Summary
在这里，我们描述了在增加静脉输注的异丙肾上腺素剂量下的心脏压力 - 体积环路分析，以确定小鼠的内在心脏功能和β肾上腺素能储备。我们使用改进的开胸方法进行压力 - 体积回路测量，其中我们包括具有正呼气末压的通气。
Abstract
心脏功能的测定是心血管疾病动物模型中可靠的终点分析，以表征特定治疗对心脏的影响。由于遗传操作的可行性，小鼠已成为研究心脏功能和寻找新的潜在治疗靶点的最常见哺乳动物动物模型。在这里，我们描述了一种方案，用于在基础条件下使用压力 - 体积环测量和分析来确定体内心脏功能，并通过静脉输注增加浓度的异丙肾上腺素的β肾上腺素能刺激。我们提供完善的治疗方案，包括考虑到正呼气末压力的通气支持，以改善胸腔开胸测量期间的负面影响，以及强效镇痛（丁丙诺啡），以避免手术过程中疼痛引起的无法控制的心肌压力。总而言之，对程序的详细说明和对可能陷阱的讨论使高度标准化和可重复的压力 - 体积循环分析成为可能，通过防止可能的方法学偏倚来减少动物被排除在实验队列之外。
Introduction
心血管疾病通常影响心脏功能。本期指出了动物疾病模型中评估体内详细心脏功能的重要性。动物实验被三个Rs（3R）指导原则（减少/改进/替换）的框架所包围。在当前发育水平上理解涉及全身反应（即心血管疾病）的复杂病理的情况下，主要选择是改进可用的方法。由于变异性较小，精炼还会导致所需动物数量的减少，从而提高分析和结论的力量。此外，心脏收缩力测量与心脏病的动物模型相结合，包括由神经体液刺激或主动脉带等压力过载引起的模型，其模拟例如改变的儿茶酚胺/β肾上腺素能水平1，2，3，4，为临床前研究提供了一种强有力的方法。考虑到基于导管的方法仍然是深入评估心脏收缩力5的最广泛使用的方法，我们旨在根据先前的经验（包括对该方法的具体参数的评估）在β肾上腺素能刺激期间通过压力 - 体积环（PVL）测量来精确测量小鼠体内心脏功能6， 7.
为了确定心脏血流动力学参数，可以使用包括成像或基于导管的技术的方法。这两种选择都伴随着优点和缺点，需要为各自的科学问题仔细考虑。成像方法包括超声心动图和磁共振成像（MRI）;两者都已成功用于小鼠。超声心动图测量涉及小鼠高心率所需的高速探头的高初始成本;这是一种相对简单的非侵入性方法，但在理想情况下应该具有识别和可视化心脏结构经验的操作员中，它是可变的。此外，不能直接进行压力测量，并且通过尺寸大小和流量测量的组合获得计算。另一方面，它的优点是可以对同一动物进行多次测量，并且可以监测心脏功能，例如在疾病进展期间。关于体积测量，MRI是金标准程序，但与超声心动图类似，无法进行直接压力测量，只能获得预载荷相关参数8。限制因素还包括可用性、分析工作量和运营成本。在这里，基于导管的测量心脏功能的方法是一个很好的替代方案，它还可以直接监测心内压力和确定与负荷无关的收缩性参数，如预负荷可招募卒中（PRSW）9。然而，通过压力 - 电导管（通过电导率测定）测量的心室体积小于MRI测量的心室体积，但组差异保持在相同的范围内10。为了确定可靠的体积值，需要进行相应的校准，这是PVL测量过程中的关键步骤。它将体积校准比色皿中血液电导率的离体测量（电导率到体积的转换）与体内分析相结合，以在推注高渗盐水11，12期间心肌平行电导。除此之外，导管在心室内的位置以及电极沿心室纵轴的正确方向对于检测它们产生的周围电场的能力至关重要。仍然随着小鼠心脏尺寸的减小，可以避免由导管脑室内方向变化产生的伪影，即使在扩张的心室5，10中，但伪影可以在β肾上腺素能刺激下进化6，13。除了电导方法之外，基于导纳的方法的发展似乎避免了校准步骤，但这里的体积值被高估了14，15。
由于小鼠是心血管研究中最重要的临床前模型之一，并且心脏的β-肾上腺素能储备是心脏生理学和病理学的核心兴趣，我们在这里提出了一个改进的方案，通过PVL测量在β肾上腺素能刺激期间通过PVL测量来确定小鼠体内的心脏功能。
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Protocol
所有动物实验均根据卡尔斯鲁厄地区委员会和海德堡大学的规定（AZ 35-9185.82/A-2/15，AZ 35-9185.82/A-18/15，AZ 35-9185.81/G131/15，AZ 35-9185.81/G121/17）的规定批准和进行，符合欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的指令2010/63/ EU的指南。该协议中显示的数据来自野生型C57Bl6 / N雄性小鼠（17±1.4周龄）。在海德堡医学院的动物设施（IBF）中，小鼠在指定的无病原体条件下维持。将小鼠置于12小时的光暗循环中，相对湿度在56-60%之间，每小时换气15次，室温为22°C + / - 2°C。 它们被关在传统的II型或II型笼子中，长期提供动物垫料和纸巾作为浓缩物。标准高压灭菌食品和高压灭菌水可用于随意食用。
