Summary
Questo protocollo descrive un saggio di reporter per studiare la regolazione della traduzione dell'mRNA in singoli ovociti durante la maturazione in vitro.
Abstract
Gli eventi associati alla maturazione nucleare degli ovocite sono stati ben descritti. Tuttavia, molto meno si sa delle vie molecolari e dei processi che si svolgono nel citoplasma in preparazione alla fecondazione e all'acquisizione della totipotenza. Durante la maturazione degli ovocite, i cambiamenti nell'espressione genica dipendono esclusivamente dalla traduzione e dal degrado degli RNA messaggeri materni (mRNA) piuttosto che dalla trascrizione. L'esecuzione del programma trascizionale, quindi, svolge un ruolo chiave nello stabilire la competenza allo sviluppo degli ovocite per sostenere lo sviluppo degli embrioni. Questo articolo fa parte di un focus sulla definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno che avviene durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovocita e zigote. In questo documento di metodo viene presentata una strategia per studiare la regolazione della traduzione degli mRNA bersaglio durante la maturazione degli ovocite in vitro. Qui, un reporter Ypet viene fuso alla regione non tradotta 3 ' (UTR) del gene di interesse e quindi micro-iniettato in ovociti insieme alla codifica dell'mRNA poliadenilato per mCherry per controllare il volume iniettato. Utilizzando la microscopia time-lapse per misurare l'accumulo del reporter, i tassi di traduzione sono calcolati a diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite. Qui, sono stati descritti i protocolli per l'isolamento e l'iniezione degli ovocite, la registrazione time-lapse e l'analisi dei dati, usando il reporter UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' come esempio.
Introduction
Un ovocita di mammiferi completamente cresciuto subisce rapidi cambiamenti nella preparazione alla fecondazione e all'acquisizione della totipotenza. Questi cambiamenti sono essenziali per sostenere lo sviluppo embrionale dopo la fecondazione. Sebbene gli eventi associati alla maturazione nucleare siano relativamente ben descritti, molto meno si sa dei processi molecolari e delle vie nel citoplasma degli ovocite. Durante le fasi finali della maturazione degli ovociti, gli ovociti sono trascrittamente silenziosi e l'espressione genica dipende interamente dalla traduzione e dalladegradazione dell'mRNA 1,2. La sintesi di proteine critiche per la competenza allo sviluppo, quindi, si basa su un programma di traduzione a tempo di mRNA di lunga durata che sono stati sintetizzati in precedenza durante la crescita degli ovocite1,3. Come parte di un focus sulla definizione di questo programma di traduzione dell'mRNA materno eseguito durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovociti e zigoti, questo documento presenta una strategia per studiare l'attivazione e la repressione della traduzione degli mRNA materni bersaglio in singoli ovociti durante la maturazione meiotica in vitro.
In questo metodo, il frame di lettura aperto YPet viene clonato a monte dell'UTR 3 ' della trascrizione di interesse. Successivamente, gli mRNA che codificano questo reporter vengono micro-iniettati in ovociti insieme a mRNA poliadenylati che codificano mCherry per controllare il volume iniettato. L'accumulo di reporter viene misurato durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro utilizzando la microscopia time-lapse. L'accumulo di proteine fluorescenti gialle (YFP) e mCherry è registrato nei singoli ovociti, e i segnali YFP sono corretti dal livello stabilizzato della mCherry co-iniettata. Dopo l'acquisizione dei dati, i tassi di traslazione sono calcolati per intervalli di tempo diversi durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro calcolando la pendenza della curva ottenuta mediante raccordo a curva.
Questo approccio fornisce uno strumento per confermare sperimentalmente i cambiamenti nella traduzione di mRNA endogeni selezionati. Inoltre, questo metodo facilita la caratterizzazione di elementi normativi che controllano la traslazione durante la maturazione meiotica degli ovocite manipolando gli elementi cis-regolatori dell'UTR 3' degli mRNA target4,5,6. La manipolazione della lunghezza della coda poli(A) consente anche di comprendere l'attività dell'adenilasi/deadenylasi negli ovociti5. La mutagenesi degli elementi ad azione cis o l'immunoprecipitazione dell'RNA possono essere utilizzate per studiare le interazioni con le proteine leganti l'RNAimparentate 6,7. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per identificare componenti essenziali del programma di traduzione che sono fondamentali per la competenza allo sviluppo degli ovocite misurando la traduzione UTR target 3' nei modelli associati alla riduzione della qualità degli ovocite 8,9,10. Questo documento di metodo presenta un esperimento rappresentativo in cui ovociti denudati di topi C57/BL6 di 21 giorni sono stati micro-iniettati con un reporter Ypet fuso all'UTR 3' di IL-7. Sono stati descritti l'impostazione e il protocollo per l'iniezione di ovocite, la registrazione time-lapse e l'analisi dei dati.
