Summary
Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.
Abstract
Oosit nükleer olgunlaşması ile ilgili olaylar iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, döllenmeye ve totipotency kazanımı için sitoplazmada gerçekleşen moleküler yollar ve süreçler hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşması sırasında, gen ifadesindeki değişiklikler transkripsiyon yerine sadece anne haberci RNA'ların (mRNA'lar) çevirisine ve bozulmasına bağlıdır. Bu nedenle, çeviri programının yürütülmesi, embriyo gelişimini sürdürmek için oosit gelişimsel yeterliliğinin oluşturulmasında kilit bir rol oynar. Bu makale, meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde gerçekleşen maternal mRNA çeviri programını tanımlamaya odaklanılmasının bir parçasıdır. Bu yöntem makalesinde, in vitro oosit olgunlaşması sırasında hedef mRNA'ların çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir strateji sunulmuştur. Burada, bir Ypet muhabiri, ilgi geninin 3' çevrilmemiş bölgesine (UTR) kaynaştırıldı ve daha sonra enjekte edilen hacmi kontrol etmek için mCherry için poliadenillenmiş mRNA kodlaması ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. Muhabir birikimini ölçmek için zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak, oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde çeviri oranları hesaplanır. Burada, Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR muhabiri örnek olarak kullanılarak, oosit izolasyonu ve enjeksiyonu, hızlandırılmış kayıt ve veri analizi protokolleri açıklanmıştır.
Introduction
Tamamen büyümüş bir memeli oosit, döllenmeye ve totipotency kazanımı için hazırlıkta hızlı değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler döllenme sonrası embriyonik gelişimi sürdürmek için gereklidir. Nükleer olgunlaşma ile ilişkili olaylar nispeten iyi tanımlanmış olsa da, oosit sitoplazmasındaki moleküler süreçler ve yollar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşmasının son aşamalarında, oositler transkripsiyonel olarak sessizdir ve gen ekspresyonu tamamen mRNA çevirisi ve bozulmasına bağlıdır1,2. Bu nedenle, gelişimsel yeterlilik için kritik proteinlerin sentezi, oosit büyümesi sırasında daha önce sentezlenen uzun ömürlü mRNA'ların zamanlanmış çevirisi programına dayanır1,3. Meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde yürütülen bu maternal mRNA çevirisi programını tanımlamaya odaklanan bu makale, in vitro meiotik olgunlaşma sırasında hedef maternal mRNA'ların tek oositlerde çevirisinin aktivasyonunu ve baskısını incelemek için bir strateji sunun bir parçası olarak sunulmaktadır.
Bu yöntemde, YPet açık okuma çerçevesi, ilgi dökümünün 3' UTR'sının yukarı akışında klonlanır. Daha sonra, bu muhabiri kodlayan mRNA'lar, enjekte edilen hacmi kontrol etmek için poliadenillenmiş mRNA'lar kodlama mCherry ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. İn vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak muhabir birikimi ölçülür. Sarı floresan protein (YFP) ve mCherry birikimi bireysel oositlerde kaydedilir ve YFP sinyalleri birlikte enjekte edilen mCherry'nin platolu seviyesi ile düzeltilir. Veri toplama işleminden sonra eğrinin montajla elde edilen eğrinin eğimi hesaplanarak in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı zaman aralıkları için çeviri oranları hesaplanır.
Bu yaklaşım, seçilen endojen mRNA'ların çevirislerindeki değişiklikleri deneysel olarak onaylamak için bir araç sağlar. Ek olarak, bu yöntem, hedef mRNAs4,5,6'nın3' UTR'sının cis düzenleyici unsurlarını manipüle ederek oosit meiotik olgunlaşma sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurların karakterizasyonunu kolaylaştırır. Poli(A) kuyruk uzunluğunun manipülasyonu ayrıca oositlerde adensilaz / deadenylaz aktivitesi hakkında fikir verir5. Cis etkili elementlerin mutajenisi veya RNA immün önksezisi, konyak RNA bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri incelemek için kullanılabilir6,7. Ek olarak, bu yöntem, azaltılmış oosit kalitesi 8,9,10ile ilişkili modellerde hedef 3' UTR çevirisini ölçerek oosit gelişimsel yeterliliği için kritik olan çeviri programının temel bileşenlerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem makalesi, 21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded oositlerinin IL-7'nin 3' UTR'sine kaynaşmış bir Ypet muhabiri ile mikro enjekte edildiği temsili bir deney sunun. Oosit enjeksiyonu, zaman atlamalı kayıt ve veri analizi için kurulum ve protokol açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren deneysel prosedürler, San Francisco'daki Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (an182026 protokolü) tarafından onaylandı.
1. Medyanın hazırlanması
- Temel oosit toplama ortamını ve oosit olgunlaşma ortamını yapmak için Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm bileşenleri ekleyin. Temel toplama ortamı için pH'ı 7,4 olarak ayarlayın. Hem toplama hem de olgunlaşma ortamı için, kullanım gününde 3 mg/mL sığır serum albümini (BSA) ve 1 μM cilostamid ekleyin.