1. 仪器和药物溶液的制备
- 中心静脉导管：将微管（外径0.6毫米）切成约20厘米长的导管。使用镊子将管子的一端拉到23号套管的尖端。对角线切割管子的另一端，以形成可以刺穿股静脉的尖锐尖端。
- 气管插管：对于插管，切下20号静脉穿刺套管长3厘米，以取出注射器附件。
- 如果插管不能完全适合呼吸机连接，请将石膏膜包裹在连接通风设备的管的末端。连接必须稳定并通过增稠密封（图1A）。将20号静脉穿刺套管的金属导针缩短至2.7厘米，并将其用作插管辅助装置。包括光纤维在内的精制插管方法也得到了很好的描述，例如Das和合作者16。
- 用于插管的麻醉混合物：将200μL肝素（1000 IU / mL）与50μL0.9%NaCl和750μL2mg / mL依托咪酯混合，来自水包油乳液基产品。每只小鼠使用7μL / g体重（BW）（0.1mg / kg BW丁丙诺啡10mg / kg BW依托咪酯）。
- 肌肉松弛剂：将100毫克泮库溴铵溶解在100毫升0.9%NaCl中。每只小鼠使用1.0μL / g体重（1mg / kg BW）。
- 异丙肾上腺素溶液：将100mg异丙肾上腺素溶解在100mL 0.9%NaCl（1μg/ μL）中。准备以下稀释液（表1），并将每个稀释液转移到1 mL注射器中。
- 为了获得稀释度1，稀释原液1：1.8。为了获得稀释度2，稀释原液1：6。为了获得稀释度3，将稀释度1稀释成1：10。最后，通过1：10稀释2得到稀释液4。
- 15%高渗NaCl（w / v）：将1.5g0.9%NaCl溶解在10mL双蒸馏H2O中。
- 制备12.5%白蛋白溶液（w / v）：将1.25g牛血清白蛋白溶解在10mL 0.9%NaCl中。将溶液在37°C孵育30分钟。冷却至室温，并用0.45μm孔径注射器过滤器过滤溶液。
- 设置准备：首先打开加热板并将其设置为39-40°C。 将充满生理盐水的注射器放在加热垫上，并将压力容积回路（PVL）导管转移到注射器中。在使用前预孵育导管至少30分钟以进行稳定。我们使用的设置包括一个1.4-F压力导通导管，一个控制单元和相应的软件，图 1B 以图形方式描述，供应商参考列在 材料表中。
2. 麻醉
- 插管前30分钟注射丁丙诺啡（腹膜内注射0.1mg / kg BW）。
- 将鼠标放入预浸有2.5%异氟醚的丙烯酸玻璃室中，并用放置在腔室底部的加热垫预热。
- 一旦小鼠沉睡（缺乏反射），腹腔内注射含有10mg / kg依托咪酯和肝素（1，200 IU / kg BW）的麻醉混合物（7 mL / kg BW）。
3. 通风
- 将动物转移到麻醉注射后3-4分钟将动物转移到插管平台（图1C）。鼠标悬挂在牙齿上，背视图面向操作员。
- 用镊子轻轻抬起舌头。要识别声门，请用第二镊子稍微抬起小鼠的下颚。
- 小心地将气管插管（图1A）插入气管并取出导杆。
- 将动物转移到加热板上，将其放在背面，然后将插管连接到小动物呼吸器。
- 将呼吸频率调整为53.5 x（体重，以克为单位）-0.26 [min-1]，如其他人所述12，并将潮气量调整为11±1 cmH2O的峰值吸气压。
- 用胶条小心地将鼠标的四肢固定在加热板上，并在双眼上涂抹眼药膏以防止干燥。
- 插入直肠温度探头，将核心体温保持在37±0.2°C。
- 安装单导联心电图并在线监测心率，作为麻醉深度和稳定性的指标。
- 在没有指间反射时，腹腔内注射1mg / kg肌肉松弛剂泛库溴铵BW。这可以防止PVL测量过程中出现呼吸伪影。
4. 手术
- 一般性建议
- 在手术过程中，用O2蒸发的~1.5-2%异氟醚通气。异氟醚浓度也可以取决于小鼠品系，性别，年龄和动物体重等变量，但需要单独和实验确定，这里的值是C57BL6 / N小鼠品系的参考。重要的是，呼吸机连接到提取系统，以防止操作员吸入异氟醚。
- 使用来自体视显微镜的1.5-4倍之间的放大倍率进行外科手术。
注意：请参阅有关动物为非生存手术做准备的机构/当地指南。
- 股骨插管
- 用70%乙醇冲洗后肢，切开左腹股沟区域并暴露左股静脉。
- 用烧灼术对上腹部动脉和静脉进行爆破。
- 用缝合线将股静脉固定在导管通道的远端。
- 在股静脉下方缝合线，并准备穿刺部位的结颅。用连接到1mL注射器的准备好的微管（参见步骤1.1）刺穿股静脉。
- 系好结，将管子固定在容器内。
- 通过用自动注射泵以15μL / min的输注速率输注0.9%NaCl并补充12.5%白蛋白来抵消液体损失。此外，使用预热的0.9%NaCl保持暴露组织湿润。
- 开 胸 术
- 用70%乙醇冲洗胸部。
- 切开紧在梨形过程下方的皮肤，并用镊子或烧灼术将胸肌与胸壁钝分开。