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Protocol
Le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California a San Francisco (protocollo AN182026).
1. Preparazione dei mezzi di comunicazione
- Aggiungere tutti i componenti, come descritto nella tabella 1, per rendere il mezzo di raccolta degli ovocite di base e il mezzo di maturazione degli ovocite. Per il supporto di raccolta di base, impostare il pH su 7.4. Sia per il mezzo di raccolta che per quello di maturazione, aggiungere 3 mg/mL di albumina sierice bovina (BSA) e 1 μM di cilostamide il giorno dell'uso.
2. Preparazione della codifica mRNA per UTR Ypet-3' e mCherry
- Ottenere le sequenze UTR 3′ degli mRNA di interesse.
NOTA: Per questo studio, le sequenze sono state precedentemente ottenute dall'ovocite del topo cDNA. - Progettare primer per amplificare gli UCRA 3' di destinazione dal cDNA degli ovociti e parti del vettore pcDNA 3.1 contenenti una sequenza di codifica Ypet, un tag V5-epitopo e un promotore T7.
- Amplificare utilizzando un kit di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Eseguire i prodotti di reazione a catena della polimerasi (PCR) su un gel per verificare se i frammenti hanno le dimensioni corrette, tagliare le bande ed estrarre il DNA dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
- Fusi i frammenti PCR a un vettore utilizzando un kit di clonazione PCR.
NOTA: I frammenti di PCR sono stati incubati sul ghiaccio per 4 ore per facilitare un processo di ricombinazione più efficiente. Ciò è contrario alle istruzioni del produttore, che raccomandano un tempo di incubazione di soli 45 minuti. - Trasfetto frammenti PCR in 5-α escherichia coli competenti.
- Aggiungere il mix e il plasmide ai batteri e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
- Scaldare il mix e il plasmide mettendo la miscela in un bagno d'acqua a 42 °C per 45 s e raffreddare immediatamente sul ghiaccio per 3 minuti.
- Aggiungere 500 μL di brodo Super Optimal con mezzo di repressione catabolita (SOC) e incubare per 1 h a 37 °C.
- Spin down a 7000 × g per 2 min, e rimuovere la maggior parte del supernatante. Resuspend e piastra su una piastra di agar Luria Broth (LB) con l'antibiotico di selezione appropriato.
NOTA: Carbenicillina è stata utilizzata in questo studio. - Incubare durante la notte a 37 °C. Isolare le colonie premendo leggermente una punta di pipetta su una delle colonie e posizionarla in 3 mL di mezzo LB con 100 μg/mL di carbenicillina. Incubare per 12-24 ore a 37 °C.
- Estrarre il DNA dei plasmidi utilizzando il kit di isolamento del DNA plasmide secondo le istruzioni del produttore e confermare le sequenze tramite sequenziamento del DNA.
- Per Ypet/3' UTR:
- Produrre un modello PCR lineare per la trascrizione in vitro. Utilizzare un primer in avanti a monte della sequenza Ypet e un primer inverso con 20 residui di timina aggiuntivi. Cfr. tabella 2 per la sequenza dell'UTR Ypet/IL-7 3' e le sequenze dei primer avanti e indietro.
NOTA: Questi residui aggiuntivi di timina aggiungeranno oligo(A) all'mRNA lineare dopo la trascrizione in vitro . - Trascrivere in vitro il prodotto PCR utilizzando un kit di trascrizione T7 secondo le istruzioni del produttore.
- Purificare l'RNA complementare risultante (cRNA) utilizzando un kit di pulizia della trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
- Elutare il cRNA purificato in acqua priva di RNAse, misurare la concentrazione e valutare l'integrità mediante elettroforesi di agarosio. Conservare a -80 °C.
- Produrre un modello PCR lineare per la trascrizione in vitro. Utilizzare un primer in avanti a monte della sequenza Ypet e un primer inverso con 20 residui di timina aggiuntivi. Cfr. tabella 2 per la sequenza dell'UTR Ypet/IL-7 3' e le sequenze dei primer avanti e indietro.
- Per mCherry:
- Produrre un modello PCR lineare per la trascrizione in vitro utilizzando un enzima di restrizione ad alta fedeltà; utilizzare l'enzima di restrizione mfEI-HF se si replica questo esempio. Digerire in un tampone di digestione durante la notte a 37 °C.
- Eseguire un gel per purificare il campione ed estrarre il DNA lineare utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
- Trascrivere in vitro il prodotto PCR utilizzando un kit di trascrizione T7 secondo le istruzioni del produttore.
