Summary
여기에서 우리는 마우스에 있는 본질적인 심장 기능 및 β 부전 예비를 결정하기 위하여 정맥 내 주입된 isoproterenol의 증가 복용량에서 심장 압력 볼륨 루프 분석을 기술합니다. 우리는 압력 볼륨 루프 측정을 위해 수정 된 오픈 가슴 접근 방식을 사용하며, 여기에는 양극 기만 압력이있는 환기가 포함됩니다.
Abstract
심장 기능의 결정은 심장에 특정 치료의 효과를 특성화하기 위해 심혈관 질환의 동물 모델에서 강력한 엔드포인트 분석이다. 유전 조작의 타당성 때문에 마우스는 심장 기능을 공부하고 새로운 잠재적인 치료 표적을 찾아서 가장 일반적인 포유류 동물 모형이 되었습니다. 여기서 우리는 기저 조건 동안 및 이소프로테레놀의 증가 농도의 정맥 주입에 의하여 β 부전 자극 의 밑에 압력 볼륨 루프 측정 및 분석을 사용하여 생체 내 심장 기능을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 우리는 개방 된 가슴 측정 중에 부정적인 영향을 개량하기 위한 긍정적 인 종기 기류 압력을 고려하여 환기 지원, 절차 중 통증으로 인한 통제 할 수없는 심근 스트레스를 피하기 위한 강력한 진통제 (Buprenorphine)를 포함한 정제 된 프로토콜을 제공합니다. 가능한 함정에 대한 절차및 논의에 대한 상세한 설명은 고도로 표준화되고 재현 가능한 압력 볼륨 루프 분석을 가능하게 하여 가능한 방법론적 편견을 방지하여 실험 집단에서 동물의 배제를 감소시킵니다.
Introduction
심혈관 질환은 일반적으로 심장 기능에 영향을 미칩니다. 이 문제는 동물 성 질병 모델에서 생체 내 상세한 심장 기능을 평가하는 데 중요성을 지적합니다. 동물 실험은 3Rs(3R) 안내 원리(감소/정제/교체)의 프레임으로 둘러싸여 있습니다. 현재 발달 수준에서 전신 반응(즉, 심혈관 질환)과 관련된 복잡한 병리를 이해하는 경우, 주요 옵션은 사용 가능한 방법을 구체화하는 것이다. 정제는 또한 분석 및 결론의 힘을 향상 감소 감소로 인해 필요한 동물 수의 감소로 이어질 것입니다. 또한, 신경신경 자극에 의해 유도된 심장질환의 동물모델과 심장수축 측정을 병행하거나, 예를 들어 변경된 카테콜아민/β-부전 수치1,2,3,4등을모방한 대동맥 밴딩과 같은 압력 과부하에 의해, 전임상 연구를 위한 강력한 방법을 제공한다. 카테터 기반 방법은 심장수축도 5의심층 평가를 위해 가장 널리 사용되는 접근법으로 남아 있음을 고려하여, 우리는 이접근법의특정 파라미터의 평가를 포함하여 이전 경험을 기반으로 β-adrenergic 자극 동안 마우스에서 생체 내 심장 기능의 정제된 측정을 소개하는 것을 목표로 하고있다. 7.
이미징 또는 카테터 기반 기술을 포함하는 심장 혈역학 적 매개 변수 접근 방식을 결정하기 위해 사용할 수 있습니다. 두 옵션 모두 각각의 과학적 질문에 대해 신중하게 고려해야 할 장점과 단점을 동반합니다. 이미징 접근법은 에코카피그래피 및 자기 공명 영상(MRI)을 포함합니다. 둘 다 마우스에서 성공적으로 사용되었습니다. 심초음파 측정은 마우스의 높은 심박수에 필요한 고속 프로브에서 높은 초기 비용을 포함; 비교적 간단한 비침습적 접근 방식이지만 이상적으로 심장 구조를 인식하고 시각화하는 데 이상적으로 경험해야 하는 운전자들 사이에서는 변이합니다. 또한 압력 측정을 직접 수행할 수 없으며 크기 크기와 유량 측정의 조합으로 계산을 얻을 수 있습니다. 한편, 질병 진행 시, 예를 들어, 동일한 동물 및 심장 기능에서 여러 측정을 수행할 수 있다는 장점이 있다. 부피 측정과 관련하여, MRI는 금 표준 절차이지만, 에코카디그래피와 유사하게, 직접 압력 측정이 불가능하고 프리로드 종속 파라미터만8을얻을 수 있다. 제한 요인은 가용성, 분석 노력 및 운영 비용도 있습니다. 여기서 카테터 기반 방법은 심장 내 압력의 직접적인 모니터링과 사전 로드 모집 스트로크 작업(PRSW)9와같은 부하 독립적 수축 파라미터의 결정을 추가로 허용하는 좋은 대안이다. 그러나 압력 전도도 카테터(전도도 측정을 통해)에 의해 측정된 심실 부피는 MRI의 것보다 작지만 그룹 차이는 동일한범위(10)에서유지된다. 신뢰할 수 있는 볼륨 값을 결정하기 위해서는 해당 교정이 필요하며 이는 PVL 측정 중에 중요한 단계입니다. 상기 고독식식염수의 볼루스 주입 시 심근의 병렬 전도도에 대한 생체 내 분석과 부피 보정 된 큐벳(부피로전도의 변환)에서 혈액 전도도의 전생체측정을 결합한다11,12. 그 외에도, 심실 내부의 카테터의 위치와 심실의 세로 축을 따라 전극의 올바른 방향은 그들에 의해 생성 된 주변 전기 장의 검출 능력에 매우 중요합니다. 여전히 마우스 심장의 크기가 감소하면 카테터의 정맥 내 방향의 변화에 의해 생성 된 유물을 피할 수 있으며, 심지어 확장 된 심실5,10에서도유물은 β 인내 자극6,13에서진화 할 수 있습니다. 전도방법 추가로 착적단계의 개발이 나타났지만, 여기서 볼륨값은오히려 과대평가된다 14,15.
마우스는 심장 혈관 연구와 β 가장 중요한 전임상 모델 중 하나이기 때문에-심장의 부전 예비는 심장 생리학 및 병리학에 대한 핵심 적인 관심사이므로, 여기서 우리는 β-adrenergic 자극 중 PVL 측정에 의해 마우스에서 생체 내 심장 기능을 결정하는 정제 된 프로토콜을 제시합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 카를스루에 지역 위원회와 하이델베르크 대학의 규정에 따라 승인및 수행되었다 (AZ 35-9185.82 / A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) 과학목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 유럽 의회의 지침 2010/63/EU지침에 부합한다. 이 프로토콜에 도시된 데이터는 야생 형 C57Bl6/N 남성 마우스(17± 1.4주)로부터 파생된다. 마우스는 하이델베르크 의학 학부의 동물 시설 (IBF)에서 지정된 병원체없는 조건하에서 유지되었다. 마우스는 12시간 밝은 어두운 주기에 수용되었으며, 상대 습도는 56-60%, 시간당 15회 공기 변화, 실온 22°C +/- 2°C입니다. 그들은 기존의 케이지 타입 II 또는 II형에 오랫동안 동물 침구와 조직 용지를 농축으로 제공했습니다. 표준 오토클레이브 식품과 오토클레이브 워터는 광고 리비도를섭취할 수 있었다.