2. Ypet-3' UTR ve mCherry için mRNA kodlamasının hazırlanması
- İlgi çekici mRNA'ların 3′ UTR dizilerini elde edin.
NOT: Bu çalışma için daha önce fare oosit cDNA'sından diziler elde edilmiştir. - Hedef 3' UTR'leri oosit cDNA'dan ve pcDNA 3.1 vektörün Ypet kodlama dizisi, V5-epitop etiketi ve T7 promotörü içeren bölümlerinden yükseltmek için astarlar tasarlayın.
- Yüksek kaliteli bir DNA polimeraz kiti kullanarak güçlendirin. Parçaların doğru boyuta sahip olup olmadığını kontrol etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünlerini bir jel üzerinde çalıştırın, bantları kesin ve üreticinin talimatlarına göre jel çıkarma kiti kullanarak jelden DNA'yı çıkarın.
- PCR klonlama kiti kullanarak PCR parçalarını bir vektörle bire bir edin.
NOT: PCR parçaları daha verimli bir rekombinasyon işlemini kolaylaştırmak için buz üzerinde 4 saat boyunca inkübe edildi. Bu, sadece 45 dakikalık bir kuluçka süresi öneren üreticinin talimatlarına aykırıdır. - PCR parçalarını yetkin 5-α Escherichia coli bakterisine dönüştür.
- Karışımı ekleyin ve bakterilere plazmid ekleyin ve 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatın.
- Karışımı 45 s için 42 °C'de bir su banyosuna yerleştirerek karışımı ve plazmid'i ısı şokuna uğratır ve hemen 3 dakika boyunca buz üzerinde soğutun.
- Katabolit baskı (SOC) ortamına sahip 500 μL Süper Optimal et suyu ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- 2 dakika boyunca 7000 × g'da aşağı dön ve süpernatantların çoğunu çıkarın. Uygun seçim antibiyotik ile luria suyu (LB) agar plakası üzerinde resuspend ve plaka.
NOT: Bu çalışmada karbenisilin kullanılmıştır. - 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın. Kolonilerden birine pipet ucuna hafifçe bastırarak ve 100 μg/ mL karbenisilin ile 3 mL LB ortamına yerleştirerek kolonileri izole edin. 37 °C'de 12-24 saat kuluçkaya yaslanın.
- Plazmid DNA izolasyon kitini kullanarak plazmidlerin DNA'sını üreticinin talimatlarına göre çıkarın ve DNA dizileme yoluyla dizileri onaylayın.
- Ypet/3' UTR için:
- In vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu üretin. Ypet dizisinin yukarı doğru bir ileri astarını ve 20 ek timin kalıntısına sahip bir ters astar kullanın. Ypet/IL-7 3' UTR dizisi ve ileri ve ters astar dizileri için Tablo 2'ye bakın.
NOT: Bu ek timin kalıntıları in vitro transkripsiyondan sonra lineer mRNA'ya oligo(A)ekler. - In vitro, ÜRETICInin talimatlarına göre bir T7 transkripsiyon kiti kullanarak PCR ürününü yazıya dökebilir.
- Elde edilen tamamlayıcı RNA'yı (cRNA) üreticinin talimatlarına göre bir transkripsiyon temizleme kiti kullanarak saflaştırın.
- RNA içermeyen suda arıtılmış cRNA'yı boşaltın, konsantrasyonu ölçün ve agarose elektroforezi ile bütünlüğü değerlendirin. −80 °C'de saklayın.
- In vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu üretin. Ypet dizisinin yukarı doğru bir ileri astarını ve 20 ek timin kalıntısına sahip bir ters astar kullanın. Ypet/IL-7 3' UTR dizisi ve ileri ve ters astar dizileri için Tablo 2'ye bakın.
- mCherry için:
- Yüksek doğrulukta bir kısıtlama enzimi kullanarak in vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu üretin; bu örneği çoğaltıyorsanız mfEI-HF kısıtlama enzimini kullanın. 37 °C'de bir gecede sindirim tamponunda sindirin.
- Numuneyi arındırmak için bir jel çalıştırın ve üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti kullanarak doğrusal DNA'yı çıkarın.
- In vitro, ÜRETICInin talimatlarına göre bir T7 transkripsiyon kiti kullanarak PCR ürününü yazıya dökebilir.
- Üreticinin talimatlarına göre bir poli(A) atık kiti kullanarak cRNA'yı (150-200 nükleotit) poliadenillatın.
- Elde edilen cRNA'yı, üreticinin talimatlarına göre bir transkripsiyon temizleme kiti kullanarak saflaştırın.
- Arıtılmış cRNA'yı RNA içermeyen suda boşaltın, mRNA konsantrasyonlarını ölçün ve jel elektroforezi ile mesaj bütünlüğünü değerlendirin. −80 °C'de saklayın.