- Poliadenilato il cRNA (150-200 nucleotidi) utilizzando un kit di pedinamento poli(A) secondo le istruzioni del produttore.
- Purificare il cRNA risultante utilizzando un kit di pulizia della trascrizione secondo le istruzioni del produttore.
- Elutare il cRNA purificato in acqua priva di RNA, misurare le concentrazioni di mRNA e valutare l'integrità del messaggio mediante elettroforesi del gel. Conservare a -80 °C.
3. Procedura sperimentale
NOTA: Nella figura 1è fornita una panoramica schematica della microiezione degli ovocici e della successiva microscopia time-lapse .
- Giorno 1
- Iniettare per via intraperitoneale topi di 21 giorni con 5 UI di gonadotropina siere della cavalla incinta per promuovere la crescita del follicolo allo stadioantrale 11.
- Giorno 3
- Collezione di ovocite
- Sacrifica i topi 44-48 ore dopo l'adescamento per raccogliere le ovaie e mettili in una piastra di Petri di plastica con mezzo di raccolta degli ovocite di base.
- Aprire con cura i follicoli astrali facendo un piccolo taglio nella parete del follicolo con un ago da 26 G. Isolare gli ovociti cumuli-chiusi intatti (COC) con diversi strati di cellule cumuliche utilizzando una pipetta di vetro azionata dalla bocca.
- Utilizzare una pipetta più piccola (leggermente più grande del diametro dell'ovocita) e denudare meccanicamente i COC mediante pipettazione ripetuta.
NOTA: In alternativa, eseguire la microiezione su COC intatti. - Utilizzando una pipetta più grande, aspirare gli ovociti denudati e metterli in una piastra di Petri con mezzo di maturazione integrato con 1 μM dell'inibitore della fosfodiesterasi, cilostamide, per evitare la ripresa della maturazione meiotica12. Mettere il piatto nell'incubatrice per 2 ore per lasciare che gli ovociti si riprendano dallo stress indotto dall'isolamento degli ovociti dai follicoli.
- Microintesi degli ovocite
- Preparare gli aghi di iniezione posizionando un tubo capillare in vetro borosilicato lungo 10 cm in un estrattore meccanico. Per un'iniezione ottimale, piegare la punta dell'ago con un angolo di 45° utilizzando un filamento riscaldato.
- Preparare piatti in polistirolo con goccioline da 20 μL di mezzo di raccolta di ovocite di base e coprire le goccioline con olio minerale leggero.
- Preparare una miscela di reporter aggiungendo 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR e 12,5 μg/μL mCherry. Preparare un volume maggiore e creare aliquote per esperimenti futuri per garantire concentrazioni simili di reporter. Conservare queste aliquote a -80 °C. Al momento dello scongelamento, centrifuga prima l'aliquota per 2 minuti a 20.000 x ge trasferisci in un nuovo tubo di microcentrifugo.
NOTA: Questa centrifugazione impedirà all'ago di iniezione di intasarsi da potenziali aggregati nel mix di reporter. - Caricare l'ago di iniezione per capillarità con circa 0,5 μL di miscela di reporter.
- Posizionare la pipetta di tenuta e l'ago di iniezione caricato nei supporti e posizionarsi nella goccia del mezzo di raccolta degli ovocite. Aspirare parte del mezzo nella pipetta di tenuta.
- Aprire l'ago di iniezione toccandolo delicatamente contro la pipetta di tenuta.
- Mettere gli ovociti in una goccia di mezzo di raccolta di base e iniettare 5-10 pL del mix di reporter.
- Incubare gli ovociti nel mezzo di maturazione con 1 μM cilostamide per 16 ore per consentire al segnale mCherry di stabilizzarsi.
- Preparare una piastra di Petri che verrà utilizzata per la microscopia time-lapse con almeno due goccioline da 20 μL di mezzo di maturazione per ogni reporter iniettato: una goccia con cilostamide da 1 μM per il controllo degli ovociti arrestati I e una goccia senza cilostamide per gli ovociti maturi. Coprire le goccioline con olio minerale leggero e posizionarlo nell'incubatrice.
- Microscopia time-lapse
- Dopo la pre-incubazione, rimuovere gli ovociti iniettati dall'incubatrice e lavarli quattro volte in mezzo di maturazione senza cilostamide. Mantenere alcuni ovociti in mezzo di maturazione con 1 μM cilostamide come gruppo di controllo degli ovociti arrestato da prophase I.
- Trasferire gli ovociti iniettati nelle rispettive goccioline sul piatto del microscopio time-lapse precedentemente preparato. Raggruppare gli ovociti utilizzando una pipetta di vetro chiusa (una pipetta chiusa può essere preparata tenendo la punta in fiamme per alcuni secondi).