1. 계측기 및 약물 솔루션 준비
- 중앙 정맥 카테터: 마이크로 튜브(외부 직경 0.6mm)를 ~20cm 길이의 카테터 튜브로 자릅니다. 집게를 사용하여 튜브의 한쪽 끝을 23 게이지 캐뉼라 끝에 당깁니다. 대각선으로 튜브의 다른 쪽 끝을 잘라 대퇴 정맥을 관통 할 수있는 날카로운 팁을 만들 수 있습니다.
- 내막피튜브: 관착튜브의 경우 20게이지 베니쿤크투르-캐뉼라3cm를 잘라 주사기 부착물을 제거합니다.
- 관착 튜브가 인공호흡기 연결에 완벽하게 맞지 않으면 환기 장치가 연결된 튜브 의 끝에 파라필름을 싸십시오. 연결은 두껍게(도1A)에의해 안정적이고 밀봉되어야 합니다. 20 게이지 베니언크-캐뉼라의 금속 가이드 핀을 2.7cm로 단축하고 삽관 보조로 사용하십시오. 기관체의 시각화를 용이하게 하기 위해 광섬유를 포함하는 관관에 대한 정제된 접근법은 또한 Das 및협력자(16)에의해 잘 설명된다.
- 삽관에 사용되는 마취 혼합물: 헤파린(1000 IU/mL)의 200 μL을 0.9% NaCl의 50 μL과 750 μL의 2 mg/mL 에토미데이트와 혼합하여 오일 인 워터 에멀젼 기반 제품에서 사용합니다. 각 마우스(0.1 mg/kg BW Buprenorphine 10 mg/kg BW etomidate)에 대해 7 μL/g 의 체중(BW)을 사용하십시오.
- 근육 이완제: 녹여 100 판큐로늄 브로마이드의 mg 에 100 mL 의 0.9% NaCl. 각 마우스에 1.0 μL/g 의 체중(1 mg/kg BW)을 사용하십시오.
- 이소프로테레놀 용액: 0.9% NaCl(1 μg/μL)의 100mL에 이소프로테레놀 100 mg을 용해하십시오. 다음 희석제(표1)를준비하고 각각 1mL 주사기로 옮김한다.
- 희석 1을 얻으려면 주식을 희석 1:1.8로 희석하십시오. 희석 2를 얻으려면 주식을 희석 1:6. 희석 3을 얻으려면 희석 1을 1:10으로 희석하십시오. 마지막으로 희석 4를 1:10 희석2로 얻습니다.
- 15% Hypertonic NaCl (w/v): 0.45 μm 모공 주사기 필터로 용액을 0.45 μm 모공 주사기 필터로 10mL의 10mL에서 0.9% NaCl의 1.5g을 녹입니다.
- 12.5% 알부민 용액(w/v): 소 세럼 알부민 1.25g을 10mL에 0.9% NaCl로 녹입니다. 37°C에서 30분 동안 용액을 배양합니다. 실온으로 식히고 0.45 μm 모공 주사기 필터로 용액을 필터링합니다.
- 설치 준비: 가열 판을 먼저 전환하여 39-40°C로 설정합니다. 가열 패드에 식염수로 채워진 주사기를 놓고 압력 볼륨 루프 (PVL) 카테터를 주사기로 옮킨다. 안정화에 사용하기 전에 카테터를 최소 30분 동안 미리 배양합니다. 우리가 사용하는 설정은 1.4-F 압력 전도도 카테터, 제어 장치 및 해당 소프트웨어로 구성되며 그림 1B에 그래픽으로 설명되고 공급자 참조는 재료 표에나열됩니다.
2. 마취
- 부프레노르핀 (0.1 mg /kg BW 인트라피톤) 30 분 전에 삽관하십시오.
- 마우스를 2.5%의 이소플루란으로 미리 포화된 아크릴 유리 챔버에 넣고 챔버 바닥에 놓인 가열 패드로 미리 데워버로 가열합니다.
- 마우스가 잠들자마자 (반사의 부족), 마취 혼합물을 주입 (7 mL/ kg BW) 포함 10 mg/kg etomidate 및 헤파린 (1,200 IU/kg BW) peritoneally.
3. 환기
- 동물을 관충플랫폼(도 1C)으로이송하여 마취 주사 후 3-4분 후에 이송한다. 마우스는 작업자를 향한 등갈 보기로 치아에 매달려 있습니다.
- 혀를 집게로 부드럽게 들어 올립니다. 글롯티를 식별하려면 마우스의 아래턱을 두 번째 집게로 약간 들어 올립니다.
- 기관체에 내막관(도1A)을조심스럽게 삽입하고 가이드 로드를 제거합니다.
- 동물을 가열 판에 옮기고 뒤쪽에 놓고 삽관튜브를 작은 동물 호흡보호구에 연결합니다.
- 호흡속도를 53.5x(그램의 체중)-0.26 [분-1]로조정하고, 다른 사람에 의해 설명된 바와 같이12,조수부피는 11±1cmH2O의피망 압력을 피크하도록 한다.
- 접착 스트립으로 가열 판에 마우스의 사지를 주의 깊게 수정하고 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 연고를 적용합니다.
- 직장 온도 프로브를 삽입하고 37 ± 0.2 °C에서 핵심 체온을 유지합니다.
- 1-lead 심전도를 설치하고 마취 깊이 및 안정성을 나타내는 지표로 온라인 심박수를 모니터링합니다.
- 디지털 간 반사 신경이 없는 경우 근육 이완제 판큐로늄 브로마이드의 1 mg/kg BW를 인터분비로 주입하십시오. 이것은 PVL 측정 도중 호흡 아티팩트를 방지합니다.
4. 수술
- 일반 권장 사항
- 수술 중, O2로기화된 ~1.5~2%의 이소플루란으로 환기한다. 이소플루란 농도는 또한 마우스 변형, 성별, 나이 및 동물의 무게와 같은 변수에 따라 달라질 수 있지만 개별적으로 실험적으로 결정되어야하며 여기에 있는 값은 C57BL6/N 마우스 변형에 대한 참조입니다. 중요한 것은, 인공호흡기는 운전자가 이소플루란을 흡입하는 것을 방지하기 위해 추출 시스템에 연결되어 있습니다.
- 외과 적 수술을 위해 스테레오 현미경에서 1.5-4 배율을 사용합니다.
참고: 비생존 수술을 위한 동물의 준비에 대한 제도적/지역 지침을 참조하십시오.
- 대퇴통
- 70%에탄올로 뒷다리를 헹구고, 왼쪽 잉구이 부위를 절개하고, 왼쪽 대퇴 정맥을 노출한다.
- 상복부 동맥과 정맥을 소터리로 폭발시다.
- 카테터 액세스에 탈지 봉합사와 대퇴 정맥을 리게이트.
- 대퇴정맥 아래에 봉합사를 전달하고 천자 부위의 매듭 두개골을 준비한다. 1 mL 주사기에 부착 된 준비 된 마이크로 튜브 (1.1 단계 참조)로 대퇴 정맥을 천공하십시오.
