Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

תגובת לב לגירוי β-אדנרגיות שנקבע על ידי ניתוח לולאת נפח לחץ

Published: May 19, 2021 doi: 10.3791/62057
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, *1,2,4, 1,2, 1,2
1Pharmakologisches Institut, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), partner site Heidelberg/Mannheim, 3Department of Internal Medicine III, University of Heidelberg, 4Department of Anesthesiology, University Hospital RWTH Aachen
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מתארים ניתוח לולאת לחץ לב תחת מינונים הולכים וגדלים של איזופרוטרנול תוך ורידי כדי לקבוע את תפקוד הלב המהותי ואת המילואים β-adrenergic בעכברים. אנו משתמשים בגישה שונה של חזה פתוח למדידות לולאת נפח הלחץ, שבה אנו כוללים אוורור עם לחץ חיובי של תפוגת קצה.

Abstract

קביעת תפקוד הלב היא ניתוח נקודת קצה חזק במודלים של בעלי חיים של מחלות לב וכלי דם על מנת לאפיין השפעות של טיפולים ספציפיים על הלב. בשל היתכנות של מניפולציות גנטיות העכבר הפך למודל החייתי היונקים הנפוץ ביותר לחקר תפקוד הלב ולחיפוש אחר מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לקבוע את תפקוד הלב ב vivo באמצעות מדידות לולאה נפח לחץ וניתוח במהלך מצבים בסיסיים ותחת גירוי β-adrenergic על ידי עירוי תוך ורידי של הגדלת ריכוזים של isoproterenol. אנו מספקים פרוטוקול מעודן כולל תמיכה באוורור תוך התחשבות בלחץ חיובי של תפוגת קצה כדי לשפר השפעות שליליות במהלך מדידות חזה פתוח, ומשככי כאבים חזקים (Buprenorphine) כדי למנוע מתח שריר הלב בלתי נשלט מעורר על ידי כאב במהלך ההליך. כל זאת יחד התיאור המפורט של ההליך והדיון על מלכודות אפשריות מאפשר ניתוח לולאת נפח לחץ סטנדרטי מאוד וניתן לשחזור, ומפחית את הדרת בעלי החיים מהחבורה הניסיונית על ידי מניעת הטיה מתודולוגית אפשרית.

Introduction

מחלות לב וכלי דם משפיעות בדרך כלל על תפקוד הלב. בעיה זו מצביעה על החשיבות בהערכת תפקוד הלב המפורט של vivo במודלים של מחלות בעלי חיים. ניסויים בבעלי חיים מוקפים במסגרת של שלושת העקרונות המנחים של Rs (3Rs) (צמצום/מקד/החלפה). במקרה של הבנת פתולוגיות מורכבות המערבות תגובות מערכתיות (כלומר, מחלות לב וכלי דם) ברמה ההתפתחותית הנוכחית, האפשרות העיקרית היא לחדד את השיטות הזמינות. זיקוק יוביל גם לירידה במספרי בעלי החיים הנדרשים בשל פחות שונות, מה שמשפר את כוח הניתוח והמסקנות. בנוסף, שילוב של מדידות התכווצות לב עם מודלים בעלי חיים של מחלות לב כולל אלה המושרה על ידי גירוי נוירוהומורלי או על ידי עומס יתר בלחץ כמו פסים בתחום העורקים, אשר מחקה למשל קטכולאמין שונה / β-adrenergic רמות1,2,3,4, מספק שיטה חזקה למחקרים פרה קליניים. אם ניקח בחשבון כי השיטה מבוססת צנתר נשאר הגישה הנפוצה ביותר להערכה מעמיקה של התכווצות הלב5, אנו שואפים להציג כאן מדידה מעודנת של תפקוד הלב in vivo בעכברים על ידי לולאת נפח לחץ (PVL) מדידות במהלך גירוי β-adrenergic המבוסס על ניסיון קודם כולל הערכה של פרמטרים ספציפיים של גישה זו6, 7.

כדי לקבוע גישות פרמטרים המודינמיים לב הכוללים הדמיה או טכניקות מבוססות צנתר זמינים. שתי האפשרויות מלוות ביתרונות וחסרונות שיש לשקול בזהירות לשאלה המדעית המתאימה. גישות ההדמיה כוללות אקוקרדיוגרפיה והדמיה תהודה מגנטית (MRI); שניהם שימשו בהצלחה בעכברים. מדידות אקוקרדיוגרפיות כרוכות בעלויות ראשוניות גבוהות מבדיקה במהירות גבוהה הנדרשת לקצב הלב הגבוה של העכברים; זוהי גישה פשוטה יחסית לא פולשנית, אך היא משתנה בקרב מפעילים אשר באופן אידיאלי צריך להיות מנוסה זיהוי והדמיה של מבני לב. בנוסף, לא ניתן לבצע מדידות לחץ ישירות וחישובים מתקבלים משילוב של סדרי גודל ומדידות זרימה. מצד שני, יש לו את היתרון כי מספר מדידות ניתן לבצע על אותה חיה ותפקוד הלב ניתן לפקח למשל במהלך התקדמות המחלה. לגבי מדידת הנפח, ה- MRI הוא הליך תקן הזהב, אך בדומה לאקוקרדיוגרפיה, אין מדידות לחץ ישירות אפשריות וניתן להשיג רק פרמטרים תלויים בטעינה מראש8. גורמים מגבילים הם גם הזמינות, מאמץ הניתוח ועלויות התפעול. כאן שיטות מבוססות קטטר למדידת תפקוד הלב הן חלופה טובה המאפשרת בנוסף ניטור ישיר של לחץ תוך-לבבי וקביעת פרמטרים של התכווצות בלתי תלויה בעומס כמו עבודת שבץ גיוס מראש (PRSW)9. עם זאת, נפחי חדרית הנמדדים על ידי קטטר מוליכות לחץ (באמצעות קביעת מוליכות) קטנים יותר מאלה של ה- MRI אך הבדלי קבוצות נשמרים באותו טווח10. כדי לקבוע ערכי נפח אמינים, הכיול המתאים נדרש, שהוא צעד קריטי במהלך מדידות PVL. הוא משלב מדידות ex vivo של מוליכות דם ב cuvettes מכויל נפח (המרה של מוליכות לנפח) עם ניתוח in vivo עבור מוליכות מקבילה של שריר הלב במהלך הזרקת בולוס של תמיסת מלחהיפרטונית 11,12. מעבר לכך, מיקום הקטטר בתוך החדר והכיוון הנכון של האלקטרודות לאורך ציר האורך של החדר הם קריטיים ליכולת הזיהוי של השדה החשמלי שמסביב המיוצר על ידיהם. עדיין עם גודל מופחת של לב העכבר ניתן להימנע חפצים המיוצרים על ידי שינויים בכיוון תוך חדרי של הקטטר, אפילו בחדרים המורחבים5,10, אבל חפצים יכולים להתפתח תחת גירוי β-adrenergic6,13. בנוסף לשיטות ההולכה נראה כי פיתוח השיטה מבוססת האשפוז נמנעה מכללי הכיול, אך כאן ערכי הנפח מוערכים יתר עלהמידה 14,15.