- 用镊子抬起镊子，然后用烧灼术横向穿过胸壁，直到从下面完全看到隔膜。
- 从下面切开横膈膜并暴露心脏顶点。然后用镊子小心地取出心包。
- 如前所述6，在左侧进行有限的肋切开术。
- 在下腔静脉下方缝合线，以在后期阶段进行预负荷减少。
- 用25号套管（最大4mm）轻轻刺穿心脏顶端。取出插管并插入PV导管，直到所有电极都在心室内。
- 通过轻柔的运动和转动来调整导管的位置，直到获得矩形环（图2A）。
- 始终使用预热的0.9%NaCl保持所有暴露的组织湿润。
5. 测量
- 一般性建议
- 在测量过程中，用~1.5-2%异氟醚与100%O2汽化通风。
- 在剂量反应方案的每个步骤上执行2次基线测量以及2次腔静脉闭塞。
注意：重要的是，在第一和第二个腔静脉闭塞后，压力和体积值都恢复到第一次闭塞前的稳态值。这种观察是必要的，以便识别由于脑室内容量连续减少而导致的导管位置的移动。如果导管位置发生偏移，尤其是体积值会移位。
- 对参数（心率、每搏量、dP/dtmax）进行在线分析，并等待获得稳态心脏功能。有关C57Bl6 / N小鼠中此处使用的设置的预期参数范围，请参阅已发布的结果6。
- 将呼吸器停在呼气末位置并记录基线参数。3至5秒后，通过用镊子将缝合线提升到下腔静脉下方来降低心脏预紧力，以获得预紧力独立参数（图2B）。打开呼吸机。等待至少30秒进行第二次闭塞，直到血流动力学参数稳定。
- 在基础条件下获得测量结果后，通过切换到制备的注射器来进行异丙肾上腺素的剂量反应。在这里，输注速率保持不变，以避免心脏前负荷的改变。更换注射器时，请注意不要吸入气泡。
- 等待至少 2 分钟，直到获得新的稳态心脏功能，然后再次在呼气末位置停止呼吸器并记录基线参数。3至5秒后，通过将缝合线提升到下腔静脉下方来减少心脏预负荷，以获得预负荷独立参数。
- 等待至少 30 秒，等待第二次遮挡。然后切换到具有下一个异丙肾上腺素浓度的制备注射器，并重复记录基线和预加载无关参数。
注意：收缩末期压力峰值（ESPS， 图2C）等伪影可能发生在异丙肾上腺素剂量增加期间，这是由导管卡住引起的。在基础参数开始之前发生的伪影可以通过重新定位导管来轻松纠正。
6. 校准
注：校准程序可能因所使用的PVL系统而异。
- 平行电导校准
- 在最后一次测量异丙肾上腺素剂量反应后，将含有15%NaCl溶液的注射器连接到股导管。小心地注入管中剩余的5μL高渗溶液，直到PVL在在线可视化期间稍微向右移动。然后等待循环恢复到稳定状态。
- 在呼气结束时停止呼吸器，并在2至3秒内注射一次10μL的15%NaCl。检查PVL是否在在线可视化过程中大部分变宽并向右移动。
- 电导体积校准
- 等待5分钟，不少于，以便推注高渗盐水完全稀释。之后取出导管，并使用1mL注射器和21号套管从跳动心脏的左心室抽取至少600μL血液。此时，动物在深度麻醉和镇痛下通过大量出血，通过停止通气和切除心脏来安乐死。
- 将血液转移到预热的（在37°C的水浴中）校准比色皿中，具有已知体积的圆柱体。将PV导管中央放置在每个圆柱体中并记录电导率。通过计算每只动物的标准曲线，电导单位可以转换为绝对体积值。
第7章 分析
- 在基础条件和异丙肾上腺素刺激下成功测量PVL后，使用适当的PVL分析软件可视化，数字化，计算和提取表征心脏功能的参数（如PRSW，dP / dt，舒张末期压力和体积，收缩末压和体积，松弛常数Tau等）。可以使用标准分析软件执行进一步的统计分析和图形表示。
- 预载荷独立参数分析
注意：对于此步骤，标准化过程至关重要。- 选择前5-6个PFL，显示所有测量过程中预载荷递减，用于分析预载荷无关参数（图2D）。在预载荷降低期间选择恒定数量的PFL进行分析将降低所获得参数测量值之间的变异性。
- 计算协议每个步骤中两个测量值的平均值。
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Representative Results
压力体积环（PVL）测量是分析药物心脏药效学和研究正常和病理条件下转基因小鼠模型心脏表型的强大工具。该协议允许评估成年小鼠模型中的心脏β肾上腺素能储备。在这里，我们描述了异氟醚麻醉联合丁丙诺啡（镇痛药）和泛库溴铵（肌肉松弛剂）下的开胸方法，其重点是通过股静脉导管输注异丙肾上腺素浓度来对β肾上腺素能刺激的心脏反应。该方案中显示的一些代表性数据来自野生型C57Bl6 / N成年雄性小鼠（图3 和 表2）。作为PVL分析所测量的一些重要参数变异性的指标，我们使用WT组和可用G*Power软件17的结果进行了功率分析（α误差概率为0.05，幂为0.8）。在 表3 中，描述了心率，PRSW，每搏量，松弛常数Tau，dP / dtmax 和dP / dtmin 的计算效应量和所需样本量，假设每个参数在0，0.825和8.25ng / min异丙肾上腺素下的变化在10%至30%之间。