3. Deneysel prosedür
NOT: Şekil 1'de oosit mikro enjeksiyonu ve sonraki zaman atlamalı mikroskopinin şematik bir özeti verilmiştir.
- 1. Gün
- İntraperitoneally 21 günlük fareler ile 5 IU hamile kısrak serum gonadotropin antral evre11folikül büyümesini teşvik etmek için enjekte.
- 3. Gün
- Oosit koleksiyonu
- Yumurtalıkları toplamak için astarlamadan sonra fareleri 44-48 saat kurban edin ve temel oosit toplama ortamına sahip plastik bir Petri kabına yerleştirin.
- Folikül duvarında 26 G'lık bir iğne ile küçük bir kesim yaparak antral folikülleri dikkatlice açın. Ağzıyla çalışan bir cam pipet kullanarak birkaç kat kümülüs hücresi ile bozulmamış kümülüs kapalı oositleri (COC' ler) izole edin.
- Daha küçük bir pipet kullanın (oosit çapından biraz daha büyük) ve tekrarlanan pipetleme ile COC'leri mekanik olarak devre dişine haline getirdiğinde.
NOT: Alternatif olarak, sağlam COC'lere mikro enjeksiyon gerçekleştirin. - Daha büyük bir pipet kullanarak, denuded oositleri aspire edin ve meiotik olgunlaşmanın yeniden başlamasını önlemek için fosfodideraz inhibitörü, cilostamid 1 μM ile desteklenmiş olgunlaşma ortamı ile bir Petri kabına yerleştirin12. Oositlerin foliküllerden izole edilmesinin neden olduğu stresten kurtulması için yemeği 2 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.
- Oosit mikro enjeksiyonu
- Mekanik bir çekme makinesine 10 cm uzunluğunda borosilikat cam kılcal boru yerleştirerek enjeksiyon iğnelerini hazırlayın. Optimum enjeksiyon için, iğne ucunu ısıtılmış bir filament kullanarak 45° açıyla bükün.
- Temel oosit toplama ortamının 20 μL damlacıkları ile polistiren yemekler hazırlayın ve damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün.
- 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR ve 12,5 μg/μL mCherry ekleyerek bir muhabir karışımı hazırlayın. Daha büyük bir hacim hazırlayın ve benzer muhabir konsantrasyonlarını sağlamak için gelecekteki deneyler için aliquots yapın. Bu aliquotları -80 °C'de saklayın. Çözdükten sonra, ilk önce aliquot'ı 20.000 x g'da2 dakika santrifüj edin ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Bu santrifüj, enjeksiyon iğnesinin muhabir karışımındaki potansiyel agregalar tarafından tıkanmasını önleyecektir. - Enjeksiyon iğnesini yaklaşık 0,5 μL muhabir karışımı ile kapillarite ile yükleyin.
- Tutma pipetini ve yüklü enjeksiyon iğnesini tutuculara yerleştirin ve oosit toplama ortamının damlacığı konumuna getirin. Ortamın bir kısmını tutma pipetine emiş.
- Enjeksiyon iğnesini tutma pipetine hafifçe dokunarak açın.
- Oositleri temel toplama ortamının bir damlasına yerleştirin ve muhabir karışımının 5-10 pL'lik kısmını enjekte edin.
- MCherry sinyalinin platoya girmesine izin vermek için olgunlaşma ortamındaki oositleri 16 saat boyunca 1 μM cilostamid ile kuluçkaya bırakın.
- Enjekte edilen her muhabir için en az iki adet 20 μL olgunlaşma ortamı damlacıklı zaman atlamalı mikroskopi için kullanılacak bir Petri kabı hazırlayın: profaz I-arrested oositleri kontrol etmek için 1 μM cilostamidli bir damlacık ve olgunlaşan oositler için cilostamid içermeyen bir damlacık. Damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün ve inkübatöre yerleştirin.
- Zaman atlamalı mikroskopi
- Ön inkübasyondan sonra, enjekte edilen oositleri inkübatörden çıkarın ve cilostamid olmadan olgunlaşma ortamında dört kez yıkayın. Profaz I-arrested oosit kontrol grubu olarak 1 μM cilostamid ile olgunlaşma ortamında bazı oositleri saklayın.
- Enjekte edilen oositleri daha önce hazırlanmış zaman atlamalı mikroskop kabındaki ilgili damlacıklarına aktarın. Kapalı bir cam pipet kullanarak oositleri kümele (ucu birkaç saniye alevde tutarak kapalı bir pipet hazırlanabilir).
NOT: Oositlerin kümelenmesi, kayıt sırasında hareketlerini önlemeye yardımcı olur. - Çanağı ışık yayan diyot aydınlatma sistemi ve 37 °C ve% 5 CO2'detutulan bir çevre odası ile donatılmış motorlu bir sahne ile donatılmış mikroskop altına yerleştirin. Bu çalışmayı çoğaltmak için aşağıdaki parametreleri kullanın: filtre kümesi: dikroik ayna YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP kanalı (Excitation (Örn. ): S500/20 × 49057; Emisyon (EM): D535/30 m 47281), mCherry kanalı (Örn: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Zaman atlamalı deneme için uygun ayarları girin (bkz. Bu çalışmada kullanılan yazılım için Malzeme Tablosu): Uygulamalar | Çok Boyutlu Edinme. İlk sekmeyi seçin Main ve zaman dilimini, birden çok sahne konumunuve birden çok dalga boyunuseçin.