מאז העכבר הוא אחד המודלים הקדם קליניים החשובים ביותר במחקר לב וכלי דם ואת β-עתודה אדנרגיית של הלב הוא עניין מרכזי בפיזיולוגיה לב ופתולוגיה, אנו מציגים כאן פרוטוקול מעודן כדי לקבוע בתפקוד הלב vivo בעכברים על ידי מדידות PVL במהלך גירוי β-adrenergic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו ובוצעו על פי תקנות המועצה האזורית קרלסרוהה ואוניברסיטת היידלברג (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) בהתאם להנחיות הנחיה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. הנתונים המוצגים בפרוטוקול זה נגזרים מעכברים זכרים מסוג C57Bl6/N (17 ± גיל שבוע וחצי). עכברים נשמרו בתנאים מוגדרים ללא פתוגן במתקן בעלי החיים (IBF) של הפקולטה לרפואה היידלברג. עכברים שוכנו במחזור של 12 שעות של אור-חושך, עם לחות יחסית בין 56-60%, שינוי אוויר של פי 15 לשעה וטמפרטורת החדר של 22 מעלות צלזיוס +/- 2 מעלות צלזיוס. הם הוחזקו בכלובים קונבנציונליים מסוג II או סוג II שסופקו זמן רב עם מצעים לבעלי חיים וניירות טישו כהעשרה. מזון אוטומטי סטנדרטי ומים אוטומטיים היו זמינים לצריכת ליביטום מודע.

1. הכנת מכשירים ופתרונות תרופתיים

  1. צנתר ורידים מרכזי: חותכים את צינור המיקרו (קוטר חיצוני 0.6 מ"מ) לצינורות צנתר באורך 20 ס"מ. השתמש במלקחיים כדי למשוך קצה אחד של הצינור על קצה צינורית 23-מד. חותכים את הקצה השני של הצינורות באלכסון כדי ליצור קצה חד שיכול לנקב את וריד הירך.
  2. צינור אנדוטראצ'אל: עבור צינור צנרור לחתוך 20-מד venipuncture-צינורית 3 ס"מ אורך כדי להסיר את מצורף מזרק.
    1. אם צינור הצנרור אינו מתאים לחיבור מכונת ההנשמה בצורה מושלמת, לעטוף parafilm מעל קצה הצינור שבו מכשיר האוורור מחובר. החיבור חייב להיות יציב ואטום על ידי העיבוי (איור 1A). לקצר את סיכת מדריך המתכת של 20-מד venipuncture-צינורית ל 2.7 ס"מ ולהשתמש בו כסיוע צנרור. גישות מעודנות לצנרור כולל סיבי אור כדי להקל על הדמיה של קנה הנשימה מתוארים גם הם היטב, למשל על ידי Das ומשתפי פעולה16.
  3. תערובת הרדמה המשמשת אינטובציה: לערבב 200 μL של הפרין (1000 IU / mL) עם 50 μL של 0.9% NaCl ו 750 μL של 2 מ"ג / מ"ל אטומידאט ממוצר מבוסס תחליב שמן במים. השתמש 7 μL / g משקל גוף (BW) עבור כל עכבר (0.1 מ"ג / קילוגרם BW Buprenorphine 10 מ"ג / קילוגרם BW אטומידאט).
  4. מרפה שרירים: להמיס 100 מ"ג של Pancuronium-ברומיד ב 100 מ"ל של 0.9% NaCl. השתמש 1.0 μL / g משקל גוף (1 מ"ג / קילוגרם BW) עבור כל עכבר.
  5. פתרונות איזופרוטרנול: להמיס 100 מ"ג איזופרוטרנול ב 100 מ"ל של 0.9% NaCl (1 מיקרוגרם / μL). הכן את הדילולים הבאים(טבלה 1)והעבר כל אחד במזרק של 1 מ"ל.
    1. כדי להשיג דילול 1, לדלל את המניה 1:1.8. כדי להשיג דילול 2, לדלל את המניה 1:6. כדי להשיג דילול 3, לדלל את הדילול 1 לתוך 1:10. לבסוף, להשיג דילול 4 על ידי דילול 1:10 של דילול 2.
  6. 15% NaCl היפרטוני (w/v): להמיס 1.5 גרם של 0.9% NaCl ב 10 מ"ל של כפול מזוקק H2O. לסנן את הפתרון עם מסנן מזרק נקבוביות 0.45 מיקרומטר.
  7. הכנת 12.5% פתרון אלבומין (w/v): להמיס 1.25 גרם של אלבומין סרום בקר ב 10 מ"ל של 0.9% NaCl. לדגור על הפתרון ב 37 °C (55 °F) במשך 30 דקות. מצננים לטמפרטורת החדר ומסננים את הפתרון עם מסנן מזרק נקבוביות בגודל 0.45 מיקרומטר.
  8. הכנת ההתקנה: ראשית להפעיל את צלחת חימום ולהגדיר אותו 39-40 °C (50 °F). מניחים מזרק מלא מלוח על כרית החימום ומעבירים את צנתר לולאת נפח הלחץ (PVL) למזרק. יש להקדים את הצנתר למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש לייצוב. ההתקנה בה אנו משתמשים מורכבת מקטטר מוליכות לחץ של 1.4-F, יחידת בקרה והתוכנה המתאימה, והיא מתוארת גרפית באיור 1B והפניות לספק מפורטות בטבלת החומרים.

2. הרדמה

  1. הזריקו בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג ב.ו. תוך-תאי) 30 דקות לפני צנרור.
  2. מניחים את העכבר לתוך תא זכוכית אקרילי רווי מראש עם 2.5% איזופלוראן והתחמם מראש עם כרית חימום להציב על בסיס התא.
  3. ברגע שהעכבר ישן (חוסר רפלקס), הזריקו את התערובת ההרדמה (7 מ"ל/ק"ג BW) המכילה 10 מ"ג/ק"ג אטומידאט והפרין (1,200 יב"ל/ק"ג BW) תוך-אפיטרונלית.

3. אוורור

  1. העבירו את החיה לפלטפורמת הצנרור (איור 1C) 3-4 דקות לאחר הזרקת ההרדמה. העכבר תלוי מהשיניים עם תצוגת הגופרית הפונה למפעיל.
  2. הרימו בעדינות את הלשון במלקחיים. כדי לזהות את הגלוטי, הרם מעט את הלסת התחתונה של העכבר עם מלקחיים שניים.
  3. הכניסו בזהירות את צינור האנדוטרכאל(איור 1A)לתוך קנה הנשימה והסירו את מוט המדריך.
  4. מעבירים את החיה על צלחת החימום, מניחים אותה על הגב ומחברים את צינור הצינור לנשימה של בעלי החיים הקטנים.
  5. התאם את קצב הנשימה ל-53.5 x (משקל גוף בגרמים)-0.26 [דקה -1],כפי שתואר על ידי אחרים12, ונפחי גאות ושפל לשיא לחצים מעוררי השראה של 11 ± 1 ס"מ2O. להקים PEEP של 2 ס"מH2O.
  6. לתקן בזהירות את הגפיים של העכבר על צלחת החימום עם רצועות דבק ולהחיל משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע יובש.
  7. הכנס בדיקה טמפרטורה רקטלית ולשמור על טמפרטורת הגוף הליבה ב 37 ± 0.2 °C (50 °F).
  8. התקן אק"ג בעל קצה חוט אחד ונטר את קצב הלב באופן מקוון כאינדיקטור לעומק ויציבות הרדמה.
  9. בהיעדר רפלקסים בין-גיטריים, הזריקו 1 מ"ג/ק"ג BW של פנקורניום-ברומיד מרפה השרירים תוך-איפריטונית. פעולה זו מונעת ממצאים נשימתיים במהלך מדידות PVL.