- 매듭을 묶어 용기 내부의 튜브를 고정합니다.
- 0.9%의 주입에 의한 중화유체 손실은 자동 주사기 펌프로 15 μL/min의 주입 속도로 12.5%의 알부민으로 보충되었습니다. 또한, 사전 따뜻하게 0.9% NaCl을 사용하여 노출된 조직 습한 상태를 유지하십시오.
- 소라코토미
- 70%의 에탄올로 흉부 헹구는 다.
- 자화증 과정 바로 아래에 피부를 절개하고 가슴 근육을 집게 또는 소손으로 가슴 벽과 무뚝뚝하게 분리합니다.
- 집게로 사이포이드 공정을 들어 올린 다음, 다이어프램이 아래에서 완전히 보일 때까지 소터리로 양쪽으로 측면으로 움직이는 가슴 벽을 잘라냅니다.
- 아래에서 다이어프램을 절개하고 심장 정점을 노출합니다. 그런 다음 조심스럽게 집게로 심낭을 제거합니다.
- 이전에 설명된 바와 같이 왼쪽에 제한된 코스토절제술을수행한다.
- 열등한 카발 정맥 아래에 봉합사를 전달하여 이후 단계에서 사전 하중 감소를 수행합니다.
- 25 게이지 캐뉼라 (최대 4mm)로 심장 정점을 부드럽게 뚫습니다. 모든 전극이 심실 내에 들어올 때까지 캐뉼라를 제거하고 PV 카테터를 삽입합니다.
- 카테터의 위치를 부드러운 움직임으로 조정하고 직사각형 모양루프가 얻어질 때까지 회전합니다(그림2A).
- 항상 전온 0.9 % NaCl을 사용하여 노출 된 모든 조직 습한 유지.
5. 측정
- 일반 권장 사항
- 측정 중에 ~ 1.5-2 %의 이소플루란으로 100 % O2로 기화합니다.
- 투여량 반응 프로토콜의 각 단계에서 2개의 기준선 측정뿐만 아니라 2개의 베나 카바 폐색을 수행한다.
참고: 첫 번째 및 두 번째 베나 카바 오클루전 이후에 압력과 볼륨 값이 첫 번째 오클루전 이전과 마찬가지로 정상 상태 값으로 돌아가는 것이 중요합니다. 이 관찰은 정맥 내 부피의 직렬 감소로 인해 카테터 위치의 변화를 인식하기 위해 필요합니다. 카테터 위치의 변화가 경우 특히 볼륨 값이 이동됩니다.
- 매개 변수(심박수, 뇌졸중 볼륨, dP/dt최대)의온라인 분석을 수행하고 정상 상태 심장 기능이 얻어질 때까지 기다립니다. C57Bl6/N 마우스에서 사용되는 설정을 가진 예상 파라미터 범위에 대해서는 공지된 결과6을참조하십시오.
- 최종 만료 위치에서 호흡보호구를 중지하고 기준 매개 변수를 기록합니다. 3~5초 후에는 예비하중독립적 파라미터(도2B)를얻기 위해 포셉으로 열등한 카빌 정맥 아래 봉합사를 들어 올려 심장 전부하를 감소시다. 인공호흡기를 켭니다. 혈역학 파라미터가 안정화될 때까지 두 번째 폐색을 위해 30초 이상 기다립니다.
- 기저 조건하에서 측정을 얻은 후 준비된 주사기로 전환하여 이소프로테레놀의 투여 량 반응으로 진행한다. 여기서 주입 속도는 심장 프리로드의 수정을 피하기 위해 변경되지 않은 상태로 유지됩니다. 주사기를 변경할 때 기포를 주입하지 않도록주의하십시오.
- 새로운 정상 상태 심장 기능이 다시 종료 만료 위치에서 호흡보호구를 중지하고 기준 기준 매개 변수를 기록보다 얻을 때까지 적어도 2 분 기다립니다. 3~5초 후에는 독립적인 매개변수를 얻기 위해 열등한 카발 정맥 아래에 봉합사를 들어 올려 심장 전부하를 줄입니다.
- 두 번째 오클루전을 위해 30초 이상 기다립니다. 그 후 다음 isoproterenol 농도로 준비된 주사기로 전환하고 기준선 의 레코딩을 반복하고 독립적인 매개 변수를 미리 로드합니다.
참고: 최종 수축기 압력 스파이크(ESPS, 도 2C)와같은 유물은 카테터 함정으로 인한 이소프로테레놀 투여량의 증가 중에 발생할 수 있다. 기저 파라미터가 시작되기 전에 발생하는 유물은 카테터의 재위치 지정을 통해 쉽게 수정할 수 있습니다.
6. 교정
참고: 교정 절차는 사용되는 PVL 시스템에 따라 달라질 수 있습니다.
- 병렬 전도도 교정
- 이소프로테레놀 용량 반응으로부터 마지막 측정 후 대퇴 수분에 15% NaCl 용액을 함유한 주사기를 연결한다. PVL이 온라인 시각화 중에 오른쪽으로 약간 이동할 때까지 튜브에 남아있는 고독용액의 5 μL을 조심스럽게 주입합니다. 그런 다음 루프가 정상 상태로 돌아올 때까지 기다립니다.
- 종료 시 호흡보호구를 멈추고 2~3초 이내에 10μL의 10μL의 볼러스를 주입합니다. 온라인 시각화 중에 PVL이 크게 넓어지고 오른쪽으로 이동하는지 확인합니다.
- 전도도 대 볼륨 교정
- 고토닉 식염수 볼러스가 완전히 희석되도록 5 분, 더 적은 기다립니다. 그 후 카테터를 제거하고 1mL 주사기와 21 게이지 캐뉼라를 사용하여 박동 심장의 왼쪽 심실에서 적어도 600 μL 혈액을 그립니다. 이 시점에서 동물은 심층 마취 및 진통에서 심층 출혈로 안락사됩니다.
- 미리 데운 (37 °C의 수조에서) 알려진 볼륨의 실린더와 교정 큐벳으로 혈액을 전송합니다. PV 카테터를 각 실린더에 중앙에 배치하고 전도도를 기록합니다. 각 동물에 대한 표준 곡선을 계산하면 전도도 단위를 절대 볼륨 값으로 변환할 수 있습니다.
7. 분석
- 기초 조건 및 이소프로테레놀 자극하에서 성공적인 PVL 측정 후, 적절한 PVL 분석 소프트웨어를 사용하여 심장 기능(PRSW, dP/dt, 최종 확장기 압력 및 볼륨, 엔드 수축기 압력 및 볼륨, 이완 상수 타우 등)을 특징으로 하는 매개 변수를 시각화, 디지털화, 계산 및 추출합니다. 표준 분석 소프트웨어로 추가 통계 분석 및 그래픽 표현을 수행할 수 있습니다.
