Summary
Hier beschreiben wir eine Herzdruck-Volumen-Schleifenanalyse unter steigenden Dosen von intravenös infundiertem Isoproterenol zur Bestimmung der intrinsischen Herzfunktion und der β-adrenergen Reserve bei Mäusen. Für die Druck-Volumen-Schleifenmessungen verwenden wir einen modifizierten Open-Chest-Ansatz, bei dem wir die Beatmung mit positivem endexspiratorischem Druck einbeziehen.
Abstract
Die Bestimmung der Herzfunktion ist eine robuste Endpunktanalyse in Tiermodellen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, um Effekte spezifischer Behandlungen auf das Herz zu charakterisieren. Aufgrund der Machbarkeit genetischer Manipulationen ist die Maus zum häufigsten Säugetiertiermodell geworden, um die Herzfunktion zu untersuchen und nach neuen potenziellen therapeutischen Zielen zu suchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bestimmung der Herzfunktion in vivo unter Verwendung von Druck-Volumen-Schleifenmessungen und -analysen unter basalen Bedingungen und unter β-adrenergen Stimulation durch intravenöse Infusion von steigenden Isoproterenolkonzentrationen. Wir bieten ein verfeinertes Protokoll einschließlich Beatmungsunterstützung unter Berücksichtigung des positiven endexspiratorischen Drucks zur Verbesserung negativer Effekte bei Messungen am offenen Brustkorb und einer starken Analgesie (Buprenorphin), um unkontrollierbaren Myokardstress zu vermeiden, der durch Schmerzen während des Eingriffs hervorgerufen wird. Insgesamt ermöglicht die detaillierte Beschreibung des Verfahrens und die Diskussion über mögliche Fallstricke eine hochstandardisierte und reproduzierbare Druck-Volumen-Schleifenanalyse, die den Ausschluss von Tieren aus der experimentellen Kohorte reduziert, indem mögliche methodische Verzerrungen verhindert werden.
Introduction
Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflussen typischerweise die Herzfunktion. Diese Frage weist auf die Bedeutung der Beurteilung der detaillierten In-vivo-Herzfunktion in Tierversuchsmodellen hin. Tierversuche sind von einem Rahmen der drei Rs (3Rs) Leitprinzipien (Reduce/Refine/Replace) umgeben. Im Falle des Verständnisses komplexer Pathologien mit systemischen Reaktionen (d.h. Herz-Kreislauf-Erkrankungen) auf der aktuellen Entwicklungsebene besteht die Hauptoption darin, die verfügbaren Methoden zu verfeinern. Die Verfeinerung wird auch zu einer Verringerung der erforderlichen Tierzahlen aufgrund der geringeren Variabilität führen, was die Aussagekraft der Analyse und der Schlussfolgerungen verbessert. Darüber hinaus bietet die Kombination von kardialen Kontraktilitätsmessungen mit Tiermodellen von Herzerkrankungen, einschließlich solcher, die durch neurohumorale Stimulation oder durch Drucküberlastung wie Aortenbanding induziert werden, die beispielsweise veränderte Katecholamin/β-adrenerge Spiegel1,2,3,4nachahmen, eine leistungsfähige Methode für präklinische Studien. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die katheterbasierte Methode nach wie vor der am weitesten verbreitete Ansatz zur eingehenden Beurteilung der kardialen Kontraktilität5ist, wollten wir hier eine verfeinerte Messung der In-vivo-Herzfunktion bei Mäusen durch Druck-Volumen-Schleifen-Messungen (PVL) während der β-adrenergen Stimulation auf der Grundlage früherer Erfahrungen, einschließlich der Bewertung spezifischer Parameter dieses Ansatzes, vorstellen6. ( 7) DIE MITGLIEDSTAATEN SIND IN DEN
Zur Bestimmung kardialer hämodynamischer Parameter stehen Ansätze zur Verfügung, die bildgebende oder katheterbasierte Techniken umfassen. Beide Optionen gehen mit Vor- und Nachteilen einher, die für die jeweilige wissenschaftliche Fragestellung sorgfältig abgewogen werden müssen. Bildgebende Ansätze umfassen Echokardiographie und Magnetresonanztomographie (MRT); beide wurden erfolgreich bei Mäusen eingesetzt. Echokardiographische Messungen sind mit hohen Anschaffungskosten durch eine Hochgeschwindigkeitssonde verbunden, die für die hohe Herzfrequenz der Mäuse erforderlich ist. Es ist ein relativ einfacher nicht-invasiver Ansatz, aber er ist variabel unter den Bedienern, die idealerweise Erfahrung in der Erkennung und Visualisierung von Herzstrukturen haben sollten. Darüber hinaus können keine Druckmessungen direkt durchgeführt werden und Berechnungen werden aus der Kombination von Größengrößen und Durchflussmessungen erhalten. Zum anderen hat es den Vorteil, dass mehrere Messungen am selben Tier durchgeführt werden können und die Herzfunktion beispielsweise während des Krankheitsverlaufs überwacht werden kann. Hinsichtlich der Volumenmessung ist die MRT das Goldstandardverfahren, aber ähnlich wie bei der Echokardiographie sind keine direkten Druckmessungen möglich und es können nur vorlastabhängige Parameter erhalten werden8. Limitierende Faktoren sind auch die Verfügbarkeit, der Analyseaufwand und die Betriebskosten. Hier sind katheterbasierte Methoden zur Messung der Herzfunktion eine gute Alternative, die zusätzlich die direkte Überwachung des intrakardialen Drucks und die Bestimmung lastunabhängiger Kontraktilitätsparameter wie preload recruitable stroke work (PRSW)9ermöglichen. Die ventrikulären Volumina, die mit einem Druckleitfähigkeitskatheter (durch Leitfähigkeitsbestimmung) gemessen werden, sind jedoch kleiner als die aus dem MRT, aber die Gruppenunterschiede werden im gleichen Bereich beibehalten10. Um zuverlässige Volumenwerte zu ermitteln, ist die entsprechende Kalibrierung erforderlich, die ein kritischer Schritt bei den PVL-Messungen ist. Es kombiniert ex vivo Messungen der Blutleitfähigkeit in volumenkalibrierten Küvetten (Umwandlung von Leitfähigkeit in Volumen) mit der in vivo Analyse für die Parallelleitung des Myokards während der Bolusinjektion der hypertonen Kochsalzlösung11,12. Darüber hinaus sind die Positionierung des Katheters im Ventrikel und die korrekte Ausrichtung der Elektroden entlang der Längsachse des Ventrikels entscheidend für die Nachweisbarkeit des von ihnen erzeugten umgebenden elektrischen Feldes. Mit der reduzierten Größe des Mausherzens ist es möglich, Artefakte zu vermeiden, die durch Veränderungen der intraventrikulären Ausrichtung des Katheters verursacht werden, selbst in erweiterten Ventrikeln5,10, aber Artefakte können sich unter β-adrenerger Stimulationentwickeln 6,13. Zusätzlich zu den Leitwertmethoden schien die Entwicklung der zulassungsbasierten Methode die Kalibrierschritte zu vermeiden, aber hier werden die Volumenwerte eher überschätzt14,15.