- Denemenin kaydedileceği konumu girmek için Kaydetme sekmesini seçin.
- Zaman noktası, süre ve zaman aralığı sayısını girmek için Zaman Çakışması sekmesini seçin.
NOT: Oosit meiotik olgunlaşmanın zamanlaması türler arasında farklılık göstererek, zaman atlamalı deneyin süresi çalışılan hayvan türlerine bağlıdır. Fare oositleri ile yapılan bu deneyde, oositler 16 saat boyunca her 15 dakikada bir kaydedildi. - Aşamasekmesini seçin. Brightfield'ı açın ve Edin | seçerek yeni bir pencere açarak oositlerin konumunu bulun | edin Canlı Göster. Oositler bulunduktan sonra, Çok Boyutlu Alım penceresine geri dönün ve oositlerin konumunu ayarlamak için + tuşuna basın.
- Dalga Boylarısekmesini seçin ve brightfield (pozlama 15 ms), YFP (pozlama 150 ms Ypet/IL7 3' UTR için pozlama) ve mCherry (Ypet/IL7 3' UTR için pozlama 75 ms) için 3 farklı dalga boyu ayarlayın.
NOT: Her Ypet/3' UTR muhabiri için pozlamayı muhabir birikimi seviyesine ve enjekte edilen hacme göre ayarlayın. Çevirinin etkinleştirilmesi durumunda hafife almayı veya doygunluğu önlemek için YFP sinyalinin denemenin başlangıcında algılama aralığının merkezine düştüğünden emin olun. mCherry için, sinyal poliadenilasyon prosedürü sırasında eklenen adenin nükleotitlerinin sayısına bağlı olduğu için her bir mCherry grubu için pozlamayı ayarlayın. Poliadenilasyon verimliliğindeki değişim nedeniyle, deneyler arasında daha iyi bir karşılaştırma için farklı deneylerde aynı mCherry grubunu kullanın. - Edin 'e tıklayarak zaman atlamalı denemeyi başlatın. Tek bir oositte zaman atlamalı kayıt örneği için Şekil 2 ve Ek Dosya'ya bakın.
- Ypet-3' UTR çevirisinin analizi
- Bu analiz için (bkz. Bu çalışmada kullanılan yazılım için Malzeme Tablosu), her oosit için iki bölge ölçümü yapın: oosit kendisi elips bölgesini tıklatın ve oosit'i ve arka plan çıkarma için kullanılacak oosit'e yakın küçük bir bölgeyi çevrele-dikdörtgen bölgeyetıklayın.
NOT: Zaman atlamalı kayıt sırasında oositlerin seçili bölgenin dışına çıkmamasını sağlayın. Bölge ölçümünün kutup gövdesi ekstrüzyonu etrafına yerleştirilmesine özellikle dikkat edin, çünkü bu durum oositte harekete neden olur ve kaydı bozabilir. - Veri çözümleme yazılımını vermek için önce Açık Günlük'ü ve ardından Günlük Verileri'ni tıklatarak bölge ölçüm verilerini bir elektronik tabloya verin.
- Her bir oosit ve ölçülen tüm zaman noktaları için arka plan bölgesi ölçümünü oosit bölgesi ölçümünden çıkarın. Bunu YFP ve mCherry dalga boyları için ayrı ayrı yapın.
- Daha sonra başvurmak için germinal vezikül arızası (GVBD) ve polar gövde ekstrüzyonunun (PBE) zamanlamasını kaydedin.
NOT: GVBD 2 saati aştığında olgunlaşan fare oositlerini hariç tutun. - Aykırılıkları denetlemek için her oosit için zaman içinde YFP ve mCherry ifadesini çizin.
NOT: Bu pürüzsüz bir eğri olmalıdır, eğer değilse, bu kayıt sırasında oosit hareket ettiğini gösterebilir. - Her bir oosit için, kaydın son on zaman noktası için ortalama mCherry ifadesini hesaplayın. Her zaman noktası için, her bir oosit için her zaman noktasında bir YFP/mCherry oranı elde etmek üzere eklenen birimi düzeltmek için YFP ifadesini ortalama mCherry ifadesine bölün.
- Eğrinin eğimini doğrusal regresyona göre sığdırarak belirli bir zaman aralığı için çeviri oranlarını hesaplayın. İstatistiksel çıkarım kullanarak çeviri oranlarındaki farklılıkları değerlendirin.