- 프리로드 독립 파라미터 분석
참고: 이 단계에서는 절차를 표준화하는 것이 중요합니다.- 프리로드 독립 파라미터(도2D)의분석을 위해 모든 측정에서 프리로드가 감소하는 첫 번째 5-6 PVL을 선택합니다. 사전 부하 감소 중에 분석을 위해 선택된 일정한 수의 PvLs는 획득한 매개 변수의 측정 중 가변성을 감소시게 됩니다.
- 프로토콜의 각 단계에서 두 측정값의 평균 값을 계산합니다.
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Representative Results
압력 부피 루프(PVL) 측정은 약물의 심장 약동성을 분석하고 정상 및 병리학 적 조건에서 유전자 변형 마우스 모델의 심장 표현형을 조사하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 모델에서 심장 β 부전 예비의 평가를 허용합니다. 여기서 우리는 주모덕 정맥 카테터를 통해 이소프로테레놀 농도를 주입하여 β-아레너지 자극에 대한 심장 반응에 초점을 맞춘 부프레노르핀(진통제) 및 판큐로늄(근육 이완제)과 결합된 이소플루란 마취 하에서 열린 가슴 방법을 설명합니다. 본 프로토콜에 나타난 일부 대표적인 데이터는 야생형 C57Bl6/N 성인 수컷마우스(도 3 및 표 2)로부터유래된다. PVL 분석에 의해 측정된 몇 가지 중요한 파라미터의 가변성을 나타내는 지표로서 우리는 WT 그룹의 결과와 사용 가능한 G*Power소프트웨어(17)의결과를 사용하여 전력 분석(α 오류 확률 0.05 및 0.8)을 수행하였다. 표 3에서는 계산된 효과 크기와 심박수, PRSW, 스트로크 볼륨, 이완 상수 타우, dP/dt최대 및 dP/dtmin 0, 0.825 및 8.25 ng/min isoproterenol 아래 각 매개 변수에 대해 10%에서 30% 사이 변화를 가정하는 데 필요한 샘플 크기가 묘사된다.
압력 볼륨 관계의 그래픽 분석은 X 축의 Y-및 압력(mmHg)에 부피(μL)를 플로팅하여 수행됩니다. 카테터가 심실 내에 올바르게 배치되면 전체 심장 주기가 직사각형 모양의 PVL(도2A 및 도 3A)으로표시됩니다. 얼마 지나지 않아, systole는 두 심장 판막이 닫혀있는 동안 등부 수축 (dP / dt최대특징)의 단계로 시작됩니다 (오른쪽 수직 가장자리). 심실 압력이 대동맥 압력을 초과하면 대동맥 판막이 열리고 혈액이 배출 단계 (상부 수평)동안 대동맥으로 펌핑됩니다. 그 후 대동맥 압력이 심실 압력을 초과하면 대동맥 판막이 닫히고 디아스톨이 시작됩니다. 상실 이완(파라미터 dP/dtmin 및 Tau 특징)이 심방 압력이 심실 압력을 초과하고 승모 판막이 열릴 때까지 심실 압력이 떨어집니다(왼쪽 수직 가장자리). 이제 최종 확장기 압력 볼륨 관계 (EDPVR)를 특징으로하는 수동 확장기 충진은 다음 심장 주기가 시작될 때까지 일어난다 (아래 수평)(그림 2A-B).
PVL 분석은 심장 프리로드와 는 별개로 심장 기능을 결정할 수 있기 때문에 심장 기능에 대한 자세한 통찰력을 제공합니다. 따라서,실험설정5에서심장 기능을 결정하기 위한 금본위제로 기재되어 있다. C57Bl6/N 마우스를 이용한 기술 프로토콜에서 심박수, 심장 출력, 뇌졸중 량 및 뇌졸중 작업과 같은 심장 기능의 일반적인 매개 변수에서 생성된 이소프로테레놀에 대한 반응을 평가했습니다. 각 파라미터에 대한 이소프로테레놀의 유의한 효과는 상이한 이소프로테레놀농도(도 3B)하에서투여 반응에서 관찰된다. PRSW 및 dP/dt최대와 같은 심장 수축의 매개 변수는 이소프로테레놀 주입(그림3A-B)에서투여량 반응의 예상 증가를 나타냈다. 한편, 이소프로테레놀 농도가 증가함에 따라 확장기 파라미터(이완 타우 및 dP/dtmin의상수)의감소(도 3C)가건강한 심장에서 카테콜라민에 의해 생성된 긍정적인 광피 효과로부터 예상되는 것으로 기록되었다. 도 3(즉, 최종 수축기 압력 및 부피, 최종 확장기 압력 및 부피, 최대 압력 등)에 도시된 이들의 추가 파라미터는 PVL 분석에서뿐만 아니라 얻어지며, 또한 과학적 질문, 유전적 또는 질병 모델 및 관측에 따라 분석될 수 있다. 증분 β-아드레날린 자극 중 각 단계에서 PVL에서 가장 흔한 파라미터에 대한 추가적이고 상세한 값은 심장 부피 파라미터에 매우 영향을 미치는 고장성 식염수와의 병렬 전도도에 대한 교정 시점을 포함하지만, 또한 심장 이노트로피 및 이완, 이전에1,6을보고하였다.