Da die Maus eines der wichtigsten präklinischen Modelle in der kardiovaskulären Forschung ist und die β-adrenerge Reserve des Herzens von zentralem Interesse in der Herzphysiologie und -pathologie ist, stellen wir hier ein verfeinertes Protokoll zur Bestimmung der in vivo Herzfunktion bei Mäusen durch PVL-Messungen während β-adrenerger Stimulation vor.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Vorschriften des Regierungspräsidiums Karlsruhe und der Universität Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) genehmigt und durchgeführt und entsprechen den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz wissenschaftlich verwendeter Tiere. Die in diesem Protokoll gezeigten Daten stammen von männlichen Wildtypen C57Bl6/N (17 ± 1,4 Wochen). Mäuse wurden unter spezifizierten pathogenfreien Bedingungen in der Tierhaltung (IBF) der Medizinischen Fakultät Heidelberg gehalten. Die Mäuse waren in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht, mit einer relativen Luftfeuchtigkeit zwischen 56-60%, einem 15-fachen Luftwechsel pro Stunde und einer Raumtemperatur von 22 ° C +/- 2 ° C. Sie wurden in konventionellen Käfigen Typ II oder Typ II gehalten, die lange zeit mit Tierstreu und Seidenpapieren als Bereicherung versehen waren. Standard autoklavierte Nahrung und autoklaviertes Wasser standen zur Verfügung, um ad libitumzu konsumieren.
1. Herstellung von Instrumenten und Arzneimittellösungen
- Zentraler Venenkatheter: Schneiden Sie den Mikroschlauch (0,6 mm Außendurchmesser) in ~20 cm lange Katheterröhren. Verwenden Sie eine Pinzette, um ein Ende des Rohres auf die Spitze einer 23-Gauge-Kanüle zu ziehen. Schneiden Sie das andere Ende des Schlauches diagonal ab, um eine scharfe Spitze zu erzeugen, die die Oberschenkelvene durchbohren kann.
- Endotrachealtube: Für ein Intubationsröhrchen schneiden Sie eine 20-Gauge-Venen-Kanüle von 3 cm Länge, um den Spritzenaufsatz zu entfernen.
- Wenn das Intubationsrohr nicht perfekt in den Ventilatoranschluss passt, wickeln Sie den Parafilm über das Ende des Rohrs, an dem das Beatmungsgerät angeschlossen ist. Die Verbindung muss stabil und durch die Eindickung abgedichtet sein (Abbildung 1A). Kürzen Sie den Metallführungsstift der 20-Gauge-Venenkanüle auf 2,7 cm und verwenden Sie ihn als Intubationshilfe. Verfeinerte Ansätze für die Intubation, einschließlich Lichtfasern zur Erleichterung der Visualisierung der Luftröhre, werden ebenfalls gut beschrieben, zum Beispiel von Das und Mitarbeitern16.
- Anästhesiemischung für die Intubation: Mischen Sie 200 μL Heparin (1000 I.E./ml) mit 50 μL 0,9% NaCl und 750 μL 2 mg/ml-Etiomidat aus einem Produkt auf Öl-in-Wasser-Basis. Verwenden Sie 7 μL/g Körpergewicht (BW) für jede Maus (0,1 mg/kg BW Buprenorphin 10 mg/kg BW-Etiomidat).
- Muskelrelaxans: Lösen Sie 100 mg Pancuronium-Bromid in 100 ml 0,9% NaCl auf. Verwenden Sie 1,0 μL/g Körpergewicht (1 mg/kg KG) für jede Maus.
- Isoproterenollösungen: Lösen Sie 100 mg Isoproterenol in 100 ml 0,9% NaCl (1 μg/μL) auf. Die folgenden Verdünnungen (Tabelle 1) werden vorbereitet und jeweils in eine 1 ml Spritze gegeben.
- Um die Verdünnung 1 zu erhalten, verdünnen Sie den Bestand 1:1,8. Um die Verdünnung 2 zu erhalten, verdünnen Sie die Brühe 1:6. Um Verdünnung 3 zu erhalten, verdünnen Sie die Verdünnung 1 in 1:10. Schließlich erhält man Verdünnung 4 durch eine 1:10 Verdünnung der Verdünnung 2.
- 15% hypertones NaCl (w/v): 1,5 g 0,9% NaCl in 10 mL doppelt destilliertemH2O auflösen. Die Lösung wird mit einem 0,45 μm Porenspritzenfilter filtriert.
- Herstellung von 12,5% iger Albuminlösung (w/v): 1,25 g Rinderserumalbumin in 10 ml 0,9% NaCl auflösen. Die Lösung bei 37 °C für 30 min inkubieren. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und die Lösung mit einem 0,45 μm Porenspritzenfilter filtrieren.
- Vorbereitung des Setups: Zuerst die Heizplatte einschalten und auf 39-40 °C einstellen. Legen Sie eine mit Kochsalzlösung gefüllte Spritze auf das Heizkissen und übertragen Sie den PVL-Katheter (Pressure-Volume Loop) in die Spritze. Den Katheter mindestens 30 Minuten vor der Anwendung zur Stabilisierung vorbrüsten. Das von uns verwendete Setup besteht aus einem 1,4-F-Druckleitfähigkeitskatheter, einer Steuereinheit und der entsprechenden Software, und es ist grafisch in Abbildung 1B beschrieben und Anbieterreferenzen sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt .
2. Anästhesie
- Buprenorphin (0,1 mg/kg KÖRPERGEWICHT intraperitoneal) 30 min vor der Intubation injizieren.
- Legen Sie die Maus in eine Acrylglaskammer, die mit 2,5% Isofluran vorgesättigt und mit einem Heizkissen auf dem Boden der Kammer vorgewärmt ist.
- Sobald die Maus schläft (fehlender Reflex), wird die Anästhesiemischung (7 ml/kg KG) mit 10 mg/kg Etipradat und Heparin (1.200 I.E./kg KG) intraperitoneal injiziert.
3. Belüftung
- Das Tier wird 3-4 Minuten nach der Anästhesieinjektion auf die Intubationsplattform (Abbildung 1C) überführt. Die Maus hängt an den Zähnen mit der Dorsalansicht zum Bediener.
- Heben Sie die Zunge vorsichtig mit einer Pinzette an. Um die Stimmritze zu identifizieren, heben Sie den Unterkiefer der Maus mit einer zweiten Pinzette leicht an.
- Führen Sie den Endotrachealtubus (Abbildung 1A) vorsichtig in die Luftröhre ein und entfernen Sie die Führungsstange.
- Übertragen Sie das Tier auf die Heizplatte, legen Sie es auf die Rückseite und verbinden Sie das Intubationsrohr mit dem Kleintierbeatmungsgerät.
- Stellen Sie die Atemfrequenz auf 53,5 x (Körpergewicht in Gramm)-0,26 [min-1], wie von anderen beschrieben12, und das Tidalvolumen auf maximalen Inspiratordruck von 11 ± 1 cmH2O ein.
- Fixieren Sie vorsichtig die Extremitäten der Maus auf der Heizplatte mit Klebestreifen und tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.
- Setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und halten Sie die Körperkerntemperatur bei 37 ± 0,2 °C.
- Installieren Sie ein 1-Kanal-EKG und überwachen Sie die Herzfrequenz online als Indikator für Anästhesietiefe und -stabilität.
- Bei Fehlen interdigitaler Reflexe intraperitoneal 1 mg/kg KÖRPERGEWICHT des Muskelrelaxans Pancuroniumbromid injizieren. Dies verhindert respiratorische Artefakte während pvl-Messungen.