- Bu analiz için (bkz. Bu çalışmada kullanılan yazılım için Malzeme Tablosu), her oosit için iki bölge ölçümü yapın: oosit kendisi elips bölgesini tıklatın ve oosit'i ve arka plan çıkarma için kullanılacak oosit'e yakın küçük bir bölgeyi çevrele-dikdörtgen bölgeyetıklayın.
- Oosit koleksiyonu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded prophase I-arrested oositlerine, IL-7'nin 3' UTR'sine kaynaşmış Ypet muhabirini kodlayan mRNA ve mRNA kodlama mCherry içeren bir muhabir karışımı enjekte edildi. YFP ve mCherry ifadesi 39 oositte kaydedildi, bunlardan 30'u olgunlaştı ve 9'u prophase I'de negatif kontrol olarak tutuklandı. Üç olgunlaşan oosit, gecikmiş bir GVBD'ye (N=2) sahip oldukları veya kayıt sırasında çanağa taşındıkları için analiz için hariç tutuldu (N=1). Şekil 3'te profaz I ve olgunlaşan oositlerde mCherry ve YFP ifadesi göstermektedir. Şekil 4, eklenen birimi düzeltmek için platolu mCherry ifadesi (son 10 zaman noktasında ortalama mCherry ifadesi) için düzeltilen olgunlaşan oositlerin YFP ifadesini gösterir. Muhabirin çeviri oranları, profaz I'deki YFP/mCherry değerleri ve cilostamid salınımı sonrası ilk 0-2 saat veya 8-10 saat boyunca olgunlaşan oositlerde eğri uydurma (doğrusal regresyon) ile ölçüldü (Şekil 5A). Muhabirin birikimi, cilostamid salınımı sonrası 0-2 saat ile 8-10 saat arasındaki çeviri oranlarında önemli bir farkla belirtildiği gibi doğrusal bir desen izlemez (s<0.0001; Şekil 5B). Bu nedenle, bu sonuçlar oosit meiotik olgunlaşma sırasında IL-7 çevirisinin aktivasyonunu göstermektedir.
Şekil 1: Deneysel prosedürün şematik özeti. Oligoadenillenmiş Ypet/3' UTR ve poliadenillenmiş mRNA kodlama mCherry, 21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded oositlerine mikro enjekte edilir. Oositler, mCherry sinyalinin bir platoya ulaşmasını sağlamak için olgunlaşma ortamı içeren cilostamid'de 16 saat boyunca ön kuluçkaya yatırılır. Ön inkübasyondan sonra, oositlerin profaz I-arrested kontrol grubu oluşturmak için cilostamid ile orta alanda tutulduğu veya olgunlaşması için cilostamid içermeyen ortamda serbest bırakıldığı bir zaman atlamalı kayıt başlatılır. Kısaltmalar: UTR = çevrilmemiş bölge; YFP = sarı floresan protein; fw astar = ileri astar; devir astarı = ters astar; Ampr = ampisilin direnci; polyA = poliadenil; oligoA = oligoadenil; GV = germinal vezikül. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tek bir oosit zaman atlamalı kayıt örneği. Brightfield, YFP ve mCherry kayıtları, Ypet/Interleukin-7 3' UTR kodlu mRNA'lar ve profaz I, MI (cilostamid salınımı sonrası 6 saat) ve MII (cilostamid salınımı sonrası 15 saat) kodlayan mRNA'lar ile enjekte edilmiştir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Kısaltmalar: YFP = sarı floresan protein; GV = germinal vezikül; MI = metafaz I; MII = metafaz II. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Zaman atlamalı mikroskopi ile kaydedilen YFP ve mCherry sinyalleri. Oligoadenillenmiş Ypet/IL7 3' UTR ve poliadenillenmiş mRNA kodlama mCherry ile enjekte edilen oositlerin YFP ve mCherry sinyalleri. Oositler ya profaz I-arrested kontrol grubu (N=9) oluşturmak için cilostamid ile orta derecede tutuldu ya da olgunlaşmaya izin vermek için cilostamid içermeyen ortamda serbest bırakıldı (N=30). Veriler bireysel oosit ölçümleridir. Kısaltmalar: IL-7 = interleukin-7; YFP = sarı floresan protein. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: YFP sinyali birlikte enjekte edilen mCherry seviyesi için düzeltildi. Profaz I-arrested ve olgunlaşan oositlerin YFP sinyalleri, YFP sinyalinin son 10 zaman noktasının ortalama mCherry sinyaline bölünmesiyle enjekte edilen hacim için düzeltildi. (A)profaz I-arrested oositler ve (B) olgunlaşan oositler için bireysel YFP/mCherry oranları ve (C) profaz I-arrested ve(D) olgunlaşma oositlerinin ortalama YFP/ mCherry oranlarının ortalama ± standart hatası anlamına gelir. Kısaltmalar: YFP = sarı floresan protein; GVBD = germinal vezikül bozulması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 0-2 saat ve 8-10 saat olgunlaşmada hesaplanan çeviri oranları. (A) mCherry (YFP/mCherry) için 0-2 saat veya 8'de düzeltilen tek oositlerin sarı floresan protein (YFP) sinyalleri -10 h sonra cilostamide serbest bırakma ve (B) çeviri oranları (ortalamanın ortalama ± standart hatası) eğri uydurma (doğrusal regresyon) ile hesaplanan YFP/mCherry değerleri 0-2 h ve 8-10 h cilostamide serbest bırakıldıktan sonra. Veriler, eşleşmeyen iki kuyruklu t testi kullanılarak analiz edildi. *s < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Çeviri baskısı örneği: Oosp2. Oositlerin Ypet-Oosp2 3′ UTR ve poliadenillenmiş mRNA kodlama mCherry ile enjekte edildiği bir deneyin verileri yeniden analiz edildi. Profaz I-arrested (N=63) ve olgunlaşan oositlerin (N=72) YFP sinyalleri, YFP sinyalinin son 10 zaman noktasının ortalama mCherry sinyaline bölünmesiyle enjekte edilen hacim için düzeltildi. YFP ve mCherry ifade verileri, bir LED ışık kaynağının kullanıldığı IL-7 deneyinin aksine, bir Xenon Arc lamba kullanılarak elde edildi. Veriler, bireysel oosit ölçümlerinin ortalama ± standart hatasını temsil eder ve daha önce Luong veark. 