그림 1. 마취 및 압력 볼륨 루프 설정. (A) 마우스 삽관에 적응된 20게이지 베니크추어 캐뉼라. (b) 마취 가스의 유동 방향을 포함하여 사용되는 압력 볼륨 측정 설정의 상이한 구성요소의 조직 및 연결을 보여주는 다이어그램. (C) 신속 하고 안전한 삽관을 위해 마우스를 걸기 위하여 이용된 삽관 플랫폼. 나사(i)는 매달려 있는 실(ii)의 끝에 양쪽에 마우스 무게에 따라 위협을 조여주시도록 포함된다. 화살표는 이소플루란 노출에 대한 연결 가능성을 나타냅니다. 온도: 온도; 심전도: 심전도; MinP소모: 최소 만료 압력; MaxP소모: 최대 만료 압력; PV: 압력 볼륨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 대표적인 압력 볼륨 분석. (A) 기저 측정 중에 분석된 파라미터가 표시되고 심장 주기 동안 주요 이벤트가 묘사되는 예시적인 압력 볼륨 기록이 표시됩니다. (B) 파라미터 ESPVR, EDPVR 및 PRSW는 사전 로드 감소 중에 묘사됩니다. (C) 기저 측정(상부 패널) 또는 폐색 기동(하부 패널) 중 또는 이소프로테레놀 자극 하에서 모두 종착수축기 압력 스파이크가 제시된다. LV: 좌심실; dP/dt분: 최소 dP/dt; dP/dt최대: 최대 dP/dt; Ves: 엔드 시슬 볼륨; Ved: 종기 확장기 볼륨; ESPVR: 종단 수축기 압력 볼륨 관계; PRSW: 사전 로드 채용 스트로크 작업; EDPVR: 종기 확장기 압력 볼륨 관계. 그림은 우리의 이전 작품의 보충에서 적응 되었다 20196. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. C57BL6/N 마우스에서 PVL 측정의 분석. (A) C57BL6/N 대조군 마우스로부터열등한 카발 정맥 폐색 시 대표적인 PVLs및 증가된 이소프로테레놀 농도를 실시한다. (B) 기저 조건 과 이소프로테레놀 중 일반적인 심장 기능은 심박수, 심장 출력, 뇌졸중 량 및 뇌졸중 작업의 분석에 의해 설명된다. (C) 추가 파라미터는 PRSW와 같은 심장 수축성 및 확장기 기능, 이완 타우(Weiss 방정식18)의상수 및 최대 및 최소 dP/dt를 평가하기 위해 분석되었다. 데이터는 표준 편차 ± 의미로 표시됩니다. BPM: 분당 비트; PRSW: 사전 로드 채용 스트로크 작업; n: 마우스 수. **p < 0.01: 기초 상태에 대한 쌍의 학생의 t-테스트에서 p 값 (isoproterenol = 0 ng / 분). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이소프로테레놀 | 농도(pg/μL) | 주입 속도(μL/분) | 용량 (ng/min) |
| 주식 | 1000 | ||
| 희석 1 | 550 | 15 | 8.25 |
| 희석 2 | 165 | 15 | 2.475 |
| 희석 3 | 55 | 15 | 0.825 |
| 희석 4 | 16.5 | 15 | 0.2475 |
표 1. β-아드레너지 자극을 증가시켜 이소프로테레놀의 희석. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 이소프로테레놀 (ng/min) | |||||
| 0 | 0.2475 | 0.825 | 2.475 | 8.25 | |
| 전역 매개 변수 및 볼륨 | |||||
| 심박수 (bpm) | 470 ± 19.6 | 490 ± 19.3 | 542 ± 20.6 | 605 ± 20.5 | 638 ± 20.5 |
| 스트로크 볼륨(μl) | 16.2 ± 2.6 | 17.6 ± 2.1 | 20.3 ± 2.8 | 22.3 ± 2.2 | 23.9 ± 2.5 |
| 심장 출력(μl/분) | 7627 ± 1210 | 8609 ± 1097 | 11000 ± 1616 | 13502 ± 1494 | 15291 ± 1761 |
| 종단 수축부(μl) | 13 ± 3.1 | 10.5 ± 3.5 | 4.81 ± 2.3 | 1.94 ± 1.9 | 1.5 ± 1.7 |
| 최종 확장기 부피(μl) | 27.4 ± 3 | 26.6 ± 3.0 | 24.1 ± 3.1 | 23.8 ± 2.6 | 24.8 ± 2.7 |
| 평균 압력(mmHg) | 27.4 ± 2.2 | 28.6 ± 2.2 | 29.2 ± 1.9 | 29.7 ± 1.9 | 30.5 ± 1.9 |
| 동맥 엘라스트란스 (mmHg/μl) | 4.44 ± 0.6 | 4.18 ± 0.7 | 3.46 ± 0.5 | 2.78 ± 0.9 | 2.91 ± 1 |
| 수축기 매개 변수 | |||||
| 사전 로드 모집 가능한 스트로크 작업 | 67.8 ± 7.62 | 76.3 ± 9.85 | 96.1 ± 14.62 | 108 ± 14.56 | 113 ± 13.02 |
| ESPVR | 4.96 ± 1.29 | 5.15 ± 1.16 | 7.2 ± 2.28 | 17.3 ± 42.04 | 40 ± 107.55 |
| 배출 분수 (%) | 52.59 ± 9.57 | 60.9 ± 9.94 | 80.23 ± 8.65 | 92.16 ± 7.2 | 94.18 ± 6.15 |
| 스트로크 작업(mmHg x μl) | 1007 ± 244.26 | 1153 ± 193 | 1399 ± 261 | 1582 ± 234 | 1720 ± 216 |
| 최대 dP/dt(mmHg/s) | 6128.7 ± 1398.39 | 7087 ± 1401 | 8982.4 ± 1481 | 11422 ± 1477 | 13256 ± 1165 |
| 최소 dV/dt(μl/s) | - 523 ± 105.58 | - 613 ± 102 | - 835 ± 151 | - 1103 ± 165 | - 1273 ± 177 |
| 종단 수축기 압력 (mmHg) | 70.8 ± 6.98 | 72.5 ± 7.42 | 69 ± 6.28 | 61.2 ± 17.36 | 68.2 ± 19.72 |
| 최대 전력(mmHg x μl/s) | 3009 ± 955.31 | 3541 ± 1188 | 4185 ± 1058 | 4272 ± 959 | 4918 ± 1418 |
| 확장기 매개 변수 | |||||
| EDPVR | 1 ± 0.93 | 1.23 ± 0.88 | 1.5 ± 0.86 | 1.87 ± 0.92 | 1.96 ± 0.99 |
| 타우 (ms, 와이즈방정식) | 6.14 ± 0.64 | 5.67 ± 0.44 | 4.92 ± 0.44 | 4.83 ± 0.55 | 4.96 ± 0.65 |
| 최소 dP/dt(mmHg/s) | - 7272 ± 1403 | - 8119 ± 1295 | - 8998 ± 1240 | - 8618 ± 1129 | - 8648 ± 1468 |
| 최종 확장기 압력 (mmHg) | 5.29 ± 1.01 | 5.74 ± 1.07 | 5.6 ± 1.51 | 5.37 ± 1.13 | 5.76 ± 1.15 |
| 최대 dV/dt(μl/s) | 765 ± 174 | 817 ± 178 | 972 ± 156 | 1158 ± 163 | 1264 ± 153 |
표 2. C57BL6/N 마우스에서 PVL 측정의 분석. 기저 조건 및 이소프로테레놀 주입 중 심장 기능의 PVL 매개 변수. 데이터는 18명의 남성 성인 마우스에서 표준 편차에 ± 평균으로 제시됩니다. PV: 압력 볼륨; BPM: 분당 비트; ESPVR: 종단 수축기 PV-관계의 경사, 낮은 심실 볼륨에서 부족한 계산 (2.475 및 8.25 ng/min 이소프로테레놀); EDPVR: 종말 확장기 PV-관계, 기하급수적 회귀 (알파 계수). 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 델타항공 (%) | 효과 크기 | 그룹당 샘플 크기 | ||||
| 이소프로테레놀 ng/min | 이소프로테레놀 ng/min | |||||
| 0 | 0.825 | 8.25 | 0 | 0.825 | 8.25 | |
| 심박수 | ||||||
| 10 | 2.4 | 2.6 | 3.1 | 4 | 4 | 3 |
| 15 | 3.6 | 3.9 | 4.6 | 3 | 3 | 3 |
| 20 | 4.8 | 5.3 | 6.2 | 3 | 3 | 3 |
| 25 | 6.0 | 6.6 | 7.8 | 3 | 3 | 3 |
| 30 | 7.2 | 7.9 | 9.3 | 3 | 3 | 3 |
| 스트로크 볼륨 | ||||||
| 10 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | 42 | 30 | 18 |
| 15 | 0.9 | 1.1 | 1.5 | 20 | 15 | 9 |
| 20 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 12 | 9 | 6 |