4. Chirurgie
- Allgemeine Empfehlungen
- Während der Operation mit ~ 1,5-2% Isofluran belüften, das mit O2 verdampftist. Die Isoflurankonzentration kann auch von Variablen wie Mausstamm, Geschlecht, Alter und Gewicht der Tiere abhängen, muss aber individuell und experimentell bestimmt werden und die Werte hier sind Referenz für den C57BL6/N-Mausstamm. Wichtig ist, dass das Beatmungsgerät an ein Absaugsystem angeschlossen ist, um zu verhindern, dass der Bediener Isofluran einatmet.
- Verwenden Sie eine Vergrößerung zwischen 1,5-4x aus dem Stereomikroskop für chirurgische Eingriffe.
HINWEIS: Beachten Sie die institutionellen/lokalen Leitlinien zur Vorbereitung des Tieres auf Operationen ohne Überleben.
- Femurkanüle
- Spülen Sie den Hinterteil mit 70% Ethanol ab, schneiden Sie die linke Leistenregion ein und legen Sie die linke Oberschenkelvene frei.
- Sprengen Sie die Epigastrikel und vene mit einer Kauterisation.
- Ligat die Oberschenkelvene mit einer Nähte, die distal zum Katheterzugang platziert wird.
- Passieren Sie eine Naht unter der Oberschenkelvene und bereiten Sie einen Knoten schädel der Punktionsstelle vor. Punktion der Oberschenkelvene mit dem vorbereiteten Mikroröhrchen (siehe Schritt 1.1), das an einer 1 ml Spritze befestigt ist.
- Binden Sie den Knoten fest, um das Rohr im Inneren des Gefäßes zu befestigen.
- Wirken Sie dem Flüssigkeitsverlust durch die Infusion von 0,9% NaCl, ergänzt mit 12,5% Albumin, bei einer Infusionsrate von 15 μL/min mit einer automatischen Spritzenpumpe entgegen. Halten Sie das exponierte Gewebe außerdem mit vorgewärmtem 0,9% NaCl feucht.
- Thorakotomie
- Spülen Sie den Thorax mit 70% Ethanol ab.
- Schneiden Sie die Haut direkt unter dem Xyphoid-Prozess ein und trennen Sie die Brustmuskeln stumpf mit einer Pinzette oder einem Kauterium von der Brustwand.
- Heben Sie den Xyphoid-Prozess mit einer Pinzette an und schneiden Sie dann die Brustwand durch, die sich seitlich auf beiden Seiten mit einem Kauterium bewegt, bis das Zwerchfell von unten vollständig sichtbar ist.
- Schneiden Sie das Zwerchfell von unten ein und legen Sie die Herzspitze frei. Entfernen Sie dann vorsichtig das Perikard mit einer Pinzette.
- Führen Sie eine begrenzte Costotomie auf der linken Seite durch, wie zuvor beschrieben6.
- Führen Sie eine Naht unter der Vena caval inferior durch, um in späteren Stadien eine Vorlastreduktion durchzuführen.
- Punktieren Sie die Herzspitze vorsichtig mit einer 25-Gauge-Kanüle (maximal 4 mm). Entfernen Sie die Kanüle und führen Sie den PV-Katheter ein, bis sich alle Elektroden im Ventrikel befinden.
- Stellen Sie die Position des Katheters durch sanfte Bewegungen und Drehungen ein, bis rechteckige Schlaufen erhalten sind (Abbildung 2A).
- Halten Sie immer das gesamte exponierte Gewebe feucht mit vorgewärmtem 0,9% NaCl.
5. Messungen
- Allgemeine Empfehlungen
- Während der Messungen mit ~ 1,5-2% Isofluran belüften, das mit 100% O2 verdampftist.
- Führen Sie 2 Baseline-Messungen sowie 2 Vena-Cava-Okklusionen für jeden Schritt des Dosis-Wirkungs-Protokolls durch.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass nach dem ersten und zweiten Vena-Cava-Verschluss sowohl die Druck- als auch die Volumenwerte auf Steady-State-Werte wie vor der ersten Okklusion zurückkehren. Diese Beobachtung ist notwendig, um eine Verschiebung der Katheterposition aufgrund serieller Reduktionen des intraventrikulären Volumens zu erkennen. Wäre eine Verschiebung der Katheterposition der Fall, würden vor allem Volumenwerte verschoben.
- Führen Sie eine Online-Analyse der Parameter (Herzfrequenz, Schlagvolumen, dP / dtmax)durch und warten Sie, bis die Steady-State-Herzfunktion erreicht ist. Für den erwarteten Parameterbereich mit der hier verwendeten Einstellung bei C57Bl6/N-Mäusen verweisen wir auf die veröffentlichten Ergebnisse6.
- Stoppen Sie das Beatmungsgerät an der Endexspirationsposition und notieren Sie die Ausgangsparameter. Reduzieren Sie nach 3 bis 5 Sekunden die kardiale Vorbelastung, indem Sie die Naht unter der Vena caval inferior mit einer Pinzette anheben, um vorlastunabhängige Parameter zu erhalten (Abbildung 2B). Schalten Sie das Beatmungsgerät ein. Warten Sie mindestens 30 Sekunden auf die zweite Okklusion, bis die hämodynamischen Parameter stabilisiert sind.
- Nach Erhalt der Messungen unter basalen Bedingungen fahren Sie mit der Dosis-Wirkungs-Beziehung von Isoproterenol fort, indem Sie zu den vorbereiteten Spritzen wechseln. Hier bleibt die Infusionsrate unverändert, um Veränderungen der kardialen Vorbelastung zu vermeiden. Achten Sie beim Wechseln der Spritze darauf, keine Luftblasen zu infundieren.
- Warten Sie mindestens 2 Minuten, bis eine neue Steady-State-Herzfunktion erreicht ist, stoppen Sie das Beatmungsgerät erneut an der endexspiratorischen Position und zeichnen Sie die Ausgangsparameter auf. Reduzieren Sie nach 3 bis 5 Sekunden die kardiale Vorbelastung, indem Sie die Naht unter der Vena caval inferior anheben, um vorlastunabhängige Parameter zu erhalten.
- Warten Sie mindestens 30 Sekunden auf die zweite Okklusion. Anschließend auf die vorbereitete Spritze mit der nächsten Isoproterenolkonzentration umschalten und die Aufzeichnungen der Baseline- und Preload-unabhängigen Parameter wiederholen.
HINWEIS: Artefakte wie die endsystolische Druckspitze (ESPS, Abbildung 2C)können während der Erhöhung der Dosierung von Isoproterenol auftreten, die aus einer Kathetereinklemmung resultiert. Artefakte, die vor dem Beginn der basalen Parameter auftreten, können durch Neupositionierung des Katheters leicht korrigiert werden.
6. Kalibrierung
HINWEIS: Die Kalibrierungsverfahren können je nach verwendetem PVL-System variieren.
- Kalibrierung der Parallelleitung
- Schließen Sie nach der letzten Messung der Isoproterenol-Dosis-Wirkungs-Beziehung eine Spritze mit einer 15%igen NaCl-Lösung an die Oberschenkelkanüle an. Füllen Sie vorsichtig 5 μL der hypertonen Lösung, die in der Röhre verbleibt, bis sich das PVL während der Online-Visualisierung leicht nach rechts verschiebt. Warten Sie dann, bis die Schleifen wieder in den stationären Zustand zurückkehren.
- Stoppen Sie das Beatmungsgerät am Ende der Exspiration und injizieren Sie innerhalb von 2 bis 3 Sekunden einen Bolus von 10 μL 15% NaCl. Überprüfen Sie, ob sich PVL während der Online-Visualisierung weitgehend verbreitert und nach rechts verschoben wird.
- Kalibrierung von Leitfähigkeit zu Volumen
- Warten Sie 5 Minuten, nicht weniger, damit der hypertone Salzbolus vollständig verdünnt ist. Anschließend den Katheter entfernen und mit einer 1 mL Spritze und einer 21-Gauge-Kanüle mindestens 600 μL Blut aus dem linken Ventrikel des schlagenden Herzens entnehmen. Zu diesem Zeitpunkt wird das Tier unter Tiefernarkose und Analgesie durch massive Blutungen eingeschläfert, indem die Beatmung und Entfernung des Herzens gestoppt wird.
- Das Blut wird in die vorgewärmte (in einem Wasserbad bei 37 °C) Kalibrierküvette mit Zylindern bekannten Volumens überführt. Legen Sie den PV-Katheter zentral in jeden Zylinder und zeichnen Sie den Leitwert auf. Durch die Berechnung einer Standardkurve für jedes Tier können die Leitwerteinheiten in absolute Volumenwerte umgerechnet werden.
7. Würdigung
- Nach erfolgreichen PVL-Messungen unter basalen Bedingungen und Isoproterenol-Stimulation visualisieren, digitalisieren, berechnen und extrahieren Sie Parameter, die die Herzfunktion charakterisieren (wie PRSW, dP/dt, enddiastolischer Druck und Volumen, endsystolischer Druck und Volumen, Relaxationskonstante Tau, unter anderem) mit einer geeigneten PVL-Analysesoftware. Weitere statistische Analysen und grafische Darstellungen können mit standardisierter Analysesoftware durchgeführt werden.
- Analyse von Preload-unabhängigen Parametern
HINWEIS: Für diesen Schritt ist es entscheidend, das Verfahren zu standardisieren.- Wählen Sie die ersten 5-6 PVLs, die eine abnehmende Vorspannung während aller Messungen zeigen, für die Analyse der vorlastunabhängigen Parameter (Abbildung 2D). Eine konstante Anzahl von PVLs, die für die Analyse während der Vorlastreduzierung ausgewählt werden, verringert die Variabilität zwischen den Messungen der erhaltenen Parameter.
- Berechnen Sie den Mittelwert der beiden Messungen für jeden Schritt des Protokolls.
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Representative Results
Die Druckvolumenschleifenmessung (PVL) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die kardiale Pharmakodynamik von Medikamenten zu analysieren und den kardialen Phänotyp gentechnisch veränderter Mausmodelle unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Das Protokoll ermöglicht die Beurteilung der kardialen β-adrenergen Reserve im erwachsenen Mausmodell. Hier beschreiben wir eine Open-Chest-Methode unter Isoflurananästhesie in Kombination mit Buprenorphin (Analgetikum) und Pancuronium (Muskelrelaxans), die sich auf die kardiale Reaktion auf β-adrenerge Stimulation konzentriert, indem Isoproterenolkonzentrationen durch einen Oberschenkelvenenkatheter infundiert werden. Einige repräsentative Daten, die in diesem Protokoll gezeigt werden, stammen von wilden männlichen Mäusen vom Typ C57Bl6/N (Abbildung 3 und Tabelle 2). Als Indikator für die Variabilität einiger wichtiger Parameter, die durch unsere PVL-Analyse gemessen wurden, haben wir eine Leistungsanalyse (α Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,05 und Potenz von 0,8) unter Verwendung der Ergebnisse der WT-Gruppe und der kostenlos verfügbaren G * Power-Software17durchgeführt. In Tabelle 3 sind die berechneten Effektgrößen und erforderlichen Stichprobengrößen für Herzfrequenz, PRSW, Schlagvolumen, die Relaxationskonstante Tau, dP/dtmax und dP/dtmin unter der Annahme von Änderungen zwischen 10% und 30% für jeden Parameter unter 0, 0,825 und 8,25 ng/min Isoproterenol dargestellt.
Die grafische Analyse der Druck-Volumen-Beziehungen erfolgt durch Aufzeichnen des Volumens (μL) auf der Y- und des Drucks (mmHg) auf der X-Achse. Wenn der Katheter korrekt innerhalb des Ventrikels platziert ist, wird ein vollständiger Herzzyklus durch einen rechteckigen PVL dargestellt (Abbildung 2A und Abbildung 3A). Kurz gesagt, Systole beginnt mit einer Phase der isovolumetrischen Kontraktion (gekennzeichnet durch dP / dtmax), während der beide Herzklappen geschlossen sind (rechte vertikale Kante). Wenn der ventrikuläre Druck den Aortendruck übersteigt, öffnet sich die Aortenklappe und das Blut wird während der Auswurfphase in die Aorta gepumpt (obere horizontal). Anschließend, wenn der Aortendruck den ventrikulären Druck übersteigt, schließt sich die Aortenklappe und die Diastole beginnt. Während der isovolumetrischen Relaxation (gekennzeichnet durch die Parameter dP/dtmin und Tau) sinkt der ventrikuläre Druck, bis der Vorhofdruck den ventrikulären Druck übersteigt und sich die Mitralklappe öffnet (linke vertikale Kante). Nun findet die passive diastolische Füllung, gekennzeichnet durch eine enddiastolische Druck-Volumen-Beziehung (EDPVR), statt, bis der nächste Herzzyklus beginnt (unten horizontal) (Abbildung 2A-B).
Die PVL-Analyse liefert detaillierte Einblicke in die Herzfunktion, da sie in der Lage ist, die Herzfunktion unabhängig von der kardialen Vorbelastung zu bestimmen. So wurde es als der Goldstandard für die Bestimmung der Herzfunktion in Versuchsaufbauten beschrieben5. In dem beschriebenen Protokoll unter Verwendung von C57Bl6/N-Mäusen untersuchten wir die Reaktion auf Isoproterenol, das auf allgemeine Parameter der Herzfunktion wie Herzfrequenz, Herzzeitvolumen, Schlagvolumen und Schlaganfallarbeit erzeugt wurde. Eine signifikante Wirkung von Isoproterenol auf jeden Parameter wird in der Dosis-Wirkungs-Beziehung unter verschiedenen Isoproterenolkonzentrationen beobachtet (Abbildung 3B). Parameter der kardialen Kontraktilität wie PRSW und dP/dtmax zeigten den erwarteten Anstieg der Dosis-Wirkungs-Beziehung unter Isoproterenol-Infusion (Abbildung 3A-B). Andererseits wurde eine Reduktion der diastolischen Parameter (Entspannungskonstante Tau und dP/dtmin)bei steigenden Isoproterenolkonzentrationen beobachtet (Abbildung 3C), wie von einer positiven lusitropen Wirkung der Katecholamine im gesunden Herzen erwartet. Weitere Parameter aus den in Abbildung 3 gezeigten (d.h. endsystolischer Druck und Volumen, enddiastolischer Druck und Volumen, Maximaldruck, unter anderem) werden ebenfalls aus der PVL-Analyse gewonnen und können auch in Abhängigkeit von der wissenschaftlichen Fragestellung, dem genetischen oder Krankheitsmodell und den erhaltenen Beobachtungen analysiert werden. Zusätzliche und detaillierte Werte für die häufigsten Parameter der Herzfunktion in PVL bei jedem Schritt während der inkrementellen β-adrenergen Stimulation, einschließlich des Zeitpunkts der Kalibrierung für parallele Leitfähigkeit mit hypertoner Kochsalzlösung, die die Parameter des Herzvolumens, aber auch die kardiale Inotropie und -entspannung stark beeinflusst, wurden zuvor berichtet1,6.
