Her presenterer vi en modifisert TGA-metode for estimering av lignininnhold i urteaktig plantebiomasse. Denne metoden estimerer lignininnholdet ved å danne spesifikke thioetherbindinger med lignin og gir en fordel i forhold til Klason-metoden, da det krever et relativt lite utvalg for lignininnholdsestimering.
Lignin er en naturlig polymer som er den nest mest tallrike polymeren på jorden etter cellulose. Lignin er hovedsakelig avsatt i plantens sekundære cellevegger og er en aromatisk heteropolymer som hovedsakelig består av tre monolignoler med betydelig industriell betydning. Lignin spiller en viktig rolle i plantevekst og utvikling, beskytter mot biotiske og abiotiske påkjenninger, og i kvaliteten på dyrefôr, tre og industrielle ligninprodukter. Nøyaktig estimering av lignininnhold er avgjørende for både grunnleggende forståelse av ligninbiosyntese og industrielle anvendelser av biomasse. Thioglykolsyremetoden (TGA) er en svært pålitelig metode for å estimere det totale lignininnholdet i plantebiomassen. Denne metoden estimerer lignininnholdet ved å danne tioethers med benzylalkoholgruppene av lignin, som er oppløselige i alkaliske forhold og uoppløselige i sure forhold. Det totale lignininnholdet er estimert ved hjelp av en standardkurve generert fra kommersiell bambus lignin.
Lignin er en av de vitale bærende komponentene i plantecellevegger og den nest mest tallrike polymeren på jorden1. Kjemisk er lignin en krysskoblet heteropolymer som består av komplekse fenolforbindelser med høy molekylvekt som danner en naturlig fornybar kilde til aromatiske polymerer og syntese av biomaterialer2,3. Denne naturlige polymeren spiller betydelige roller i plantevekst, utvikling, overlevelse, mekanisk støtte, celleveggstivhet, vanntransport, mineraltransport, losjimotstand, vevs- og organutvikling, avsetning av energi og beskyttelse mot biotiske og abiotiske påkjenninger4,5,6,7. Lignin består hovedsakelig av tre forskjellige monolignoler: nåletyl, sinapyl og p-coumarylalkoholer som er avledet fra fenylpropanoidveien8,9. Mengden lignin og sammensetningen av monomerer varierer basert på plantearter, vev / organtype og forskjellige stadier av planteutvikling10. Lignin er bredt klassifisert i mykt tre, hardved og gress lignin basert på kilden og monolignolsammensetningen. Mykved består hovedsakelig av 95% nåletylalkohol med 4% p-coumaryl og 1% sinapylalkoholer. Hardved har nåletyl- og sinapylalkoholer i like store mengder, mens gress lignin består av ulike proporsjoner av nåletyl, sinapyl og p-coumarylalkoholer11,12. Sammensetningen av monomerer er kritisk da den bestemmer ligninstyrken, nedbrytningen og nedbrytningen av celleveggen, samt bestemmer molekylær struktur, forgrening og krysskobling med andre polysakkarider13,14.
Lignin forskning får betydning i foraging, tekstilindustrien, papirindustrien, og for bioetanol, biodrivstoff og bio-produkter på grunn av sin lave pris og høye overflod15,16. Ulike kjemiske metoder (f.eks. acetylkymid, syrevaskemidler, Klason og permanganatoksidasjon) sammen med instrumentelle metoder (f.eks. nær infrarød (NIR) spektroskopi, kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og ultrafiolett (UV) spektrofotometri) ble brukt til lignin kvantifisering9,17. Analysemetodene for lignin er generelt klassifisert basert på elektromagnetisk stråling, gravimetri og løselighet. Prinsippet bak ligninestimering ved elektromagnetisk stråling var basert på lignins kjemiske egenskap der den absorberer lys ved spesifikke bølgelengder. Disse resultatene ble estimert basert på prinsippet om at lignin har en sterkere UV-absorbans enn karbohydrater. I 1962 brukte Bolker og Somerville kaliumkloridpellets for å estimere lignininnhold i tre18. Denne metoden har imidlertid ulemper ved estimering av lignininnhold fra urteaktige prøver på grunn av tilstedeværelsen av ikke-lignin fenolforbindelser og fravær av en passende utryddelseskoeffisient. I 1970 fant Fergus og Goring at guaiacyl og syringyl sammensatt absorpsjon maxima var på 280 nm og 270 nm, noe som korrigerte utryddelseskoeffisientproblemet til Bolker- og Somerville-metoden19. Senere ble infrarød spektroskopi, en svært følsom teknikk for karakterisering av fenolics, også brukt til ligninestimering med en liten mengde plantebiomasseprøver. Et eksempel på slik teknologi var diffus refleks Fourier transform spektrofotometri. Denne metoden mangler imidlertid en riktig standard som ligner på UV-metoden20. Senere ble lignininnholdet estimert av NIRS (nær infrarød spektroskopi) og NMR (kjernemagnetisk resonansspektroskopi). Selv om det er ulemper i disse metodene, endrer de ikke lignins kjemiske struktur, beholder renheten20.