4. ניתוח

  1. המלצות כלליות
    1. במהלך הניתוח, לאוורר עם ~ 1.5-2% איזופלוראן התאדה עם O2. ריכוז איזופלוראן יכול להיות תלוי גם במשתנים כמו זן העכבר, מין, גיל ומשקל של בעלי החיים, אבל זה צריך להיות נקבע באופן אינדיבידואלי וניסוי והערכים כאן הם התייחסות לזן העכבר C57BL6 / N. חשוב לציין, מכונת ההנשמה מחוברת למערכת מיצוי כדי למנוע מהמפעיל לשאוף איזופלוראן.
    2. השתמש בהגדלה בין 1.5-4x ממיקרוסקופ הסטריאו להליכים כירורגיים.
      הערה: עיין בהדרכה מוסדית/מקומית על הכנת החיה לניתוחים שאינם הישרדותיים.
  2. קנוניציה של הירך
    1. לשטוף את האחורי עם 70% אתנול, incise את האזור מפשעתי שמאל ולחשוף את וריד הירך השמאלי.
    2. פיצוץ העורק האפיגסטרי והווריד עם צריבה.
    3. ליגט את וריד הירך עם תיל הניח דיסטל לגישה קטטר.
    4. מעבירים תפר מתחת לווריד הירך ומכינים קשר גולגולתי של אתר ניקוב. לנקב את וריד הירך עם צינור מיקרו מוכן (ראה שלב 1.1) מחובר מזרק 1 מ"ל.
    5. לקשור את הקשר כדי לתקן את הצינור בתוך הכלי.
    6. נטרל אובדן נוזלים על ידי עירוי של 0.9% NaCl בתוספת 12.5% אלבומין בקצב עירוי של 15 μL / min עם משאבת מזרק אוטומטית. בנוסף, לשמור על רקמות חשופות לחות באמצעות 0.9% NaCl מחומם מראש.
  3. בית החזה
    1. לשטוף את בית החזה עם 70% אתנול.
    2. יש להסית את העור ממש מתחת לתהליך הקסיפוד ולהפריד בבוטות את שרירי החזה מקיר החזה עם מלקחיים או כרוכי.
    3. הרם את תהליך xyphoid עם מלקחיים, ולאחר מכן לחתוך דרך קיר החזה נע לרוחב משני הצדדים עם cautery עד הסרעפת גלויה לחלוטין מלמטה.
    4. תעוררו את הסרעפת מלמטה ותחשפו את פסגת הלב. ואז בזהירות להסיר את קרום הלב עם מלקחיים.
    5. בצע costotomy מוגבל בצד שמאל כפי שתואר בעבר6.
    6. להעביר תפר מתחת לווריד הפרשים הנחות כדי לבצע הפחתת עומס מראש בשלבים מאוחרים יותר.
    7. לנקב בעדינות את פסגת הלב עם צינורית 25-מד (מקסימום 4 מ"מ). הסר את הצינורית ולהכניס את צנתר PV עד כל האלקטרודות נמצאות בתוך החדר.
    8. התאם את מיקום הקטטר על ידי תנועות עדינות ופניות עד לקבלת לולאות בצורת מלבן (איור 2A).
    9. שמור תמיד את כל הרקמות חשופות לחות באמצעות 0.9% NaCl מחומם מראש.

5. מדידות

  1. המלצות כלליות
    1. במהלך המדידות, לאוורר עם ~ 1.5-2% איזופלוראן התאדה עם 100% O2.
    2. בצע 2 מדידות בסיסיות, כמו גם 2 אסימות vena cava על כל שלב של פרוטוקול תגובת המינון.
      הערה: חשוב שלאחר החסימה הראשונה והשנייה של הוועד הוועד, ערכי הלחץ והנפח יחזרו לערכי מצב יציב כמו לפני החסימה הראשונה. תצפית זו נחוצה על מנת לזהות שינוי במצב הקטטר עקב הפחתות סדרתיות בנפח תוך חדריקולרי. אם שינוי בתנוחת הצנתר יהיה המקרה, במיוחד ערכי נפח יוסטו.
  2. בצע ניתוח מקוון של פרמטרים (קצב לב, נפח שבץ, dP / dtמקסימום) ולחכות עד תפקוד לב יציב-מצב מתקבל. עבור טווח הפרמטרים הצפוי עם ההגדרה כאן בשימוש בעכברים C57Bl6/N אנא עיין בתוצאות שפורסמו6.
  3. עצור את מכונת ההנשמה במצב תפוגה קצה ולרשום פרמטרים בסיסיים. לאחר 3 עד 5 שניות להפחית preload הלב על ידי הרמת התפר מתחת לווריד הפרשים הנחותים עם מלקחיים כדי להשיג מראש פרמטרים עצמאיים (איור 2B). תדליק את מכונת ההנשמה. המתן לפחות 30 שניות לחסימה השנייה עד שהפרמטרים המודינמיים יתייצבו.
  4. לאחר קבלת המדידות בתנאים בסיסיים להמשיך את המינון-תגובה של isoproterenol על ידי מעבר מזרקים מוכנים. כאן שיעור העירוי נשאר ללא שינוי על מנת למנוע שינויים של preload הלב. יש להקפיד לא להחדיר בועות אוויר בעת החלפת המזרק.
    1. המתן לפחות 2 דקות עד שתתקבל פונקציית לב חדשה במצב יציב מאשר שוב לעצור את מכונת ההנשמה במצב תפוגה הסופי ולרשום פרמטרים בסיסיים. לאחר 3 עד 5 שניות להפחית preload הלב על ידי הרמת התפר מתחת לווריד הפרשים הנחותים על מנת להשיג פרמטרים עצמאיים preload.
    2. המתן לפחות 30 שניות לחסימת החסם השני. לאחר מכן מעבר למזרק המוכן עם ריכוז isoproterenol הבא ולחזור על ההקלטות של פרמטרים בסיסיים לטעון מראש עצמאי.
      הערה: חפצים כמו ספייק הלחץ הסיסטולי הסופי (ESPS, איור 2C)יכולים להתרחש במהלך העלייה במינון של איזופרוטרנול, הנובע מלכוד קטטר. חפצים המתרחשים לפני תחילת הפרמטרים הבזליים ניתן לתקן בקלות באמצעות מיקום מחדש של הקטטר.

6. כיול

הערה: הליכי הכיול עשויים להשתנות בהתאם למערכת PVL המשמשת.

  1. כיול מוליכות מקבילית
    1. חבר מזרק המכיל תמיסת NaCl של 15% לסלסול הירך לאחר המדידה האחרונה מתגובת המינון של איזופרוטרנול. בזהירות להחדיר 5 μL של הפתרון ההיפרטוני שנותר בצינור עד PVL לזוז מעט ימינה במהלך הדמיה באינטרנט. אז חכה עד שהלולאות יחזרו למצב יציב.
    2. עצור את מכונת ההנשמה בסיום תפוגה ולהזריק בולוס אחד של 10 μL של 15% NaCl בתוך 2 עד 3 שניות. בדוק אם PVL מתרחב במידה רבה ומוזז ימינה במהלך תצוגה חזותית מקוון.
  2. כיול מוליכות לנפח
    1. המתן 5 דקות, לא פחות, כך בולוס מלוחים היפרטוני מדולל לחלוטין. לאחר מכן להסיר את הקטטר ולשאוב לפחות 600 דם μL מן החדר השמאלי של הלב הפועם באמצעות מזרק 1 מ"ל ו צינורית 21-מד. בשלב זה החיה מורדמת תחת הרדמה עמוקה ומעשי שךך על ידי דימום מסיבי, על ידי עצירת האוורור והסרת הלב.
    2. העבר את הדם לתוך cuvette כיול מראש (באמבט מים ב 37 °C (37 °F) כיול עם צילינדרים של נפח ידוע. מניחים את צנתר PV במרכז בכל גליל ומקליטים את המוליך. על ידי חישוב עקומה סטנדרטית עבור כל בעל חיים, ניתן להמיר את יחידות המוליכות לערכי נפח מוחלטים.

