Summary
Aqui descrevemos uma análise de loop de volume de pressão cardíaca sob doses crescentes de isoproterenol infundido por via intravenosa para determinar a função cardíaca intrínseca e a reserva β-adrenérgica em camundongos. Utilizamos uma abordagem de peito aberto modificada para as medições de loop de volume de pressão, nas quais incluímos ventilação com pressão final-expiratória positiva.
Abstract
A determinação da função cardíaca é uma análise robusta do ponto final em modelos animais de doenças cardiovasculares, a fim de caracterizar efeitos de tratamentos específicos no coração. Devido à viabilidade das manipulações genéticas, o camundongo tornou-se o modelo animal mamífero mais comum para estudar a função cardíaca e buscar novos potenciais alvos terapêuticos. Aqui descrevemos um protocolo para determinar a função cardíaca in vivo usando medidas e análises de loop de volume de pressão durante as condições basais e sob estimulação β-adrenérgica por infusão intravenosa de concentrações crescentes de isoproterenol. Fornecemos um protocolo refinado, incluindo suporte à ventilação levando em conta a pressão final positiva para amenizar efeitos negativos durante as medidas do peito aberto e a potente analgesia (Buprenorphine) para evitar o estresse miocárdio incontrolável evocado pela dor durante o procedimento. Todos juntos, a descrição detalhada do procedimento e a discussão sobre possíveis armadilhas permitem uma análise de loop de volume de pressão altamente padronizada e reprodutível, reduzindo a exclusão dos animais da coorte experimental, prevenindo possíveis viés metodológico.
Introduction
Doenças cardiovasculares normalmente afetam a função cardíaca. Esta questão aponta a importância na avaliação da função cardíaca in vivo detalhada em modelos de doenças animais. A experimentação animal é cercada por um quadro dos três princípios orientadores de Rs (3Rs) (Reduzir/Refinar/Substituir). No caso de compreender patologias complexas envolvendo respostas sistêmicas (ou seja, doenças cardiovasculares) no nível de desenvolvimento atual, a principal opção é refinar os métodos disponíveis. O refino também levará a uma redução do número de animais necessários devido à menor variabilidade, o que melhora o poder da análise e das conclusões. Além disso, a combinação de medidas de contratilidade cardíaca com modelos animais de doença cardíaca, incluindo aqueles induzidos por estimulação neurohumoral ou por sobrecarga de pressão como banda aórtica, que imita, por exemplo, os níveis alterados de catecolamina/β-adrenérgico1,2,3,4, fornece um método poderoso para estudos pré-clínicos. Tendo em conta que o método baseado em cateter permanece a abordagem mais utilizada para uma avaliação aprofundada da contratilidade cardíaca5,pretendemos apresentar aqui uma medição refinada da função cardíaca in vivo em camundongos por medições de loop de volume de pressão (PVL) durante β-adrenérgico com base na experiência anterior, incluindo a avaliação de parâmetros específicos desta abordagem6, 7.
Para determinar parâmetros hemodinâmicos cardíacos, estão disponíveis abordagens que incluem imagens ou técnicas baseadas em cateter. Ambas as opções são acompanhadas de vantagens e desvantagens que precisam ser cuidadosamente consideradas para a respectiva questão científica. As abordagens de imagem incluem ecocardiografia e ressonância magnética (RM); ambos foram usados com sucesso em camundongos. As medições ecocardiográficas envolvem altos custos iniciais de uma sonda de alta velocidade necessária para a alta frequência cardíaca dos camundongos; é uma abordagem não invasiva relativamente simples, mas é variável entre os operadores que, idealmente, devem ser experimentados reconhecendo e visualizando estruturas cardíacas. Além disso, nenhuma medição de pressão pode ser realizada diretamente e os cálculos são obtidos a partir da combinação de magnitudes de tamanho e medições de fluxo. Por outro lado, tem a vantagem de que várias medidas podem ser realizadas na mesma função animal e cardíaca podem ser monitoradas, por exemplo, durante a progressão da doença. Quanto à medição do volume, a ressonância magnética é o procedimento padrão-ouro, mas semelhante à ecocardiografia, não são possíveis medidas diretas de pressão e apenas parâmetros dependentes de pré-carga podem ser obtidos8. Fatores limitantes também são a disponibilidade, o esforço de análise e os custos operacionais. Aqui, os métodos baseados em cateter para medir a função cardíaca são uma boa alternativa que, adicionalmente, permitem o monitoramento direto da pressão intracardica e a determinação de parâmetros de contratilidade independentes da carga, como o trabalho de acidente vascular cerebral pré-carga (PRSW)9. No entanto, os volumes ventriculares medidos por um cateter de condução de pressão (por determinação de condutividade) são menores do que os da ressonância magnética, mas as diferenças de grupo são mantidas na mesma faixa10. Para determinar valores de volume confiáveis é necessária a calibração correspondente, que é um passo crítico durante as medições pvl. Combina medições ex vivo de condutividade sanguínea em cuvetas calibradas em volume (conversão de condutância em volume) com a análise in vivo para a condutância paralela do miocárdio durante a injeção de bolus da solução salina hipertônica11,12. Além disso, o posicionamento do cateter dentro do ventrículo e a orientação correta dos eletrodos ao longo do eixo longitudinal do ventrículo são fundamentais para a capacidade de detecção do campo elétrico circundante produzido por eles. Ainda com o tamanho reduzido do coração do rato é possível evitar artefatos produzidos por alterações na orientação intraventricular do cateter, mesmo em ventrículos dilatados5,10, mas artefatos podem evoluir sob β-adrenergic stimulation6,13. Além dos métodos de condutância, o desenvolvimento do método baseado em admissão apareceu para evitar as etapas de calibração, mas aqui os valores de volume são bastante superestimados14,15.
