的 x、y 和 z 位置的细胞跟踪软件，从而解决此问题。
最后，描述的单卵母细胞记者检测代表了一种策略，以调查在卵母细胞到卵母细胞过渡时执行的转化程序。增加对这个转化程序的了解，可以为卵母细胞发育能力的分子调节提供重要的线索。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH R01 GM097165、GM116926和尤尼斯·肯尼迪·施莱佛·尼赫德国家生殖和不孕症转化研究中心P50 HD055764的支持。恩里科·达尔代洛得到了拉勒基金会的奖学金的支持，纳塔莎·科斯特曼斯得到了荷兰科学研究组织（NWO）的鲁比肯研究金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
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