7. ניתוח

  1. לאחר מדידות PVL מוצלחות בתנאים בסיסיים וגירוי איזופרוטרנול, לדמיין, להפוך, דיגיטציה, לחשב ולחלץ פרמטרים המאפיינים את תפקוד הלב (כמו PRSW, dP / dt, לחץ ונפח סופ-דיאסטולי, לחץ ונפח סיסטולי קצה, טאו קבוע הרפיה, בין היתר) באמצעות תוכנת ניתוח PVL מתאימה. ניתוח סטטיסטי נוסף וייצוגים גרפיים יכולים להתבצע באמצעות תוכנת ניתוח סטנדרטית.
  2. ניתוח פרמטרים בלתי תלויים בטעינה מראש
    הערה: בשלב זה חיוני לתקנן את ההליך.
    1. בחר את 5-6 PVLs הראשונים המציגים הפחתת עומס מראש לאורך כל המדידות לניתוח של פרמטרים בלתי תלויים בטעינה מראש (איור 2D). מספר קבוע של PVLs שנבחרו לניתוח במהלך הפחתת עומס מראש יקטין את השונות בין המדידות של הפרמטרים שהושגו.
    2. חשב את הערך הממוצע של שתי המידות בכל שלב בפרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדידת לולאת נפח הלחץ (PVL) היא כלי רב עוצמה לנתח פרמקודינמיקה לבבית של תרופות ולחקור את פנוטיפ הלב של מודלים עכבר מהונדס גנטית בתנאים נורמליים ופתולוגיים. הפרוטוקול מאפשר הערכה של רזרבה β-אדנרגיות לב במודל העכבר למבוגרים. כאן אנו מתארים שיטת חזה פתוח תחת הרדמה איזופלורנית בשילוב עם buprenorphine (כאבים) ופנקורוניום (מרפה שרירים), המתמקדת בתגובת הלב לגירוי β-אדנרגני על ידי הטמעת ריכוזי איזופרוטרנול באמצעות צנתר וריד הירך. חלק מהנתונים הייצוגיים המוצגים בפרוטוקול זה נגזרים מעכברים זכרים מסוג פראי C57Bl6/N(איור 3 וטבלה 2). כאינדיקטור לשונות של כמה פרמטרים חשובים שנמדדו על ידי ניתוח PVL שלנו ביצענו ניתוח צריכת חשמל (α הסתברות שגיאה של 0.05 וכוח של 0.8) באמצעות התוצאות מקבוצת WT ותוכנת G * Power הזמינה בחינם17. בטבלה 3 גדלי האפקט המחושב וגדלי המדגם הנדרשים עבור קצב לב, PRSW, נפח קו, קבוע הרפיה טאו, dP / dtמקסימום ו dP / dtדקות בהנחה שינויים בין 10% ל 30% עבור כל פרמטר תחת 0, 0.825 ו 8.25 ng / min isoproterenol מתוארים.

ניתוח גרפי של יחסי לחץ-נפח נעשה על ידי התוויית נפח (μL) על Y- ולחץ (mmHg) על ציר X. אם הצנתר ממוקם כראוי בתוך החדר, מחזור לב מלא מיוצג על ידי PVL בצורת מלבן (איור 2A ואיור 3A). זמן קצר, systole מתחיל עם שלב של התכווצות איזובולומטרית (מאופיין dP / dtמקסימום), שבמהלכו שני שסתומי הלב סגורים (קצה אנכי ימני). כאשר לחץ חדרי עולה על לחץ אבי העורקים, שסתום אבי העורקים נפתח ודם נשאב לתוך אבי העורקים במהלך שלב הפליטה (אופקי עליון). לאחר מכן, כאשר הלחץ אבי העורקים עולה על לחץ חדרי, שסתום אבי העורקים נסגר דיאסטולה מתחיל. במהלך הרפיה איזובולומטרית (המאופיינת בפרמטרים dP / dtmin ו טאו) לחץ החדר יורד עד לחץ האיזדורים עולה על הלחץ החדרי ואת שסתום מיטרלי נפתח (קצה אנכי שמאל). עכשיו מילוי דיאסטולי פסיבי, המאופיין ביחסי לחץ-נפח לחץ-נפח סופ-דיאסטוליים (EDPVR), מתרחש עד תחילת מחזור הלב הבא (האופק התחתון) (איור 2A-B).

ניתוח PVL מספק תובנות מפורטות על תפקוד הלב שכן הוא מסוגל לקבוע תפקוד לב עצמאי מן העומס הלב. לכן, זה תוארה כסטנדרט הזהב לקביעת תפקוד הלב במערך ניסיוני5. בפרוטוקול המתואר באמצעות עכברי C57Bl6/N, הערכנו את התגובה לאיזופרוטרנול המיוצר בפרמטרים כלליים של תפקוד הלב כגון קצב לב, תפוקת לב, נפח שבץ ועבודת שבץ. השפעה משמעותית של איזופרוטרנול על כל פרמטר נצפתה בתגובת המינון בריכוזים איזופרוטרנול שונים (איור 3B). פרמטרים של התכווצות לב כמו PRSW ו- dP/dtmax הראו את העלייה הצפויה במינון-תגובה תחת עירוי איזופרוטרנול (איור 3A-B). מצד שני, ירידה בפרמטרים דיאסטוליים (קבוע של הרפיה טאו ו dP / dtדקות) עם ריכוזי איזופרוטרנול גובר נרשמו (איור 3C) כצפוי אפקט lusitropic חיובי המיוצר על ידי catecholamines בלב הבריא. פרמטרים נוספים מאלה המוצגים באיור 3 (כלומר, לחץ ונפח סיסטוליים, לחץ ונפח סופ-דיאסטולי, לחץ מקסימלי, בין היתר) מתקבלים גם מניתוח PVL וניתן לנתח אותם גם בהתאם לשאלה המדעית, למודל הגנטי או למחלה ולתצפיות שהושגו. ערכים נוספים ומפורטים עבור הפרמטרים הנפוצים ביותר של תפקוד הלב ב PVL על כל צעד במהלך גירוי מצטבר β-adrenergic, כולל נקודת הזמן של כיול עבור מוליכות מקבילה עם תמיסת מלח היפרטונית אשר משפיע מאוד על הפרמטרים נפח הלב, אבל גם inotropy לב והרפיה, דווחו בעבר1,6.

Figure 1

איור 1. הרדמה ונפח לחץ הגדרת לולאה. (A) venipuncture-צינורית 20-מד מותאם עבור צנרור עכבר. (B) דיאגרמה המציגה את הארגון והחיבור של הרכיבים השונים של הגדרת מדידת נפח הלחץ המשמשת, כולל כיוון הזרימה של הגז ההרדמה. (ג) פלטפורמת צנרר המשמשת לתליית העכברים עבור צנרוב מהיר ובטוח. ברגים (i) בשני הצדדים בסוף החוט התלוי (ii) כלולים כדי להדק את האיום בהתאם למשקל העכבר. החץ מציין אפשרות חיבור לחשיפה איזופלוריין. טמפ:: טמפרטורה; אק"ג: אלקטרוקרדיוגרמה; הפקתמזערית : לחץ תפוגה מינימלי; הפקת MaxP: לחץ תפוגה מקסימלי; PV: נפח לחץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2

איור 2. ניתוח נפח לחץ מייצג. (א) הקלטות נפח לחץ למופת שבהן מוצגים פרמטרים שנותחו במהלך מדידת בזאלי ואירועים עיקריים במהלך מחזור הלב מתוארים. (ב) פרמטרים ESPVR, EDPVR ו- PRSW מתוארים במהלך הפחתת עומס מראש. (C) קוצי לחץ סיסטוליים במהלך מדידות בזאליות (פאנל עליון) או במהלך תמרון החסימה (פאנל תחתון) שניהם תחת גירוי איזופרוטרנול מוצגים. LV: חדר שמאלי; dP/dtmin: Minimum dP/dt; dP/dtmax: Maximum dP/dt; Ves: אמצעי אחסון סיסטולי קצה; Ved: נפח דיאסטולי קצה; ESPVR: קשרי לחץ-נפח-לחץ סיסטוליים; PRSW: עומס מראש עבודת שבץ גיוס; EDPVR: קשר לחץ-נפח לחץ-נפח סוף-דיאסטולי. הדמות הותאמה מהתוספת של העבודה הקודמת שלנו 20196. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3