压力-体积关系的图形分析是通过在Y轴上绘制体积（μL）和在X轴上绘制压力（mmHg）来完成的。如果导管正确放置在心室内，则整个心脏周期由矩形PVL表示（图2A和图3A）。不久，收缩期开始于等压收缩阶段（特征为dP / dtmax），在此期间，两个心脏瓣膜都关闭（右垂直边缘）。当心室压力超过主动脉压时，主动脉瓣打开，血液在射血阶段（上水平）被泵入主动脉。随后，当主动脉压超过心室压力时，主动脉瓣关闭并开始舒张。在等压弛豫期间（以参数 dP/dtmin和 Tau 为特征），心室压力下降，直到心房压力超过心室压力且二尖瓣打开（左垂直边缘）。现在，以舒张末压-容积关系（EDPVR）为特征的被动舒张充盈发生，直到下一个心脏周期开始（底部水平）（图2A-B）。
PVL分析提供了对心脏功能的详细见解，因为它能够独立于心脏前负荷确定心脏功能。因此，它被描述为在实验装置中确定心脏功能的金标准5。在使用C57Bl6 / N小鼠的所述方案中，我们评估了对心脏功能的一般参数（如心率，心输出量，每搏量和中风功）产生的异丙肾上腺素的反应。在不同异丙肾上腺素浓度下的剂量反应中观察到异丙肾上腺素对每个参数的显着影响（图3B）。心脏收缩力参数，如PRSW和dP / dtmax，显示异丙肾上腺素输注下剂量反应的预期增加（图3A-B）。另一方面，随着异丙肾上腺素浓度的增加，舒张压参数（松弛Tau和dP / dtmin的常数）的降低被记录下来（图3C），这是由儿茶酚胺在健康心脏中产生的正向减郁作用所期望的。图3所示的进一步参数（即收缩末期压力和体积，舒张末压和体积，最大压力等）也从PVL分析中获得，也可以根据科学问题，遗传或疾病模型和获得的观察结果进行分析。在增量β肾上腺素能刺激期间，PVL中每一步心脏功能最常见参数的附加和详细值，包括与高渗盐水平行电导的校准时间点，这高度影响心脏体积参数，以及心脏正性肌力和松弛，以前已经报道过1，6。
图 1.麻醉和压力容积回路设置。（A） 适用于小鼠插管的20号静脉穿刺套管。 （B） 显示所用压力 - 体积测量装置的不同组件的组织和连接的图表，包括麻醉气体的流动方向。 （三） 插管平台用于悬挂小鼠，以便快速安全地插管。悬挂螺纹末端的螺钉（i）包括（ii）的两侧螺钉，以根据鼠标重量拧紧威胁。箭头表示异氟醚暴露的连接可能性。温度：温度;心电图：心电图;最小消耗量： 呼气压最小;最大呼气压力 ： 最大呼气压;PV：压力-体积。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2.具有代表性的压力-体积分析。（A） 示例性压力 - 体积记录，其中显示了基础测量期间分析的参数，并描述了心脏周期中的主要事件。 （B） 在预紧力降低期间描绘了ESPVR、EDPVR和PRSW参数。 （C） 在异丙肾上腺素刺激下，在基础测量（上图）或闭塞操作（下图）期间，给出了收缩末期压力峰值。左心室：左心室;dP/dtmin： 最小 dP/dt;dP/dt最大值 ： 最大 dP/dt;Ves： 收缩末期体积;Ved： 舒张末期容积;ESPVR：收缩末期压力-体积关系;PRSW：预负荷可招募的中风工作;EDPVR：舒张末期压力-容量关系。图改编自我们之前工作的补充 20196. 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3.分析C57BL6 / N小鼠的PVL测量结果。（A）C57BL6 / N对照小鼠的下腔静脉闭塞期间的代表性PVL，并接受增加的异丙肾上腺素浓度。 （B） 基础疾病期间和异丙肾上腺素期间的一般心脏功能通过分析心率，心输出量，每搏量和中风功来描述。 （C） 分析其他参数以评估心脏收缩力和舒张功能，如PRSW，松弛Tau常数（Weiss方程18）以及最大和最小dP / dt。数据以均值±标准差表示。BPM：每分钟节拍数;PRSW：预负荷可招募的中风工作;n：小鼠数量。**p < 0.01：配对学生 t 检验相对于基础条件的 p 值（异丙肾上腺素 = 0 ng/min）。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 异 丙 肾上腺素 | 浓度（皮克/微升） | 输注速率（μL/分钟） | 剂量（纳克/分钟） |
| 股票 | 1000 | ||
| 稀释 1 | 550 | 15 | 8.25 |
| 稀释 2 | 165 | 15 | 2.475 |
| 稀释 3 | 55 | 15 | 0.825 |
| 稀释 4 | 16.5 | 15 | 0.2475 |
表 1.稀释异丙肾上腺素用于增加β肾上腺素能刺激。请点击此处下载此表格。
| 异丙肾上腺素（纳克/分钟） | |||||
| 0 | 0.2475 | 0.825 | 2.475 | 8.25 | |
| 全局参数和卷 | |||||
| 心率（每分点） | 470 ± 19.6 | 490 ± 19.3 | 542 ± 20.6 | 605 ± 20.5 | 638 ± 20.5 |
| 冲程体积（μl） | 16.2 ± 2.6 | 17.6 ± 2.1 | 20.3 ± 2.8 | 22.3 ± 2.2 | 23.9 ± 2.5 |
| 心输出量（μl/min） | 7627 ± 1210 | 8609 ± 1097 | 11000 ± 1616 | 13502 ± 1494 | 15291 ± 1761 |
| 收缩末期体积（μl） | 13 ± 3.1 | 10.5 ± 3.5 | 4.81 ± 2.3 | 1.94 ± 1.9 | 1.5 ± 1.7 |
| 舒张末期体积（μl） | 27.4 ± 3 | 26.6 ± 3.0 | 24.1 ± 3.1 | 23.8 ± 2.6 | 24.8 ± 2.7 |
| 平均压力（毫米汞柱） | 27.4 ± 2.2 | 28.6 ± 2.2 | 29.2 ± 1.9 | 29.7 ± 1.9 | 30.5 ± 1.9 |
| 动脉弹性（毫米汞柱/微升） | 4.44 ± 0.6 | 4.18 ± 0.7 | 3.46 ± 0.5 | 2.78 ± 0.9 | 2.91 ± 1 |
| 收缩压参数 | |||||
| 预负荷可招募的中风工作 | 67.8 ± 7.62 | 76.3 ± 9.85 | 96.1 ± 14.62 | 108 ± 14.56 | 113 ± 13.02 |
| ESPVR | 4.96 ± 1.29 | 5.15 ± 1.16 | 7.2 ± 2.28 | 17.3 ± 42.04 | 40 ± 107.55 |
| 射血分数（%） | 52.59 ± 9.57 | 60.9 ± 9.94 | 80.23 ± 8.65 | 92.16 ± 7.2 | 94.18 ± 6.15 |
| 行程功（毫米汞柱 x μl） | 1007 ± 244.26 | 1153 ± 193 | 1399 ± 261 | 1582 ± 234 | 1720 ± 216 |
| 最大 dP/dt （毫米汞柱/秒） | 6128.7 ± 1398.39 | 7087 ± 1401 | 8982.4 ± 1481 | 11422 ± 1477 | 13256 ± 1165 |
| 最小分量/分吨（微升/秒） | - 523 ± 105.58 | - 613 ± 102 | - 835 ± 151 | - 1103 ± 165 | - 1273 ± 177 |
| 收缩末压（毫米汞柱） | 70.8 ± 6.98 | 72.5 ± 7.42 | 69 ± 6.28 | 61.2 ± 17.36 | 68.2 ± 19.72 |
| 最大功率（毫米汞柱 x μl/秒） | 3009 ± 955.31 | 3541 ± 1188 | 4185 ± 1058 | 4272 ± 959 | 4918 ± 1418 |
| 舒张压参数 | |||||
| 断续器 | 1 ± 0.93 | 1.23 ± 0.88 | 1.5 ± 0.86 | 1.87 ± 0.92 | 1.96 ± 0.99 |
| Tau （ms， Weiss's equation） | 6.14 ± 0.64 | 5.67 ± 0.44 | 4.92 ± 0.44 | 4.83 ± 0.55 | 4.96 ± 0.65 |
| 最小 dP/dt （mmHg/s） | - 7272 ± 1403 | - 8119 ± 1295 | - 8998 ± 1240 | - 8618 ± 1129 | - 8648 ± 1468 |
| 舒张末压（毫米汞柱） | 5.29 ± 1.01 | 5.74 ± 1.07 | 5.6 ± 1.51 | 5.37 ± 1.13 | 5.76 ± 1.15 |
| 最大 dV/dt （μl/s） | 765 ± 174 | 817 ± 178 | 972 ± 156 | 1158 ± 163 | 1264 ± 153 |
表 2.分析C57BL6 / N小鼠的PVL测量结果。 基础疾病和异丙肾上腺素输注期间心脏功能的 PVL 参数。数据以18只雄性成年小鼠的平均±标准偏差表示。PV： 压力容积;BPM：每分钟节拍数;ESPVR：收缩末期PV关系的斜率，在低心室内容积（2.475和8.25 ng / min异丙肾上腺素）下计算不足;EDPVR：舒张末期 PV 关系，指数回归（α 系数）。请点击此处下载此表格。
| 对内达 （%） | 效果大小 | 每组样本数量 | ||||