5. Kısaltmalar: YFP = sarı floresan protein; Oosp2 = oosit salgılanan protein 2; UTR = çevrilmemiş bölge; IL-7 = interleukin-7; LED= ışık yayan diyot; GVBD = germinal vezikül bozulması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Mikro enjeksiyon ve floresan maruziyetinin GVBD ve PBE zamanlaması üzerindeki etkisi. Mikro enjekte edilen ve floresanlara maruz kalan (enjekte edilen) veya enjekte edilmeden ve floresansa maruz olmayan (enjekte edilmeden) oositlerin GVBD ve PBE zamanlaması. Veriler bireysel oosit ölçümleridir. Veriler eşleşmeyen iki kuyruklu t-testikullanılarak analiz edildi. *s<0.001. Kısaltmalar: GVBD = germinal vezikül bozulması; PBE= kutup gövdesi ekstrüzyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Temel oosit toplama ortamı | ||
| parça | 500 mL için | |
| HEPES modifiye Minimum Esansiyel Orta Kartal | 7,1 g | |
| Sodyum bikarbonat | 252 mg | |
| Sodyum piruvat | 1,15 mL | |
| Penisilin/Streptomisin 100x | 5 mL | |
| Ultra saf damıtılmış su (Invitrogen, 10977-015) | 500 mL'ye kadar | |
| Olgunlaşma ortamı | ||
| parça | 500 mL için | |
| MEM alfa 1x | 500 mL'ye kadar | |
| Sodyum piruvat | 1,15 mL | |
| Penisilin/Streptomisin 100x | 5 mL | |
Tablo 1: Medyanın hazırlanması. Temel oosit toplama ortamı ve oosit olgunlaşma ortamı hazırlamak için eklenmesi gereken bileşenlerin listesi.
| sıra | |||||
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGACCCAAGCTG GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGCGCGGCGAGGGCGAGGGGGGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCCCTGGTGACCACCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGTACAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGACGGCCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCC GGCATCACCGAGGGCATGAACGAGCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAA CCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGAC ATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTTCATATACTTGGGGTTGAAACCCTTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATG AGATGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATACATATAAAGATATATCAA CTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAACCGTTCCAAATGTTTC TAACACTACAAAGTCTACAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTCTTAGC AAAATGATGGGGTGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGGGTGGAACTGTTTTAG ACTGGAGATACTGGGGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGC AGCAGCAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATGAATGTAACA KATARAKTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTAT TCCAAAGATACTGAACCTTAGTATTCAGTCCTTTTGACACTTTGGTAATAAAGCTTATAACTGAA TTTTCAATTTGAAAAGTATTTTTAAAAGAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATTTTTAATTT TGGCATTCTGTCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCTCTATCTATCTATATATATATA ATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTAACAC TGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAGTGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACAC ATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAA AACACTAATTTTTGTTTTATAGTAGGGTCTTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGC CAATGCTTAATTAGAAACATTCTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATCCTAT GTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTTGTAAGGTCTGCTTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTA TGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCTCCTTGCTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCTGGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCAC ATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTTGCTTCTCCTTTTCCCCAACCCCCATAATGCTACTCAGTGG TACAGATAGCTGGGATTATCAATTGAGAGAACACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTT GCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTGTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGTGTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTA AGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTATACCTGGGGCTGTCTGGAT GGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATTTTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT |
||||
| İleri astar | GAGAACCCACTGCTTAC | ||||
| Ters astar | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCCTTTATTTTG CCAAAATC |
||||
Tablo 2: Muhabir ve astar dizileri Örneği YFP/IL7 3'UTR muhabiri dizisi ve in vitro transkripsiyon için doğrusal bir PCR şablonu üretmek için kullanılan ileri ve ters astar dizileri.