איור 3. ניתוח של מדידות PVL בעכברים C57BL6/N. (A) PVLs נציג במהלך החסימה וריד הפרש נחות מעכברי בקרה C57BL6/N נתון הגדלת ריכוזי איזופרוטרנול. (B) תפקוד לב כללי במהלך מצבים בסיסיים ובמהלך איזופרוטרנול מתואר על ידי ניתוח של קצב הלב, פלט הלב, נפח שבץ ועבודת שבץ. (ג) פרמטרים נוספים נותחו כדי להעריך התכווצות לב ותפקוד דיאסטולי כמו PRSW, הקבוע של הרפיה טאו (משוואתוייס 18)ואת מקסימום ומינימלי dP / dt. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית התקן. BPM: פעימות לדקה; PRSW: עומס מראש עבודת שבץ גיוס; n: מספר העכברים. **p < 0.01: ערכי p ממבחן t של התלמיד המשויך נגד מצב הבזל (איזופרוטרנול = 0 ננוגרם / דקה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איזופרוטרנול ריכוז (pg/μL) קצב עירוי (μL/min) מינונים (ng/min)
מניות 1000
דילול 1 550 15 8.25
דילול 2 165 15 2.475
דילול 3 55 15 0.825
דילול 4 16.5 15 0.2475

טבלה 1. דילול איזופרוטרנול להגברת גירוי β-אדנרגיות.  נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איזופרוטרנול (ng/min)
0 0.2475 0.825 2.475 8.25
פרמטרים ואמצעי אחסון כלליים
דופק (bpm) 470 ± 19.6 490 ± 19.3 542 ± 20.6 605 ± 20.5 638 ± 20.5
עוצמת קו (μl) 16.2 ± 2.6 17.6 ± 2.1 20.3 ± 2.8 22.3 ± 2.2 23.9 ± 2.5
תפוקת לב (μl/min) 7627 ± 1210 8609 ± 1097 11000 ± 1616 13502 ± 1494 15291 ± 1761
End-systolic Volume (μl) 13 ± 3.1 10.5 ± 3.5 4.81 ± 2.3 1.94 ± 1.9 1.5 ± 1.7
End-diastolic Volume (μl) 27.4 ± 3 26.6 ± 3.0 24.1 ± 3.1 23.8 ± 2.6 24.8 ± 2.7
לחץ ממוצע (mmHg) 27.4 ± 2.2 28.6 ± 2.2 29.2 ± 1.9 29.7 ± 1.9 30.5 ± 1.9
אלגנטיות עורקית (mmHg/μl) 4.44 ± 0.6 4.18 ± 0.7 3.46 ± 0.5 2.78 ± 0.9 2.91 ± 1
פרמטרים סיסטוליים
טען מראש עבודת שבץ ניתנת לגיוס 67.8 ± 7.62 76.3 ± 9.85 96.1 ± 14.62 108 ± 14.56 113 ± 13.02
ESPVR 4.96 ± 1.29 5.15 ± 1.16 7.2 ± 2.28 17.3 ± 42.04 40 ± 107.55
שבר פליטה (%) 52.59 ± 9.57 60.9 ± 9.94 80.23 ± 8.65 92.16 ± 7.2 94.18 ± 6.15
עבודת שבץ (mmHg x μl) 1007 ± 244.26 1153 ± 193 1399 ± 261 1582 ± 234 1720 ± 216
מקסימום dP/dt (mmHg/s) 6128.7 ± 1398.39 7087 ± 1401 8982.4 ± 1481 11422 ± 1477 13256 ± 1165
מינימום dV/dt (μl/s) - 523 ± 105.58 - 613 ± 102 - 835 ± 151 - 1103 ± 165 - 1273 ± 177
לחץ סיסטולי קצה (mmHg) 70.8 ± 6.98 72.5 ± 7.42 69 ± 6.28 61.2 ± 17.36 68.2 ± 19.72
הספק מרבי (mmHg x μl/s) 3009 ± 955.31 3541 ± 1188 4185 ± 1058 4272 ± 959 4918 ± 1418
פרמטרים דיאסטוליים
EDPVR 1 ± 0.93 1.23 ± 0.88 1.5 ± 0.86 1.87 ± 0.92 1.96 ± 0.99
טאו (ms, המשוואה שלוייס) 6.14 ± 0.64 5.67 ± 0.44 4.92 ± 0.44 4.83 ± 0.55 4.96 ± 0.65
מינימום dP/dt (mmHg/s) - 7272 ± 1403 - 8119 ± 1295 - 8998 ± 1240 - 8618 ± 1129 - 8648 ± 1468
לחץ דיאסטולי קצה (mmHg) 5.29 ± 1.01 5.74 ± 1.07 5.6 ± 1.51 5.37 ± 1.13 5.76 ± 1.15
מקסימום dV/dt (μl/s) 765 ± 174 817 ± 178 972 ± 156 1158 ± 163 1264 ± 153

טבלה 2. ניתוח של מדידות PVL בעכברים C57BL6/N. PVL פרמטרים של תפקוד הלב במהלך מצבים בסיסיים ובמהלך עירוי איזופרוטרנול. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית התקן מ-18 עכברים בוגרים זכרים. PV: נפח לחץ; BPM: פעימות לדקה; ESPVR: שיפוע של קצה-סיסטולי PV-Relationship, חישוב לא מספיק בנפחים תוך חדריים נמוכים (2.475 ו 8.25 ng/min איזופרוטרנול); EDPVR: End-diastolic PV-Relationship, רגרסיה מעריכית (מקדם אלפא). נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דלתא (%) גודל אפקט גודל לדוגמה לכל קבוצה
איזופרוטרנול ng/min איזופרוטרנול ng/min
0 0.825 8.25 0 0.825 8.25
קצב לב
10 2.4 2.6 3.1 4 4 3
15 3.6 3.9 4.6 3 3 3
20 4.8 5.3 6.2 3 3 3
25 6.0 6.6 7.8 3 3 3
30 7.2 7.9 9.3 3 3 3
עוצמת קו
10 0.6 0.7 1.0 42 30 18
15 0.9 1.1 1.5 20 15 9
20 1.2 1.5 2.0 12 9 6
25 1.5 1.8 2.4 8 6 4
30 1.8 2.2 2.9 6 5 4
טען מראש עבודת שבץ ניתנת לגיוס
10 0.9 0.7 0.9 21 38 22
15 1.3 1.0 1.3 10 18 11
20 1.8 1.3 1.7 7 11 7
25 2.2 1.6 2.2 5 7 5
30 2.7 2.0 2.6 4 6 4
dP/dtmax
10 0.4 0.6 1.1 83 44 14
15 0.7 0.9 1.7 38 20 7
20 0.9 1.2 2.3 22 12 5
25 1.1 1.5 2.8 15 8 4
30 1.3 1.8 3.4 11 6 3
טאו
10 1.0 1.1 0.8 19 14 28
15 1.4 1.7 1.2 9 7 13
20 1.9 2.2 1.5 6 5 8
25 2.4 2.8 1.9 4 4 6
30 2.9 3.4 2.3 4 3 5
dP/dtmin
10 0.5 0.7 0.6 60 31 47
15 0.8 1.1 0.9 27 15 22
20 1.0 1.4 1.2 16 9 13
25 1.3 1.8 1.5 11 6 9
30 1.6 2.2 1.8 8 5 7
קשרי לחץ-נפח-נפח סיסטוליים
10 0.4 0.3 0.04 >100 >100 >100
15 0.6 0.5 0.06 48 73 >100
20 0.8 0.6 0.07 28 41 >100
25 1.0 0.8 0.09 19 27 >100
30 1.2 1.0 0.11 13 19 >100
נפח דיאסטולי End-diastolic
10 0.9 0.8 0.9 20 27 20
15 1.4 1.2 1.4 10 13 10
20 1.8 1.6 1.8 6 8 6
25 2.3 2.0 2.3 5 6 5
30 2.8 2.4 2.8 4 5 4