Como o camundongo é um dos modelos pré-clínicos mais importantes em pesquisa cardiovascular e a reserva β-a reserva adrenérgica do coração é de interesse central em fisiologia cardíaca e patologia, apresentamos aqui um protocolo refinado para determinar a função cardíaca in vivo em camundongos por medições de PVL durante β-adrenergic estimulação.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram aprovados e realizados de acordo com as normas do Conselho Regional de Karlsruhe e da Universidade de Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) de acordo com as diretrizes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre a proteção dos animais utilizados para fins científicos. Os dados mostrados neste protocolo são derivados de camundongos machos do tipo selvagem C57Bl6/N (17 ± 1,4 semanas de idade). Os camundongos foram mantidos sob condições especificadas de livre de patógenos na instalação animal (IBF) da Faculdade de Medicina de Heidelberg. Os camundongos foram alojados em um ciclo claro-escuro de 12 horas, com umidade relativa entre 56-60%, uma mudança de ar 15 vezes por hora e temperatura ambiente de 22°C +/- 2°C. Foram mantidos em gaiolas convencionais tipo II ou tipo II há muito tempo fornecidos com cama animal e papéis de tecido como enriquecimento. Alimentos autoclavados padrão e água autoclavada estavam disponíveis para consumir ad libitum.
1. Elaboração de instrumentos e soluções de medicamentos
- Cateter venoso central: Corte o micro tubo (diâmetro externo de 0,6 mm) em tubos de cateter de ~20 cm de comprimento. Use fórceps para puxar uma extremidade do tubo na ponta de uma cânula de calibre 23. Corte a outra extremidade do tubo na diagonal para criar uma ponta afiada que possa perfurar a veia femoral.
- Tubo endotraqueal: Para um tubo de intubação corte uma ubula venipuncture de 20 mm de comprimento para remover o acessório da seringa.
- Se o tubo de intubação não se encaixar perfeitamente na conexão do ventilador, enrole o parafilme sobre a extremidade do tubo onde o dispositivo de ventilação está conectado. A conexão deve ser estável e selada pelo espessamento(Figura 1A). Encurte o pino guia metálico da cânula venipunctura de 20 bitolas para 2,7 cm e use-o como um auxílio de intubação. Abordagens refinadas para intubação, incluindo fibras leves para facilitar a visualização da traqueia também são bem descritas, por exemplo, por Das e colaboradores16.
- Mistura anestésica utilizada para intubação: Misture 200 μL de heparina (1000 UI/mL) com 50 μL de 0,9% NaCl e 750 μL de 2 mg/mL etomidato de um produto à base de emulsão óleo-na-água. Use 7 μL/g de peso corporal (BW) para cada rato (0,1 mg/kg BW Buprenorphine 10 mg/kg BW etomidate).
- Relaxante muscular: Dissolva 100 mg de brometo de pancurônio em 100 mL de 0,9% NaCl. Use 1,0 μL/g de peso corporal (1 mg/kg BW) para cada rato.
- Soluções de isoproterenol: Dissolver 100 mg de isoproterenol em 100 mL de 0,9% NaCl (1 μg/μL). Prepare as seguintes diluições(Tabela 1) e transfira cada uma em uma seringa de 1 mL.
- Para obter diluição 1, diluir o estoque em 1:1.8. Para obter diluição 2, diluir o estoque em 1:6. Para obter diluição 3, diluir a diluição 1 em 1:10. Por fim, obtenha diluição 4 por uma diluição de 1:10 de diluição 2.
- 15% Hypertnic NaCl (c/v): Dissolver 1,5 g de 0,9% NaCl em 10 mL de H2O. Filtrar a solução com um filtro de seringa porosa de 0,45 μm.
- Preparação de 12,5% de solução albumina (c/v): Dissolver 1,25 g de albumina de soro bovino em 10 mL de 0,9% NaCl. Incubar a solução a 37 °C por 30 min. Esfrie até a temperatura ambiente e filtre a solução com um filtro de seringa porosa de 0,45 μm.
- Preparação da configuração: Ligue primeiro a placa de aquecimento e coloque-a em 39-40 °C. Coloque uma seringa cheia de soro fisiológico na almofada de aquecimento e transfira o cateter de loop de volume de pressão (PVL) para dentro da seringa. Pré-incubar o cateter por pelo menos 30 minutos antes de ser usado para estabilização. A configuração que usamos consiste em um cateter de condução de pressão 1.4 F, uma unidade de controle e o software correspondente, e é descrito graficamente na Figura 1B e as referências do provedor estão listadas na Tabela de Materiais.
2. Anestesia
- Injete buprenorfina (0,1 mg/kg BW intraperitoneally) 30 min antes da intubação.
- Coloque o mouse em uma câmara de vidro acrílico pré-saturada com isoflurane de 2,5% e pré-aquecida com uma almofada de aquecimento colocada na base da câmara.
- Assim que o camundongo dormir (falta de reflexo), injete a mistura anestésica (7 mL/kg BW) contendo etomidato de 10 mg/kg etomidato e heparina (1.200 UI/kg BW) intraperitoneally.
3. Ventilação
- Transfira o animal para a plataforma de intubação (Figura 1C) 3-4 minutos após a injeção anestésico. O rato fica pendurado nos dentes com a visão dorsal voltada para o operador.
- Levante suavemente a língua com fórceps. Para identificar os glottis, levante ligeiramente a mandíbula inferior do rato com o segundo fórceps.
- Insira cuidadosamente o tubo endotraqueal(Figura 1A) na traqueia e remova a haste guia.
- Transfira o animal para a placa de aquecimento, coloque-o na parte de trás e conecte o tubo de intubação ao pequeno respirador animal.
- Ajuste a taxa respiratória para 53,5 x (peso corporal em gramas)-0,26 [min-1],como descrito por outros12, e volumes de maré para pico de pressões inspiratórias de 11 ± 1 cmH2O. Estabeleça um PEEP de 2 cmH2O.
- Fixar cuidadosamente as extremidades do mouse na placa de aquecimento com tiras adesivas e aplique pomada nos dois olhos para evitar o ressecamento.
- Insira uma sonda de temperatura reta e mantenha a temperatura do núcleo do núcleo a 37 ± 0,2 °C.
- Instale um ECG de 1 chumbo e monitore a frequência cardíaca on-line como um indicador para profundidade e estabilidade da anestesia.
- Após a ausência de reflexos interdigiais, injete 1 mg/kg BW do músculo relaxante pancurônio-brometo intraperitoneally. Isso previne artefatos respiratórios durante as medições de PVL.