| 25 | 1.5 | 1.8 | 2.4 | 8 | 6 | 4 |
| 30 | 1.8 | 2.2 | 2.9 | 6 | 5 | 4 |
| 사전 로드 채용 가능한 스트로크 작업 | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.7 | 0.9 | 21 | 38 | 22 |
| 15 | 1.3 | 1.0 | 1.3 | 10 | 18 | 11 |
| 20 | 1.8 | 1.3 | 1.7 | 7 | 11 | 7 |
| 25 | 2.2 | 1.6 | 2.2 | 5 | 7 | 5 |
| 30 | 2.7 | 2.0 | 2.6 | 4 | 6 | 4 |
| dP/dt최대 | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.6 | 1.1 | 83 | 44 | 14 |
| 15 | 0.7 | 0.9 | 1.7 | 38 | 20 | 7 |
| 20 | 0.9 | 1.2 | 2.3 | 22 | 12 | 5 |
| 25 | 1.1 | 1.5 | 2.8 | 15 | 8 | 4 |
| 30 | 1.3 | 1.8 | 3.4 | 11 | 6 | 3 |
| 타우 | ||||||
| 10 | 1.0 | 1.1 | 0.8 | 19 | 14 | 28 |
| 15 | 1.4 | 1.7 | 1.2 | 9 | 7 | 13 |
| 20 | 1.9 | 2.2 | 1.5 | 6 | 5 | 8 |
| 25 | 2.4 | 2.8 | 1.9 | 4 | 4 | 6 |
| 30 | 2.9 | 3.4 | 2.3 | 4 | 3 | 5 |
| dP/dt분 | ||||||
| 10 | 0.5 | 0.7 | 0.6 | 60 | 31 | 47 |
| 15 | 0.8 | 1.1 | 0.9 | 27 | 15 | 22 |
| 20 | 1.0 | 1.4 | 1.2 | 16 | 9 | 13 |
| 25 | 1.3 | 1.8 | 1.5 | 11 | 6 | 9 |
| 30 | 1.6 | 2.2 | 1.8 | 8 | 5 | 7 |
| 종단 수축기 압력 볼륨 관계 | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.3 | 0.04 | >100 | >100 | >100 |
| 15 | 0.6 | 0.5 | 0.06 | 48 | 73 | >100 |
| 20 | 0.8 | 0.6 | 0.07 | 28 | 41 | >100 |
| 25 | 1.0 | 0.8 | 0.09 | 19 | 27 | >100 |
| 30 | 1.2 | 1.0 | 0.11 | 13 | 19 | >100 |
| 최종 확장기 볼륨 | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.8 | 0.9 | 20 | 27 | 20 |
| 15 | 1.4 | 1.2 | 1.4 | 10 | 13 | 10 |
| 20 | 1.8 | 1.6 | 1.8 | 6 | 8 | 6 |
| 25 | 2.3 | 2.0 | 2.3 | 5 | 6 | 5 |
| 30 | 2.8 | 2.4 | 2.8 | 4 | 5 | 4 |
표 3. C57BL6/N 수컷 마우스에서 관찰된 값을 기반으로 선택한 매개 변수에 대한 예상 효과 크기와 필요한 샘플 크기. 델타는 대조군(즉, 야생 유형)과 치료 그룹 사이의 매개 변수의 가설 차이를 묘사합니다. G*Power 19를통해 제어 데이터(평균 및 표준 편차), 알파 오차(0.05) 및 전력(0.8)을 사용하여 효과 크기와 필수 샘플 크기를 계산합니다. 굵은 값(테이블의 온라인 버전의 녹색 배경)은 isoproterenol의 각 용량에 대한 각 매개 변수에 대해 제안된 임계값 효과 크기(1≤) 및 샘플 크기를 나타냅니다. dP/dt분: 최소 dP/dt; dP/dt최대: 최대 dP/dt. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 우리는 증가하는 β-아드레너기자극하에서 마우스에서 생체 내 심장 기능을 분석하는 프로토콜을 제공한다. 절차는 유전자 변형 마우스 또는 내정간섭시 심장 기능 및 부력 예비군 (예를 들면, 이노트로피 및 크로노트로피)의 기준선 매개 변수를 모두 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 심장 기능을 결정하는 다른 수단과 비교하여 압력 볼륨 루프(PVL) 측정의 가장 두드러진 장점은 본질적이고 부하 독립적인 심장 기능의 분석입니다. 다른 모든 방법(예를 들어, MRI 및 에코카르디그래피)은 심장 기능의 부하 의존성 매개변수만 평가할 수 있으며 특히 심장 수축은 안정적으로 확인할 수 없습니다. 이를 통해 PVL 측정은 심장 기능5의심층 분석의 엔드 포인트 측정을 위한 금 표준입니다. 그러나, 앞에 명명된 방법은 심장 기능의 순차적 분석을 허용하고, 경도 관측을 위한 최전선에 그(예를 들어, 질병 진행 도중). 또한, 심혈 부피, 그리고 그 후 스트로크 부피 및 기타 유래 파라미터는,마우스(20)에서MRI에 비해 PVL 측정에서 과소평가될 수 있다.
유효한 PVL 데이터를 얻기 위하여 중요한 프로토콜 도중 4개의 중요한 단계가 있습니다: 1) 삽관, 2) 대퇴정맥 카테터의 배치, 3) 압력 전도성 카테터의 배치 및 4) periprocedural 처방. 쥐의 비침습적 삽관은 약간의 경험을 필요로하고 삽관의 시간 프레임이 좁기 때문에 이소플루란을 사용할 때 복잡하다 (20 - 40 s). 따라서, 관착 후 올바른 튜브 배치는 환기호흡기를 변경할 때 뮤린 가슴 의 움직임을 검사하여 주의 깊게 검사되어야 한다. 삽관을 위한 창을 넓히기 위하여는, 우리는 여기에서 짧은 연기 최면 etomidate의 수반되는 사용을 설명했습니다. 또한, 글로티스의 시각화를 용이하게 하기 위한 광섬유도16을사용할 수 있다. 대퇴 정맥 카테터의 적절한 배치는 나중에 단계 동안 이소 프로 테레놀의 적용에 필수적이다. 이 단계 동안, 공기 색전증은 폐 색전증을 유도하는 동물에게 심각한 해를 끼칠 수 있습니다. 대퇴카테터의 올바른 배치는 처음에 정맥 혈액의 주의 깊은 포부에 의해 검사 될 수있다. 적절한 카테터 배치가 후반 단계에서 불확실한 경우, 최종 확장기 볼륨을 검사할 수 있으며, 이는 PVL을 온라인으로 시각화할 때 사소한 볼루스에 대한 응답으로 증가해야 합니다. 대부분의 다른 조사자들과는 달리, 우리는 여기에서 대퇴정맥의 수식을 설명하는 반면, 다른 사람들은 경정맥을 중앙 정맥 접근12,21의대상 선박으로 가장 자주 사용하였다. 이 접근법은 경동맥이 준비될 때 가까운 가슴 접근법에서 와 같이 미골 신경에 가깝게 조작하지 않는 장점이 있으며, 따라서 신경을 만지거나 손상시키는 것만으로 부교감 시스템의 잠재적 자극이 피된다고 가정합니다. 심실 내에 PV 카테터를 적절히 배치하는 것은 특히 볼륨 파라미터에 관한 의미 있는 데이터를 얻는 데 매우 중요합니다. 전극이 심실 내부에 완전히 들어가지 않거나 카테터가 심실의 세로 축을 따라 제대로 배치되지 않은 경우 부피 파라미터는 매우 과소 평가됩니다. 또한, 내피와 압력 트랜스듀서 사이의 접촉은 기준선 측정6동안 용납되어서는 안 되는 최종 수축 압력 스파이크를 일으킨다. 마지막으로, 마취 깊이 및 유체 관리를 포함한 periprocedural 식이요법은 마우스에서 PVL 데이터의 신뢰성에 큰 영향을 미칩니다. 마취 언더- 또는 과다 조절은 모두 혈역학 적 매개 변수에 심각하게 영향을 미칠 수 있으며, 가장 자주 심장 기능 감소의 결과로. 주로 혈액 손실 및 증발로 인한 유체 손실은 0.9 % NaCl에 용해 된 12.5 % 알부민과 같은 적합한 솔루션의 일정한 주입으로 대응되어야합니다. 접근이 아주 침략적이다는 것을, 더 적은 중요한 것은 불충분한 고통 회피에 의해 불러일으킨 심장 혈관 기능에 영향을 극소화하기 위하여 Buprenorphine 같이 강력한 진통제의 포함입니다. 우리는 삽관 하기 전에 진통제 를 주입. 전체 시술을 시작하기 전에 주입 ~30 분, 특히 작업자가 경험하고 따라서 빠른 경우 조사 단계에서 통증을 피하는 적절한 진통 효과에 도달하기 위해 주입 ~30 분을 수행하는 것이 중요합니다. 추가적으로, 비만 모형으로 일할 때 아마 더 높은 복용량은 이 물질의 높은 지성 때문에 고려되어야 합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 또한 도부타민 또는 에피네프린과 같은 다른 카테콜라미너기식 자극에 대한 반응을 결정할 때 수정될 수 있다. 예를 들어 Calligaris와 동료에 의해 수행22 누가 도부타민 자극 동안 정맥 내 압력에서 분석을 설명.
