Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Summary

Her presenterer vi en modifisert TGA-metode for estimering av lignininnhold i urteaktig plantebiomasse. Denne metoden estimerer lignininnholdet ved å danne spesifikke thioetherbindinger med lignin og gir en fordel i forhold til Klason-metoden, da det krever et relativt lite utvalg for lignininnholdsestimering.

Abstract

Lignin er en naturlig polymer som er den nest mest tallrike polymeren på jorden etter cellulose. Lignin er hovedsakelig avsatt i plantens sekundære cellevegger og er en aromatisk heteropolymer som hovedsakelig består av tre monolignoler med betydelig industriell betydning. Lignin spiller en viktig rolle i plantevekst og utvikling, beskytter mot biotiske og abiotiske påkjenninger, og i kvaliteten på dyrefôr, tre og industrielle ligninprodukter. Nøyaktig estimering av lignininnhold er avgjørende for både grunnleggende forståelse av ligninbiosyntese og industrielle anvendelser av biomasse. Thioglykolsyremetoden (TGA) er en svært pålitelig metode for å estimere det totale lignininnholdet i plantebiomassen. Denne metoden estimerer lignininnholdet ved å danne tioethers med benzylalkoholgruppene av lignin, som er oppløselige i alkaliske forhold og uoppløselige i sure forhold. Det totale lignininnholdet er estimert ved hjelp av en standardkurve generert fra kommersiell bambus lignin.

Introduction

Lignin er en av de vitale bærende komponentene i plantecellevegger og den nest mest tallrike polymeren på jorden¹. Kjemisk er lignin en krysskoblet heteropolymer som består av komplekse fenolforbindelser med høy molekylvekt som danner en naturlig fornybar kilde til aromatiske polymerer og syntese av biomaterialer^2,3. Denne naturlige polymeren spiller betydelige roller i plantevekst, utvikling, overlevelse, mekanisk støtte, celleveggstivhet, vanntransport, mineraltransport, losjimotstand, vevs- og organutvikling, avsetning av energi og beskyttelse mot biotiske og abiotiske påkjenninger^4,5,6,7. Lignin består hovedsakelig av tre forskjellige monolignoler: nåletyl, sinapyl og p-coumarylalkoholer som er avledet fra fenylpropanoidveien^8,9. Mengden lignin og sammensetningen av monomerer varierer basert på plantearter, vev / organtype og forskjellige stadier av planteutvikling¹⁰. Lignin er bredt klassifisert i mykt tre, hardved og gress lignin basert på kilden og monolignolsammensetningen. Mykved består hovedsakelig av 95% nåletylalkohol med 4% p-coumaryl og 1% sinapylalkoholer. Hardved har nåletyl- og sinapylalkoholer i like store mengder, mens gress lignin består av ulike proporsjoner av nåletyl, sinapyl og p-coumarylalkoholer^11,12. Sammensetningen av monomerer er kritisk da den bestemmer ligninstyrken, nedbrytningen og nedbrytningen av celleveggen, samt bestemmer molekylær struktur, forgrening og krysskobling med andre polysakkarider^13,14.