| 异丙肾上腺素/分钟 | 异丙肾上腺素/分钟 | |||||
| 0 | 0.825 | 8.25 | 0 | 0.825 | 8.25 | |
| 心率 | ||||||
| 10 | 2.4 | 2.6 | 3.1 | 4 | 4 | 3 |
| 15 | 3.6 | 3.9 | 4.6 | 3 | 3 | 3 |
| 20 | 4.8 | 5.3 | 6.2 | 3 | 3 | 3 |
| 25 | 6.0 | 6.6 | 7.8 | 3 | 3 | 3 |
| 30 | 7.2 | 7.9 | 9.3 | 3 | 3 | 3 |
| 行程量 | ||||||
| 10 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | 42 | 30 | 18 |
| 15 | 0.9 | 1.1 | 1.5 | 20 | 15 | 9 |
| 20 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 12 | 9 | 6 |
| 25 | 1.5 | 1.8 | 2.4 | 8 | 6 | 4 |
| 30 | 1.8 | 2.2 | 2.9 | 6 | 5 | 4 |
| 预紧可招募的行程工作 | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.7 | 0.9 | 21 | 38 | 22 |
| 15 | 1.3 | 1.0 | 1.3 | 10 | 18 | 11 |
| 20 | 1.8 | 1.3 | 1.7 | 7 | 11 | 7 |
| 25 | 2.2 | 1.6 | 2.2 | 5 | 7 | 5 |
| 30 | 2.7 | 2.0 | 2.6 | 4 | 6 | 4 |
| 最大dP/dt | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.6 | 1.1 | 83 | 44 | 14 |
| 15 | 0.7 | 0.9 | 1.7 | 38 | 20 | 7 |
| 20 | 0.9 | 1.2 | 2.3 | 22 | 12 | 5 |
| 25 | 1.1 | 1.5 | 2.8 | 15 | 8 | 4 |
| 30 | 1.3 | 1.8 | 3.4 | 11 | 6 | 3 |
| 头 | ||||||
| 10 | 1.0 | 1.1 | 0.8 | 19 | 14 | 28 |
| 15 | 1.4 | 1.7 | 1.2 | 9 | 7 | 13 |
| 20 | 1.9 | 2.2 | 1.5 | 6 | 5 | 8 |
| 25 | 2.4 | 2.8 | 1.9 | 4 | 4 | 6 |
| 30 | 2.9 | 3.4 | 2.3 | 4 | 3 | 5 |
| dP/dtmin | ||||||
| 10 | 0.5 | 0.7 | 0.6 | 60 | 31 | 47 |
| 15 | 0.8 | 1.1 | 0.9 | 27 | 15 | 22 |
| 20 | 1.0 | 1.4 | 1.2 | 16 | 9 | 13 |
| 25 | 1.3 | 1.8 | 1.5 | 11 | 6 | 9 |
| 30 | 1.6 | 2.2 | 1.8 | 8 | 5 | 7 |
| 收缩末期压力-容积关系 | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.3 | 0.04 | >100 | >100 | >100 |
| 15 | 0.6 | 0.5 | 0.06 | 48 | 73 | >100 |
| 20 | 0.8 | 0.6 | 0.07 | 28 | 41 | >100 |
| 25 | 1.0 | 0.8 | 0.09 | 19 | 27 | >100 |
| 30 | 1.2 | 1.0 | 0.11 | 13 | 19 | >100 |
| 舒张末期容积 | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.8 | 0.9 | 20 | 27 | 20 |
| 15 | 1.4 | 1.2 | 1.4 | 10 | 13 | 10 |
| 20 | 1.8 | 1.6 | 1.8 | 6 | 8 | 6 |
| 25 | 2.3 | 2.0 | 2.3 | 5 | 6 | 5 |
| 30 | 2.8 | 2.4 | 2.8 | 4 | 5 | 4 |