טבלה 3. גודל אפקט משוער וגודל המדגם הנדרש עבור פרמטרים נבחרים בהתבסס על ערכים שנצפו בעכברים זכרים C57BL6/N. דלתא מתארת הבדל היפותטי בפרמטר בין פקד (כלומר, סוג פראי) לבין קבוצת טיפול. גודל האפקט וגודל המדגם הנדרש לכל קבוצה מחושבים באמצעות נתוני בקרה (ממוצע וסטיית תקן), שגיאת אלפא (0.05) וצריכת חשמל (0.8) באמצעות G*Power 19. ערכים מודגשים (רקעים ירוקים בגירסה המקוונת של הטבלה) מציינים גודל אפקט סף מוצע (1≤) וגודל דגימה עבור כל פרמטר בכל מנה של איזופרוטרנול. dP/dtmin: Minimum dP/dt; dP/dtmax: Maximum dP/dt. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לנתח את תפקוד הלב in vivo בעכברים תחת הגדלת גירוי β-adrenergic. ההליך יכול לשמש כדי לטפל בשניהם, פרמטרים בסיסיים של תפקוד הלב ואת עתודה adrenergic (למשל, inotropy ו כרונוטרופיה) בעכברים מהונדסים גנטית או על התערבויות. היתרון הבולט ביותר של מדידות לולאת נפח לחץ (PVL) בהשוואה לאמצעים אחרים לקביעת תפקוד הלב הוא ניתוח של תפקוד לב מהותי, בלתי תלוי עומס. כל השיטות האחרות (למשל, MRI ואקוקרדיוגרפיה) יכולות רק להעריך פרמטרים תלויי עומס של תפקוד הלב ובמיוחד התכווצות הלב לא ניתן לקבוע באופן אמין. זה עושה מדידות PVL תקן הזהב למדידות נקודת קצה של ניתוח מעמיק של תפקוד הלב5. עם זאת, השיטות שנקראו לפני מאפשרות ניתוח רציף של תפקוד הלב, ומביאות אותם לחזית לתצפיות אורך (למשל, במהלך התקדמות המחלה). יתר על כן, אמצעי אחסון תוך חדריים, ולאחר מכן נפח שבץ ופרמטרים נגזרים אחרים, ניתן להמעיט בערךות PVL לעומת MRI בעכברים20.

ישנם ארבעה שלבים קריטיים במהלך הפרוטוקול החיוניים להשגת נתוני PVL תקפים: 1) צנרור, 2) מיקום של צנתר וריד הירך, 3) מיקום של צנתר מוליכות הלחץ ו -4) משטר הפריפרוקורל. צנרוב לא פולשני של עכברים דורש קצת ניסיון והוא מסובך בעת שימוש isoflurane כמו מסגרת הזמן עבור צנרוב הוא צר (20 - 40 s). לכן, לאחר הצנרור יש לבדוק בקפידה את מיקום הצינור הנכון על ידי בחינת תנועות החזה המוריני בעת שינוי קצב הנשימה של מכונות ההנשמה. כדי להרחיב את החלון עבור צנרודציה, תיארנו כאן את השימוש בו-זמן באטומידאט ההיפנוטי הקצר. יתר על כן, סיבים קלים כדי להקל על הדמיה של glottis זמינים16. מיקום נכון של קטטר וריד הירך חיוני ליישום איזופרוטרנול בשלבים מאוחרים יותר. במהלך שלב זה, תסחיף אוויר יכול לפגוע קשות בבעלי החיים גרימת תסחיף ריאתי. מיקום נכון של קטטר הירך יכול להיבדק בתחילה על ידי שאיפה זהירה של דם ורידים. כאשר מיקום צנתר תקין אינו בטוח בשלבים מאוחרים יותר, ניתן לבדוק נפח דיאסטולי קצה, אשר אמור להגדיל בתגובה בולוס הקל ביותר בעת הדמיית PVL באינטרנט. בניגוד לרוב החוקרים האחרים, אנו מתארים כאן את השינון של וריד הירך, בעוד שאחרים השתמשו לרוב בווריד הצוואר ככלי היעד לגישה ורידית מרכזית12,21. גישה זו יש את היתרון של לא מניפולציה קרוב עצב vagal, כפי שנעשה בגישה החזה הקרוב כאשר עורק החזה מוכן, ולכן אנו מניחים כי גירוי פוטנציאלי של המערכת הפאראסימפתטית פשוט על ידי נגיעה / פגיעה בעצב נמנע. מיקום נכון של קטטר PV בתוך החדר הוא חיוני כדי לקבל נתונים משמעותיים במיוחד לגבי פרמטרי נפח. כאשר אלקטרודות אינן לגמרי בתוך החדר או הצנתר אינו ממוקם כראוי לאורך ציר האורך של החדר, פרמטרי נפח הם מאוד לזלזל. כמו כן, מגע בין אנדוקרדיום לבין מתמר הלחץ גורם קוצי לחץ סיסטולי קצה אשר לא צריך להיות נסבל במהלך מדידות בסיסיות6. לבסוף, משטר periprocedural כולל עומק הרדמה וניהול נוזלים יש השפעה משמעותית על האמינות של נתוני PVL בעכברים. הרדמה מתחת או מנת יתר יכולה להשפיע קשות על הפרמטרים המודינמיים, וכתוצאה מכך לרוב תפקוד לב מופחת. אובדן נוזלים, אשר בעיקר עקב איבוד דם ואידוי, חייב להיותנטרל עם עירוי מתמיד של פתרונות מתאימים כגון 12.5% אלבומין מומס 0.9% NaCl, אשר אנו ממליצים. להיות כי הגישה היא פולשנית מאוד, לא פחות חשוב הוא הכללה של משכך כאבים חזק כמו Buprenorphine כדי למזער את ההשפעות על תפקודים לב וכלי דם מעוררים הימנעות כאב לא מספיק. אנחנו מזריקים את התרופה המשפכת לפני צנרר. חשוב לבצע את הזריקה ~ 30 דקות לפני תחילת ההליך כולו, במיוחד אם המפעיל מנוסה, ולכן מהר, על מנת להגיע אפקט משכך כאבים נאות הימנעות כל כאב במהלך שלב החקירה. בנוסף, כאשר עובדים עם מודלים שמנים כנראה מינונים גבוהים יותר צריך להיחשב בשל lipophilicity גבוהה של חומר זה. לבסוף, פרוטוקול זה עשוי להשתנות גם בקביעת תגובה לגירויים קטכולמינרגיים אחרים כגון דובוטמין או אפינפרין; כפי שנעשה למשל על ידי קליגרי ועמיתיו22 שתיארו את הניתוח בלחץ תוך חדרי במהלך גירוי dobutamine.