Ek Dosya: Sarı floresan protein(YFP) ve mCherry zaman atlamalı kayıt. Ypet/Interleukin-7 3' UTR ve poliadenillenmiş mCherry kodlayan mRNA'larla enjekte edilen tek bir oositin YFP ve mCherry zaman atlamalı kayıtları. YFP kanalı (Örn: S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), mCherry kanalı (Örn: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m). Oositler her 15 dakikada bir 16 saat (7 kare/saniye) kaydedildi. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan yöntem, in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde hedef mRNA'nın aktivasyonunu ve çevirisinin baskısını incelemek için bir stratejiyi açıklar. Oosit-kümülüs hücre iletişimi8,13,bu yöntemi tanımlamak amacıyla oosit tarafından salınan bir sitokin olan IL-7 seçildi. IL-7'nin oosit olgunlaşması8 sırasında giderek daha fazla çevrildiğini ve bu yöntemi kullanarak çevirisel aktivasyonun iyi görselleştirilmesini sağladığı bilinmektedir. Bununla birlikte, çeviri deney boyunca sabit bir oranda gerçekleşirse, bir muhabirin birikimi doğrusal bir deseni takip eder ve deneyin başındaki ve sonundaki çeviri oranları benzer olacaktır. Bu sonuç, tüm kayıt aralığı boyunca doğrusal bir regresyonun fit (R) iyiliği ile doğrulanabilir. Muhabir çevirisinde bir baskı, kendisini YFP sinyalinin platolanması olarak gösterecektir.
3' UTR çevirisinin baskılanmasına bir örnek, Luong veark. 5, yazarların oosit meiotik olgunlaşma sırasında Oosit Salgılanan Protein 2'nin (Oosp2) baskısını bildirdiği yer. Bu veriler yeniden analiz edilmiştir ve Şekil 6'da gösterilmiştir. Olgunlaşan oositler, çevirinin baskılanmasına işaret eden YFP sinyalinin platolaşmasını gösterirken, profaz I-arrested kontrol grubu, deneyin başında ve sonunda benzer çeviri oranlarını gösteren doğrusal bir muhabir birikimi deseni izler. Çevirinin baskısını incelerken, YPF sinyalinin platolaştırılmasının kötü kültür koşulları nedeniyle oosit kalitesinde bir azalma ile açıklanmaması ve böylece oositlerin yaşayabilirliğinin doğrulanması için bir profaz I-arrested kontrol grubunun dahil edilmesi özellikle önemlidir. Muhabirin birikimi, YFP için primerler kullanılarak nicel ters transkripsiyon PCR ile veya bu protokolde muhabirde yer alan V5-epitop etiketinden yararlanarak batı şişkinliği ile doğrulanabilir.
YFP sinyalinin platolaşması sadece çevirinin aktif olarak düzenlenmiş baskısından kaynaklanmayabilir, ancak oosit meiotik ilerleme sırasında muhabirin bozulmasıyla da açıklanabilir. Bu, embriyonik genom ekspresyonuna geçiş için gerekli olan endojen mRNA'nın dengesinin bozulmasını yansıtabilir14,15,16. Bu olasılık, mRNA'ların stabilitesini doğrulamak için profaz I aşamasındaki hedef gen transkript düzeyleri ile metafaz II evresi ölçülerek doğrulanabilir. Oosit cDNA'yı hazırlarken, oligo-dT astarlama üzerinde rastgele onaltılık astar kullanımı tercih edilir. İkinci yöntem, transkript seviyelerindeki gerçek farklılıklar yerine bu transkriptlerin poli(A) uzunluğundaki farklılıkları yansıtabilecek gen transkript seviyelerinde belirgin farklılıklar sunar7.
Fare oositlerinde genom çapında endojen mRNA çevirisini incelemek için çeşitli yöntemler vardır. Bu yöntemler arasında polisome profilleme7,17,18 ve RiboTag/RNA-Seq5,19,20 bulunur. Ribozom profilleme, mayada kullanılan genom çapında çeviriyi incelemek için başka bir yöntemdir, bu da mayozu incelemek için kullanılan başka bir model organizmadır21,22. Bununla birlikte, faredeki mRNA çevirisini incelemek için genom çapındaki bu analizler, numune başına 150-200 oosit kullanılmasını gerektirirken, analiz için mevcut oosit sayısı genellikle sınırlıdır. Burada açıklanan tek oosit tahlili, 3' UTR hedef mRNA'ların çevirisini değerlendirmek için, 3' UTR'nin oosit meiotik olgunlaşma4,5,6sırasında çeviri programını düzenleyen öğelerinin karakterizasyonuna izin verdiği için genom çapındaki çeviri analizlerini tamamlar. Geçmişte, luciferaz bazlı tahliller, örnek başına sadece birkaç oosit gerektiren çok hassas bir yöntem olduğu için 3' UTR hedef mRNA'lar10,20,23'ün çevirisini değerlendirmek için kullanılırdı; bununla birlikte, bir numunedeki luciferaz miktarını tespit etmek için oositlerin lysed edilmesi gerekir.