表 3.基于在C57BL6 / N雄性小鼠中观察到的值，所选参数的估计效应量和所需样本量。 Delta描述了对照组（即野生型）和治疗组之间参数的假设差异。使用对照数据（平均值和标准差）、α误差（0.05）和功率（0.8）通过G*Power 19计算每组的效应量和所需样本量。粗体值（在线版表格中的绿色背景）表示每剂量异丙肾上酚的每个参数的建议阈值效应量（1≤）和样本量。dP/dtmin： 最小 dP/dt;dP/dt最大值 ： 最大 dP/dt.请点击此处下载此表格。
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Discussion
在这里，我们提供了一种方案来分析在增加β肾上腺素能刺激下的小鼠体内心脏功能。该程序可用于解决转基因小鼠或干预中心脏功能的基线参数和肾上腺素能储备（例如，正性肌力和变时性）。与其他确定心脏功能的方法相比，压力 - 体积环（PVL）测量最突出的优势是分析内在的，与负荷无关的心脏功能。所有其他方法（例如，MRI 和超声心动图）只能评估心脏功能的负荷依赖性参数，尤其是无法可靠地确定心脏收缩力。这使得PVL测量成为心脏功能深入分析的终点测量的黄金标准5。然而，前面命名的方法允许对心脏功能进行顺序分析，使它们成为纵向观察（例如，在疾病进展期间）的最前沿。此外，与小鼠20中的MRI相比，PVL测量中的脑室内容积以及随后的卒中容积和其他衍生参数可能被低估。
在方案期间，有四个关键步骤对于获得有效的PVL数据至关重要：1）插管，2）放置股静脉导管，3）放置压力导导管和4）围手术期方案。小鼠的非侵入性插管需要一些经验，并且在使用异氟醚时很复杂，因为插管的时间框架很窄（20-40秒）。因此，插管后，在改变呼吸机呼吸频率时，应通过检查小鼠胸部运动来仔细检查正确的管子位置。为了扩大插管的窗口，我们在这里描述了短效催眠etomidate的伴随使用。此外，可用于促进声门可视化的光纤维16.正确放置股静脉导管对于在后期阶段应用异丙肾上腺素至关重要。在这一步中，空气栓塞会严重伤害动物，诱发肺栓塞。股导管的正确放置最初可以通过小心抽吸静脉血来检查。当在后期阶段不确定导管的正确放置时，可以检查舒张末期容积，当在线观察PVL时，舒张末期容积应随着最轻微的推注而增加。与大多数其他研究人员相反，我们在这里描述了股静脉的插管，而其他人最常使用颈静脉作为中心静脉通路的目标血管12，21。这种方法的优点是不会像准备颈动脉时在近距离胸部接近时那样操纵迷走神经，因此我们假设通过简单地触摸/损伤神经来避免副交感神经系统的潜在刺激。在心室内正确放置PV导管对于获得有意义的数据至关重要，特别是有关容量参数的数据。当电极不完全在心室内或导管未沿心室纵轴正确放置时，体积参数被严重低估。此外，心内膜和压力传感器之间的接触会导致收缩末期压力峰值，这在基线测量期间不应被容忍6。最后，包括麻醉深度和液体管理在内的围手术期方案对小鼠PVL数据的可靠性有显着影响。麻醉剂剂量不足或过量都会严重影响血流动力学参数，最常导致心脏功能下降。液体流失主要是由于失血和蒸发，必须通过不断输注合适的溶液来抵消，例如12.5%白蛋白溶解在0.9%NaCl中，我们推荐。由于这种方法具有很强的侵入性，同样重要的是加入一种有效的镇痛药，如丁丙诺啡，以尽量减少避免疼痛不足对心血管功能的影响。我们在插管前注射镇痛药。重要的是在开始整个过程之前约30分钟进行注射，特别是如果操作员经验丰富，因此速度快，以达到适当的镇痛效果，避免在调查阶段出现任何疼痛。此外，当使用肥胖模型时，由于该物质的高亲脂性，可能应考虑更高的剂量。最后，该协议也可以被修改以确定对其他儿茶酚胺能刺激（如多巴酚丁胺或肾上腺素）的反应;例如，由Calligaris及其同事22完成，他们描述了多巴酚丁胺刺激期间脑室内压力的分析。
关于PVL测量的记录和分析，需要考虑几个步骤。首先，在实验数据集中始终如一地分析PVL记录非常重要。在记录期间，需要通过关闭呼吸机来避免由于交替的肺压导致交替的心脏前负荷而演变的呼吸器。为了进一步消除呼吸道伪影，我们建议使用肌肉松弛剂莽库溴铵，以防止异氟醚麻醉期间经常出现的膈肌收缩。此外，与其他方案相比，在终末呼气时停止通气并分析所有选定的回路是可行的，这与其他方案相反，这些方案建议选择8-10个回路，然后识别5-6个呼气末回路，随后对其进行分析23。重要的是，呼吸暂停的周期应保持较短，以避免通气不足导致高碳酸血症和呼吸性酸中毒。为了改善氧合作用并防止肺不张的形成，我们之前检查了在小鼠PVL测量期间使用PEEP通气6 。在选择用于分析预加载独立数据的循环时，请选择前 5-6 个环路，显示舒张末期体积减小，并避免包括仅压力下降但体积恒定的循环。此外，额外的节拍不应包含在分析中，因为它们对 PVL 参数有至关重要的影响。值得注意的是，最常见的心律失常性心跳是由于闭塞缝合线和鼠心之间的接触而发生的。通过输注高渗盐水进行平行电导的校准对心脏功能的参数有巨大的影响，据我们所知，应在实验结束时进行6。值得注意的是，由于其对心脏功能的影响，在治疗期间仅进行一次平行电导的校准。然而，平行电导在方案期间略有变化，由于肾上腺素能刺激时心室形状的变化。用于小鼠PVL评估的准入系统无需盐水校准，并且可以在整个PVL记录中动态计算平行电导。然而，这种方法的准确性仍在争论5，8，24，25。