Abbildung 1. Anästhesie und Druck-Volumen-Loop-Setup. (A) 20-Gauge-Venenpunktionskanüle, die für die Intubation von Mäusen geeignet ist. (B) Diagramm, das die Organisation und den Zusammenhang der verschiedenen Komponenten des verwendeten Druck-Volumen-Messaufbaus zeigt, einschließlich der Fließrichtung des Anästhesiegases. (C) Intubationsplattform, die verwendet wird, um die Mäuse für eine schnelle und sichere Intubation aufzuhängen. Schrauben (i) auf beiden Seiten am Ende des hängenden Gewindes (ii) sind enthalten, um die Bedrohung in Abhängigkeit vom Gewicht der Maus zu verschärfen. Der Pfeil zeigt eine Anschlussmöglichkeit für Isofluran-Exposition an. Temp.: Temperatur; EKG: Elektrokardiogramm; MinPexp: Minimaler Exspirationsdruck; MaxPexp: Maximaler Exspirationsdruck; PV: Druckvolumen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Repräsentative Druck-Volumen-Analyse. (A) Beispielhafte Druckvolumenaufzeichnungen, bei denen während der Basalmessung analysierte Parameter und Hauptereignisse während des Herzzyklus dargestellt werden. (B) Die Parameter ESPVR, EDPVR und PRSW werden während der Vorlastreduzierung dargestellt. (C) Endsystolische Druckspitzen während basaler Messungen (oberes Panel) oder während des Okklusionsmanövers (unteres Panel) werden beide unter Isoproterenolstimulation dargestellt. LV: Linksventrikulär; dP/dtmin: Minimum dP/dt; dP/dtmax: Maximale dP/dt; Ves: Endsystolisches Volume; Ved: Enddiastolisches Volumen; ESPVR: Endsystolische Druck-Volumen-Beziehung; PRSW: Preload rekrutierbare Schlaganfallarbeit; EDPVR: Enddiastolische Druck-Volumen-Beziehung. Die Abbildung wurde aus der Ergänzung unserer vorherigen Arbeit 20196angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Analyse von PVL-Messungen in C57BL6/N-Mäusen. (A) Repräsentative PVLs während des Verschlusses der Vena im unteren Verlauf von C57BL6/N-Kontrollmäusen und bei steigenden Isoproterenolkonzentrationen. (B) Die allgemeine Herzfunktion während der Basalbedingungen und während des Isoproterenols wird durch die Analyse von Herzfrequenz, Herzzeitvolumen, Schlagvolumen und Schlaganfallarbeit beschrieben. (C) Zusätzliche Parameter wurden analysiert, um die kardiale Kontraktilität und diastolische Funktion wie PRSW, die Relaxationskonstante Tau (Weiss-Gleichung18)und die maximale und minimale dP/dt zu bewerten. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. BPM: Schläge pro Minute; PRSW: Preload rekrutierbare Schlaganfallarbeit; n: Anzahl der Mäuse. **p < 0,01: p-Werte aus dem gepaarten Student's t-Test gegen den basalen Zustand (Isoproterenol = 0 ng/min). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Isoproterenol | Konzentration (pg/μL) | Infusionsrate (μL/min) | Dosierungen (ng/min) |
| Lager | 1000 | ||
| Verdünnung 1 | 550 | 15 | 8.25 |
| Verdünnung 2 | 165 | 15 | 2.475 |
| Verdünnung 3 | 55 | 15 | 0.825 |
| Verdünnung 4 | 16.5 | 15 | 0.2475 |
Tabelle 1. Verdünnung von Isoproterenol zur Erhöhung der β-adrenergen Stimulation. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
| Isoproterenol (ng/min) | |||||
| 0 | 0.2475 | 0.825 | 2.475 | 8.25 | |
| Globale Parameter und Volumes | |||||
| Herzfrequenz (bpm) | 470 ± 19,6 | 490 ± 19,3 | 542 ± 20,6 | 605 ± 20,5 | 638 ± 20,5 |
| Hubvolumen (μl) | 16,2 ± 2,6 | 17,6 ± 2,1 | 20,3 ± 2,8 | 22,3 ± 2,2 | 23,9 ± 2,5 |
| Herzzeitvolumen (μl/min) | 7627 ± 1210 | 8609 ± 1097 | 11000 ± 1616 | 13502 ± 1494 | 15291 ± 1761 |
| Endsystolisches Volumen (μl) | 13 ± 3.1 | 10,5 ± 3,5 | 4,81 ± 2,3 | 1,94 ± 1,9 | 1,5 ± 1,7 |
| Enddiastolisches Volumen (μl) | 27,4 ± 3 | 26,6 ± 3,0 | 24.1 ± 3.1 | 23,8 ± 2,6 | 24,8 ± 2,7 |
| Mittlerer Druck (mmHg) | 27,4 ± 2,2 | 28,6 ± 2,2 | 29,2 ± 1,9 | 29,7 ± 1,9 | 30,5 ± 1,9 |
| Arterielle Elastanz (mmHg/μl) | 4,44 ± 0,6 | 4.18 ± 0.7 | 3,46 ± 0,5 | 2,78 ± 0,9 | 2.91 ± 1 |
| Systolische Parameter | |||||
| Recruitable Stroke Work vorladen | 67,8 ± 7,62 | 76,3 ± 9,85 | 96,1 ± 14,62 | 108 ± 14.56 Uhr | 113 ± 13.02 |
| ESPVR | 4,96 ± 1,29 | 5.15 ± 1.16 | 7.2 ± 2.28 | 17.3 ± 42.04 | 40 ± 107,55 |
| Ejektionsfraktion (%) | 52.59 ± 9.57 | 60,9 ± 9,94 | 80.23 ± 8.65 | 92,16 ± 7,2 | 94.18 ± 6.15 |
| Hubarbeit (mmHg x μl) | 1007 ± 244,26 | 1153 ± 193 | 1399 ± 261 | 1582 ± 234 | 1720 ± 216 |
| Maximaler dP/dt (mmHg/s) | 6128,7 ± 1398,39 | 7087 ± 1401 | 8982,4 ± 1481 | 11422 ± 1477 | 13256 ± 1165 |
| Minimale dV/dt (μl/s) | - 523 ± 105.58 | - 613 ± 102 | - 835 ± 151 | - 1103 ± 165 | - 1273 ± 177 |
| Endsystolischer Druck (mmHg) | 70,8 ± 6,98 | 72,5 ± 7,42 | 69 ± 6,28 | 61,2 ± 17,36 | 68,2 ± 19,72 |
| Maximale Leistung (mmHg x μl/s) | 3009 ± 955,31 | 3541 ± 1188 | 4185 ± 1058 | 4272 ± 959 | 4918 ± 1418 |
| Diastolische Parameter | |||||
| EDPVR | 1 ± 0,93 | 1,23 ± 0,88 | 1,5 ± 0,86 | 1,87 ± 0,92 | 1,96 ± 0,99 |
| Tau (ms, WeissscheGleichung) | 6.14 ± 0.64 | 5,67 ± 0,44 | 4,92 ± 0,44 | 4,83 ± 0,55 | 4,96 ± 0,65 |
| Minimaler dP/dt (mmHg/s) | - 7272 ± 1403 | - 8119 ± 1295 | - 8998 ± 1240 | - 8618 ± 1129 | - 8648 ± 1468 |