PVL 측정의 기록 및 분석에 관해서는 고려해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 실험 데이터 집합에서 PVL 기록을 일관되게 분석하는 것이 매우 중요합니다. 기계적 환기 중에 심장 프리로드를 번갈아 가며 호흡 압력을 번갈아 가며 진화하는 호흡기 유물은 녹음 중에 인공호흡기를 끄면 피해야 합니다. 호흡기 유물을 더 제거하기 위해 이소플루란 마취 중에 자주 보이는 다이어프램의 수축을 방지하기 위해 근육 이완제 판큐로늄을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 최종 만료시 환기를 중지하고 선택된 루프를 모두 분석하는 것이 가능하며, 8-10 루프를 선택한 다음 이후에 분석되는 5-6 엔드 만료 루프를 식별하는 것을 권장하는 다른 프로토콜과는 달리23. 중요한 것은, 무호흡증의 기간은 hypercapnia 및 호흡 산증의 결과로 저환기를 피하기 위하여 짧게 유지되어야 합니다. 산소화를 개선하고 아틸라시스의 형성을 방지하기 위해, 우리는 이전에 마우스6에서PVL 측정 중에 엿볼 환기의 사용을 검사했다. 프리로드 독립 데이터 분석을 위한 루프를 선택할 때, 최종 확장기 볼륨이 감소하는 첫 번째 5-6 루프를 선택하고 압력만 감소하지만 볼륨이 일정한 루프를 포함하지 않도록 하십시오. 또한 PVL 매개 변수에 결정적으로 영향을 미치기 때문에 추가 비트를 분석에 포함해서는 안 됩니다. 놀랍게도, 가장 자주 부정맥 비트는 폐색 봉합사와 뮤린 심장 사이의 접촉으로 인해 발생합니다. 고독식염수의 주입을 통한 병렬 전도도에 대한 교정은 심장 기능의 매개 변수에 엄청난 영향을 미치며, 우리의 이해에, 실험6의끝에서 수행되어야한다. 특히 심장 기능에 미치는 영향으로 병렬 전도도에 대한 교정은 프로토콜 중에 한 번만 수행됩니다. 그러나 병렬 전도도는 부전 자극시 심실 모양의 변화로 인해 프로토콜 중에 약간 변경됩니다. 마우스의 PVL 평가를 위한 입학 시스템은 식염수 교정이 필요하지 않으며 PVL 기록 전반에 걸쳐 병렬 전도도를 동적으로 계산할 수 있는 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법의 정확성은 여전히5,8,24,25에대해 논의 중입니다.
우리는 성인 건강한 야생 형 남성 마우스 (즉, C57Bl6/N)에서이 프로토콜을 사용할 때 수축기 압력은 기준선에서 70 mmHg에서 90 mmHg의 범위와 β 아드레노 수용체 작용제 isoproteren을 최대 자극하는 동안 80 ~ 100 mmHg 사이의 범위에 있음을 관찰에서 결정했습니다. 마찬가지로, 스트로크 부피는 기준선에서 13 μL에서 20 μL 및 최대 자극 시 20 μL 및 35 μL 사이의 범위에 있는 것으로 관찰되었다. 심박수는 기준선에서 분당 약 450~520회 비트였으며 최대 자극 시 분당 650비트를 훨씬 초과할 수 있습니다. 프리로드 독립적 인 심장 수축성에 관해서는, 가장 강력한 파라미터 프리로드 모집 스트로크 작업 (PRSW)은 기준선에서 60 mmHg에서 80 mmHg 사이와 최대 자극 중에 100 mmHg와 140 mmHg 사이의 적절한 것으로 간주되었다. 기준 매개 변수가 일반적으로 얻은 것과 크게 차이가 있거나 심장 기능이 β-아드레너지 자극에 부적절하게 반응할 때 합병증(예: 관찰되지 않은 혈액 손실, 체온의 하락/상승 또는 투여량 이하의 마취)을 고려해야 합니다.
더욱이, 몇몇 유물은 마우스에 있는 PVL 측정 도중 생길 수 있습니다. 가장 일반적인 유물은 카테터 함정에서 유래하고 0 ng/min isoproterenol에서 기저 측정 전에 카테터를 다시 배치하여 쉽게 정류할 수 있는 최종 수축기 압력 스파이크(ESPS, 도 2C)입니다. ESPS가 심장 기능6의여러 매개 변수에 영향을 줄 수 있기 때문에 의미 있는 데이터를 얻기 위해 기준 조건에서 ESPS가 근절되기 전에 측정이 시작되어서는 안됩니다. 그러나, ESPS가 기준선에서 영향을 받지 않는 측정에서 변경된 심실 형태로 인해 이소프로테레놀을 가진 증분 자극 중에 발생하는 경우, 카테터 재배치가 용량 반응 프로토콜 동안 병렬 전도도를 변화시킬 것이기 때문에 이를 해결할 수 없다. 하나는 이를 면밀히 조사해야 하기 때문에, 마찬가지로 기준선에서 이러한 ESPS는 최대압력(13,26)을크게 증가시킬 뿐만 아니라 감소된 볼륨 검출6을통해 심장 기능의 매개 변수를 현저하게 변화시키는 것으로 나타났다.