4. Cirurgia
- Recomendações gerais
- Durante a cirurgia, ventile com ~1,5-2% de isoflurane vaporizado com O2. A concentração de isoflurane também pode depender de variáveis como cepa de camundongos, sexo, idade e peso dos animais, mas precisa ser individual e experimentalmente determinada e os valores aqui são referência para a cepa de camundongos C57BL6/N. É importante ressaltar que o ventilador está conectado a um sistema de extração para evitar que o operador inale isoflurane.
- Use uma ampliação entre 1,5-4x do microscópio estéreo para procedimentos cirúrgicos.
NOTA: Consulte orientações institucionais/locais sobre a preparação do animal para cirurgias de não sobrevivência.
- Cannulação femoral
- Enxágüe a linha traseira com 70% de etanol, incisee a região inguinal esquerda e exponha a veia femoral esquerda.
- Exploda a artéria epigástrica e a veia com um cautery.
- Ligate a veia femoral com uma sutura colocada distal ao acesso ao cateter.
- Passe uma sutura sob a veia femoral e prepare um nó craniano de perfuração. Puna a veia femoral com o micro tubo preparado (ver passo 1.1) preso a uma seringa de 1 mL.
- Amarre o nó para consertar o tubo dentro do vaso.
- Contra-ação perda de fluido pela infusão de 0,9% NaCl complementada com 12,5% de albumina a uma taxa de infusão de 15 μL/min com uma bomba de seringa automática. Além disso, mantenha o tecido exposto úmido usando 0,9% de NaCl pré-aquecido.
- Toracotomia
- Enxágüe o tórax com 70% de etanol.
- Incisar a pele logo abaixo do processo xifoide e separar sem rodeios os músculos peitorais da parede do peito com fórceps ou um cautery.
- Levante o processo xifoide com fórceps e, em seguida, corte através da parede do peito movendo-se lateralmente em ambos os lados com um cauterismo até que o diafragma seja totalmente visível por baixo.
- Incisar o diafragma por baixo e expor o ápice cardíaco. Em seguida, remova cuidadosamente o pericárdio com fórceps.
- Realize uma costotomia limitada no lado esquerdo como descrito anteriormente6.
- Passe uma sutura sob a veia caval inferior para realizar a redução da pré-carga durante os estágios posteriores.
- Puna suavemente o ápice cardíaco com uma cânula de 25 mm (máximo de 4 mm). Remova a cânula e insira o cateter FOTOVOLTAICO até que todos os eletrodos estejam dentro do ventrículo.
- Ajuste a posição do cateter por movimentos suaves e giros até que sejam obtidas alças em forma retangular(Figura 2A).
- Mantenha sempre todos os tecidos expostos úmidos usando 0,9% de NaCl pré-aquecido.
5. Medições
- Recomendações gerais
- Durante as medições, ventile com ~1,5-2% de isoflurane vaporizado com 100% O2.
- Realize 2 medidas de linha de base, bem como 2 oclusãos de vena cava em cada etapa do protocolo de resposta à dose.
NOTA: É importante que após a primeira e segunda oclusão vena cava, tanto os valores de pressão quanto de volume retornem aos valores de estado estável como antes da primeira oclusão. Esta observação é necessária para reconhecer uma mudança na posição do cateter devido a reduções seriais no volume intraventricular. Se uma mudança na posição do cateter fosse o caso, especialmente os valores de volume seriam deslocados.
- Realize uma análise on-line dos parâmetros (frequência cardíaca, volume de derrame, dP/dtmax) e espere até obter a função cardíaca de estado estável. Para a faixa de parâmetros esperada com a configuração aqui utilizada em camundongos C57Bl6/N, consulte os resultados publicados6.
- Pare o respirador na posição expiratória final e regise parâmetros de linha de base. Após 3 a 5 segundos reduza a carga cardíaca levantando a sutura abaixo da veia caval inferior com fórceps, a fim de obter parâmetros independentes de pré-carga(Figura 2B). Ligue o ventilador. Espere pelo menos 30 segundos para a segunda oclusão até que os parâmetros hemodinâmicos sejam estabilizados.
- Após a obtenção das medidas em condições basais proceder à dose-resposta de isoproterenol, mudando para as seringas preparadas. Aqui a taxa de infusão permanece inalterada para evitar modificações da pré-carga cardíaca. Tome cuidado para não infundir bolhas de ar ao trocar a seringa.
- Espere pelo menos 2 minutos até que uma nova função cardíaca de estado estável seja obtida do que parar novamente o respirador na posição expiratória final e registrar parâmetros de linha de base. Após 3 a 5 segundos reduza a carga cardíaca levantando a sutura abaixo da veia caval inferior, a fim de obter parâmetros independentes de pré-carga.
- Espere pelo menos 30 segundos pela segunda oclusão. Depois mudando para a seringa preparada com a próxima concentração isoproterenol e repetir as gravações dos parâmetros independentes de linha de base e pré-carga.
NOTA: Artefatos como o pico de pressão sistólica final (ESPS, Figura 2C) podem ocorrer durante o aumento da dosagem de isoproterenol, que resulta da armadilha do cateter. Artefatos que ocorrem antes do início dos parâmetros basais podem ser facilmente corrigidos através do ree posicionado do cateter.
6. Calibração
NOTA: Os procedimentos de calibração podem variar dependendo do sistema PVL utilizado.
- Calibração de condução paralela
- Conecte uma seringa contendo uma solução naCl de 15% à cânula femoral após a última medição da dose-resposta isoproterenol. Infundir cuidadosamente 5 μL da solução hipertônica restante no tubo até que pvl mude ligeiramente para a direita durante a visualização on-line. Então espere até que os laços voltem ao estado estável.
- Pare o respirador no final da expiração e injete um bolus de 10 μL de 15% de NaCl dentro de 2 a 3 segundos. Verifique se o PVL se expande em grande parte e será deslocado para a direita durante a visualização on-line.
- Calibração conduance-volume
- Espere 5 min, nada menos, para que o bolus salino hipertônico seja completamente diluído. Depois remova o cateter e retire pelo menos 600 μL de sangue do ventrículo esquerdo do coração pulsante usando uma seringa de 1 mL e uma cânula de 21 calibres. Neste momento, o animal é eutanizado sob anestesia profunda e analgesia por hemorragia maciça, parando a ventilação e remoção do coração.
- Transfira o sangue para o cuvette de calibração pré-aquecido (em banho-maria a 37 °C) com cilindros de volume conhecido. Coloque o cateter PV centralizado em cada cilindro e regisse a condução. Ao calcular uma curva padrão para cada animal, as unidades de condução podem ser convertidas em valores absolutos de volume.
7. Análise
- Após medições bem sucedidas de PVL em condições basais e estimulação isoproterenol, visualize, digitalize, calcule e extraia parâmetros caracterizando função cardíaca (como PRSW, dP/dt, pressão e volume diastólico final, pressão e volume sistólica final, tensão e volume de relaxamento constantes, entre outros) utilizando um software de análise PVL apropriado. Análises estatísticas adicionais e representações gráficas podem ser realizadas com software de análise padrão.
- Análise de parâmetros independentes de pré-carga
NOTA: Para esta etapa é crucial padronizar o procedimento.- Selecione os primeiros 5-6 PVLs mostrando a diminuição da pré-carga em todas as medições para a análise de parâmetros independentes de pré-carga(Figura 2D). Um número constante de PVLs selecionados para análise durante a redução da pré-carga diminuirá a variabilidade entre as medições dos parâmetros obtidos.
- Calcule o valor médio das duas medidas em cada etapa do protocolo.
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Representative Results
A medição do ciclo de volume de pressão (PVL) é uma ferramenta poderosa para analisar a farmacodinâmica cardíaca de drogas e investigar o fenótipo cardíaco de modelos de camundongos geneticamente modificados em condições normais e patológicas. O protocolo permite a avaliação da reserva cardíaca β-adrenérgica no modelo de camundongo adulto. Aqui descrevemos um método de peito aberto sob anestesia isoflurano combinada com buprenorfina (analgésico) e pancurônio (relaxante muscular), que se concentra na resposta cardíaca à estimulação β-adrenérgica, infundindo concentrações de isoproterenol através de um cateter venoso femoral. Alguns dados representativos mostrados neste protocolo são derivados de camundongos machos adultos do tipo selvagem C57Bl6/N(Figura 3 e Tabela 2). Como indicador da variabilidade de alguns parâmetros importantes medidos pela nossa análise PVL, realizamos uma análise de potência (α probabilidade de erro de 0,05 e potência de 0,8) utilizando os resultados do grupo WT e do software G*Power disponívelgratuitamente 17. Na Tabela 3 são retratados os tamanhos de efeito calculados e os tamanhos amostrais necessários para a frequência cardíaca, PRSW, volume de traçado, a constante de relaxamento Tau, dP/dtmax e dP/dtmin assumindo alterações entre 10% e 30% para cada parâmetro abaixo de 0, 0,825 e 8,25 ng/min isoproterenol.
A análise gráfica das relações de volume de pressão é feita por plotagem de volume (μL) no Y- e pressão (mmHg) no eixo X. Se o cateter for colocado corretamente dentro do ventrículo, um ciclo cardíaco completo é representado por um PVL em forma retangular(Figura 2A e Figura 3A). Em breve, o sístole começa com uma fase de contração isovolumétrica (caracterizada por dP/dtmax),durante a qual ambas as válvulas cardíacas são fechadas (borda vertical direita). Quando a pressão ventricular excede a pressão aórtica, a válvula aórtica se abre e o sangue é bombeado para dentro da aorta durante a fase de ejeção (horizontal superior). Posteriormente, quando a pressão aórtica excede a pressão ventricular, a válvula aórtica se fecha e a diastola começa. Durante o relaxamento isovolumétrico (caracterizado pelos parâmetros dP/dtmin e Tau) a pressão ventricular cai até que a pressão atrial exceda a pressão ventricular e a válvula mitral se abra (borda vertical esquerda). Agora, o preenchimento diastólico passivo, caracterizado pela relação de pressão-volume de pressão /egâmica final (EDPVR), ocorre até o próximo ciclo cardíaco começar (horizontal inferior)(Figura 2A-B).
A análise PVL fornece insights detalhados sobre a função cardíaca, uma vez que é capaz de determinar a função cardíaca independente da pré-carga cardíaca. Assim, tem sido descrito como o padrão-ouro para determinar a função cardíaca em configurações experimentais5. No protocolo descrito utilizando camundongos C57Bl6/N, avaliamos a resposta ao isoproterenol produzido em parâmetros gerais de função cardíaca, como frequência cardíaca, saída cardíaca, volume de derrame e trabalho vascular cerebral. Um efeito significativo de isoproterenol em cada parâmetro é observado na resposta da dose em diferentes concentrações isoproterenol(Figura 3B). Parâmetros de contrailidade cardíaca como PRSW e dP/dtmax mostraram o aumento esperado na dose-resposta sob infusão de isoproterenol(Figura 3A-B). Por outro lado, foi registrada uma redução nos parâmetros diastólicos (constante de relaxamento Tau e dP/dtmin)com o aumento das concentrações de isoproterenol(Figura 3C)como sendo esperado a partir de um efeito lusitrópico positivo produzido por catecolaminas no coração saudável. Outros parâmetros dos apresentados na Figura 3 (ou seja, pressão e volume sistólico final, pressão e volume diastólicos finais, pressão máxima, entre outros) são obtidos também a partir da análise PVL e também podem ser analisados dependendo da questão científica, do modelo genético ou da doença e observações obtidas. Valores adicionais e detalhados para os parâmetros mais comuns da função cardíaca em PVL em cada etapa durante a estimulação incremental β-adrenérgica, incluindo o ponto de tempo de calibração para condução paralela com soronina hipertônica que influencia muito os parâmetros de volume cardíaco, mas também a inotropia cardíaca e o relaxamento, foram previamente relatados1,6.
Figura 1. Instalação de ciclo de anestesia e volume de pressão. (A) venipuncture-cânula de 20 mm adaptada para intubação do rato. (B) Diagrama mostrando a organização e conexão dos diferentes componentes da configuração de medição de volume de pressão utilizada, incluindo a direção de fluxo do gás anestésico. (C) Plataforma de intubação usada para pendurar os ratos para uma intubação rápida e segura. Parafusos (i) em ambos os lados na extremidade da rosca suspensa (ii) estão incluídos para apertar a ameaça dependendo do peso do mouse. A seta indica uma possibilidade de conexão para exposição isoflurane. Temperatura; ECG: Eletrocardiograma; MinPexp: Pressão expiratória mínima; MaxPexp: Pressão expiratória máxima; PV: Volume de pressão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise representativa do volume de pressão. (A) Gravações exemplares de volume de pressão onde os parâmetros analisados durante a medição basal são mostrados e os principais eventos durante o ciclo cardíaco são retratados. (B) Os parâmetros ESPVR, EDPVR e PRSW são retratados durante a pré-redução da carga. (C) Picos de pressão sistólicas finais durante as medições basais (painel superior) ou durante a manobra de oclusão (painel inferior) ambos sob estimulação isoproterenol são apresentados. LV: Ventricular esquerdo; dP/dtmin: DP/dt mínimo; dP/dtmax: Máximo dP/dt; Ves: Volume sistólico final; Ved: Volume diastólico final; ESPVR: Relação fim-sistólica de volume de pressão; PRSW: Trabalho de traçado pré-carregado; EDPVR: Relação fim diastólico de volume de pressão. A figura foi adaptada a partir do suplemento do nosso trabalho anterior 20196. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise de medições de PVL em camundongos C57BL6/N. (A) PvLs representativos durante a oclusão da veia caval inferior dos ratos de controle C57BL6/N e submetidos ao aumento das concentrações de isoproterenol. (B) A função cardíaca geral durante as condições basais e durante o isoproterenol é descrita pela análise da frequência cardíaca, saída cardíaca, volume de derrame e trabalho vascular cerebral. (C) Foram analisados parâmetros adicionais para avaliar a contratude cardíaca e a função diastólica como PRSW, a constante de relaxamento Tau (Weiss Equation18) e o dP/dt máximo e mínimo. Os dados são apresentados como ± desvio padrão. BPM: Batidas por minuto; PRSW: Trabalho de traçado pré-carregado; n: número de ratos. **p < 0,01: p-valores do t-teste do aluno emparelhado contra a condição basal (isoproterenol = 0 ng/min). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Isoproterenol | Concentração (pg/μL) | Taxa de infusão (μL/min) | Doses (ng/min) |
| Estoque | 1000 | ||
| Diluição 1 | 550 | 15 | 8.25 |
| Diluição 2 | 165 | 15 | 2.475 |
| Diluição 3 | 55 | 15 | 0.825 |
| Diluição 4 | 16.5 | 15 | 0.2475 |
Mesa 1. Diluição de isoproterenol para aumentar a estimulação β-adrenérgica. Clique aqui para baixar esta tabela.
| Isoproterenol (ng/min) | |||||
| 0 | 0.2475 | 0.825 | 2.475 | 8.25 | |
| Parâmetros e Volumes Globais | |||||
| Frequência cardíaca (bpm) | 470 ± 19,6 | 490 ± 19,3 | 542 ± 20.6 | 605 ± 20,5 | 638 ± 20,5 |
| Volume de traçado (μl) | 16.2 ± 2.6 | 17.6 ± 2.1 | 20.3 ± 2.8 | 22.3 ± 2.2 | 23.9 ± 2.5 |
| Saída cardíaca (μl/min) | 7627 ± 1210 | 8609 ± 1097 | 11000 ± 1616 | 13502 ± 1494 | 15291 ± 1761 |
| Volume sistólico final (μl) | 13 ± 3.1 | 10.5 ± 3.5 | 4.81 ± 2.3 | 1,94 ± 1,9 | 1,5 ± 1,7 |
| Volume diastólico final (μl) | 27.4 ± 3 | 26,6 ± 3.0 | 24.1 ± 3.1 | 23,8 ± 2,6 | 24,8 ± 2,7 |
| Pressão média (mmHg) | 27.4 ± 2.2 | 28.6 ± 2.2 | 29.2 ± 1.9 | 29,7 ± 1,9 | 30.5 ± 1.9 |
| Elastance Arterial (mmHg/μl) | 4.44 ± 0.6 | 4.18 ± 0.7 | 3.46 ± 0,5 | 2,78 ± 0,9 | 2.91 ± 1 |
| Parâmetros sistólicos | |||||
| Trabalho de traçado pré-carregado | 67.8 ± 7.62 | 76.3 ± 9.85 | 96.1 ± 14.62 | 108 ± 14.56 | 113 ± 13.02 |
| ESPVR | 4.96 ± 1.29 | 5.15 ± 1.16 | 7.2 ± 2.28 | 17.3 ± 42.04 | 40 ± 107,55 |
| Fração de ejeção (%) | 52.59 ± 9.57 | 60.9 ± 9.94 | 80.23 ± 8.65 | 92.16 ± 7.2 | 94.18 ± 6.15 |
| Trabalho de traçado (mmHg x μl) | 1007 ± 244.26 | 1153 ± 193 | 1399 ± 261 | 1582 ± 234 | 1720 ± 216 |
| DP/dt máximo (mmHg/s) | 6128,7 ± 1398,39 | 7087 ± 1401 | 8982,4 ± 1481 | 11422 ± 1477 | 13256 ± 1165 |
| Mínimo dV/dt (μl/s) | - 523 ± 105,58 | - 613 ± 102 | - 835 ± 151 | - 1103 ± 165 | - 1273 ± 177 |
| Pressão sistólica final (mmHg) | 70.8 ± 6.98 | 72,5 ± 7.42 | 69 ± 6.28 | 61.2 ± 17.36 | 68.2 ± 19.72 |
| Potência Máxima (mmHg x μl/s) | 3009 ± 955.31 | 3541 ± 1188 | 4185 ± 1058 | 4272 ± 959 | 4918 ± 1418 |
| Parâmetros diastólicos | |||||
| EDPVR | 1 ± 0,93 | 1.23 ± 0,88 | 1.5 ± 0,86 | 1,87 ± 0,92 | 1,96 ± 0,99 |
| Tau (ms, equação deWeiss) | 6.14 ± 0.64 | 5.67 ± 0.44 | 4.92 ± 0.44 | 4.83 ± 0,55 | 4.96 ± 0,65 |
| DP/dt mínimo (mmHg/s) | - 7272 ± 1403 | - 8119 ± 1295 | - 8998 ± 1240 | - 8618 ± 1129 | - 8648 ± 1468 |
| Pressão diastólica final (mmHg) | 5.29 ± 1.01 | 5.74 ± 1.07 | 5.6 ± 1,51 | 5.37 ± 1.13 | 5.76 ± 1.15 |
| DV/dt máximo (μl/s) | 765 ± 174 | 817 ± 178 | 972 ± 156 | 1158 ± 163 | 1264 ± 153 |
Mesa 2. Análise de medições de PVL em camundongos C57BL6/N. Parâmetros PVL de função cardíaca durante as condições basais e durante a infusão de isoproterenol. Os dados são apresentados como ± desvio padrão de 18 camundongos adultos do sexo masculino. PV: Volume de pressão; BPM: Batidas por minuto; ESPVR: Inclinação de Foto-Relacionamento PV sistólica final, cálculo insuficiente em volumes intra-ventriculares baixos (2.475 e 8,25 ng/min Isoproterenol); EDPVR: Focampisto-Foto-Relacionamento, regressão exponencial (coeficiente alfa). Clique aqui para baixar esta tabela.
| Delta (%) | Tamanho do efeito | Tamanho da amostra por grupo | ||||
| Isoproterenol ng/min | Isoproterenol ng/min | |||||
| 0 | 0.825 | 8.25 | 0 | 0.825 | 8.25 | |
| Frequência cardíaca | ||||||
| 10 | 2.4 | 2.6 | 3.1 | 4 | 4 | 3 |
| 15 | 3.6 | 3.9 | 4.6 | 3 | 3 | 3 |
| 20 | 4.8 | 5.3 | 6.2 | 3 | 3 | 3 |
| 25 | 6.0 | 6.6 | 7.8 | 3 | 3 | 3 |
| 30 | 7.2 | 7.9 | 9.3 | 3 | 3 | 3 |
| Volume de traçado | ||||||
| 10 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | 42 | 30 | 18 |
| 15 | 0.9 | 1.1 | 1.5 | 20 | 15 | 9 |
| 20 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 12 | 9 | 6 |
| 25 | 1.5 | 1.8 | 2.4 | 8 | 6 | 4 |
| 30 | 1.8 | 2.2 | 2.9 | 6 | 5 | 4 |
| Trabalho de traçado pré-carregado | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.7 | 0.9 | 21 | 38 | 22 |
| 15 | 1.3 | 1.0 | 1.3 | 10 | 18 | 11 |
| 20 | 1.8 | 1.3 | 1.7 | 7 | 11 | 7 |
| 25 | 2.2 | 1.6 | 2.2 | 5 | 7 | 5 |
| 30 | 2.7 | 2.0 | 2.6 | 4 | 6 | 4 |
| dP/dtmax | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.6 | 1.1 | 83 | 44 | 14 |
| 15 | 0.7 | 0.9 | 1.7 | 38 | 20 | 7 |
| 20 | 0.9 | 1.2 | 2.3 | 22 | 12 | 5 |
| 25 | 1.1 | 1.5 | 2.8 | 15 | 8 | 4 |
| 30 | 1.3 | 1.8 | 3.4 | 11 | 6 | 3 |
| Tau | ||||||
| 10 | 1.0 | 1.1 | 0.8 | 19 | 14 | 28 |
| 15 | 1.4 | 1.7 | 1.2 | 9 | 7 | 13 |
| 20 | 1.9 | 2.2 | 1.5 | 6 | 5 | 8 |
| 25 | 2.4 | 2.8 | 1.9 | 4 | 4 | 6 |
| 30 | 2.9 | 3.4 | 2.3 | 4 | 3 | 5 |
| dP/dtmin | ||||||
| 10 | 0.5 | 0.7 | 0.6 | 60 | 31 | 47 |
| 15 | 0.8 | 1.1 | 0.9 | 27 | 15 | 22 |
| 20 | 1.0 | 1.4 | 1.2 | 16 | 9 | 13 |
| 25 | 1.3 | 1.8 | 1.5 | 11 | 6 | 9 |
| 30 | 1.6 | 2.2 | 1.8 | 8 | 5 | 7 |
| Relação fim-sistólica de volume de pressão | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.3 | 0.04 | >100 | >100 | >100 |
| 15 | 0.6 | 0.5 | 0.06 | 48 | 73 | >100 |
| 20 | 0.8 | 0.6 | 0.07 | 28 | 41 | >100 |
| 25 | 1.0 | 0.8 | 0.09 | 19 | 27 | >100 |
| 30 | 1.2 | 1.0 | 0.11 | 13 | 19 | >100 |
| Volume diastólico final | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.8 | 0.9 | 20 | 27 | 20 |
| 15 | 1.4 | 1.2 | 1.4 | 10 | 13 | 10 |
| 20 | 1.8 | 1.6 | 1.8 | 6 | 8 | 6 |
| 25 | 2.3 | 2.0 | 2.3 | 5 | 6 | 5 |
| 30 | 2.8 | 2.4 | 2.8 | 4 | 5 | 4 |
Mesa 3. Tamanho estimado do efeito e tamanho amostral necessário para parâmetros selecionados com base nos valores observados em camundongos machos C57BL6/N. Delta retrata uma diferença hipotética no parâmetro entre um controle (ou seja, tipo selvagem) e um grupo de tratamento. O tamanho do efeito e o tamanho da amostra exigido por grupo são calculados utilizando dados de controle (média e desvio padrão), erro alfa (0,05) e potência (0,8) via G*Power 19. Valores em negrito (fundos verdes na versão on-line da tabela) indicam um tamanho sugerido de efeito limiar (1≤) e tamanho da amostra para cada parâmetro em cada dose de isoproterenol. dP/dtmin: DP/dt mínimo; dP/dtmax: Máximo dP/dt. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo para analisar a função cardíaca in vivo em camundongos sob crescente estimulação β-adrenérgica. O procedimento pode ser usado para abordar ambos os parâmetros de linha de base da função cardíaca e a reserva adrenérgica (por exemplo, inotropia e cronotropia) em camundongos geneticamente modificados ou após intervenções. A vantagem mais proeminente das medidas de ciclo de volume de pressão (PVL) em comparação com outros meios de determinação da função cardíaca é a análise da função cardíaca intrínseca e independente da carga. Todos os outros métodos (por exemplo, ressonância magnética e ecocardiografia) só podem avaliar parâmetros dependentes da carga da função cardíaca e, especialmente, a contratude cardíaca não pode ser determinada de forma confiável. Isso faz com que as medidas pvl o padrão ouro para medições de ponto final de análise aprofundada da função cardíaca5. No entanto, os métodos nomeados antes permitem a análise sequencial da função cardíaca, trazendo-os à vanguarda para observações longitudinais (por exemplo, durante a progressão da doença). Além disso, volumes intraventriculares e, posteriormente, volume de traçado e outros parâmetros derivados podem ser subestimados em medições de PVL em comparação com a ressonância magnética em camundongos20.
Existem quatro etapas críticas durante o protocolo que são cruciais para a obtenção de dados pvl válidos: 1) Intubação, 2) colocação do cateter vesícula femoral, 3) colocação do cateter de condumento de pressão e 4) do regime periprocedural. A intubação não invasiva de camundongos requer alguma experiência e é complicada ao usar isoflurane, pois o prazo para intubação é estreito (20 - 40 s). Assim, após a intubação, a colocação correta do tubo deve ser cuidadosamente verificada examinando os movimentos torácicos murinos ao alterar a taxa respiratória dos ventiladores. Para ampliar a janela para a intubação, descrevemos aqui o uso concomitante do etomidate hipnótico de ação curta. Além disso, fibras leves para facilitar a visualização dos glottis estão disponíveis16. A colocação adequada do cateter venoso femoral é essencial para a aplicação de isoproterenol durante estágios posteriores. Durante esta etapa, a embolia do ar pode prejudicar severamente os animais induzindo embolia pulmonar. A colocação correta do cateter femoral pode inicialmente ser verificada por uma aspiração cuidadosa de sangue venoso. Quando a colocação adequada do cateter é incerta durante os estágios posteriores, o volume de diastólica final pode ser examinado, o que deve aumentar em resposta ao menor bolus ao visualizar PVL on-line. Ao contrário da maioria dos outros investigadores, descrevemos aqui a canulação da veia femoral, enquanto outros mais frequentemente usavam a veia jugular como o vaso alvo para o acesso venoso central12,21. Essa abordagem tem a vantagem de não manipular perto do nervo vagal, como feito na abordagem do peito próximo quando a carótida é preparada, e assim assumimos que a estimulação potencial do sistema parassimpático simplesmente toca/danifica o nervo é evitada. A colocação adequada do cateter fotovoltaico dentro do ventrículo é crucial para obter dados significativos especialmente no que diz respeito aos parâmetros de volume. Quando os eletrodos não estão completamente dentro do ventrículo ou o cateter não é colocado adequadamente ao longo do eixo longitudinal do ventrículo, os parâmetros de volume são altamente subestimados. Além disso, o contato entre o endocárdio e o transdutor de pressão causa picos de pressão sistólica final que não devem ser tolerados durante as medições da linha de base6. Por fim, o regime periprocedural, incluindo a profundidade da anestesia e o gerenciamento de fluidos, tem um impacto significativo na confiabilidade dos dados PVL em camundongos. A subessotésico ou a superdosagem podem afetar severamente parâmetros hemodinâmicos, resultando na redução da função cardíaca. A perda de fluidos, que é principalmente devido à perda de sangue e evaporação, deve ser neutralizada com a infusão constante de soluções adequadas, como 12,5% de albumina dissolvida em 0,9% NaCl, o que recomendamos. Sendo que a abordagem é muito invasiva, não menos importante é a inclusão de um analgésico potente como o Buprenorphine para minimizar influências nas funções cardiovasculares evocadas pela insuficiência de evitar a dor. Injetamos a droga analgésica antes da intubação. É importante realizar a injeção ~30 minutos antes de iniciar todo o procedimento, especialmente se o operador for experimentado, e, portanto, rápido, a fim de alcançar um efeito analgésico adequado evitando qualquer dor durante a fase de investigação. Além disso, ao trabalhar com modelos obesos provavelmente doses mais altas devem ser consideradas devido à alta lipofilia desta substância. Finalmente, este protocolo também pode ser modificado na determinação da resposta a outros estímulos catecolamanérgicos, como dobutamina ou epinefrina; como por exemplo feito por Calligaris e colegas22 que descreveram a análise na pressão intraventricular durante a estimulação da dobutamina.
Quanto ao registro e análise das medições de PVL, existem várias etapas que precisam ser consideradas. Em primeiro lugar, é de grande importância analisar consistentemente gravações de PVL em um conjunto experimental de dados. Artefatos respiratórios que evoluem devido à pressão pulmonar alternada, resultando em pré-carga cardíaca alternada durante a ventilação mecânica, precisam ser evitados desligando o ventilador durante as gravações. Para eliminar ainda mais os artefatos respiratórios, recomendamos o uso do pancurônio relaxante muscular, a fim de evitar contrações do diafragma que são frequentemente vistas durante a anestesia isoflurane. Além disso, torna-se viável parar a ventilação no final da expiração e analisar todos os loops selecionados, em contraste com outros protocolos recomendando selecionar 8-10 loops e, em seguida, identificar loops finais de 5-6 que são posteriormente analisados23. É importante ressaltar que períodos de apneia devem ser mantidos curtos para evitar hipoventilação resultando em hipercapnia e acidose respiratória. Para melhorar a oxigenação e prevenir a formação de atelectasia, examinamos previamente o uso de ventilação peep durante medições de PVL em camundongos6. Ao selecionar loops para a análise de dados independentes pré-carga, selecione os primeiros loops 5-6 mostrando o volume final de diastólicas e evite incluir loops onde apenas a pressão está diminuindo, mas o volume é constante. Além disso, as batidas extras não devem ser incluídas na análise, pois afetam crucialmente os parâmetros PVL. Notavelmente, na maioria das vezes as batidas arrítmicas ocorrem devido ao contato entre a sutura de oclusão e o coração murino. A calibração para condutância paralela via infusão de soro fisiológico hipertônico tem um tremendo impacto sobre os parâmetros da função cardíaca e deve, para nossa compreensão, ser realizada no final de um experimento6. Notavelmente, devido ao seu impacto na função cardíaca, a calibração para condução paralela é realizada apenas uma vez durante o protocolo. No entanto, a conduance paralela muda ligeiramente durante o protocolo, devido a mudanças na forma dos ventrículos após a estimulação adrenérgica. Sistemas de admissão para avaliações de PVL em camundongos estão disponíveis que não têm necessidade de calibrações salinas e podem calcular a condutância paralela dinamicamente ao longo das gravações pvl. No entanto, a exatidão deste método ainda está em debate5,8,24,25.
Determinamos a partir de nossas observações que ao usar este protocolo em camundongos machos adultos e saudáveis (ou seja, C57Bl6/N), a pressão sistólica está na faixa de 70 mmHg a 90 mmHg na linha de base e entre 80 e 100 mmHg durante a estimulação máxima com o isoproterenol agonista agonista β.adrenor. Da mesma forma, observou-se que o volume de avc foi observado na faixa de 13 μL a 20 μL na linha de base e entre 20 μL e 35 μL durante a estimulação máxima. A frequência cardíaca foi de cerca de 450 a 520 batidas por minuto na linha de base e pode muito bem exceder 650 batidas por minuto durante a estimulação máxima. Quanto à contratilidade cardíaca pré-carga independente, o trabalho de avc pré-carga pré-carga mais robusto (PRSW) foi considerado adequado entre 60 mmHg a 80 mmHg na linha de base e entre 100 mmHg e 140 mmHg durante a estimulação máxima. Se os parâmetros de linha de base divergem significativamente dos normalmente obtidos, ou quando a função cardíaca reage inadequadamente à estimulação β-adrenérgica, as complicações (por exemplo, perda de sangue não observada, queda/aumento da temperatura corporal ou anestésico sobre/sob dose) devem ser levadas em consideração.
Além disso, alguns artefatos podem surgir durante as medições de PVL em camundongos. O artefato mais comum é o pico de pressão sistólica final (ESPS, Figura 2C), que resulta da armadilha do cateter e é facilmente reticificável reparando o cateter antes das medições basais em 0ng/min isoproterenol. As medições não devem ser iniciadas antes que os ESPSs sejam erradicados em condições básicas para obter dados significativos, pois o ESPS pode afetar vários parâmetros da função cardíaca6. No entanto, quando um ESPS ocorre durante a estimulação incremental com isoproterenol devido à morfologia ventricular alterada em medidas não afetadas na linha de base, isso não é retificável, uma vez que o reposicionamento do cateter alteraria a condutância paralela durante o protocolo de resposta à dose. É preciso examinar isso de perto, pois, da mesma forma, esses ESPSs têm sido mostrados para alterar significativamente parâmetros da função cardíaca não apenas através de uma pressão máxima significativamente aumentada13,26, mas também através da redução da detecção de volume6.
Os valores representativos para parâmetros hemodinâmicos obtidos por medições de PVL sob condições básicas e durante a estimulação incremental com isoproterenol em camundongos variam amplamente com diferentes abordagens metodológicas e em diferentes cepas de camundongos27,28. Além disso, deve-se estar ciente de que fenótipos de camundongos geneticamente alterados também podem ser restritos a diferentes origens genéticas. Metodologicamente, existem duas abordagens primordiais de realização de análises de volume de pressão em camundongos. Cada método tem suas (des)vantagens e o método de escolha muitas vezes depende das experiências do laboratório e de seus investigadores. Nós aqui focamos no procedimento de peito aberto, no qual o cateter é colocado através de uma punção no ápice. Esta abordagem tem o avanço da colocação do cateter sob visão que permite o posicionamento preciso do cateter, um preditor essencial para o registro de dados significativos da função cardíaca em camundongos. Isso é particularmente verdadeiro para o registro de parâmetros de volume na gama de microliters. Em contraste, um aspecto crítico dessa abordagem é a perda de pressões fisiológicas intra-torácicas, resultando em colapso pulmonar e formação de atelectasia e maior perda de fluido corporal. No entanto, usando ventilação positiva de pressão final-expiratória (PEEP), descrevemos aqui uma estratégia que provou neutralizar danos pulmonares durante pvl de peito aberto em camundongos6. A segunda abordagem experimental é inserir o cateter através da artéria carótida e, em seguida, retrógradamente através da válvula aórtica. Usando essa técnica, as pressões intra-torácicas podem ser mantidas bastante normais, embora ainda seja necessária ventilação mecânica, o que enfraquece essa vantagem. Além disso, a abordagem de peito fechado limita as possibilidades dos investigadores para um posicionamento preciso do cateter. Além disso, os cateteres fotovoltaicos utilizados em camundongos têm diâmetros que variam de 1 a 1,4 francês (0,33 mm a 0,47 mm), o que implica uma obstrução significativa do trato de saída murina ao utilizar a abordagem do peito fechado, já que aortas de camundongos adultos normalmente têm diâmetros entre 0,8 mm e 1,2 mm29,30. Quanto ao uso de PVL em modelos de insuficiência cardíaca, a abordagem de peito aberto é de particular importância para modelos de constrição aórtica transversal, onde a constrição está localizada entre a artéria innominada e a artéria carótida esquerda. Aqui o cateter não pode ser colocado através da artéria carótida. Por outro lado, a abordagem de peito fechado é de interesse dos pesquisadores que investigam modelos murinos de ventrículos dilatados, como após a indução do infarto do miocárdio, onde a punção do ápice não é viável.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses deve ser declarado.
Acknowledgments
Somos gratos a Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter e à equipe da Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) da Universidade de Heidelberg para assistência técnica especializada.
Este trabalho foi apoiado pelo DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular), pelo BMBF (Ministério alemão da Educação e Pesquisa), por um estado federal de Baden-Württemberg, a Inovação e o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) Project-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 e o Centro de Pesquisa Colaborativa (SFB) 1118.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
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