| Enddiastolischer Druck (mmHg) | 5.29 ± 1.01 | 5.74 ± 1.07 | 5,6 ± 1,51 | 5.37 ± 1.13 | 5.76 ± 1.15 |
| Maximaler dV/dt (μl/s) | 765 ± 174 | 817 ± 178 | 972 ± 156 | 1158 ± 163 | 1264 ± 153 |
Tabelle 2. Analyse von PVL-Messungen in C57BL6/N-Mäusen. PVL-Parameter der Herzfunktion während basaler Bedingungen und während der Isoproterenol-Infusion. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von 18 männlichen erwachsenen Mäusen dargestellt. PV: Druckvolumen; BPM: Schläge pro Minute; ESPVR: Steigung der endsystolischen PV-Beziehung, unzureichende Berechnung bei niedrigen intraventrikulären Volumina (2,475 und 8,25 ng/min Isoproterenol); EDPVR: Enddiastolische PV-Beziehung, exponentielle Regression (Alpha-Koeffizient). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
| Delta (%) | Effektstärke | Stichprobenumfang pro Gruppe | ||||
| Isoproterenol ng/min | Isoproterenol ng/min | |||||
| 0 | 0.825 | 8.25 | 0 | 0.825 | 8.25 | |
| Herzfrequenz | ||||||
| 10 | 2.4 | 2.6 | 3.1 | 4 | 4 | 3 |
| 15 | 3.6 | 3.9 | 4.6 | 3 | 3 | 3 |
| 20 | 4.8 | 5.3 | 6.2 | 3 | 3 | 3 |
| 25 | 6.0 | 6.6 | 7.8 | 3 | 3 | 3 |
| 30 | 7.2 | 7.9 | 9.3 | 3 | 3 | 3 |
| Schlagvolumen | ||||||
| 10 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | 42 | 30 | 18 |
| 15 | 0.9 | 1.1 | 1.5 | 20 | 15 | 9 |
| 20 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 12 | 9 | 6 |
| 25 | 1.5 | 1.8 | 2.4 | 8 | 6 | 4 |
| 30 | 1.8 | 2.2 | 2.9 | 6 | 5 | 4 |
| Preload rekrutierbare Schlaganfallarbeit | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.7 | 0.9 | 21 | 38 | 22 |
| 15 | 1.3 | 1.0 | 1.3 | 10 | 18 | 11 |
| 20 | 1.8 | 1.3 | 1.7 | 7 | 11 | 7 |
| 25 | 2.2 | 1.6 | 2.2 | 5 | 7 | 5 |
| 30 | 2.7 | 2.0 | 2.6 | 4 | 6 | 4 |
| dP/dtmax | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.6 | 1.1 | 83 | 44 | 14 |
| 15 | 0.7 | 0.9 | 1.7 | 38 | 20 | 7 |
| 20 | 0.9 | 1.2 | 2.3 | 22 | 12 | 5 |
| 25 | 1.1 | 1.5 | 2.8 | 15 | 8 | 4 |
| 30 | 1.3 | 1.8 | 3.4 | 11 | 6 | 3 |
| Tau | ||||||
| 10 | 1.0 | 1.1 | 0.8 | 19 | 14 | 28 |
| 15 | 1.4 | 1.7 | 1.2 | 9 | 7 | 13 |
| 20 | 1.9 | 2.2 | 1.5 | 6 | 5 | 8 |
| 25 | 2.4 | 2.8 | 1.9 | 4 | 4 | 6 |
| 30 | 2.9 | 3.4 | 2.3 | 4 | 3 | 5 |
| dP/dtmin | ||||||
| 10 | 0.5 | 0.7 | 0.6 | 60 | 31 | 47 |
| 15 | 0.8 | 1.1 | 0.9 | 27 | 15 | 22 |
| 20 | 1.0 | 1.4 | 1.2 | 16 | 9 | 13 |
| 25 | 1.3 | 1.8 | 1.5 | 11 | 6 | 9 |
| 30 | 1.6 | 2.2 | 1.8 | 8 | 5 | 7 |
| Endsystolische Druck-Volumen-Beziehung | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.3 | 0.04 | >100 | >100 | >100 |
| 15 | 0.6 | 0.5 | 0.06 | 48 | 73 | >100 |
| 20 | 0.8 | 0.6 | 0.07 | 28 | 41 | >100 |
| 25 | 1.0 | 0.8 | 0.09 | 19 | 27 | >100 |
| 30 | 1.2 | 1.0 | 0.11 | 13 | 19 | >100 |
| Enddiastolisches Volumen | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.8 | 0.9 | 20 | 27 | 20 |
| 15 | 1.4 | 1.2 | 1.4 | 10 | 13 | 10 |
| 20 | 1.8 | 1.6 | 1.8 | 6 | 8 | 6 |
| 25 | 2.3 | 2.0 | 2.3 | 5 | 6 | 5 |
| 30 | 2.8 | 2.4 | 2.8 | 4 | 5 | 4 |
Tabelle 3. Geschätzte Effektgröße und erforderliche Stichprobengröße für ausgewählte Parameter basierend auf Werten, die bei männlichen C57BL6/N-Mäusen beobachtet wurden. Delta stellt einen hypothetischen Unterschied im Parameter zwischen einer Kontrolle (d. h. Wildtyp) und einer Behandlungsgruppe dar. Die Effektgröße und die erforderliche Stichprobengröße pro Gruppe werden anhand von Kontrolldaten (Mittelwert und Standardabweichung), Alpha-Fehler (0,05) und Leistung (0,8) über G*Power 19berechnet. Fettgedruckte Werte (grüne Hintergründe in der Online-Version der Tabelle) geben eine vorgeschlagene Schwellenwerteffektgröße (1≤) und eine Stichprobengröße für jeden Parameter für jede Isoproterenoldosis an. dP/dtmin: Minimum dP/dt; dP/dtmax: Maximale dP/dt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der in vivo Herzfunktion bei Mäusen unter zunehmender β-adrenerger Stimulation zur Verfügung. Das Verfahren kann verwendet werden, um sowohl Die Basisparameter der Herzfunktion als auch die adrenerge Reserve (z. B. Inotropie und Chronotropie) bei genetisch veränderten Mäusen oder bei Eingriffen zu adressieren. Der wichtigste Vorteil von PVL-Messungen (Pressure-Volume Loop) im Vergleich zu anderen Mitteln zur Bestimmung der Herzfunktion ist die Analyse der intrinsischen, lastunabhängigen Herzfunktion. Alle anderen Methoden (z.B. MRT und Echokardiographie) können nur belastungsabhängige Parameter der Herzfunktion beurteilen und insbesondere die Herzkontraktilität kann nicht zuverlässig bestimmt werden. Dies macht PVL-Messungen zum Goldstandard für Endpunktmessungen der Tiefenanalyse der Herzfunktion5. Die zuvor genannten Methoden ermöglichen jedoch eine sequentielle Analyse der Herzfunktion und bringen sie für Längsschnittbeobachtungen (z. B. während des Fortschreitens der Krankheit) in den Vordergrund. Darüber hinaus können intraventrikuläre Volumina und anschließend das Schlagvolumen und andere abgeleitete Parameter in PVL-Messungen im Vergleich zur MRT bei Mäusen unterschätzt werden20.
Es gibt vier kritische Schritte während des Protokolls, die entscheidend sind, um gültige PVL-Daten zu erhalten: 1) Intubation, 2) Platzierung des Oberschenkelvenenkatheters, 3) Platzierung des Druckleitfähigkeitskatheters und 4) das periprozedurale Regime. Die nicht-invasive Intubation von Mäusen erfordert einige Erfahrung und ist bei der Verwendung von Isofluran kompliziert, da der Zeitrahmen für die Intubation eng ist (20 - 40 s). Daher sollte nach der Intubation die korrekte Schlauchplatzierung sorgfältig überprüft werden, indem die mauseren Brustbewegungen bei der Veränderung der Atemfrequenz des Beatmungsgeräts untersucht werden. Um das Zeitfenster für die Intubation zu erweitern, haben wir hier die gleichzeitige Verwendung des kurz wirkenden hypnotischen Etiomidats beschrieben. Darüber hinaus stehen Lichtfasern zur Verfügung, um die Visualisierung der Stimmritze zu erleichtern16. Die richtige Platzierung des Femurvenenkatheters ist für die Anwendung von Isoproterenol in späteren Stadien unerlässlich. Während dieses Schritts kann eine Luftembolie die Tiere, die eine Lungenembolie auslösen, schwer schädigen. Die korrekte Platzierung des Oberschenkelkatheters kann zunächst durch eine sorgfältige Aspiration von venösem Blut überprüft werden. Wenn die richtige Katheterplatzierung in späteren Stadien unsicher ist, kann das enddiastolische Volumen untersucht werden, das als Reaktion auf den geringsten Bolus bei der Online-Visualisierung von PVL zunehmen sollte. Im Gegensatz zu den meisten anderen Forschern beschreiben wir hier die Kanülierung der Oberschenkelvene, während andere am häufigsten die Jugularvene als Zielgefäß für den zentralvenösen Zugangverwendeten 12,21. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass er nicht in der Nähe des Vagusnervs manipuliert wird, wie es beim close chest approach gemacht wird, wenn die Halsschlagader vorbereitet ist, und daher gehen wir davon aus, dass eine mögliche Stimulation des parasympathischen Systems durch einfaches Berühren / Schädigen des Nervs vermieden wird. Die richtige Platzierung des PV-Katheters im Ventrikel ist entscheidend, um aussagekräftige Daten zu erhalten, insbesondere in Bezug auf Volumenparameter. Wenn sich Elektroden nicht vollständig im Ventrikel befinden oder der Katheter nicht richtig entlang der Längsachse des Ventrikels platziert ist, werden die Volumenparameter stark unterschätzt. Darüber hinaus verursacht der Kontakt zwischen dem Endokard und dem Druckaufnehmer endsystolische Druckspitzen, die während der Baseline-Messungen nicht toleriert werden sollten6. Schließlich hat das periprozedurale Regime, einschließlich Anästhesietiefe und Flüssigkeitsmanagement, einen signifikanten Einfluss auf die Zuverlässigkeit der PVL-Daten bei Mäusen. Eine Unter- oder Überdosierung der Anästhesie kann beide die hämodynamischen Parameter stark beeinflussen, was meistens zu einer verminderten Herzfunktion führt. Dem Flüssigkeitsverlust, der meist auf Blutverlust und Verdunstung zurückzuführen ist, muss mit der ständigen Infusion geeigneter Lösungen wie 12,5% Albumin gelöst in 0,9% NaCl entgegengewirkt werden, was wir empfehlen. Da der Ansatz sehr invasiv ist, ist die Einbeziehung eines starken Analgetikums wie Buprenorphin nicht weniger wichtig, um Einflüsse auf herz-Kreislauf-Funktionen zu minimieren, die durch unzureichende Schmerzvermeidung hervorgerufen werden. Wir injizieren das Analgetikum vor der Intubation. Es ist wichtig, die Injektion ~ 30 Minuten vor Beginn des gesamten Verfahrens durchzuführen, insbesondere wenn der Bediener erfahren ist, und somit schnell, um eine angemessene analgetische Wirkung zu erzielen, die Schmerzen während der Untersuchungsphase vermeidet. Darüber hinaus sollten bei der Arbeit mit übergewichtigen Modellen aufgrund der hohen Lipophilie dieser Substanz wahrscheinlich höhere Dosen in Betracht gezogen werden. Schließlich kann dieses Protokoll auch modifiziert werden, um das Ansprechen auf andere katecholaminerge Reize wie Dobutamin oder Adrenalin zu bestimmen; wie zum Beispiel von Calligaris und Kollegen22, die die Analyse des intraventrikulären Drucks während der Dobutaminstimulation beschrieben.
Bei der Aufzeichnung und Analyse von PVL-Messungen sind mehrere Schritte zu beachten. Erstens ist es von überwältigender Wichtigkeit, PVL-Aufzeichnungen über einen experimentellen Datensatz hinweg konsistent zu analysieren. Respiratorische Artefakte, die sich durch abwechselnden Lungendruck entwickeln, was zu einer abwechselnden Herzvorbelastung während der mechanischen Beatmung führt, müssen vermieden werden, indem das Beatmungsgerät während der Aufnahmen ausgeschaltet wird. Um Atemwegsartefakte weiter zu eliminieren, empfehlen wir die Verwendung des Muskelrelaxans Pancuronium, um Kontraktionen des Zwerchfells zu verhindern, die häufig während der Isoflurananästhesie auftreten. Darüber hinaus ist es möglich, die Beatmung bei Endablauf zu stoppen und alle ausgewählten Schleifen zu analysieren, im Gegensatz zu anderen Protokollen, die empfehlen, 8-10 Schleifen auszuwählen und dann 5-6 endexspiratorische Schleifen zu identifizieren, die anschließend analysiert werden23. Wichtig ist, dass die Apnoe-Perioden kurz gehalten werden sollten, um eine Hypoventilation zu vermeiden, die zu Hyperkapnie und respiratorischer Azidose führt. Um die Sauerstoffversorgung zu verbessern und die Bildung von Atelektase zu verhindern, haben wir zuvor den Einsatz von PEEP-Beatmung während PVL-Messungen bei Mäusen untersucht6. Wählen Sie bei der Auswahl von Schleifen für die Analyse von Preload-unabhängigen Daten die ersten 5-6 Schleifen aus, die ein abnehmendes enddiastolisches Volumen aufweisen, und vermeiden Sie schleifen, in denen nur der Druck abnimmt, das Volumen jedoch konstant ist. Darüber hinaus sollten zusätzliche Beats nicht in die Analyse einbezogen werden, da sie die PVL-Parameter entscheidend beeinflussen. Bemerkenswerterweise treten arrhythmische Schläge am häufigsten aufgrund des Kontakts zwischen der Okklusionsnaht und dem murinen Herzen auf. Die Kalibrierung für die Parallelleitung durch Infusion von hypertoner Kochsalzlösung hat einen enormen Einfluss auf die Parameter der Herzfunktion und sollte nach unserem Verständnis am Ende eines Experiments durchgeführt werden6. Bemerkenswert ist, dass aufgrund seiner Auswirkungen auf die Herzfunktion die Kalibrierung für die parallele Leitfähigkeit nur einmal während des Protokolls durchgeführt wird. Die parallele Leitfähigkeit ändert sich jedoch während des Protokolls geringfügig, da sich die Form der Ventrikel bei adrenerger Stimulation ändert. Zulassungssysteme für PVL-Bewertungen bei Mäusen sind verfügbar, die keine Kochsalzlösungskalibrierungen benötigen und die parallele Leitfähigkeit dynamisch über PVL-Aufzeichnungen hinweg berechnen können. Die Genauigkeit dieser Methode wird jedoch noch diskutiert5,8,24,25.