我们从观察中确定，当在成年健康野生型雄性小鼠（即C57Bl6 / N）中使用该协议时，收缩压在基线时为70 mmHg至90 mmHg，在用β受体激动剂异丙肾上腺素最大刺激期间为80至100 mmHg。同样，在基线时观察到每搏量在13μL至20μL范围内，在最大刺激期间在20μL至35μL之间。基线时的心率约为每分钟450至520次，在最大刺激期间可以远远超过每分钟650次。关于预负荷无关的心脏收缩力，最稳健的参数预负荷可招募卒中工作（PRSW）被认为在基线时在60 mmHg至80 mmHg之间以及最大刺激期间在100 mmHg至140 mmHg之间是足够的。如果基线参数与通常获得的参数明显不同，或者当心脏功能对β肾上腺素能刺激反应不当时，应考虑并发症（例如，未观察到的失血、体温下降/升高或麻醉剂剂量过高/不足）。
此外，在小鼠PVL测量过程中可能会出现一些伪影。最常见的伪影是收缩末期压力峰值（ESPS，图 2C），这是由导管卡住引起的，在基础测量之前重新定位导管以 0 ng/min 异丙肾上烯醇，很容易矫正。为了获得有意义的数据，在基线条件下根除ESPS之前，不应开始测量，因为ESPS可以影响心脏功能的几个参数6。然而，当ESPS在用异丙肾上腺素进行增量刺激期间发生时，由于在基线时未受影响的测量中心室形态改变，这是不可纠正的，因为导管重新定位会改变剂量反应方案期间的平行电导。人们必须仔细检查这一点，因为，同样，这些ESPS已被证明不仅通过显着增加的最大压力13，26，而且通过减少体积检测6来显着改变心脏功能的参数。
在基线条件下和用异丙肾上腺素增量刺激期间，通过PVL测量获得的血液动力学参数的代表性值随不同的方法学方法和不同的小鼠品系而有很大差异27，28。除此之外，人们应该意识到，基因改变小鼠的表型也可能仅限于不同的遗传背景。从方法上讲，在小鼠中执行压力 - 体积分析有两种最重要的方法。每种方法都有其（不）优点，选择的方法通常取决于实验室及其研究人员的经验。我们在这里专注于开胸手术，其中导管通过穿刺在顶端放置。这种方法具有在视觉下放置导管的进步，允许精确的导管定位，这是记录小鼠心脏功能有意义数据的重要预测因子。对于记录微升范围内的体积参数尤其如此。相反，这种方法的一个关键方面是生理胸内压力的损失，导致肺塌陷和肺不张形成以及体液损失增加。然而，通过使用呼气末正压（PEEP）通气，我们在这里描述了一种已被证明可以抵消小鼠胸部开放PVL期间肺损伤的策略6。第二种实验方法是通过颈动脉插入导管，然后通过主动脉瓣逆行。通过使用这种技术，胸腔内压力可以保持相当正常，尽管仍然需要机械通气，这削弱了这一优势。此外，闭胸方法限制了研究人员精确定位导管的可能性。此外，小鼠中使用的PV导管的直径范围为1至1.4法国（0.33毫米至0.47毫米），这意味着使用闭胸方法时小鼠流出道的显着阻塞，因为成年小鼠的主动脉通常直径在0.8毫米至1.2毫米之间29，30。关于PVL在心力衰竭模型中的应用，开胸入路对于横向主动脉收缩模型特别重要，其中收缩位于化学动脉和左颈动脉之间。在这里，导管不能通过颈动脉放置。另一方面，对于研究扩张心室小鼠模型的研究人员来说，闭胸方法很感兴趣，例如在诱导心肌梗死后，其中顶点穿刺是不可行的。
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Disclosures
无需声明任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Manuela Ritzal，Hans-Peter Gensheimer，Christin Richter和海德堡大学Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung（IBF）的团队提供专家技术援助。
这项工作得到了DZHK（德国心血管研究中心），BMBF（德国教育和研究部），巴登 - 符腾堡州联邦国家创新基金会和Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG，德国研究基金会）项目ID 239283807 - TRR 152，FOR 2289和协作研究中心（SFB）1118的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
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