Lignin forskning får betydning i foraging, tekstilindustrien, papirindustrien, og for bioetanol, biodrivstoff og bio-produkter på grunn av sin lave pris og høye overflod^15,16. Ulike kjemiske metoder (f.eks. acetylkymid, syrevaskemidler, Klason og permanganatoksidasjon) sammen med instrumentelle metoder (f.eks. nær infrarød (NIR) spektroskopi, kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og ultrafiolett (UV) spektrofotometri) ble brukt til lignin kvantifisering^9,17. Analysemetodene for lignin er generelt klassifisert basert på elektromagnetisk stråling, gravimetri og løselighet. Prinsippet bak ligninestimering ved elektromagnetisk stråling var basert på lignins kjemiske egenskap der den absorberer lys ved spesifikke bølgelengder. Disse resultatene ble estimert basert på prinsippet om at lignin har en sterkere UV-absorbans enn karbohydrater. I 1962 brukte Bolker og Somerville kaliumkloridpellets for å estimere lignininnhold i tre¹⁸. Denne metoden har imidlertid ulemper ved estimering av lignininnhold fra urteaktige prøver på grunn av tilstedeværelsen av ikke-lignin fenolforbindelser og fravær av en passende utryddelseskoeffisient. I 1970 fant Fergus og Goring at guaiacyl og syringyl sammensatt absorpsjon maxima var på 280 nm og 270 nm, noe som korrigerte utryddelseskoeffisientproblemet til Bolker- og Somerville-metoden¹⁹. Senere ble infrarød spektroskopi, en svært følsom teknikk for karakterisering av fenolics, også brukt til ligninestimering med en liten mengde plantebiomasseprøver. Et eksempel på slik teknologi var diffus refleks Fourier transform spektrofotometri. Denne metoden mangler imidlertid en riktig standard som ligner på UV-metoden²⁰. Senere ble lignininnholdet estimert av NIRS (nær infrarød spektroskopi) og NMR (kjernemagnetisk resonansspektroskopi). Selv om det er ulemper i disse metodene, endrer de ikke lignins kjemiske struktur, beholder renheten²⁰.

Den gravimetriske Klason-metoden er en direkte og den mest pålitelige analytiske metoden for ligninestimering av treaktige stengler. Grunnlaget for gravimetrisk ligninestimering er hydrolyse/solubilisering av ikke-ligninforbindelser og innsamling av uoppløselig lignin for gravimetri²¹. I denne metoden fjernes karbohydrater ved hydrolyse av biomassen med konsentrert H₂SO₄ for å trekke ut ligninrester^20,22. Lignininnholdet estimert ved denne metoden er kjent som syre uoppløselig lignin eller Klason lignin. Påføring av Klason-metoden avhenger av plantearter, vevstype og celleveggtype. Tilstedeværelsen av variable mengder ikke-ligninkomponenter som tanniner, polysakkarider og proteiner resulterer i proporsjonale forskjeller i estimering av syre uoppløselig / løselig lignininnhold. Derfor anbefales Klason-metoden bare for lignin-estimering av biomasse med høyt lignininnhold som treaktige stengler^17,23. Løselighetsmetoder som acetylbromid (AcBr), syreoppløselig lignin og tioglykolsyre (TGA) er mest brukte metoder for estimering av lignininnholdet fra ulike plantebiomassekilder. Kim et al. etablerte to metoder for ligninutvinning ved solubilisering. Den første metoden trekker ut lignin som en uoppløselig rest ved å løse cellulose og hemicellulose, mens den andre metoden skiller lignin i den oppløselige fraksjonen, og etterlater cellulose og hemicellulose som den uoppløselige rester²⁴.

Lignende metoder som brukes i lignin estimering basert på løselighet er tioglykolsyre (TGA) og acetylkymid (AcBr) metoder²⁵. Både TGA og acetylbromidmetoder estimerer lignininnholdet ved å måle absorbansen av den solubiliserte lignin ved 280 nm; AcBr-metoden forringer imidlertid xylans under prosessen med lignin-solubilisering og viser en falsk økning i lignininnholdet²⁶. Thioglycolate (TGA) metoden er den mer pålitelige metoden, da den avhenger av spesifikk binding med thioethergruppene av benzylalkoholgrupper av lignin med TGA. TGA bundet lignin er utfelt under sure forhold ved hjelp av HCl, og lignin innholdet er estimert ved hjelp av sin absorbans ved 280 nm²⁷. TGA-metoden har ytterligere fordeler med mindre strukturelle modifikasjoner, en løselig form for lignin-estimering, mindre forstyrrelser fra ikke-ligninkomponenter og presis estimering av lignin på grunn av spesifikk binding med TGA.

Denne TGA-metoden er modifisert basert på typen plantebiomasseprøve som brukes til lignininnholdsestimering. Her modifiserte og tilpasset vi den raske TGA-metoden for risstrå²⁷ til bomullsvev for å estimere lignininnholdet. Kort sagt ble de tørkede pulveriserte planteprøvene utsatt for proteinløselighetsbuffer og metanolutvinning for å fjerne proteiner og alkoholløselig brøkdel. De alkoholløselige rester ble behandlet med TGA og utfelt lignin under sure forhold. En lignin standardkurve ble generert ved hjelp av kommersiell bambus lignin og en regresjonslinje (y = mx + c) ble oppnådd. X-verdien bruker gjennomsnittlige absorbansverdier på lignin ved 280 nm, mens “m” og “c” ble angitt fra regresjonslinjen for å beregne ukjent ligninkonsentrasjon i biomasseprøver av bomullsanlegg. Denne metoden er delt inn i fem faser: 1) forberedelse av planteprøver; 2) vasking av prøvene med vann og metanol; 3) behandling av pellets med TGA og syre for å utfelle lignin; 4) nedbør av lignin; og 5) standard kurveforberedelse og lignininnholdsestimering av prøven. De to første fasene er primært fokusert på plantematerialepreparatet etterfulgt av vann, PSB (proteinløselighetsbuffer) og metanolutvinning for å oppnå alkoholløselig materiale. Deretter ble det behandlet med TGA (tioglykolsyre) og HCl for å danne et kompleks med lignin i tredje fase. På slutten ble HCl brukt til å utfelle lignin, som ble oppløst i natriumhydroksid for å måle absorbansen ved 280 nm²⁸.

Protocol

1. Utarbeidelse av planteprøver Samle to måneder gamle bomullsplanter fra drivhuset (Figur 1A). Vend plantepottene forsiktig for å skille jord og røtter med intakte laterale røtter ved å løsne jorda rundt planten (Figur 1B). Vask de oppsamlede plantene grundig i skuffer fylt med vann for å fjerne alt smuss (for rotprøver) (Figur 1C). Bruk papirhåndklær til å tørke separert rot-, s…

Representative Results

To forskjellige eksperimentelle bomullslinjer ble sammenlignet for forskjeller i deres lignininnhold i forskjellige vev. Det ekstraherte lignininnholdet i hver prøve ble målt til 280 nm og registrerte sine respektive absorbansverdier. De gjennomsnittlige absorbansverdiene for hver biologiske replikering ble sammenlignet med regresjonslinjen i lignin-standardkurven (Tabell 2, Figur 3C). Regresjonslinjen, y = mx + c, brukes til å beregne det ukjente lignininnholdet i de eks…

Discussion

Lignin spiller en betydelig rolle i plantevekst og utvikling og har nylig blitt grundig studert for biodrivstoff, bioenergi og bioproduktapplikasjoner. Lignin er rik på aromatiske forbindelser som er lagret i alle vaskulære plante sekundærcellevegger. Den har flere industrielle applikasjoner som trepanelprodukter, biodispergeringsmidler, flocculants, polyuretanskum og i harpikser av kretskort^29,30,31. Det meste av lignin gene…

Materials

BioSpectrophotometer kinetic	Eppendorf kinetic	6136000010	For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin	Aldrich	1002171289	Used in the preparation of the standard curve
Distilled water	Fischer Scientific	16690382	Used in the protocol
Falcon tubes	VWR	734-0448	Containers for solutions
Freezer mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer	Eppendorf	13527550	For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer	Walter	WP1007-HS	Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)	Sigma	221677	Used in the protocol
Incubator	Fisherbrand	150152633	For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale	Mettler toledo	30243386	For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)	Fischer Scientific	67-56-1	Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)	Microcentrifuge	Z628034-500EA	Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder	Hanchen	Amazon	Used for crushing dried samples
pH meter	Fisher Scientific	AE150	Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven	Fisher Scientific	15-015-2633	Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)	Sigma Aldrich	68-11-1	Used in the protocol
Vacuum dryer	Eppendorf	22820001	Used for drying samples
Vortex mixer	Eppendorf	3340001	For proper mixing of samples