Wir stellten aus unseren Beobachtungen fest, dass bei Verwendung dieses Protokolls bei erwachsenen gesunden männlichen Wildtypmäusen (d.h. C57Bl6/N) der systolische Druck im Bereich von 70 mmHg bis 90 mmHg zu Studienbeginn und zwischen 80 und 100 mmHg während der maximalen Stimulation mit dem β-Adrenorezeptor-Agonisten Isoproterenol liegt. Ebenso wurde beobachtet, dass das Schlagvolumen zu Studienbeginn im Bereich von 13 μL bis 20 μL und während der maximalen Stimulation zwischen 20 μL und 35 μL lag. Die Herzfrequenz lag zu Studienbeginn bei etwa 450 bis 520 Schlägen pro Minute und kann während der maximalen Stimulation 650 Schläge pro Minute überschreiten. In Bezug auf die preloadunabhängige kardiale Kontraktilität wurde der robusteste Parameter Preload Recruitable Stroke Work (PRSW) als ausreichend zwischen 60 mmHg und 80 mmHg zu Studienbeginn und zwischen 100 mmHg und 140 mmHg während der maximalen Stimulation angesehen. Wenn die Ausgangsparameter signifikant von den üblicherweise erhaltenen Parametern abweichen oder wenn die Herzfunktion unangemessen auf β-adrenerge Stimulation reagiert, sollten Komplikationen (z. B. unbeobachteter Blutverlust, Abfall/Anstieg der Körpertemperatur oder Anästhesie-Über-/Unterdosis) berücksichtigt werden.
Darüber hinaus können einige Artefakte bei PVL-Messungen bei Mäusen auftreten. Das häufigste Artefakt ist die endsystolische Druckspitze (ESPS, Abbildung 2C),die aus dem Kathetereinschluss resultiert und leicht durch Neupositionierung des Katheters vor den basalen Messungen bei 0 ng/min Isoproterenol reparierbar ist. Die Messungen sollten nicht beginnen, bevor ESPS unter Den Ausgangsbedingungen eliminiert werden, um aussagekräftige Daten zu erhalten, da ESPS mehrere Parameter der Herzfunktion beeinflussen kann6. Wenn jedoch ein ESPS während der inkrementellen Stimulation mit Isoproterenol aufgrund einer veränderten ventrikulären Morphologie in Messungen auftritt, die zu Studienbeginn nicht betroffen sind, ist dies nicht rektifizierbar, da die Katheterneupositionierung die parallele Leitfähigkeit während des Dosis-Wirkungs-Protokolls verändern würde. Man muss dies genau untersuchen, da auch bei diesen ESPS gezeigt wurde, dass sie Parameter der Herzfunktion nicht nur durch einen signifikant erhöhten Maximaldruck13,26,sondern auch durch eine reduzierte Volumenerkennung signifikant verändern6.
Repräsentative Werte für hämodynamische Parameter, die durch PVL-Messungen unter Ausgangsbedingungen und während der inkrementellen Stimulation mit Isoproterenol bei Mäusen erhaltenwurden,variieren stark mit verschiedenen methodischen Ansätzen und in verschiedenen Mausstämmen27,28. Darüber hinaus sollte man sich darüber im Klaren sein, dass Phänotypen genetisch veränderter Mäuse auch auf unterschiedliche genetische Hintergründe beschränkt sein können. Methodisch gibt es zwei überlegene Ansätze zur Durchführung einer Druck-Volumen-Analyse bei Mäusen. Jede Methode hat ihre (Dis-)Vorteile und die Methode der Wahl hängt oft von den Erfahrungen des Labors und seiner Forscher ab. Wir konzentrieren uns hier auf das Open-Chest-Verfahren, bei dem der Katheter über eine Punktion an der Spitze platziert wird. Dieser Ansatz hat die Weiterentwicklung der Katheterplatzierung unter Sicht, die eine präzise Katheterpositionierung ermöglicht, ein wesentlicher Prädiktor für die Aufzeichnung aussagekräftiger Daten der Herzfunktion bei Mäusen. Dies gilt insbesondere für die Erfassung von Volumenparametern im Mikroliterbereich. Im Gegensatz dazu ist ein kritischer Aspekt dieses Ansatzes der Verlust physiologischer intrathoraler Drücke, was zu kollabierenden Lungen und Atelektasebildung und einem höheren Verlust von Körperflüssigkeit führt. Durch die Verwendung der PEEP-Beatmung (Positive End-Expiratory Pressure) beschreiben wir hier jedoch eine Strategie, die nachweislich Lungenschäden während der PVL des offenen Brustkorbs bei Mäusen entgegenwirkt6. Der zweite experimentelle Ansatz besteht darin, den Katheter über die Halsschlagader und dann retrograd durch die Aortenklappe einzuführen. Durch die Verwendung dieser Technik können intrafolakale Drücke ziemlich normal gehalten werden, obwohl immer noch eine mechanische Beatmung erforderlich ist, was diesen Vorteil schwächt. Darüber hinaus schränkt der Closed-Chest-Ansatz die Möglichkeiten der Forscher für eine präzise Katheterpositionierung ein. Darüber hinaus haben PV-Katheter, die bei Mäusen verwendet werden, Durchmesser von 1 bis 1,4 Französisch (0,33 mm bis 0,47 mm), was eine signifikante Obstruktion des murinen Ausflusstraktes bei Verwendung des geschlossenen Brustansatzes impliziert, da Aorten erwachsener Mäuse typischerweise Durchmesser zwischen 0,8 mm und 1,2 mmhaben 29,30. In Bezug auf die Verwendung von PVL in Herzinsuffizienzmodellen ist der Open-Chest-Ansatz von besonderer Bedeutung für transversale Aortenverengungsmodelle, bei denen sich die Verengung zwischen der innominierten Arterie und der linken Halsschlagader befindet. Hier kann der Katheter nicht über die Halsschlagader platziert werden. Auf der anderen Seite ist der Closed-Chest-Ansatz von Interesse für Forscher, die murine Modelle von erweiterten Ventrikeln untersuchen, beispielsweise nach der Induktion eines Myokardinfarkts, bei dem eine Punktion der Spitze nicht möglich ist.
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Disclosures
Es muss kein Interessenkonflikt erklärt werden.
Acknowledgments
Wir danken Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter und dem Team der Interfakultären Biomedizinischen Forschungseinrichtung (IBF) der Universität Heidelberg für die kompetente technische Unterstützung.
Unterstützt wurde diese Arbeit vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung), dem BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung), einem baden-württembergischen Landesinnovationsfonds und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Projekt-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 und dem Sonderforschungsbereich (SFB) 1118.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
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