NOTA: Il raggruppamento degli ovociti aiuta a prevenirne il movimento durante la registrazione. - Posizionare il piatto al microscopio dotato di un sistema di illuminazione a diodi emettitori di luce e di uno stadio motorizzato dotato di una camera ambientale mantenuta a 37 °C e al 5% di CO2. Per replicare questo studio, utilizzare i seguenti parametri: set di filtri: specchio dicroico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canale YFP (Eccitazione (Ex): S500/20 × 49057; Emissione (EM): D535/30 m 47281), canale mCherry (Es: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Immettere le impostazioni appropriate per l'esperimento time-lapse (vedere Table of Materials per il software utilizzato in questo studio): Fare clic su App | Acquisizione multidimensionale. Selezionare la prima scheda Main e selezionare timelapse, posizioni a più fasi elunghezze d'onda multiple.
- Selezionare la scheda Salvataggio per immettere la posizione in cui salvare l'esperimento.
- Selezionare la tabulazione Timelapse per immettere il numero di punti di tempo, la durata e l'intervallo di tempo.
NOTA: La durata dell'esperimento time-lapse dipende dalle specie animali studiate, poiché la tempistica della maturazione meiotica degli ovocite differisce da una specie all'altra. In questo esperimento con gli ovociti del topo, gli ovociti sono stati registrati ogni 15 minuti per 16 ore. - Selezionare la scheda Stage. Attivare brightfield e individuare la posizione degli ovociti aprendo una nuova finestra selezionando Acquisisci | Acquisire | Mostra in diretta. Una volta localizzati gli ovociti, tornare alla finestra Acquisizione multidimensionale e premere + per impostare la posizione degli ovociti.
- Selezionare le lunghezze d'ondadella scheda e impostare 3 diverse lunghezze d'onda per brightfield (esposizione 15 ms), YFP (esposizione 150 ms per Ypet/IL7 3' UTR) e mCherry (esposizione 75 ms per Ypet/IL7 3' UTR).
NOTA: Regolare l'esposizione per ogni reporter UTR Ypet/3' in base al livello di accumulo del reporter e al volume iniettato. Assicurarsi che il segnale YFP cada al centro della gamma di rilevamento all'inizio dell'esperimento per evitare sottovalutazioni o saturazioni in caso di attivazione della traduzione. Per mCherry, regolare l'esposizione per ogni lotto di mCherry in quanto il segnale dipende dal numero di nucleotidi di adenina aggiunti durante la procedura di poliadenilazione. A causa della variazione dell'efficienza della poliadenilazione, utilizzare lo stesso lotto di mCherry in diversi esperimenti per un migliore confronto tra esperimenti. - Avviare l'esperimento time lapse facendo clic su Acquire. Vedere la figura 2 e il file supplementare per un esempio di registrazione time-lapse in un singolo ovocita.
- Analisi della traduzione UTR Ypet-3'
- Per questa analisi (vedi Tabella dei materiali per il software utilizzato in questo studio), eseguire due misurazioni della regione per ogni ovocita: l'ovocita stessa-click sulla regione dell'ellisse e circondare l'ovocita-e una piccola regione vicino all'ovocita da utilizzare per la sottrazione di fondo-click sulla regione rettangolare.
NOTA: Assicurarsi che gli ovociti non si spostino fuori dalla regione selezionata durante la registrazione time-lapse. Prestare particolare attenzione al posizionamento della misurazione della regione intorno all'estrusione del corpo polare, in quanto ciò causa movimento nell'ovocita e può distorcere la registrazione. - Esportare i dati di misurazione dell'area in un foglio di calcolo facendo clic prima su Apri registro e quindi su Dati registro per esportare il software di analisi dei dati.
- Per ogni singolo ovocita e per tutti i punti di tempo misurati, sottrarre la misurazione della regione di sfondo dalla misurazione della regione degli ovocita. Eseguire questa operazioni per le lunghezze d'onda YFP e mCherry separatamente.
- Registrare la tempistica della rottura germinale della vescicola (GVBD) e dell'estrusione del corpo polare (PBE) per un riferimento successivo.
NOTA: Escludere gli ovociti del mouse in maturazione quando GVBD supera le 2 ore. - Tracciate l'espressione YFP e mCherry nel tempo per ogni ovocita da verificare per verificare la presenza di valori anomali.
NOTA: Questa dovrebbe essere una curva liscia, se non lo è questo può indicare che l'ovocita si è spostato durante la registrazione. - Per ogni singolo ovocita, calcolare l'espressione media mCherry per gli ultimi dieci punti di tempo della registrazione. Per ogni punto di tempo, dividere l'espressione YFP per l'espressione mCherry mediata per correggere il volume iniettato per ottenere un rapporto YFP/mCherry in ogni punto di tempo per ogni singolo ovocito.
- Calcolare i tassi di traslazione per un intervallo di tempo specifico adattando la pendenza della curva in base alla regressione lineare. Valutare le differenze nei tassi di traduzione utilizzando l'inferenza statistica.
- Per questa analisi (vedi Tabella dei materiali per il software utilizzato in questo studio), eseguire due misurazioni della regione per ogni ovocita: l'ovocita stessa-click sulla regione dell'ellisse e circondare l'ovocita-e una piccola regione vicino all'ovocita da utilizzare per la sottrazione di fondo-click sulla regione rettangolare.
- Collezione di ovocite
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Representative Results
Gli ovociti arrestati dai prophase I di topi C57/BL6 di 21 giorni sono stati iniettati con un mix di reporter contenente mRNA che codifica per il reporter Ypet fuso all'UTR 3' di IL-7 e mRNA che codifica per mCherry. L'espressione YFP e mCherry è stata registrata in 39 ovociti, di cui 30 maturi, e 9 sono stati arrestati in prophase I come controllo negativo. Tre ovociti in maturazione sono stati esclusi per l'analisi perché avevano un GVBD ritardato (N=2) o si sono spostati nella piastra durante la registrazione (N=1). La figura 3 mostra l'espressione di mCherry e YFP negli ovociti prophase I e in maturazione. La figura 4 mostra l'espressione YFP degli ovociti in maturazione corretti per l'espressione mCherry stabilizzata (espressione media mCherry negli ultimi 10 punti di tempo) da correggere per il volume iniettato. I tassi di traduzione del reporter sono stati misurati mediante raccordo a curva (regressione lineare) i valori YFP/mCherry in prophase I e negli ovociti in maturazione durante i primi 0-2 h o 8-10 h dopo il rilascio di cilostamide(figura 5A). L'accumulo del reporter non segue uno schema lineare, come indicato da una differenza significativa nei tassi di traduzione tra 0-2 h e 8-10 h dopo il rilascio di cilostamide (p<0.0001; Figura 5B). Pertanto, questi risultati indicano l'attivazione della traduzione IL-7 durante la maturazione meiotica degli ovocite.
Figura 1: Panoramica schematica della procedura sperimentale. L'UTR Ypet/3' oligoadenylato e la codifica in mCherry di mCherry poliadenylati vengono microiniettati in ovociti denudati di topi C57/BL6 di 21 giorni. Gli ovociti vengono pre-incubati per 16 ore in cilostamide contenente mezzo di maturazione per consentire al segnale mCherry di raggiungere un altopiano. Dopo la pre-incubazione, viene avviata una registrazione time-lapse in cui gli ovociti sono tenuti in mezzo con cilostamide per creare un gruppo di controllo prophase I-arrested o rilasciati in mezzo a maturo senza cilostamide. Abbreviazioni: UTR = regione non tradotta; YFP = proteina fluorescente gialla; fw primer = primer in avanti; primer rev = primer inverso; Ampr = resistenza all'ampicillina; polyA = poliadenile; oligoA = oligoadenile; GV = vescicola germinale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempio di registrazione time-lapse di un singolo ovocita. Registrazioni brightfield, YFP e mCherry di un singolo ovocita iniettate con mRNA che codificano Ypet/Interleukin-7 3' UTR e mCherry poliadenylato a prophase I, MI (6 ore dopo l'uscita della cilostamide) e MII (15 ore dopo l'uscita della cilostamide). Barra di scala = 25 μm. Abbreviazioni: YFP = proteina fluorescente gialla; GV = vescicola germinale; MI = metafase I; MII = metafase II. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Segnali YFP e mCherry registrati mediante microscopia time-lapse. Segnali YFP e mCherry di ovociti iniettati con UTR Ypet/IL7 3' oligoadenilato e codifica mCherry di mCherry. Gli ovociti erano tenuti in mezzo con cilostamide per generare un gruppo di controllo prophase I-arrested (N=9) o rilasciati in mezzo privo di cilostamide per consentire la maturazione (N=30). I dati sono misurazioni individuali degli ovocite. Abbreviazioni: IL-7 = interleuchina-7; YFP = proteina fluorescente gialla. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Segnale YFP corretto per il livello di mCherry co-iniettato. I segnali YFP degli ovociti prophase I arrestati e in maturazione sono stati corretti per il volume iniettato dividendo il segnale YFP per il segnale mCherry medio degli ultimi 10 punti di tempo. Rapporti individuali YFP/mCherry per gli ovociti(A)prophase I-arrested e (B) gli ovociti ± in maturazione e per l'errore standard dei rapporti YFP/mCherry medio di (C) prophase I-arrested e(D)ovociti maturanti. Abbreviazioni: YFP = proteina fluorescente gialla; GVBD = rottura germinale vescicolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Tassi di traduzione calcolati a 0-2 h e 8-10 h di maturazione. (A) Segnali di proteine fluorescenti gialle (YFP) di singoli ovociti corretti per mCherry (YFP/mCherry) a 0-2 h o 8-10 ore dopo il rilascio di cilostamide e (B) i tassi di traslazione (errore standard medio della media) calcolati mediante raccordo a curva (regressione lineare) i valori YFP/mCherry ± 0-2 h e 8-10 h dopo il rilascio di cilostamide. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t a due code non accoppiato. *p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esempio di repressione della traduzione: Oosp2. Dati ri-analizzati di un esperimento in cui gli ovociti sono stati iniettati con UTR Ypet-Oosp2 3′ e mCherry di codifica mCherry di mRNA poliadenylato. I segnali YFP di prophase I-arrested (N=63) e ovociti in maturazione (N=72) sono stati corretti per il volume iniettato dividendo il segnale YFP per il segnale mCherry medio degli ultimi 10 punti di tempo. I dati dell'espressione YFP e mCherry sono stati ottenuti utilizzando una lampada Xenon Arc, a differenza dell'esperimento IL-7 in cui è stata utilizzata una sorgente luminosa a LED. I dati rappresentano la ± errore standard della media delle singole misurazioni degli ovocite e sono stati precedentemente pubblicati in Luong et al. 5. Abbreviazioni: YFP = proteina fluorescente gialla; Oosp2 = proteina secreta degli ovocite 2; UTR = regione non tradotta; IL-7 = interleuchina-7; LED= diodo emettitore di luce; GVBD = rottura germinale vescicolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Effetto dell'esposizione alla microiniezione e alla fluorescenza sui tempi di GVBD e PBE. Temporizzazione del GVBD e del PBE degli ovociti che sono stati microiniettati ed esposti alla fluorescenza (iniettati), o non iniettati e non esposti a fluorescenza (non iniettati). I dati sono misurazioni individuali degli ovocite. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t a due code nonaccoppiato. *p<0,001. Abbreviazioni: GVBD = ripartizione germinale vescicolare; PBE= estrusione del corpo polare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Supporto di raccolta degli ovocite di base | ||
| componente | Per 500 mL | |
| HEPES modificato Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 g | |
| bicarbonato di sodio | 252 mg di | |
| Piruvato di sodio | 1,15 mL | |
| Penicillina/Streptomicina 100x | 5 mL | |
| Acqua distillata ultrapura (Invitrogen, 10977-015) | Fino a 500 mL | |
| Mezzo di maturazione | ||
| componente | Per 500 mL | |
| MEM alfa 1x | Fino a 500 mL | |
| Piruvato di sodio | 1,15 mL | |
| Penicillina/Streptomicina 100x | 5 mL | |
Tabella 1: Preparazione dei mezzi di comunicazione. Elenco di componenti che devono essere aggiunti per preparare il mezzo di raccolta degli ovocite di base e il mezzo di maturazione degli ovocitati.
| sequenza | |||||
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGACCCAAGCTG GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCGACCACATGAAGCACGACTTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGCTGGAGTCTGACCGCCGCC GGCATCACCGAGGGCATGAACGAGCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAA CCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGAC ATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTTCATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTAGTGAGGTATG AGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATACATATAAGATATATCAA CTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTC TAACACTACAAAGTCTACAAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTTCTTAGC AAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAG ACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGC AGCAGCAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACA CATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTAT TCCAAAGATACTGAACCTTAGTATTCAGTCGCTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATAACTGAA TTTTCAATTTGAAAGTATATTTATTTAAAGAATAATATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATGTTTAATTT TGGCATTCTGTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTATCTATCTATATATATATA ATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACAC TGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAGTGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACAC ATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAA AACACTAATTTCTTGTTTTATAGTAGGGTCTTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGC CAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTAT GTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTGTAAGGTCTGTCTGTCTTCTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTA TGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCTCTTTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCTGGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCAC ATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTTTCCCCCTATAATGCTACTCAGTGG TACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAGAACACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTT GCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGTGTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTA AGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTATACCTGCAAGGCTGTCTGGAT GGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTGATTTTGGCAAATAAAGGATAATATTTT |
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| Primer in avanti | GAGAACCCACTGCTTAC | ||||
| Primer inverso | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCCTTTATTTTG CCAAAATC |
||||
Tabella 2: Esempio di sequenze di reporter e primer Sequenza di YFP/IL7 3'UTR reporter e sequenze di primer avanti e indietro che sono stati utilizzati per produrre un modello PCR lineare per la trascrizione in vitro.