기준 조건 하에서 PVL 측정에 의해 얻어진 혈역학 파라미터에 대한 대표적인 값과 마우스내 이소프로테레놀을 이용한 증분 자극 중 마우스내 다른 방법론적 접근법과 다른 마우스균주(27,28)에따라 크게 다릅니다. 그 이상으로, 하나는 유전으로 변경된 마우스의 표현형이 또한 명백한 유전 배경으로 제한될 수 있다는 것을 알고 있어야 합니다. 방법론적으로, 마우스에서 압력 부피 분석을 수행하는 두 가지 가장 중요한 접근 방식이 있습니다. 각 방법은 (dis) 장점을 가지고 있으며, 선택의 방법은 종종 실험실과 그 조사자의 경험에 따라 달라집니다. 우리는 여기에 카테터가 정점에 구멍을 통해 배치되는 오픈 가슴 절차에 초점을 맞춥니다. 이 접근법은 마우스에서 심장 기능의 의미 있는 데이터의 기록을 위한 필수적인 예측인 정확한 카테터 포지셔닝을 허용하는 비전의 카테터 배치의 발전이 있습니다. 이는 마이크로리터 범위에서 볼륨 매개 변수를 기록하는 데 특히 해당됩니다. 대조적으로, 이 접근의 중요한 양상은 폐와 감석 형성및 체액의 더 높은 손실의 결과로 생리적인 흉부 내 압력의 손실입니다. 그러나, 양수 종기 기만압력(PEEP) 환기를 이용하여, 마우스6에서열린 가슴 PVL 동안 폐 손상을 중화시키는 것이 입증된 전략을 소개한다. 두 번째 실험 적인 방법은 경동맥을 통해 카테터를 삽입한 다음 대동맥 판막을 통해 역행하는 것입니다. 이 기술을 사용하여, 기계적 환기가 여전히 필요하지만, 내 흉내 압력은 오히려 정상 개최 할 수 있습니다, 이는이 장점을 약화. 또한, 폐쇄 가슴 접근 방식은 정확한 카테터 위치에 대한 조사자 가능성을 제한합니다. 더욱이, 마우스에 사용되는 PV 카테터는 1에서 1.4 프랑스어(0.33mm ~ 0.47mm)에 이르는 직경을 가지며, 이는 폐쇄된 흉부 접근법을 사용할 때 뮤린 유출로의 현저한 방해를 의미하며, 성인 마우스의 대타는 일반적으로 0.8mm에서 1.2mm29,30사이의 직경을 갖는다. 심부전 모델에서 PVL의 사용에 관해서는, 개방 가슴 접근은 수축이 지명 동맥과 왼쪽 경동맥 사이에 있는 횡방향 대동맥 수축 모형을 위해 특히 중요합니다. 여기서 카테터는 경동맥을 통해 배치할 수 없습니다. 한편, 폐쇄형 흉부 접근법은 근심경색의 유도 후와 같이 확장된 심실의 뮤린 모델을 조사하는 연구자들에게 관심이 있으며, 정점의 펑크는 실현 가능하지 않다.
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Disclosures
이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.
Acknowledgments
우리는 마누엘라 리잘, 한스-피터 겐셰이머, 크리스틴 리히터, 그리고 하이델베르크 대학의 인터파쿨테르 바이오메디치니슈 포르충세인리치(IBF) 팀에 감사드립니다.
이 작품은 DZHK (독일 심장 혈관 연구 센터), BMBF (독일 교육 및 연구부), 바덴 뷔르템베르크 연방 국가 혁신 재단 및 도이치 포르스충스게마인샤프트 (DFG, 독일 연구 재단) 프로젝트 ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 및 공동 연구 센터 (SFB) 118에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
References
- Bacmeister, L., et al. Inflammation and fibrosis in murine models of heart failure. Basic Research in Cardiology. 114 (3), 19 (2019).
- Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Reviews Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovascular Research. 39 (1), 60-76 (1998).
- Lefkowitz, R. J., Rockman, H. A., Koch, W. J. Catecholamines, cardiac beta-adrenergic receptors, and heart failure. Circulation. 101 (14), 1634-1637 (2000).
- Cingolani, O. H. K. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 2198-2206 (2011).
- Bacmeister, L., et al. Assessment of PEEP-Ventilation and the Time Point of Parallel-Conductance Determination for Pressure-Volume Analysis Under beta-Adrenergic Stimulation in Mice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 36 (2019).
- Segin, S., et al. Cardiomyocyte-Specific Deletion of Orai1 Reveals Its Protective Role in Angiotensin-II-Induced Pathological Cardiac Remodeling. Cells. 9 (5), (2020).
- Clark, J. E., Marber, M. S. Advancements in pressure-volume catheter technology - stress remodelling after infarction. Experimental Physiology. 98 (3), 614-621 (2013).
- Glower, D. D., et al. Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work. Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).
- Winter, E. M., et al. Left ventricular function in the post-infarct failing mouse heart by magnetic resonance imaging and conductance catheter: a comparative analysis. Acta Physiologica. 194 (2), 111-122 (2008).
- Krenz, M. Conductance, admittance, and hypertonic saline: should we take ventricular volume measurements with a grain of salt. Journal of Applied Physiology. 107 (6), 1683-1684 (2009).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Wei, A. E., Maslov, M. Y., Pezone, M. J., Edelman, E. R., Lovich, M. A. Use of pressure-volume conductance catheters in real-time cardiovascular experimentation. Heart, Lung and Circulation. 23 (11), 1059-1069 (2014).
- van Hout, G. P., et al. Admittance-based Pressure-Volume Loops versus gold standard cardiac magnetic resonance imaging in a porcine model of myocardial infarction. Physiological Reports. 2 (4), 00287 (2014).
- Wei, C. L., Shih, M. H. Calibration Capacity of the Conductance-to-Volume Conversion Equations for the Mouse Conductance Catheter Measurement System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1627-1634 (2009).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Weiss, J. L., Frederiksen, J. W., Weisfeldt, M. L. Hemodynamic determinants of the time-course of fall in canine left ventricular pressure. Journal of Clinical Investigation. 58 (3), 751-760 (1976).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavioral Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Jacoby, C., et al. Direct comparison of magnetic resonance imaging and conductance microcatheter in the evaluation of left ventricular function in mice. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 87-95 (2006).
- Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 443-450 (2000).
- Calligaris, S. D., Ricca, M., Conget, P. Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50050 (2013).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942 (2015).
- Pearce, J. A., Porterfield, J. E., Larson, E. R., Valvano, J. W., Feldman, M. D. Accuracy considerations in catheter based estimation of left ventricular volume. Conference proceedings - IEEE engineering in medicine and biology society. 2010, 3556-3558 (2010).
- Nielsen, J. M., et al. Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 534-540 (2007).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiological Genomics. 42 (2), 103-113 (2010).
- Oosterlinck, W., Vanderper, A., Flameng, W., Herijgers, P. Glucose tolerance and left ventricular pressure-volume relationships in frequently used mouse strains. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 281312 (2011).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (5), 1829-1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