Diğerleri canlı fare oositlerinde GFP birikimini değerlendirmek için 3' UTR / yeşil floresan protein (GFP) muhabiri kullanmıştır4. Bununla birlikte, bu deneylerde sadece iki zaman noktası kullanılmıştır: inkübasyonun başlangıcı (profaz I) ve inkübasyonun sonu (metafaz II). Bu, ölçümlerin gücünü büyük ölçüde azaltır ve hata olasılığını arttırır. Kinetik veriler, oranlara (birden fazla nokta) göre doğru ölçümler sağlar ve çevirisel aktivasyonun veya baskının gerçekleştiği zamanı doğru bir şekilde tanımlar. Buna ek olarak, çevirinin baskısı bu tek zaman noktalarında değerlendirilemez ve bu da yanlış bir sonuca yol açabilir. Bu nedenle, bu yöntem, fare oositlerinin5,6,9'un in vitro olgunlaşması boyunca Ypet/3' UTR muhabir birikimini değerlendirmek için zaman atlamalı mikroskopi uygulanarak ayarlandı. Bu stratejiyi kullanarak, oosit olgunlaşması sırasında farklı geçişlerde çeviriyi incelemek mümkündür.
Bu yöntemle ilgili dikkate alınması gereken birkaç önemli husus vardır. İlk olarak, kullanılan muhabirler arasında, ihmali muhabir birikimini önemli ölçüde azaltan bir oligo(A) kuyruğu bulunur. Bunun nedeni hem çevirinin azalması hem de muhabir mRNAistikrarsızlaştırması 24,25. Profaz I'deki ön kuluçka sırasında, oligoadensilat probun çevirisi endojen mRNA5'inçeviri oranını yansıtacak şekilde ayarlanır. İkincisi, kayıt sayısındaki veya floresan maruz kalma süresindeki bir artışın fototoksiteye neden olabileceğini ve böylece oosit kalitesini bozabileceğini fark etmek önemlidir. Mevcut deney 15 dakikalık aralıklarla benimsenmesine rağmen, düşük muhabir ifadesi durumunda yüksek floresan maruziyeti kullanılması gerektiğinde örnekleme oranı azaltılabilir.
Fototoksibilite miktarını sınırlamak için, daha kısa bir heyecan gerektiren soğuk bir LED ışık kaynağı kullanıldı26. Oositlerdeki potansiyel fototoksiklik etkilerini değerlendirmek için, GVBD ve PBE'nin zamanlaması, mikro enjekte edilen ve floresanlara maruz kalan veya enjekte edilmeden ve floresanlara maruz olmayan oositlerde karşılaştırıldı. Mikro enjeksiyon ve floresan maruziyetinin kombinasyonunun GVBD'yi (p<0.001) hafifçe geciktirdği, PBE'nin zamanlaması ise benzer olduğu bulunmuştur (Şekil 7).
Bu yöntem, in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında 3' UTR'nin çevirisel düzenleyici unsurlarını incelemek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, çevirinin düzenlenmesi için gerekli fonksiyonel 5' UTR elemanlarını incelemek veya in vitro oosit döllenme sırasında çeviriyi incelemek için dekullanılabilir. Bu yöntem insan ve fare oositlerine uygulanmış olsa da, diğer hayvan türleri için de geçerlidir. Bu muhabir tahlili tek oositlerde yapıldığı için, özellikle analiz için mevcut oosit sayısının sınırlı olduğu mono-yumurtlama türlerinde kullanım için uygundur. Denuded oositlerin kullanılmasının aksine, bu tekniğin bir başka uygulaması, kümülüs hücrelerinin çeviri programı8,10,27'nindüzenlenmesinde önemli bir rol oynadığından, muhabirin kümülüs kapalı oositlere enjeksiyonudur. Bununla birlikte, kümülüs kapalı oositlerin, COC genişlemesi sırasında kümülüs hücrelerinin hareketi nedeniyle denuded oositlere kıyasla deney sırasında kayıt düzleminden uzaklaşma olasılığının daha yüksek olduğu dikkate alınmalıdır. Bu, analizden dışlanmaları gereken daha büyük bir oosit oranına neden olabilir. Gelecekte, damlacıktaki oositlerin x, y ve z konumlarını izleyebilen ve bu sorunu çözebilecek hücre izleme yazılımı kullanılabilir.
Sonuç olarak, açıklanan tek oosit muhabir tahlili, oosit-zigot geçişinde yürütülen çeviri programını araştırmak için bir stratejiyi temsil eder. Bu çeviri programının daha fazla bilgi birikimi, oosit gelişimsel yeterliliğinin moleküler regülasyonu hakkında önemli ipuçları sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH R01 GM097165, GM116926 ve Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 tarafından Marco Conti'ye desteklenmiştir. Enrico M. Daldello, Lalor Vakfı'ndan bir burs, Natasja G. J. Costermans ise Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (NWO) rubicon bursu ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