File supplementare: Proteina fluorescente gialla(YFP) e registrazione time-lapse mCherry. Registrazioni time-lapse YFP e mCherry di un singolo ovocita iniettato con mRNA che codificano Ypet/Interleukin-7 3' UTR e mCherry poliadenylato. Canale YFP (Es: S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), canale mCherry (Es: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m). Gli ovociti venivano registrati ogni 15 minuti per 16 ore (7 fotogrammi al secondo). Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il metodo presentato descrive una strategia per studiare l'attivazione e la repressione della traduzione dell'mRNA bersaglio in diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro. IL-7, una citochina rilasciata dall'ovocito che può essere coinvolta nella comunicazione cellulare ovocita-cumulo8,13, è stata scelta allo scopo di descrivere questo metodo. IL-7 è noto per essere sempre più tradotto durante la maturazione degli ovocite8 e consente una buona visualizzazione dell'attivazione traslizionale utilizzando questo metodo. Se, tuttavia, la traduzione avviene a un ritmo costante durante l'esperimento, l'accumulo di un reporter seguirà uno schema lineare e i tassi di traduzione all'inizio e alla fine dell'esperimento saranno simili. Questa conclusione può essere verificata dalla bontà di adattamento (R) di una regressione lineare attraverso l'intero intervallo di registrazione. Una repressione nella traduzione dei reporter si presenterà come l'altopiano del segnale YFP.
Un esempio di repressione della traduzione 3' UTR, può essere trovato nello studio di Luong et al. 5, dove gli autori riportano la repressione della proteina secreta degli ovocite 2 (Oosp2) durante la maturazione meiotica degli ovocite. Questi dati sono stati ri-analizzati e sono mostrati nella figura 6. Gli ovociti in maturazione mostrano un plateauing del segnale YFP, che indica la repressione della traduzione, mentre il gruppo di controllo prophase I-arrested segue un modello lineare di accumulo di reporter, che indica tassi di traduzione simili all'inizio e alla fine dell'esperimento. Quando si studia la repressione della traduzione, è particolarmente importante includere un gruppo di controllo prophase I-arrested per garantire che l'plateauing del segnale YPF non sia spiegato da una diminuzione della qualità degli ovociti a causa delle cattive condizioni culturali, confermando così la vitalità degli ovociti. L'accumulo del reporter può essere convalidato da PCR quantitativa a trascrizione inversa utilizzando primer per YFP o da gonfiore occidentale sfruttando il tag V5-epitopo incluso nel reporter in questo protocollo.
L'aumentare del segnale YFP potrebbe non essere dovuto solo alla repressione attivamente regolamentata della traduzione, ma può anche essere spiegato dal degrado del reporter durante la progressione meiotica degli ovocite. Ciò può rispecchiare la destabilizzazione dell'mRNA endogeno, che è essenziale per la transizione all'espressione del genoma embrionale14,15,16. Questa possibilità può essere verificata misurando i livelli di trascrizione genica bersaglio nello stadio prophase I rispetto alla fase metafase II per confermare la stabilità degli mRNA. Quando si prepara il cDNA degli ovocite, è preferibile utilizzare l'adescamento casuale dell'esamero sull'adescamento oligo-dT. Quest'ultimo metodo presenta apparenti differenze nei livelli di trascrizione genica che possono riflettere le differenze nella lunghezza poli(A) di queste trascrizioni piuttosto che le differenze effettive nei livelli di trascrizione7.
Esistono diversi metodi per studiare la traduzione di mRNA endogeno a livello genomico negli ovociti del topo. Questi metodi includono la profilatura polisome7,17,18 e RiboTag/RNA-Seq5,19,20. La profilazione ribosoma è un altro metodo per studiare la traduzione a livello genomico che è stata utilizzata nel lievito, che è un altro organismo modello che viene utilizzato per studiare la meiosi21,22. Tuttavia, queste analisi a livello genomico per studiare la traduzione dell'mRNA nel topo richiedono l'uso di 150-200 ovociti per campione, mentre il numero di ovociti disponibili per l'analisi è solitamente limitato. Il saggio monoocitare descritto nel presente documento per valutare la traduzione di 3' UTR di mRNA bersaglio integra analisi della traduzione a livello genomico, in quanto consente la caratterizzazione di elementi dell'UTR 3' che regolano il programma di traduzione durante la maturazione meiotica degli ovocite4,5,6. In passato, i saggi basati sulla luciferasi sono stati utilizzati per valutare la traduzione del 3' UTR degli mRNA bersaglio10,20,23 in quanto si tratta di un metodo molto sensibile che richiede solo pochi ovociti per campione; tuttavia, gli ovociti devono essere laliti per rilevare la quantità di luciferasi in un campione.
Altri hanno utilizzato un reporter 3' UTR/proteina fluorescente verde (GFP) per valutare l'accumulo di GFP negli ovociti del topovivi 4. Tuttavia, in questi esperimenti, sono stati utilizzati solo due punti di tempo: l'inizio dell'incubazione (prophase I) e la fine dell'incubazione (metafase II). Ciò riduce notevolmente la potenza delle misurazioni e aumenta la possibilità di errori. I dati cinetici forniscono misurazioni accurate in base alle velocità (più punti) e definiscono con precisione il momento in cui avviene l'attivazione traslazione o la repressione. Inoltre, la repressione della traduzione non può essere valutata in questi singoli punti di tempo, il che può portare a una conclusione imprecisa. Pertanto, questo metodo è stato regolato applicando la microscopia time-lapse per valutare l'accumulo di reporter UTR Ypet/3' durante la maturazione in vitro degli ovociti del topo 5,6,9. Utilizzando questa strategia, è possibile studiare la traduzione in diverse transizioni durante la maturazione degli ovocite.
Ci sono diversi aspetti importanti su questo metodo da considerare. In primo luogo, i giornalisti utilizzati includono una coda oligo(A) la cui omissione riduce notevolmente l'accumulo di reporter. Ciò può essere dovuto sia alla diminuzione della traduzione che alla destabilizzazione dell'mRNA del reporter24,25. Durante la pre-incubazione in prophase I, la traduzione di una sonda oligoadenylata si regola per riflettere il tasso di traslazione dell'mRNA endogeno5. In secondo luogo, è importante rendersi conto che un aumento del numero di registrazioni o della durata dell'esposizione alla fluorescenza può potenzialmente indurre fototossicità e quindi compromettere la qualità degli ovocici. Sebbene l'esperimento attuale ha adottato intervalli di 15 minuti, la frequenza di campionamento può essere ridotta quando si deve utilizzare un'esposizione ad alta fluorescenza in caso di bassa espressione del reporter.
Per limitare la quantità di fototossicità, è stata utilizzata una sorgente di luce a LED fredda, che richiede un'eccitazione piùbreve 26. Per valutare i potenziali effetti di fototossicità negli ovociti, la tempistica di GVBD e PBE è stata confrontata in ovociti microiniettati ed esposti alla fluorescenza o non iniettati e non esposti alla fluorescenza. La combinazione di microiniezione ed esposizione alla fluorescenza ha ritardato leggermente il GVBD (p<0,001), mentre la tempistica del PBE era simile(figura 7).
Questo metodo è stato utilizzato per studiare gli elementi regolatori trascizionali dell'UTR 3' durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro. Allo stesso modo, può anche essere utilizzato per studiare elementi UTR funzionali da 5' essenziali per la regolazione della traduzione o per studiare la traduzione durante la fecondazione in ovocita invitro. Sebbene questo metodo sia stato applicato agli ovociti umani e del topo, è applicabile anche ad altre specie animali. Poiché questo saggio del reporter viene eseguito in singoli ovociti, è particolarmente adatto per l'uso in specie mono-ovulatorie in cui il numero di ovociti disponibili per l'analisi è limitato. A differenza dell'uso di ovociti denudati, un'altra applicazione di questa tecnica è l'iniezione del reporter in ovociti cumuli-chiusi, poiché le cellule cumuli svolgono un ruolo importante nella regolazione del programma traslizionale8,10,27. Tuttavia, si dovrebbe tenere conto del fatto che gli ovociti racchiusi in cumulo hanno maggiori probabilità di allontanarsi dal piano di registrazione durante l'esperimento rispetto agli ovociti denudati a causa del movimento delle cellule cumuli durante l'espansione del COC. Ciò può comportare una percentuale maggiore di ovociti che devono essere esclusi dall'analisi. In futuro, può essere utilizzato un software di tracciamento cellulare in grado di tracciare le posizioni x, y e z degli ovociti nella goccia, che potrebbe risolvere questo problema.
In conclusione, il saggio descritto del singolo reporter ovocita rappresenta una strategia per indagare il programma trascizionale eseguito durante la transizione tra ovocite e zigote. Una maggiore conoscenza di questo programma trascizionale può fornire importanti indizi sulla regolazione molecolare della competenza allo sviluppo degli ovocite.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM097165, GM116926 ed Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 a Marco Conti. Enrico M. Daldello è stato sostenuto da una borsa di studio della Fondazione Lalor e Natasja G. J. Costermans è stata sostenuta da una borsa di studio Rubicon dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
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