לגבי ההקלטה והניתוח של מדידות PVL ישנם מספר שלבים שיש לקחת בחשבון. ראשית, יש חשיבות מכרעת לנתח באופן עקבי הקלטות PVL על פני ערכת נתונים ניסיונית. יש להימנע מממצאים נשימתיים המתפתחים עקב לחץ ריאתי לסירוגין וכתוצאה מכך עומס לבבי לסירוגין במהלך אוורור מכני יש להימנע על ידי כיבוי מכונת ההנשמה במהלך ההקלטות. כדי לחסל עוד יותר חפצים נשימתיים, אנו ממליצים להשתמש pancuronium מרפה שרירים על מנת למנוע התכווצויות של הסרעפת כי הם נראים לעתים קרובות במהלך הרדמה איזופלוראן. בנוסף, זה עושה ריאלי לעצור את האוורור בסיום-תפוגה ולנתח את כל הלולאות שנבחרו, בניגוד לפרוטוקולים אחרים הממליצים לבחור 8-10 לולאות ולאחר מכן לזהות 5-6 לולאות תפוגת קצה כי הם מנותחים לאחר מכן23. חשוב לציין, תקופות של דום נשימה צריך להישמר קצר כדי למנוע hypoventilation וכתוצאה מכך hypercapnia וחומצת בדרכי הנשימה. כדי לשפר חמצון ולמנוע היווצרות של atelectasis, בדקנו בעבר את השימוש ב- PEEP-אוורור במהלך מדידות PVL בעכברים6. בעת בחירת לולאות לניתוח נתונים בלתי תלויים בטעינה מראש, בחר את הלולאות הראשונות של 5-6 המציגות ירידה בנפח הדיאסטולי הסופי והימנע מלכלול לולאות שבהן הלחץ היחיד יורד, אך עוצמת הקול קבועה. יתר על כן, פעימות נוספות לא צריך להיכלל בניתוח, כפי שהם משפיעים באופן מכריע על הפרמטרים PVL. למרבה הפלא, לרוב פעימות הפרעות קצב מתרחשות בשל מגע בין תפל החסימה לבין הלב המוריני. כיול מוליכות מקבילה באמצעות עירוי של תמיסת מלח היפרטונית יש השפעה עצומה על פרמטרים של תפקוד הלב צריך, להבנתנו, להתבצע בסוף ניסוי6. ראוי לציין, בשל השפעתו על תפקוד הלב, כיול מוליכות מקבילה מבוצע רק פעם אחת במהלך הפרוטוקול. עם זאת, מוליכות מקבילה משתנה מעט במהלך הפרוטוקול, בשל שינויים בצורת החדרים על גירוי adrenergic. מערכות קבלה להערכות PVL בעכברים זמינות שאין להן צורך בכיול מלוח ויכולות לחשב מוליכות מקבילית באופן דינמי לאורך הקלטות PVL. עם זאת, הדיוק של שיטה זו עדיין נמצא בדיון5,8,24,25.

קבענו מהתצפיות שלנו כי בעת שימוש בפרוטוקול זה בעכברים זכרים מסוג בר בריא למבוגרים (כלומר, C57Bl6/N), לחץ סיסטולי הוא בטווח של 70 מ"מ כ"ג עד 90 מ"מ כ"ג בבסיס ובין 80 ל -100 מ"מ כ"ג במהלך גירוי מרבי עם איזופרוטרנול אגוניסט אגוניסט β-adrenoreceptor. כמו כן, עוצמת שבץ נצפתה להיות בטווח של 13 μL כדי 20 μL בקו הבסיס ובין 20 μL ו 35 μL במהלך גירוי מקסימלי. קצב הלב היה סביב 450 עד 520 פעימות לדקה בקו הבסיס והוא יכול בהחלט לעלות על 650 פעימות לדקה במהלך גירוי מקסימלי. לגבי התכווצות לב עצמאית מראש, הפרמטר החזק ביותר מראש לטעון עבודת שבץ (PRSW) נחשב מספיק בין 60 mmHg ל 80 מ"מ כ"ג בבסיס ובין 100 מ"מ כ"ג ו 140 מ"מ כ"ג במהלך גירוי מקסימלי. אם הפרמטרים הבסיסיים לסטות באופן משמעותי מאלה המתקבלים בדרך כלל, או כאשר תפקוד הלב מגיב באופן בלתי הולם לגירוי β-adrenergic, סיבוכים (למשל, איבוד דם ללא הפרעה, ירידה/ עלייה בטמפרטורת הגוף או הרדמה מעל / מתחת מינון) יש לקחת בחשבון.

יתר על כן, כמה חפצים עשויים להתעורר במהלך מדידות PVL בעכברים. החפץ הנפוץ ביותר הוא ספייק הלחץ הסיסטולי הקצה (ESPS, איור 2C), הנובע מלכוד קטטר והוא ניתן לזיהוי בקלות על ידי מיקום מחדש של הקטטר לפני מדידות הבזל ב 0 ננוגרם / דקה איזופרוטרנול. מדידות לא צריך להתחיל לפני ESPSs נמחקים בתנאים בסיסיים על מנת לקבל נתונים משמעותיים, כמו ESPS יכול להשפיע על מספר פרמטרים של תפקוד הלב6. עם זאת, כאשר ESPS מתרחשת במהלך גירוי מצטבר עם איזופרוטרנול עקב מורפולוגיה חדרית שונה במדידות שלא הושפעו בקו הבסיס, זה לא ניתן לזיהוי, שכן מיקום מחדש של קטטר ישנה מוליכות מקבילה במהלך פרוטוקול תגובת המינון. יש לבחון זאת מקרוב, שכן, כמו אלה בבסיס, ESPSs אלה הוכחו לשנות באופן משמעותי פרמטרים של תפקוד הלב לא רק באמצעות לחץ מקסימלי מוגבר באופן משמעותי13,26, אלא גם באמצעות זיהוי נפח מופחת6.

ערכים מייצגים עבור פרמטרים hemodynamic המתקבלים על ידי מדידות PVL בתנאים בסיסיים ובמהלך גירוי מצטבר עם איזופרוטרנול בעכברים להשתנות במידה רבה עם גישות מתודולוגיות שונות בזני עכבר שונים27,28. מעבר לכך, יש להיות מודעים לכך פנוטיפים של עכברים שהשתנו גנטית עשויים להיות מוגבלים גם לרקע גנטי מובהק. מבחינה מתודולוגית, ישנן שתי גישות בעלות חשיבות עליונה של ביצוע ניתוח נפח לחץ בעכברים. לכל שיטה יש יתרונות (דיס) שלה ושיטת הבחירה תלויה לעתים קרובות בחוויות המעבדה והחוקרים שלה. אנו מתמקדים כאן בהליך החזה הפתוח, שבו הצנתר ממוקם באמצעות נקב על השיא. גישה זו כוללת את קידום מיקום הצנתר תחת ראייה המאפשר מיקום צנתר מדויק, מנבא חיוני להקלטת נתונים משמעותיים של תפקוד הלב בעכברים. הדבר נכון במיוחד להקלטת פרמטרי נפח בטווח המיקרוליטרים. לעומת זאת, היבט קריטי של גישה זו הוא אובדן לחצים פיזיולוגיים תוך-בית החזה, וכתוצאה מכך קריסת ריאות היווצרות atelectasis ואובדן גבוה יותר של נוזל הגוף. עם זאת, באמצעות אוורור חיובי של לחץ תפוגת קצה (PEEP), אנו מתארים כאן אסטרטגיה שהוכיחה את עצמה כמנטרלת נזק ריאתי במהלך PVL בחזה פתוח בעכברים6. הגישה הניסיונית השנייה היא להכניס את הצנתר דרך העורק הראשי ולאחר מכן בנסיגה דרך שסתום אבי העורקים. באמצעות טכניקה זו, לחצים פנים-בית החזה יכול להיות מוחזק נורמלי למדי, אם כי אוורור מכני עדיין נדרש, אשר מחליש את היתרון הזה. יתר על כן, הגישה של חזה סגור מגבילה את אפשרויות החוקרים למיקום צנתר מדויק. יתר על כן, צנתרים PV המשמשים בעכברים יש קטרים הנעים בין 1 ל 1.4 צרפתית (0.33 מ"מ עד 0.47 מ"מ), מה שמרמז על חסימה משמעותית של דרכי היציאה של מורין בעת שימוש בגישה של חזה סגור, כמו aortas של עכברים בוגרים בדרך כלל יש קטרים בין 0.8 מ"מ ל 1.2 מ"מ29,30. לגבי השימוש ב- PVL במודלים של אי ספיקת לב, הגישה של החזה הפתוח היא בעלת חשיבות מיוחדת למודלים של התכווצות בוב העורקים, שם הצמצום ממוקם בין העורק הראשי השנון לעורק הראשי השמאלי. כאן לא ניתן למקם את הצנתר דרך העורק הראשי. מצד שני, הגישה של חזה סגור מעניינת חוקרים החוקרים מודלים מוריניים של חדרים מולחנים, כגון לאחר אינדוקציה של אוטם שריר הלב, שבו ניקוב של השיא אינו ריאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין להצהיר על ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים למנואלה ריצל, הנס-פיטר גנשהיימר, כריסטין ריכטר והצוות מאינטרפאקולטר ביומדיזינישה פורשונגסיינריכטונג (IBF) מאוניברסיטת היידלברג לסיוע טכני מומחה.