Den gravimetriske Klason-metoden er en direkte og den mest pålitelige analytiske metoden for ligninestimering av treaktige stengler. Grunnlaget for gravimetrisk ligninestimering er hydrolyse/solubilisering av ikke-ligninforbindelser og innsamling av uoppløselig lignin for gravimetri21. I denne metoden fjernes karbohydrater ved hydrolyse av biomassen med konsentrert H2SO4 for å trekke ut ligninrester20,22. Lignininnholdet estimert ved denne metoden er kjent som syre uoppløselig lignin eller Klason lignin. Påføring av Klason-metoden avhenger av plantearter, vevstype og celleveggtype. Tilstedeværelsen av variable mengder ikke-ligninkomponenter som tanniner, polysakkarider og proteiner resulterer i proporsjonale forskjeller i estimering av syre uoppløselig / løselig lignininnhold. Derfor anbefales Klason-metoden bare for lignin-estimering av biomasse med høyt lignininnhold som treaktige stengler17,23. Løselighetsmetoder som acetylbromid (AcBr), syreoppløselig lignin og tioglykolsyre (TGA) er mest brukte metoder for estimering av lignininnholdet fra ulike plantebiomassekilder. Kim et al. etablerte to metoder for ligninutvinning ved solubilisering. Den første metoden trekker ut lignin som en uoppløselig rest ved å løse cellulose og hemicellulose, mens den andre metoden skiller lignin i den oppløselige fraksjonen, og etterlater cellulose og hemicellulose som den uoppløselige rester24.
Lignende metoder som brukes i lignin estimering basert på løselighet er tioglykolsyre (TGA) og acetylkymid (AcBr) metoder25. Både TGA og acetylbromidmetoder estimerer lignininnholdet ved å måle absorbansen av den solubiliserte lignin ved 280 nm; AcBr-metoden forringer imidlertid xylans under prosessen med lignin-solubilisering og viser en falsk økning i lignininnholdet26. Thioglycolate (TGA) metoden er den mer pålitelige metoden, da den avhenger av spesifikk binding med thioethergruppene av benzylalkoholgrupper av lignin med TGA. TGA bundet lignin er utfelt under sure forhold ved hjelp av HCl, og lignin innholdet er estimert ved hjelp av sin absorbans ved 280 nm27. TGA-metoden har ytterligere fordeler med mindre strukturelle modifikasjoner, en løselig form for lignin-estimering, mindre forstyrrelser fra ikke-ligninkomponenter og presis estimering av lignin på grunn av spesifikk binding med TGA.
Denne TGA-metoden er modifisert basert på typen plantebiomasseprøve som brukes til lignininnholdsestimering. Her modifiserte og tilpasset vi den raske TGA-metoden for risstrå27 til bomullsvev for å estimere lignininnholdet. Kort sagt ble de tørkede pulveriserte planteprøvene utsatt for proteinløselighetsbuffer og metanolutvinning for å fjerne proteiner og alkoholløselig brøkdel. De alkoholløselige rester ble behandlet med TGA og utfelt lignin under sure forhold. En lignin standardkurve ble generert ved hjelp av kommersiell bambus lignin og en regresjonslinje (y = mx + c) ble oppnådd. X-verdien bruker gjennomsnittlige absorbansverdier på lignin ved 280 nm, mens “m” og “c” ble angitt fra regresjonslinjen for å beregne ukjent ligninkonsentrasjon i biomasseprøver av bomullsanlegg. Denne metoden er delt inn i fem faser: 1) forberedelse av planteprøver; 2) vasking av prøvene med vann og metanol; 3) behandling av pellets med TGA og syre for å utfelle lignin; 4) nedbør av lignin; og 5) standard kurveforberedelse og lignininnholdsestimering av prøven. De to første fasene er primært fokusert på plantematerialepreparatet etterfulgt av vann, PSB (proteinløselighetsbuffer) og metanolutvinning for å oppnå alkoholløselig materiale. Deretter ble det behandlet med TGA (tioglykolsyre) og HCl for å danne et kompleks med lignin i tredje fase. På slutten ble HCl brukt til å utfelle lignin, som ble oppløst i natriumhydroksid for å måle absorbansen ved 280 nm28.
Lignin spiller en betydelig rolle i plantevekst og utvikling og har nylig blitt grundig studert for biodrivstoff, bioenergi og bioproduktapplikasjoner. Lignin er rik på aromatiske forbindelser som er lagret i alle vaskulære plante sekundærcellevegger. Den har flere industrielle applikasjoner som trepanelprodukter, biodispergeringsmidler, flocculants, polyuretanskum og i harpikser av kretskort29,30,31. Det meste av lignin gene…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Institutt for plante- og jordvitenskap og bomull inc. for deres delvise støtte til denne studien.
BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |