Summary

Resposta cardíaca à estimulação β-adrenérgica determinada pela análise do loop de pressão-volume

Published: May 19, 2021
doi:

Summary

Aqui descrevemos uma análise de loop de volume de pressão cardíaca sob doses crescentes de isoproterenol infundido por via intravenosa para determinar a função cardíaca intrínseca e a reserva β-adrenérgica em camundongos. Utilizamos uma abordagem de peito aberto modificada para as medições de loop de volume de pressão, nas quais incluímos ventilação com pressão final-expiratória positiva.

Abstract

A determinação da função cardíaca é uma análise robusta do ponto final em modelos animais de doenças cardiovasculares, a fim de caracterizar efeitos de tratamentos específicos no coração. Devido à viabilidade das manipulações genéticas, o camundongo tornou-se o modelo animal mamífero mais comum para estudar a função cardíaca e buscar novos potenciais alvos terapêuticos. Aqui descrevemos um protocolo para determinar a função cardíaca in vivo usando medidas e análises de loop de volume de pressão durante as condições basais e sob estimulação β-adrenérgica por infusão intravenosa de concentrações crescentes de isoproterenol. Fornecemos um protocolo refinado, incluindo suporte à ventilação levando em conta a pressão final positiva para amenizar efeitos negativos durante as medidas do peito aberto e a potente analgesia (Buprenorphine) para evitar o estresse miocárdio incontrolável evocado pela dor durante o procedimento. Todos juntos, a descrição detalhada do procedimento e a discussão sobre possíveis armadilhas permitem uma análise de loop de volume de pressão altamente padronizada e reprodutível, reduzindo a exclusão dos animais da coorte experimental, prevenindo possíveis viés metodológico.

Introduction

Doenças cardiovasculares normalmente afetam a função cardíaca. Esta questão aponta a importância na avaliação da função cardíaca in vivo detalhada em modelos de doenças animais. A experimentação animal é cercada por um quadro dos três princípios orientadores de Rs (3Rs) (Reduzir/Refinar/Substituir). No caso de compreender patologias complexas envolvendo respostas sistêmicas (ou seja, doenças cardiovasculares) no nível de desenvolvimento atual, a principal opção é refinar os métodos disponíveis. O refino também levará a uma redução do número de animais necessários devido à menor variabilidade, o que melhora o poder da análise e das conclusões. Além disso, a combinação de medidas de contratilidade cardíaca com modelos animais de doença cardíaca, incluindo aqueles induzidos por estimulação neurohumoral ou por sobrecarga de pressão como banda aórtica, que imita, por exemplo, os níveis alterados de catecolamina/β-adrenérgico1,2,3,4, fornece um método poderoso para estudos pré-clínicos. Tendo em conta que o método baseado em cateter permanece a abordagem mais utilizada para uma avaliação aprofundada da contratilidade cardíaca5,pretendemos apresentar aqui uma medição refinada da função cardíaca in vivo em camundongos por medições de loop de volume de pressão (PVL) durante β-adrenérgico com base na experiência anterior, incluindo a avaliação de parâmetros específicos desta abordagem6, 7.

Para determinar parâmetros hemodinâmicos cardíacos, estão disponíveis abordagens que incluem imagens ou técnicas baseadas em cateter. Ambas as opções são acompanhadas de vantagens e desvantagens que precisam ser cuidadosamente consideradas para a respectiva questão científica. As abordagens de imagem incluem ecocardiografia e ressonância magnética (RM); ambos foram usados com sucesso em camundongos. As medições ecocardiográficas envolvem altos custos iniciais de uma sonda de alta velocidade necessária para a alta frequência cardíaca dos camundongos; é uma abordagem não invasiva relativamente simples, mas é variável entre os operadores que, idealmente, devem ser experimentados reconhecendo e visualizando estruturas cardíacas. Além disso, nenhuma medição de pressão pode ser realizada diretamente e os cálculos são obtidos a partir da combinação de magnitudes de tamanho e medições de fluxo. Por outro lado, tem a vantagem de que várias medidas podem ser realizadas na mesma função animal e cardíaca podem ser monitoradas, por exemplo, durante a progressão da doença. Quanto à medição do volume, a ressonância magnética é o procedimento padrão-ouro, mas semelhante à ecocardiografia, não são possíveis medidas diretas de pressão e apenas parâmetros dependentes de pré-carga podem ser obtidos8. Fatores limitantes também são a disponibilidade, o esforço de análise e os custos operacionais. Aqui, os métodos baseados em cateter para medir a função cardíaca são uma boa alternativa que, adicionalmente, permitem o monitoramento direto da pressão intracardica e a determinação de parâmetros de contratilidade independentes da carga, como o trabalho de acidente vascular cerebral pré-carga (PRSW)9. No entanto, os volumes ventriculares medidos por um cateter de condução de pressão (por determinação de condutividade) são menores do que os da ressonância magnética, mas as diferenças de grupo são mantidas na mesma faixa10. Para determinar valores de volume confiáveis é necessária a calibração correspondente, que é um passo crítico durante as medições pvl. Combina medições ex vivo de condutividade sanguínea em cuvetas calibradas em volume (conversão de condutância em volume) com a análise in vivo para a condutância paralela do miocárdio durante a injeção de bolus da solução salina hipertônica11,12. Além disso, o posicionamento do cateter dentro do ventrículo e a orientação correta dos eletrodos ao longo do eixo longitudinal do ventrículo são fundamentais para a capacidade de detecção do campo elétrico circundante produzido por eles. Ainda com o tamanho reduzido do coração do rato é possível evitar artefatos produzidos por alterações na orientação intraventricular do cateter, mesmo em ventrículos dilatados5,10, mas artefatos podem evoluir sob β-adrenergic stimulation6,13. Além dos métodos de condutância, o desenvolvimento do método baseado em admissão apareceu para evitar as etapas de calibração, mas aqui os valores de volume são bastante superestimados14,15.

Como o camundongo é um dos modelos pré-clínicos mais importantes em pesquisa cardiovascular e a reserva βa reserva adrenérgica do coração é de interesse central em fisiologia cardíaca e patologia, apresentamos aqui um protocolo refinado para determinar a função cardíaca in vivo em camundongos por medições de PVL durante β-adrenergic estimulação.

Protocol

Todos os experimentos em animais foram aprovados e realizados de acordo com as normas do Conselho Regional de Karlsruhe e da Universidade de Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) de acordo com as diretrizes da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu sobre a proteção dos animais utilizados para fins científicos. Os dados mostrados neste protocolo são derivados de camundongos machos do tipo selvagem C57Bl6/N (17 ± 1,4 semanas de idade). Os camundongos…

Representative Results

A medição do ciclo de volume de pressão (PVL) é uma ferramenta poderosa para analisar a farmacodinâmica cardíaca de drogas e investigar o fenótipo cardíaco de modelos de camundongos geneticamente modificados em condições normais e patológicas. O protocolo permite a avaliação da reserva cardíaca β-adrenérgica no modelo de camundongo adulto. Aqui descrevemos um método de peito aberto sob anestesia isoflurano combinada com buprenorfina (analgésico) e pancurônio (relaxante muscular), que se concentra na re…

Discussion

Aqui, fornecemos um protocolo para analisar a função cardíaca in vivo em camundongos sob crescente estimulação β-adrenérgica. O procedimento pode ser usado para abordar ambos os parâmetros de linha de base da função cardíaca e a reserva adrenérgica (por exemplo, inotropia e cronotropia) em camundongos geneticamente modificados ou após intervenções. A vantagem mais proeminente das medidas de ciclo de volume de pressão (PVL) em comparação com outros meios de determinação da função cardíaca é a anál…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos a Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter e à equipe da Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) da Universidade de Heidelberg para assistência técnica especializada.

Este trabalho foi apoiado pelo DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular), pelo BMBF (Ministério alemão da Educação e Pesquisa), por um estado federal de Baden-Württemberg, a Inovação e o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) Project-ID 239283807 – TRR 152, FOR 2289 e o Centro de Pesquisa Colaborativa (SFB) 1118.

Materials

1.4F SPR-839 catheter Millar Instruments, USA 840-8111
1 ml syringes Beckton Dickinson, USA REF303172
Bio Amplifier ADInstruments, USA FE231
Bridge-Amplifier ADInstruments, USA FE221
Bovine Serum Albumin Roth, Germany 8076.2
Buprenorphine hydrochloride Bayer, Germany 4007221026402
Calibration cuvette Millar, USA 910-1049
Differential pressure transducer MPX Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany Type 39912
Dumont Forceps #5/45 Fine Science tools Inc. 11251-35
Dumont Forceps #7B Fine Science tools Inc. 11270-20
Graefe Forceps Fine Science tools Inc. 11051-10
GraphPad Prism GraphPad Software Ver. 8.3.0
EcoLab-PE-Micotube Smiths, USA 004/310/168-1
Etomidate Lipuro Braun, Germany 2064006
Excel Microsoft
Heparin Ratiopharm, Germany R26881
Hot plate and control unit Labotec, Germany Hot Plate 062
Isofluran Baxter, Germany HDG9623
Isofluran Vaporizer Abbot Vapor 19.3
Isoprenalinhydrochloride Sigma-Aldrich, USA I5627
Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID Smiths Medical International Ltd, UK Ref. 800/100/100
MiniVent ventilator for mice Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany Type 845
MPVS Ultra PVL System Millar Instruments, USA
NaCl AppliChem, Germany A3597
NaCl 0.9% isotonic Braun, Germany 2350748
Pancuronium-bromide Sigma-Aldrich, USA BCBQ8230V
Perfusor 11 Plus Harvard Apparatus Nr. 70-2209
Powerlab 4/35 control unit ADInstruments, USA PL3504
Rechargeable cautery-Set Faromed, Germany 09-605
Scissors Fine Science tools Inc. 140094-11
Software LabChart 7 Pro ADInstruments, USA LabChart 7.3 Pro
Standard mouse food LASvendi GmbH, Germany Rod18
Stereo microscope Zeiss, Germany Stemi 508
Surgical suture 8/0 Suprama, Germany Ch.B.03120X
Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge Beckton Dickinson, USA 393224
Vessel Cannulation Forceps Fine Science tools Inc. 00574-11
Water bath Thermo Fisher Scientific, USA
Syringe filter (Filtropur S 0.45) Sarstedt, Germany Ref. 83.1826

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Cite This Article
Medert, R., Bacmeister, L., Segin, S., Freichel, M., Camacho Londoño, J. E. Cardiac Response to β-Adrenergic Stimulation Determined by Pressure-Volume Loop Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62057, doi:10.3791/62057 (2021).

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