עבודה זו נתמכה על ידי DZHK (המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם), BMBF (משרד החינוך והמחקר הגרמני), באדן-וירטמברג חדשנות המדינה הפדרלית וחיבה לחדשנות של המדינה הפדרלית דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) פרויקט-ID 239283807 - TRR 152, עבור 2289 ומרכז המחקר השיתופי (SFB) 1118.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.4F SPR-839 catheter Millar Instruments, USA 840-8111
1 ml syringes Beckton Dickinson, USA REF303172
Bio Amplifier ADInstruments, USA FE231
Bridge-Amplifier ADInstruments, USA FE221
Bovine Serum Albumin Roth, Germany 8076.2
Buprenorphine hydrochloride Bayer, Germany 4007221026402
Calibration cuvette Millar, USA 910-1049
Differential pressure transducer MPX Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany Type 39912
Dumont Forceps #5/45 Fine Science tools Inc. 11251-35
Dumont Forceps #7B Fine Science tools Inc. 11270-20
Graefe Forceps Fine Science tools Inc. 11051-10
GraphPad Prism GraphPad Software Ver. 8.3.0
EcoLab-PE-Micotube Smiths, USA 004/310/168-1
Etomidate Lipuro Braun, Germany 2064006
Excel Microsoft
Heparin Ratiopharm, Germany R26881
Hot plate and control unit Labotec, Germany Hot Plate 062
Isofluran Baxter, Germany HDG9623
Isofluran Vaporizer Abbot Vapor 19.3
Isoprenalinhydrochloride Sigma-Aldrich, USA I5627
Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID Smiths Medical International Ltd, UK Ref. 800/100/100
MiniVent ventilator for mice Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany Type 845
MPVS Ultra PVL System Millar Instruments, USA
NaCl AppliChem, Germany A3597
NaCl 0.9% isotonic Braun, Germany 2350748
Pancuronium-bromide Sigma-Aldrich, USA BCBQ8230V
Perfusor 11 Plus Harvard Apparatus Nr. 70-2209
Powerlab 4/35 control unit ADInstruments, USA PL3504
Rechargeable cautery-Set Faromed, Germany 09-605
Scissors Fine Science tools Inc. 140094-11
Software LabChart 7 Pro ADInstruments, USA LabChart 7.3 Pro
Standard mouse food LASvendi GmbH, Germany Rod18
Stereo microscope Zeiss, Germany Stemi 508
Surgical suture 8/0 Suprama, Germany Ch.B.03120X
Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge Beckton Dickinson, USA 393224
Vessel Cannulation Forceps Fine Science tools Inc. 00574-11
Water bath Thermo Fisher Scientific, USA
Syringe filter (Filtropur S 0.45) Sarstedt, Germany Ref. 83.1826

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bacmeister, L., et al. Inflammation and fibrosis in murine models of heart failure. Basic Research in Cardiology. 114 (3), 19 (2019).
  2. Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Reviews Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
  3. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovascular Research. 39 (1), 60-76 (1998).
  4. Lefkowitz, R. J., Rockman, H. A., Koch, W. J. Catecholamines, cardiac beta-adrenergic receptors, and heart failure. Circulation. 101 (14), 1634-1637 (2000).
  5. Cingolani, O. H. K. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 2198-2206 (2011).
  6. Bacmeister, L., et al. Assessment of PEEP-Ventilation and the Time Point of Parallel-Conductance Determination for Pressure-Volume Analysis Under beta-Adrenergic Stimulation in Mice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 36 (2019).
  7. Segin, S., et al. Cardiomyocyte-Specific Deletion of Orai1 Reveals Its Protective Role in Angiotensin-II-Induced Pathological Cardiac Remodeling. Cells. 9 (5), (2020).
  8. Clark, J. E., Marber, M. S. Advancements in pressure-volume catheter technology - stress remodelling after infarction. Experimental Physiology. 98 (3), 614-621 (2013).
  9. Glower, D. D., et al. Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work. Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).
  10. Winter, E. M., et al. Left ventricular function in the post-infarct failing mouse heart by magnetic resonance imaging and conductance catheter: a comparative analysis. Acta Physiologica. 194 (2), 111-122 (2008).
  11. Krenz, M. Conductance, admittance, and hypertonic saline: should we take ventricular volume measurements with a grain of salt. Journal of Applied Physiology. 107 (6), 1683-1684 (2009).
  12. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
  13. Wei, A. E., Maslov, M. Y., Pezone, M. J., Edelman, E. R., Lovich, M. A. Use of pressure-volume conductance catheters in real-time cardiovascular experimentation. Heart, Lung and Circulation. 23 (11), 1059-1069 (2014).
  14. van Hout, G. P., et al. Admittance-based Pressure-Volume Loops versus gold standard cardiac magnetic resonance imaging in a porcine model of myocardial infarction. Physiological Reports. 2 (4), 00287 (2014).
  15. Wei, C. L., Shih, M. H. Calibration Capacity of the Conductance-to-Volume Conversion Equations for the Mouse Conductance Catheter Measurement System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1627-1634 (2009).
  16. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
  17. Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
  18. Weiss, J. L., Frederiksen, J. W., Weisfeldt, M. L. Hemodynamic determinants of the time-course of fall in canine left ventricular pressure. Journal of Clinical Investigation. 58 (3), 751-760 (1976).
  19. Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavioral Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
  20. Jacoby, C., et al. Direct comparison of magnetic resonance imaging and conductance microcatheter in the evaluation of left ventricular function in mice. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 87-95 (2006).
  21. Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 443-450 (2000).
  22. Calligaris, S. D., Ricca, M., Conget, P. Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50050 (2013).
  23. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942 (2015).
  24. Pearce, J. A., Porterfield, J. E., Larson, E. R., Valvano, J. W., Feldman, M. D. Accuracy considerations in catheter based estimation of left ventricular volume. Conference proceedings - IEEE engineering in medicine and biology society. 2010, 3556-3558 (2010).
  25. Nielsen, J. M., et al. Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 534-540 (2007).
  26. Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
  27. Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiological Genomics. 42 (2), 103-113 (2010).
  28. Oosterlinck, W., Vanderper, A., Flameng, W., Herijgers, P. Glucose tolerance and left ventricular pressure-volume relationships in frequently used mouse strains. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 281312 (2011).
  29. Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (5), 1829-1837 (2002).
  30. Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).

Tags

רפואה גיליון 171 גירוי β-אדנרגיות איזופרוטרנול תפקוד לב לולאות נפח לחץ לב עכבר in vivo חזה פתוח
תגובת לב לגירוי β-אדנרגיות שנקבע על ידי ניתוח לולאת נפח לחץ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Medert, R., Bacmeister, L., Segin,… More

Medert, R., Bacmeister, L., Segin, S., Freichel, M., Camacho Londoño, J. E. Cardiac Response to β-Adrenergic Stimulation Determined by Pressure-Volume Loop Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62057, doi:10.3791/62057 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter