Summary
هنا نصف تحليل حلقة ضغط القلب الحجم تحت جرعات متزايدة من الايسوبروترينول غرست عن طريق الوريد لتحديد وظيفة القلب الجوهرية واحتياطيات β الأدرينالية في الفئران. نحن نستخدم نهج تعديل الصدر المفتوح لقياسات حلقة حجم الضغط ، والتي تشمل التهوية مع ضغط نهاية منتهية الصلاحية الإيجابية.
Abstract
تحديد وظيفة القلب هو تحليل نقطة النهاية قوية في النماذج الحيوانية لأمراض القلب والأوعية الدموية من أجل توصيف آثار علاجات محددة على القلب. نظرا لجدوى التلاعب الجيني أصبح الفأر النموذج الحيواني الثدييات الأكثر شيوعا لدراسة وظيفة القلب والبحث عن أهداف علاجية محتملة جديدة. هنا نحن نصف بروتوكول لتحديد وظيفة القلب في الجسم الحي باستخدام قياسات حلقة حجم الضغط والتحليل خلال الظروف القاعدية وتحت التحفيز β الأدرينالية عن طريق التسريب عن طريق الوريد من تركيزات متزايدة من الايسوبروترينول. نحن نقدم بروتوكول المكرر بما في ذلك دعم التهوية مع الأخذ في الاعتبار الضغط الإيجابي نهاية الزفير لتحسين الآثار السلبية خلال قياسات الصدر المفتوح، والتسكين قوية (Buprenorphine) لتجنب الإجهاد عضلة القلب لا يمكن السيطرة عليها التي أثارها الألم أثناء الإجراء. كل ذلك معا وصف مفصل للإجراء والمناقشة حول المزالق المحتملة تمكن عالية موحدة وقابلة للاستنساخ تحليل حلقة حجم الضغط، والحد من استبعاد الحيوانات من الفوج التجريبي عن طريق منع التحيز المنهجي ممكن.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية تؤثر عادة على وظيفة القلب. تشير هذه المسألة إلى أهمية تقييم وظيفة القلب المفصلة في الجسم الحي في نماذج الأمراض الحيوانية. ويحيط التجارب على الحيوانات إطار من المبادئ التوجيهية ثلاثة روبية (3Rs) (خفض / صقل / استبدال). في حالة فهم الأمراض المعقدة التي تنطوي على استجابات نظامية (أي أمراض القلب والأوعية الدموية) على المستوى التنموي الحالي ، فإن الخيار الرئيسي هو تحسين الطرق المتاحة. كما سيؤدي التكرير إلى خفض أعداد الحيوانات المطلوبة بسبب التباين الأقل، مما يحسن من قوة التحليل والاستنتاجات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الجمع بين قياسات انقباض القلب مع النماذج الحيوانية لأمراض القلب بما في ذلك تلك الناجمة عن التحفيز العصبي أو الضغط الزائد مثل النطاقات الأبهرية ، والتي تحاكي على سبيل المثال الكاتيكولامين المتغير / مستويات β الأدرينالية1و2و3و4، توفر طريقة قوية للدراسات ما قبل السريرية. مع الأخذ في الاعتبار أن الطريقة القائمة على القسطرة لا تزال النهج الأكثر استخداما لتقييم متعمق للانقباض القلبي5، استهدفنا تقديم هنا قياسا مكررا لوظيفة القلب في الجسم الحي في الفئران عن طريق قياسات حلقة حجم الضغط (PVL) خلال التحفيز β الأدرينالين استنادا إلى التجربة السابقة بما في ذلك تقييم معلمات محددة لهذا النهج6، 7.
لتحديد نهج المعلمات الدموية القلبية التي تشمل التصوير أو تقنيات القسطرة القائمة متوفرة. ويقترن كلا الخيارين بمزايا وعيوب تحتاج بعناية إلى النظر فيها بالنسبة للمسألة العلمية ذات الصلة. وتشمل أساليب التصوير تخطيط صدى القلب والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)؛ وقد استخدمت على حد سواء بنجاح في الفئران. وتشمل القياسات صدى القلب التكاليف الأولية العالية من مسبار عالي السرعة اللازم لارتفاع معدل ضربات القلب للفئران; وهو نهج غير الغازية واضحة نسبيا، ولكنه متغير بين المشغلين الذين من الناحية المثالية ينبغي أن يكون من ذوي الخبرة التعرف وتصور هياكل القلب. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن إجراء أي قياسات للضغط مباشرة، ويتم الحصول على الحسابات من مزيج من مقادير الحجم وقياسات التدفق. من ناحية أخرى ، لديها ميزة أنه يمكن إجراء العديد من القياسات على نفس وظيفة الحيوان والقلب يمكن رصدها على سبيل المثال أثناء تطور المرض. فيما يتعلق بقياس الحجم ، فإن التصوير بالرنين المغناطيسي هو الإجراء القياسي الذهبي ، ولكن على غرار تخطيط صدى القلب ، لا يمكن قياسات الضغط المباشر ويمكن الحصول على معلمات تعتمد على التحميل المسبق فقط8. وعوامل الحد هي أيضا مدى توافرها، وجهود التحليل وتكاليف التشغيل. هنا الأساليب القائمة على القسطرة لقياس وظيفة القلب هي بديل جيد أن تسمح بالإضافة إلى ذلك للرصد المباشر للضغط داخل القلب وتحديد المعلمات الانقباض مستقل الحمل مثل العمل السكتة الدماغية القابلة للتوظيف التحميل (PRSW)9. ومع ذلك، فإن الأحجام البطينية التي تقاس بقسطرة توصيل الضغط (من خلال تحديد الموصلية) أصغر من تلك الموجودة في التصوير بالرنين المغناطيسي ولكن يتم الحفاظ على اختلافات المجموعة في نفس النطاق10. من أجل تحديد قيم حجم موثوق بها مطلوب المعايرة المقابلة، وهي خطوة حاسمة خلال قياسات PVL. فهو يجمع بين قياسات الجسم الحي السابق لموصلية الدم في cuvettes حجم معايرة (تحويل التوصيل إلى حجم) مع تحليل في الجسم الحي للتوصيل الموازي للميوكارديوم أثناء حقن بولوس من المالحة فرطتونية11،12. أبعد من ذلك ، فإن وضع القسطرة داخل البطين والاتجاه الصحيح للأقطاب الكهربائية على طول المحور الطولي للبطين أمران حاسمان لقدرة الكشف عن المجال الكهربائي المحيط الذي تنتجه. لا يزال مع انخفاض حجم قلب الفأر من الممكن تجنب القطع الأثرية الناتجة عن التغيرات في اتجاه داخل البطين من القسطرة، حتى في البطينينالمتوسعة 5،10،ولكن القطع الأثرية يمكن أن تتطور تحت التحفيز β الأدرينالين6،13. بالإضافة إلى طرق التوصيل ، بدا أن تطوير أسلوب القبول القائم على تجنب خطوات المعايرة ، ولكن هنا يتم المبالغة في تقدير قيم الحجم14و15.
منذ الماوس هو واحد من أهم النماذج قبل السريرية في أبحاث القلب والأوعية الدموية β-احتياطي الأدرينالية من القلب هو من مصلحة مركزية في فسيولوجيا القلب وعلم الأمراض، ونحن نقدم هنا بروتوكول المكرر لتحديد في وظيفة القلب في الجسم الحي في الفئران عن طريق قياسات PVL خلال التحفيز β الأدرينالين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات وتنفيذها وفقا للوائح المجلس الإقليمي كارلسروه وجامعة هايدلبرغ (AZ 35-9185.82/A-2/15، AZ 35-9185.82/A-18/15، AZ 35-9185.81/G131/15، AZ 35-9185.81/G121/17) تتوافق مع المبادئ التوجيهية الواردة في التوجيه 2010/63/EU للبرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية. البيانات المعروضة في هذا البروتوكول مشتقة من الفئران الذكور من النوع البري C57Bl6/N (17 ± 1.4 أسبوعا من العمر). تم الحفاظ على الفئران في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في منشأة الحيوان (IBF) التابعة لكلية هايدلبرغ الطبية. تم إيواء الفئران في دورة ضوء داكنة لمدة 12 ساعة ، مع رطوبة نسبية بين 56-60 ٪ ، وتغيير الهواء 15 مرة في الساعة ودرجة حرارة الغرفة من 22 درجة مئوية +/- 2 درجة مئوية. وقد احتفظ بهم في أقفاص تقليدية من النوع الثاني أو النوع الثاني، وجرى تزويدهم منذ فترة طويلة بأسرة الحيوانات وأوراق الأنسجة كإثراء. كانت الأغذية القياسية المعبشة تلقائيا والمياه المعبشة تلقائيا متاحة لاستهلاك libitum الإعلانية.
1. إعداد الأجهزة والحلول الدوائية
- القسطرة الوريدية المركزية: اقطع الأنبوب الصغير (قطره الخارجي 0.6 مم) إلى أنابيب قسطرة بطول 20 سم تقريبا. استخدام ملقط لسحب نهاية واحدة من الأنبوب على غيض من قنية قياس 23. قطع الطرف الآخر من الأنابيب قطريا لخلق طرف حاد التي يمكن أن تخترق الوريد الفخذي.
- أنبوب القصبة الهوائية: بالنسبة إلى أنبوب التنبيب، قطع أنبوب venipuncture-cannula ذو قياس 20 سم بطول 3 سم لإزالة مرفق الحقنة.
- إذا كان أنبوب التنبيب لا يتناسب مع اتصال جهاز التنفس الصناعي تماما، التفاف parafilm على نهاية الأنبوب حيث يتم توصيل جهاز التهوية. يجب أن يكون الاتصال مستقرا ومختلا بالسمك(الشكل 1A). تقصير دبوس دليل معدني من venipuncture-cannula قياس 20 إلى 2.7 سم واستخدامه كمساعدة التنبيب. كما أن المناهج المكررة للتنبيب بما في ذلك الألياف الضوئية لتسهيل تصور القصبة الهوائية موصوفة بشكل جيد ، على سبيل المثال من قبل داس والمتعاونين16.
- خليط مخدر يستخدم للتنبيب: مزيج 200 ميكرولتر من الهيبارين (1000 وحدة دولية / مل) مع 50 ميكرولتر من 0.9٪ NaCl و 750 ميكرولتر من 2 ملغم / مل إيتوميدات من منتج قائم على الزيت في الماء. استخدام 7 ميكرولتر / غرام وزن الجسم (BW) لكل فأر (0.1 ملغم / كجم BW Buprenorphine 10 ملغ / كجم BW etomidate).
- استرخاء العضلات: حل 100 ملغ من بروميد بانكورونيوم في 100 مل من 0.9٪ NaCl. استخدم 1.0 ميكرولتر/غرام من وزن الجسم (1 ملغم/كغ بي واط) لكل فأر.
- حلول إيسوبروترينول: حل 100 ملغ من إيسوبروترينول في 100 مل من 0.9٪ NaCl (1 ميكروغرام / ميكرولتر). إعداد المخففات التالية (الجدول 1) ونقل كل في حقنة 1 مل.
- للحصول على التخفيف 1، تمييع المخزون 1:1.8. للحصول على تخفيف 2، تمييع المخزون 1:6. للحصول على التخفيف 3، تمييع التخفيف 1 إلى 1:10. وأخيرا، الحصول على تخفيف 4 من قبل 1:10 تخفيف التخفيف 2.
- 15٪ من حمض NaCl Hypertonic (ث/v): حل 1.5 غرام من NaCl 0.9٪ في 10 مل من H2O. المقطر المزدوج تصفية الحل مع مرشح حقنة المسام 0.45 ميكرومتر.
- إعداد 12.5٪ حل الألبومين (ث / v): حل 1.25 غرام من الألبومين مصل البقر في 10 مل من 0.9٪ NaCl. احتضان الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وتصفية الحل مع مرشح حقنة المسام 0.45 ميكرومتر.
- إعداد الإعداد: التبديل الأول على لوحة التدفئة وتعيينه إلى 39-40 درجة مئوية. ضع حقنة مملوءة بالمحلول الملحي على وسادة التدفئة ونقل قسطرة حلقة حجم الضغط (PVL) إلى الحقنة. قبل احتضان القسطرة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل استخدامها لتحقيق الاستقرار. الإعداد نستخدمها تتكون من القسطرة 1.4-F الضغط التوصيل، وحدة التحكم والبرمجيات المقابلة، وهو موضح بيانيا على الشكل 1B والمراجع مزود مدرجة في جدول المواد.
2. التخدير
- حقن البوبرينورفين (0.1 ملغم/كغ BW intraperitoneally) 30 دقيقة قبل التنبيب.
- ضع الماوس في غرفة زجاجية أكريليك مشبعة مسبقا مع isoflurane 2.5٪ وتدفأ مسبقا مع وسادة التدفئة وضعت على قاعدة الغرفة.
- بمجرد أن ينام الفأر (عدم وجود رد فعل) ، قم بحقن الخليط المخدر (7 مل / كجم BW) الذي يحتوي على 10 ملغم / كجم إيتوميدات وهيبارين (1200 وحدة دولية / كجم BW) intraperitoneally.
3. التهوية
- نقل الحيوان إلى منصة التنبيب (الشكل 1C) 3-4 دقائق بعد الحقن مخدر. الماوس يتدلى من الأسنان مع عرض الظهر التي تواجه المشغل.
- رفع اللسان بلطف مع ملقط. لتحديد glottis، رفع الفك السفلي للفأر قليلا مع ملقط الثاني.
- أدخل أنبوب القصبة الهوائية بعناية(الشكل 1A)في القصبة الهوائية وأزل قضيب الدليل.
- نقل الحيوان على لوحة التدفئة، ووضعه على ظهره وربط أنبوب التنبيب إلى الجهاز التنفسي الحيواني الصغير.
- ضبط معدل التنفس إلى 53.5 × (وزن الجسم بالجرام)-0.26 [دقيقة-1]،كما وصفها الآخرون12،وحجم المد والجزر إلى ذروة الضغوط الملهمة من 11 ± 1 cmH2O. إنشاء PEEP من 2 سمH2O.
- إصلاح بعناية أطراف الماوس على لوحة التدفئة مع شرائط لاصقة وتطبيق مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف.
- أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم وحافظ على درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 ± 0.2 درجة مئوية.
- تثبيت تخطيط القلب 1 الرصاص ورصد معدل ضربات القلب على الخط كمؤشر لعمق التخدير والاستقرار.
- عند عدم وجود ردود الفعل بين النوى، وحقن 1 ملغم/ كغ BW من العضلات مرخي بانكورونيوم بروميد intraperitoneally. وهذا يمنع القطع الأثرية التنفسية أثناء قياسات PVL.
4. الجراحة
- التوصيات العامة
- أثناء الجراحة، تهوية مع ~ 1.5-2٪ isoflurane تبخرت مع O2. تركيز isoflurane يمكن أن تعتمد أيضا على متغيرات مثل سلالة الماوس والجنس والعمر والوزن من الحيوانات، ولكن يجب أن يتم تحديدها بشكل فردي وتجريبي والقيم هنا هي مرجع لسلالة الماوس C57BL6/N. الأهم من ذلك، يتم توصيل جهاز التنفس الصناعي إلى نظام استخراج لمنع المشغل من استنشاق isoflurane.
- استخدام التكبير بين 1.5-4x من المجهر ستيريو لإجراء العمليات الجراحية.
ملاحظة: الرجوع إلى التوجيه المؤسسي / المحلي حول إعداد الحيوان للجراحة غير البقاء على قيد الحياة.
- علبة الفخذ
- شطف الأطراف الخلفية مع الإيثانول 70٪، وincise المنطقة الأربية اليسرى وفضح الوريد الفخذي الأيسر.
- انفجار الشريان الوريدي الوريدي والكواية.
- Ligate الوريد الفخذي مع خياطة وضعت القاصي إلى وصول القسطرة.
- تمرير خياطة تحت الوريد الفخذي وإعداد عقدة الجمجمة من موقع ثقب. ثقب الوريد الفخذي مع أنبوب صغير المعدة (انظر الخطوة 1.1) تعلق على حقنة 1 مل.
- ربط أسفل عقدة لإصلاح أنبوب داخل السفينة.
- مواجهة فقدان السوائل عن طريق ضخ 0.9٪ NaCl تكملها مع 12.5٪ الألبومين بمعدل ضخ 15 ميكرولتر / دقيقة مع مضخة حقنة أوتوماتيكية. بالإضافة إلى ذلك، حافظ على رطوبة الأنسجة المكشوفة باستخدام NaCl بنسبة 0.9٪ قبل الإحماء.
- استئصال الصدر
- شطف الصدر مع الإيثانول 70٪.
- انبس الجلد فقط تحت عملية xyphoid وفصل بصراحة العضلات الصدرية من جدار الصدر مع ملقط أو الكي.
- رفع عملية xyphoid مع ملقط، ومن ثم قطع من خلال جدار الصدر تتحرك أفقيا على كلا الجانبين مع الكي حتى الحجاب الحاجز مرئية تماما من تحت.
- انسي الحجاب الحاجز من تحت وفضح قمة القلب. ثم إزالة التمور بعناية مع ملقط.
- إجراء عملية استئصال تكلفة محدودة على الجانب الأيسر كما هو موضح سابقا6.
- مرر خياطة تحت الوريد التجويف السفلي لإجراء تقليل التحميل المسبق خلال المراحل اللاحقة.
- ثقب بلطف قمة القلب مع قنية قياس 25 (أقصى 4 ملم). إزالة القنية وإدخال القسطرة الكهروضوئية حتى جميع الأقطاب الكهربائية داخل البطين.
- ضبط موقف القسطرة عن طريق حركات لطيف ويتحول حتى يتم الحصول على حلقات مستطيلة الشكل(الشكل 2A).
- الحفاظ دائما على جميع الأنسجة المكشوفة الرطبة باستخدام ما قبل الدافئة 0.9٪ NaCl.
5. القياسات
- التوصيات العامة
- أثناء القياسات، تهوية مع ~ 1.5-2٪ isoflurane تبخرت مع 100٪ O2.
- إجراء قياسين خط الأساس وكذلك 2 انسدادات فينا كافا على كل خطوة من بروتوكول الاستجابة الجرعة.
ملاحظة: من المهم أن بعد الانسداد كافا vena الأول والثاني، كل من قيم الضغط وحدة التخزين العودة إلى قيم الحالة الثابتة كما قبل الانسداد الأول. هذه الملاحظة ضرورية من أجل التعرف على التحول في وضع القسطرة بسبب التخفيضات التسلسلية في حجم البطين. إذا كان التحول في موقف القسطرة سيكون هو الحال، وخاصة سيتم تغيير قيم الحجم.
- إجراء تحليل على الخط من المعلمات (معدل ضربات القلب، وحجم السكتة الدماغية، dP / DTماكس)والانتظار حتى يتم الحصول على وظيفة القلب ثابتة الدولة. لنطاق المعلمة المتوقع مع الإعداد المستخدم هنا في الفئران C57Bl6/N يرجى الرجوع إلى النتائج المنشورة6.
- إيقاف الجهاز التنفسي في وضع انتهاء الصلاحية وتسجيل معلمات خط الأساس. بعد 3 إلى 5 ثوان تقليل التحميل المسبق القلب عن طريق رفع خياطة تحت الوريد التجويف السفلي مع ملقط من أجل الحصول على المعلمات المستقلة التحميل المسبق(الشكل 2B). تشغيل جهاز التنفس الصناعي. انتظر 30 ثانية على الأقل للانسداد الثاني حتى تستقر المعلمات الديناميكية الدموية.
- بعد الحصول على القياسات في ظل ظروف القاعدية المضي قدما في استجابة الجرعة من isoproterenol عن طريق التحول إلى المحاقن المعدة. هنا يبقى معدل التسريب دون تغيير من أجل تجنب تعديلات التحميل المسبق للقلب. الحرص على عدم غرس فقاعات الهواء عند تغيير الحقنة.
- انتظر دقيقتين على الأقل حتى يتم الحصول على وظيفة القلب الثابتة الجديدة من إيقاف الجهاز التنفسي مرة أخرى في وضع الانتهاء ومعلمات خط الأساس القياسية. بعد 3 إلى 5 ثوان تقليل التحميل المسبق القلب عن طريق رفع خياطة تحت الوريد التجويف السفلي من أجل الحصول على المعلمات المستقلة التحميل المسبق.
- انتظر 30 ثانية على الأقل للانسداد الثاني. بعد ذلك التحول إلى حقنة أعدت مع تركيز isoproterenol المقبل وتكرار تسجيلات خط الأساس والمعلمات المستقلة التحميل المسبق.
ملاحظة: القطع الأثرية مثل ارتفاع الضغط الانقباضي نهاية (ESPS, الشكل 2C) يمكن أن تحدث خلال الزيادة في جرعة من إيسوبروتيرينول, مما ينتج عن الفخ القسطرة. يمكن تصحيح القطع الأثرية التي تحدث قبل بدء المعلمات القاعدية بسهولة عن طريق إعادة تحديد موضع القسطرة.
6. المعايرة
ملاحظة: قد تختلف إجراءات المعايرة حسب نظام PVL المستخدم.
- معايرة التوصيل المتوازي
- توصيل حقنة تحتوي على محلول NaCl 15٪ إلى قنية الفخذ بعد القياس الأخير من استجابة جرعة إيسوبروترينول. غرس بعناية 5 ميكرولتر من محلول hypertonic المتبقية في الأنبوب حتى PVL تحول قليلا إلى اليمين أثناء التصور على الخط. ثم انتظر حتى الحلقات العودة إلى حالة ثابتة.
- وقف الجهاز التنفسي عند انتهاء الصلاحية وحقن بولوس واحد من 10 ميكرولتر من 15٪ NaCl في غضون 2 إلى 3 ثوان. تحقق مما إذا كان PVL توسيع إلى حد كبير ويتم تحويلها إلى اليمين أثناء التصور على الخط.
- معايرة التوصيل إلى الحجم
- الانتظار 5 دقائق، لا أقل، بحيث يتم تخفيف بولوس المالحة فرط الحرارة تماما. بعد ذلك قم بإزالة القسطرة واسحب ما لا يقل عن 600 ميكرولتر من البطين الأيسر للقلب النابض باستخدام حقنة 1 مل وقنية قياس 21. عند هذه النقطة الوقت هو القتل الرحيم الحيوان تحت التخدير العميق والتسكين عن طريق نزيف هائل، عن طريق وقف التهوية وإزالة القلب.
- نقل الدم إلى ما قبل الحارة (في حمام مائي في 37 درجة مئوية) cuvette المعايرة مع اسطوانات من حجم معروف. ضع القسطرة الكهروضوئية مركزيا في كل أسطوانة وسجل التوصيل. من خلال حساب منحنى قياسي لكل ، يمكن تحويل وحدات التوصيل إلى قيم حجم مطلقة.
7. تحليل
- بعد قياسات PVL الناجحة في ظل الظروف القاعدية وتحفيز isoproterenol ، تصور ، رقمنة ، حساب واستخراج المعلمات التي تميز وظيفة القلب (مثل PRSW ، dP / dt ، الضغط النهائي الانبساطي والحجم ، الضغط والحجم نهاية الانقباضي ، الاسترخاء ثابت تاو ، من بين أمور أخرى) باستخدام برنامج تحليل PVL المناسبة. يمكن إجراء المزيد من التحليل الإحصائي والتمثيلات الرسومية باستخدام برامج التحليل القياسية.
- تحليل المعلمات المستقلة التحميل المسبق
ملاحظة: لهذه الخطوة من الضروري توحيد الإجراء.- حدد أول 5-6 PVLs تظهر انخفاض التحميل المسبق في جميع القياسات لتحليل المعلمات المستقلة التحميل المسبق(الشكل 2D). وسيقلل العدد الثابت من الأصناف الكهروضوئية المختارة للتحليل أثناء تخفيض التحميل المسبق من التباين بين قياسات المعلمات التي تم الحصول عليها.
- حساب متوسط قيمة القياسين في كل خطوة من البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قياس حجم الضغط حلقة (PVL) هو أداة قوية لتحليل الديناميكا الدوائية القلبية للأدوية والتحقيق في النمط الظاهري القلبي لنماذج الماوس المعدلة وراثيا في ظل الظروف العادية والمرضية. يسمح البروتوكول بتقييم احتياطي β الأدرينالية القلبية في نموذج الماوس البالغ. هنا نصف طريقة مفتوحة الصدر تحت تخدير isoflurane جنبا إلى جنب مع البوبرينورفين (مسكن) وبانكورونيوم (ارتخاء العضلات)، والذي يركز على استجابة القلب لتحفيز β الأدرينالين عن طريق غرس تركيزات إيزوبروترينول من خلال قسطرة الوريد الفخذي. بعض البيانات التمثيلية المبينة في هذا البروتوكول مشتقة من نوع البرية C57Bl6/N الفئران الذكور البالغين (الشكل 3 والجدول 2). كمؤشر على تباين بعض المعلمات الهامة التي تقاس بتحليل PVL لدينا قمنا بتحليل الطاقة (α احتمال الخطأ من 0.05 وقوة 0.8) باستخدام النتائج من مجموعة WT والبرمجيات G * Power المتاحة مجانا17. في الجدول 3 يتم تصوير أحجام التأثير المحسوب وأحجام العينة المطلوبة لمعدل ضربات القلب ، PRSW ، حجم السكتة الدماغية ، ثابت الاسترخاء Tau ، dP / dtmax و dP / dtmin على افتراض التغييرات بين 10٪ إلى 30٪ لكل معلمة تحت 0 و 0.825 و 8.25 نانوغرام / دقيقة isoproterenol.
يتم التحليل الرسومي للعلاقات بحجم الضغط من خلال رسم الحجم (μL) على Y والضغط (mmHg) على المحور X. إذا تم وضع القسطرة بشكل صحيح داخل البطين، يتم تمثيل دورة القلب الكاملة بواسطة PVL مستطيل الشكل(الشكل 2A والشكل 3A). بعد فترة وجيزة، يبدأ الستول بمرحلة من الانكماش متساوي التماثل (تتميز dP/dtmax)،يتم خلالها إغلاق كل من صمامات القلب (الحافة الرأسية اليمنى). عندما يتجاوز ضغط البطين الضغط الأبهري، يفتح الصمام الأبهري ويتم ضخ الدم في الشريان الأورطي أثناء مرحلة القذف (الأفقي العلوي). في وقت لاحق ، عندما يتجاوز الضغط الأبهري الضغط البطيني ، يغلق الصمام الأبهري ويبدأ الدياسول. أثناء الاسترخاء متساوي التماثل (يتميز المعلمات dP / DTمين وتاو) ينخفض ضغط البطين حتى يتجاوز ضغط الأذين ضغط البطين ويفتح الصمام التاجي (الحافة الرأسية اليسرى). الآن ملء الانبساطي السلبي، تتميز العلاقة نهاية الضغط الانبساطي حجم (EDPVR)، يحدث حتى تبدأ دورة القلب المقبل (أسفل الأفقي)(الشكل 2A-B).
يوفر تحليل PVL رؤى مفصلة في وظيفة القلب لأنه قادر على تحديد وظيفة القلب مستقلة عن الحمل المسبق للقلب. وهكذا، فقد وصفت بأنها معيار الذهب لتحديد وظيفة القلب في الاجهزة التجريبية5. في البروتوكول الموصوف باستخدام فئران C57Bl6/N ، قمنا بتقييم الاستجابة للإيسوبروترينول المنتجة على المعلمات العامة لوظيفة القلب مثل معدل ضربات القلب ، خرج القلب ، حجم السكتة الدماغية وعمل السكتة الدماغية. لوحظ تأثير كبير من إيسوبروترينول على كل معلمة في استجابة الجرعة تحت تركيزات إيسوبروترينول مختلفة (الشكل 3B). وأظهرت معلمات انقباض القلب مثل PRSW وdP / dtماكس الزيادة المتوقعة في الجرعة استجابة تحت ضخ isoproterenol (الشكل 3A-B). من ناحية أخرى، تم تسجيل انخفاض في المعلمات الانبساطي (ثابت من الاسترخاء تاو وDP / DTدقيقة)مع زيادة تركيزات إيسوبروترينول(الشكل 3C)كما هو متوقع من تأثير lusitropic إيجابية التي تنتجها الكاتيكولامينات في القلب السليم. كما يتم الحصول على معلمات أخرى من تلك الموضحة في الشكل 3 (أي الضغط والحجم الانقباضي النهائي والضغط والحجم الانبساطي النهائي والضغط الأقصى وغيرها) من تحليل PVL أيضا ويمكن تحليلها أيضا اعتمادا على السؤال العلمي ونموذج المرض الوراثي أو المرض والملاحظات التي تم الحصول عليها. قيم إضافية ومفصلة للمعلمات الأكثر شيوعا من وظيفة القلب في PVL على كل خطوة خلال التحفيز β الأدرينالية التدريجي, بما في ذلك نقطة زمنية للمعايرة لموازية التوصيل مع المالحة hypertonic الذي يؤثر تأثيرا كبيرا على المعلمات حجم القلب, ولكن أيضا inotropy القلب والاسترخاء, وقد تم الإبلاغ سابقا1,6.
الشكل 1. التخدير وإعداد حلقة حجم الضغط. (أ) 20 قياس venipuncture-cannula تكييفها تنبيب الماوس. (ب) رسم بياني يبين تنظيم المكونات المختلفة لإعداد قياس حجم الضغط المستخدم والاتصال بها، بما في ذلك اتجاه تدفق غاز التخدير. (ج) منصة التنبيب المستخدمة لتعليق الفئران لفترة تبيب سريعة وآمنة. يتم تضمين مسامير (1) في كلا الجانبين في نهاية الخيط المعلق (2) لتشديد التهديد اعتمادا على وزن الماوس. يشير السهم إلى إمكانية الاتصال للتعرض isoflurane. درجة الحرارة:درجة الحرارة; تخطيط القلب: تخطيط القلب; MinPإكسب: الحد الأدنى من الضغط الزفيري; ماكسبإكسب:أقصى ضغط الزواية. PV: حجم الضغط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تحليل حجم الضغط التمثيلي. (أ) تسجيلات نموذجية بحجم الضغط حيث يتم عرض المعلمات التي يتم تحليلها أثناء القياس القاعدي وتصوير الأحداث الرئيسية أثناء الدورة القلبية. (ب) يتم تصوير المعلمات ESPVR و EDPVR و PRSW أثناء التخفيض المسبق. (ج) نهاية الانقباضي الضغط المسامير خلال القياسات القاعدية (لوحة العليا) أو أثناء المناورة انسداد (لوحة السفلى) يتم تقديم كل من تحت التحفيز isoproterenol. LV: البطين الأيسر; dP/dtدقيقة: الحد الأدنى dP/dt; dP/dtالحد الأقصى: الحد الأقصى dP/dt; Ves: نهاية الانقباضي حجم; Vإد: نهاية الانبساطي حجم; ESPVR: نهاية الانقباضي الضغط حجم العلاقة; PRSW: التحميل المسبق للعمل السكتة الدماغية للتوظيف; EDPVR: نهاية الانبساطي الضغط حجم العلاقة. تم اقتباس الشكل من ملحق عملنا السابق 20196. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تحليل قياسات PVL في الفئران C57BL6/N. (أ) PVLs ممثل خلال انسداد الوريد التجويف السفلي من الفئران C57BL6 /N السيطرة وتعرض لزيادة تركيزات إيزوبروتيرينول. (ب) وظيفة القلب العامة خلال الحالات القاعدية وخلال isoproterenol يوصف من خلال تحليل معدل ضربات القلب، والناتج القلبي، وحجم السكتة الدماغية والعمل السكتة الدماغية. (ج) تم تحليل معلمات إضافية لتقييم انقباض القلب والوظيفة الانبساطية مثل PRSW ، وثابت الاسترخاء تاو (معادلة فايس18)والحد الأقصى والحد الأدنى dP / dt. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط الانحراف المعياري ±. BPM: يدق في الدقيقة الواحدة. PRSW: التحميل المسبق للعمل السكتة الدماغية للتوظيف; ن: عدد الفئران. ** p < 0.01: p-values من اختبار T للطالب المقترن مقابل الحالة القاعدية (isoproterenol = 0 نانوغرام/دقيقة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أيسوبروترينول | التركيز (pg/μL) | معدل التسريب (ميكرولتر/دقيقة) | جرعات (نانوغرام / دقيقة) |
| رصيد | 1000 | ||
| التخفيف 1 | 550 | 15 | 8.25 |
| التخفيف 2 | 165 | 15 | 2.475 |
| التخفيف 3 | 55 | 15 | 0.825 |
| التخفيف 4 | 16.5 | 15 | 0.2475 |
الجدول 1 - الجداول التخفيف من الايسوبروترينول لزيادة التحفيز β الأدرينالية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
| إيسوبروترينول (نانوغرام/دقيقة) | |||||
| 0 | 0.2475 | 0.825 | 2.475 | 8.25 | |
| المعلمات والمجلدات العمومية | |||||
| معدل ضربات القلب (bpm) | 470 ± 19.6 | 490 ± 19.3 | 542 ± 20.6 | 605 ± 20.5 | 638 ± 20.5 |
| حجم السكتة الدماغية (ميكرولتر) | 16.2 ± 2.6 | 17.6 ± 2.1 | 20.3 ± 2.8 | 22.3 ± 2.2 | 23.9 ± 2.5 |
| إخراج القلب (ميكرولتر/ دقيقة) | 7627 ± 1210 | 8609 ± 1097 | 11000 ± 1616 | 13502 ± 1494 | 15291 ± 1761 |
| نهاية الحجم الانقباضي (ميكرولتر) | 13 ± 3.1 | 10.5 ± 3.5 | 4.81 ± 2.3 | 1.94 ± 1.9 | 1.5 ± 1.7 |
| نهاية الانبساطي حجم (ميكرولتر) | 27.4 ± 3 | 26.6 ± 3.0 | 24.1 ± 3.1 | 23.8 ± 2.6 | 24.8 ± 2.7 |
| متوسط الضغط (مم زئبق) | 27.4 ± 2.2 | 28.6 ± 2.2 | 29.2 ± 1.9 | 29.7 ± 1.9 | 30.5 ± 1.9 |
| إلستانس الشرياني (مم زئبق/ميكرولتر) | 4.44 ± 0.6 | 4.18 ± 0.7 | 3.46 ± 0.5 | 2.78 ± 0.9 | 2.91 ± 1 |
| المعلمات الانقباضية | |||||
| التحميل المسبق لعمل السكتة الدماغية القابل للتوظيف | 67.8 ± 7.62 | 76.3 ± 9.85 | 96.1 ± 14.62 | 108 ± 14.56 | 113 ± 13.02 |
| ESPVR | 4.96 ± 1.29 | 5.15 ± 1.16 | 7.2 ± 2.28 | 17.3 ± 42.04 | 40 ± 107.55 |
| كسر القذف (٪) | 52.59 ± 9.57 | 60.9 ± 9.94 | 80.23 ± 8.65 | 92.16 ± 7.2 | 94.18 ± 6.15 |
| عمل السكتة الدماغية (مم زئبق × ميكرولتر) | 1007 ± 244.26 | 1153 ± 193 | 1399 ± 261 | 1582 ± 234 | 1720 ± 216 |
| أقصى dP/dt (مم زئبق/ثانية) | 6128.7 ± 1398.39 | 7087 ± 1401 | 8982.4 ± 1481 | 11422 ± 1477 | 13256 ± 1165 |
| الحد الأدنى dV/dt (ميكرولتر/ثانية) | - 523 ± 105.58 | - 613 ± 102 | - 835 ± 151 | - 1103 ± 165 | - 1273 ± 177 |
| الضغط الانقباضي النهائي (mmHg) | 70.8 ± 6.98 | 72.5 ± 7.42 | 69 ± 6.28 | 61.2 ± 17.36 | 68.2 ± 19.72 |
| أقصى طاقة (مم زئبق x ميكرولتر/ثانية) | 3009 ± 955.31 | 3541 ± 1188 | 4185 ± 1058 | 4272 ± 959 | 4918 ± 1418 |
| المعلمات الانبساطية | |||||
| EDPVR | 1 ± 0.93 | 1.23 ± 0.88 | 1.5 ± 0.86 | 1.87 ± 0.92 | 1.96 ± 0.99 |
| تاو (MS، معادلةفايس) | 6.14 ± 0.64 | 5.67 ± 0.44 | 4.92 ± 0.44 | 4.83 ± 0.55 | 4.96 ± 0.65 |
| الحد الأدنى dP/dt (مم زئبق/ثانية) | - 7272 ± 1403 | - 8119 ± 1295 | - 8998 ± 1240 | - 8618 ± 1129 | - 8648 ± 1468 |
| الضغط الانبساطي النهائي (مم زئبق) | 5.29 ± 1.01 | 5.74 ± 1.07 | 5.6 ± 1.51 | 5.37 ± 1.13 | 5.76 ± 1.15 |
| أقصى درجة dV/dt (ميكرولتر/ثانية) | 765 ± 174 | 817 ± 178 | 972 ± 156 | 1158 ± 163 | 1264 ± 153 |
الجدول 2 - الأرباح تحليل قياسات PVL في الفئران C57BL6/N. PVL معلمات وظيفة القلب خلال الظروف القاعدية وخلال ضخ isoproterenol. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط الانحراف المعياري ± عن 18 فأرا بالغا ذكرا. PV: حجم الضغط; BPM: يدق في الدقيقة الواحدة. ESPVR: منحدر نهاية الانقباضي PV-العلاقة, حساب غير كافية في أحجام منخفضة داخل البطين (2.475 و 8.25 نانوغرام / دقيقة إيسوبروتيرينول); EDPVR: نهاية الانبساطي PV-العلاقة، الانحدار الأسي (معامل ألفا). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
| دلتا (٪) | حجم التأثير | حجم العينة لكل مجموعة | ||||
| إيسوبروترينول نغ/مين | إيسوبروترينول نغ/مين | |||||
| 0 | 0.825 | 8.25 | 0 | 0.825 | 8.25 | |
| معدل ضربات القلب | ||||||
| 10 | 2.4 | 2.6 | 3.1 | 4 | 4 | 3 |
| 15 | 3.6 | 3.9 | 4.6 | 3 | 3 | 3 |
| 20 | 4.8 | 5.3 | 6.2 | 3 | 3 | 3 |
| 25 | 6.0 | 6.6 | 7.8 | 3 | 3 | 3 |
| 30 | 7.2 | 7.9 | 9.3 | 3 | 3 | 3 |
| حجم السكتة الدماغية | ||||||
| 10 | 0.6 | 0.7 | 1.0 | 42 | 30 | 18 |
| 15 | 0.9 | 1.1 | 1.5 | 20 | 15 | 9 |
| 20 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 12 | 9 | 6 |
| 25 | 1.5 | 1.8 | 2.4 | 8 | 6 | 4 |
| 30 | 1.8 | 2.2 | 2.9 | 6 | 5 | 4 |
| التحميل المسبق لعمل السكتة الدماغية القابلة للتوظيف | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.7 | 0.9 | 21 | 38 | 22 |
| 15 | 1.3 | 1.0 | 1.3 | 10 | 18 | 11 |
| 20 | 1.8 | 1.3 | 1.7 | 7 | 11 | 7 |
| 25 | 2.2 | 1.6 | 2.2 | 5 | 7 | 5 |
| 30 | 2.7 | 2.0 | 2.6 | 4 | 6 | 4 |
| dP/ dtكحد أقصى | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.6 | 1.1 | 83 | 44 | 14 |
| 15 | 0.7 | 0.9 | 1.7 | 38 | 20 | 7 |
| 20 | 0.9 | 1.2 | 2.3 | 22 | 12 | 5 |
| 25 | 1.1 | 1.5 | 2.8 | 15 | 8 | 4 |
| 30 | 1.3 | 1.8 | 3.4 | 11 | 6 | 3 |
| تاو | ||||||
| 10 | 1.0 | 1.1 | 0.8 | 19 | 14 | 28 |
| 15 | 1.4 | 1.7 | 1.2 | 9 | 7 | 13 |
| 20 | 1.9 | 2.2 | 1.5 | 6 | 5 | 8 |
| 25 | 2.4 | 2.8 | 1.9 | 4 | 4 | 6 |
| 30 | 2.9 | 3.4 | 2.3 | 4 | 3 | 5 |
| dP/ dtدقيقة | ||||||
| 10 | 0.5 | 0.7 | 0.6 | 60 | 31 | 47 |
| 15 | 0.8 | 1.1 | 0.9 | 27 | 15 | 22 |
| 20 | 1.0 | 1.4 | 1.2 | 16 | 9 | 13 |
| 25 | 1.3 | 1.8 | 1.5 | 11 | 6 | 9 |
| 30 | 1.6 | 2.2 | 1.8 | 8 | 5 | 7 |
| علاقة حجم الضغط الانقباضي النهائي | ||||||
| 10 | 0.4 | 0.3 | 0.04 | >100 | >100 | >100 |
| 15 | 0.6 | 0.5 | 0.06 | 48 | 73 | >100 |
| 20 | 0.8 | 0.6 | 0.07 | 28 | 41 | >100 |
| 25 | 1.0 | 0.8 | 0.09 | 19 | 27 | >100 |
| 30 | 1.2 | 1.0 | 0.11 | 13 | 19 | >100 |
| نهاية الانبساطي حجم | ||||||
| 10 | 0.9 | 0.8 | 0.9 | 20 | 27 | 20 |
| 15 | 1.4 | 1.2 | 1.4 | 10 | 13 | 10 |
| 20 | 1.8 | 1.6 | 1.8 | 6 | 8 | 6 |
| 25 | 2.3 | 2.0 | 2.3 | 5 | 6 | 5 |
| 30 | 2.8 | 2.4 | 2.8 | 4 | 5 | 4 |
الجدول 3 - الأرباح حجم التأثير المقدر وحجم العينة المطلوب للمعلمات المحددة استنادا إلى القيم الملاحظة في الفئران الذكور C57BL6/N. دلتا يصور الفرق الفرضي في المعلمة بين عنصر تحكم (أي نوع البرية) ومجموعة العلاج. يتم حساب حجم التأثير وحجم العينة المطلوب لكل مجموعة باستخدام بيانات التحكم (المتوسط والانحراف المعياري) وخطأ ألفا (0.05) والطاقة (0.8) عبر G* Power 19. تشير القيم الجريئة (الخلفيات الخضراء في الإصدار الفوري للجدول) إلى حجم تأثير عتبة مقترح (1≤) وحجم عينة لكل معلمة على كل جرعة من إيسوبروترينول. dP/dtدقيقة: الحد الأدنى dP/dt; dP/dtالحد الأقصى: الحد الأقصى dP/dt. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، ونحن نقدم بروتوكولا لتحليل وظيفة القلب في الجسم الحي في الفئران تحت التحفيز β الأدرينالين المتزايد. يمكن استخدام الإجراء لمعالجة كل من المعلمات الأساسية لوظيفة القلب واحتياطي الأدرينالين (على سبيل المثال ، inotropy و chronotropy) في الفئران المعدلة وراثيا أو عند التدخلات. الميزة الأبرز لقياسات حلقة حجم الضغط (PVL) بالمقارنة مع الوسائل الأخرى لتحديد وظيفة القلب هي تحليل وظيفة القلب الجوهرية والمستقلة عن الحمل. جميع الطرق الأخرى (مثل التصوير بالرنين المغناطيسي وتخطيط صدى القلب) يمكن تقييم المعلمات التي تعتمد على الحمل فقط من وظيفة القلب وخاصة انكماش القلب لا يمكن تحديدها بشكل موثوق. وهذا يجعل PVL القياسات معيار الذهب لقياس نقطة النهاية من التحليل المتعمق للوظيفة القلب5. ومع ذلك ، فإن الأساليب المسماة من قبل تسمح بإجراء تحليل تسلسلي لوظيفة القلب ، مما يجعلها في طليعة الملاحظات الطولية (على سبيل المثال ، أثناء تطور المرض). علاوة على ذلك ، يمكن الاستهانة بالأحجام داخل البطين ، وبالتالي حجم السكتة الدماغية والمعلمات المشتقة الأخرى ، في قياسات PVL مقارنة بالرنين المغناطيسي في الفئران20.
هناك أربع خطوات حاسمة خلال البروتوكول التي تعتبر حاسمة للحصول على بيانات PVL صالحة: 1) التنبيب، 2) وضع قسطرة الوريد الفخذي، 3) وضع القسطرة الضغط التوصيل و 4) نظام ما حول البروسيدural. عدم التنبيب الغازية من الفئران يتطلب بعض الخبرة ومعقدة عند استخدام isoflurane كما الإطار الزمني للتنبيب ضيق (20-40 ق). وهكذا، بعد التنبيب يجب فحص وضع الأنبوب الصحيح بعناية عن طريق فحص حركات الصدر مورين عند تغيير معدل التنفس الصناعي. لتوسيع نافذة التنبيب ، وصفنا هنا الاستخدام المصاحب للإيتومييدات المنومة قصيرة التمثيل. وعلاوة على ذلك، تتوفر ألياف ضوئية لتسهيل التصور من glottis16. الموضع السليم للقسطرة الوريد الفخذي ضروري لتطبيق isoproterenol خلال المراحل اللاحقة. خلال هذه الخطوة، يمكن أن الانسداد الهواء تضر بشدة الحيوانات التي تحفز الانصمام الرئوي. يمكن فحص الموضع الصحيح للقسطرة الفخذية في البداية من خلال الطموح الدقيق للدم الوريدي. عندما يكون وضع القسطرة المناسب غير مؤكد خلال المراحل اللاحقة ، يمكن فحص الحجم الانبساطي النهائي ، والذي يجب أن يزيد استجابة لأدنى بولوس عند تصور PVL على الخط. خلافا لمعظم المحققين الآخرين، ونحن هنا وصف العلبة من الوريد الفخذي، في حين أن البعض الآخر في معظم الأحيان استخدام الوريد الوداجي كوعاء الهدف للوصول الوريدي المركزي12،21. هذا النهج لديه ميزة عدم التلاعب بالقرب من العصب المبهم ، كما هو الحال في نهج الصدر القريب عندما يتم إعداد السباتي ، وبالتالي نفترض أنه يتم تجنب التحفيز المحتمل للنظام شبه المتعاطف ببساطة عن طريق لمس / إتلاف العصب. يعد الموضع السليم للقسطرة الكهروضوئية داخل البطين أمرا حاسما للحصول على بيانات ذات مغزى خاصة فيما يتعلق بمعلمات الحجم. عندما لا تكون الأقطاب الكهربائية داخل البطين تماما أو لا يتم وضع القسطرة بشكل صحيح على طول المحور الطولي للبطين ، يتم الاستهانة بمعلمات الحجم بشكل كبير. علاوة على ذلك ، يسبب الاتصال بين الاندوكيوم ومحول الضغط طفرات الضغط الانقباضي النهائية التي لا ينبغي التسامح معها أثناء قياسات خط الأساس6. وأخيرا، فإن النظام المحيط بالطبيعة بما في ذلك عمق التخدير وإدارة السوائل له تأثير كبير على موثوقية بيانات PVL في الفئران. يمكن أن يؤثر الخدر تحت أو جرعة زائدة على المعلمات الديناميكية الدموية بشدة ، مما يؤدي في معظم الأحيان إلى انخفاض وظيفة القلب. فقدان السوائل، والذي يرجع في الغالب إلى فقدان الدم والتبخر، يجب مواجهته مع التسريب المستمر للحلول المناسبة مثل 12.5٪ من الألبومين الذائب في NaCl بنسبة 0.9٪، وهو ما نوصي به. يجري أن النهج الغازية جدا, لا يقل أهمية هو إدراج مسكن قوية مثل البوبرينورفين لتقليل التأثيرات على وظائف القلب والأوعية الدموية التي أثارها تجنب الألم غير كافية. نحن حقن المخدرات مسكن قبل التنبيب. من المهم إجراء الحقنة قبل 30 دقيقة من بدء الإجراء بأكمله ، خاصة إذا كان المشغل من ذوي الخبرة ، وبالتالي بسرعة ، من أجل الوصول إلى تأثير مسكن مناسب لتجنب أي ألم أثناء مرحلة التحقيق. بالإضافة إلى ذلك، عند العمل مع نماذج السمنة ربما ينبغي النظر في جرعات أعلى بسبب ارتفاع الدهون من هذه المادة. وأخيرا، يمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول في تحديد الاستجابة لمحفزات الكاتيكولامينرجية الأخرى مثل الدومبوتامين أو الإبينفرين؛ كما فعل على سبيل المثال من قبل كاليغاريس وزملاؤه22 الذين وصفوا التحليل في الضغط داخل البطين أثناء التحفيز الديوبوتامين.
فيما يتعلق بتسجيل وتحليل قياسات PVL هناك العديد من الخطوات التي تحتاج إلى النظر فيها. أولا، من الأهمية بمكان تحليل تسجيلات PVL باستمرار عبر مجموعة بيانات تجريبية. يجب تجنب القطع الأثرية التنفسية التي تتطور بسبب الضغط الرئوي المتناوب مما يؤدي إلى التحميل المسبق القلبي بالتناوب أثناء التهوية الميكانيكية عن طريق إيقاف تشغيل جهاز التنفس الصناعي أثناء التسجيلات. للقضاء على المزيد من القطع الأثرية التنفسية، نوصي باستخدام بانكورونيوم ارتخاء العضلات من أجل منع تقلصات الحجاب الحاجز التي كثيرا ما ينظر إليها أثناء التخدير isoflurane. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يجعل من الممكن لوقف التهوية في نهاية انتهاء الصلاحية وتحليل جميع الحلقات المختارة، على النقيض من البروتوكولات الأخرى التي توصي بتحديد 8-10 حلقات ومن ثم تحديد 5-6 الحلقات نهاية الانتهاء التي يتم تحليلها في وقت لاحق23. الأهم من ذلك، ينبغي أن تبقى فترات انقطاع النفس قصيرة لتجنب نقص التهوية مما أدى إلى فرط capnia وحمض الجهاز التنفسي. لتحسين الأوكسجين ومنع تشكيل atelectasis، ونحن درس سابقا استخدام زقزقة التهوية خلالقياساتPVL في الفئران 6 . عند تحديد الحلقات لتحليل البيانات المستقلة التحميل المسبق، حدد الحلقات 5-6 الأولى التي تظهر انخفاض حجم الانبساطي وتجنب بما في ذلك الحلقات حيث الضغط فقط هو الانخفاض، ولكن حجم ثابت. علاوة على ذلك ، لا ينبغي تضمين دقات إضافية في التحليل ، لأنها تؤثر بشكل حاسم على معلمات PVL. بشكل ملحوظ ، تحدث في معظم الأحيان دقات عدم انتظام ضربات القلب بسبب الاتصال بين خياطة الانسداد وقلب مورين. معايرة التوصيل المتوازي عن طريق ضخ المالحة فرط الطنين له تأثير هائل على معلمات وظيفة القلب وينبغي، حسب فهمنا، أن يتم في نهاية تجربة6. وتجدر الإشارة إلى أنه نظرا لتأثيرها على وظيفة القلب ، يتم إجراء معايرة التوصيل الموازي مرة واحدة فقط أثناء البروتوكول. ومع ذلك، يتغير التوصيل المتوازي قليلا خلال البروتوكول، بسبب التغيرات في شكل البطينين عند التحفيز الدريني. تتوفر أنظمة القبول لتقييمات PVL في الفئران التي لا تحتاج إلى معايرة ملحية ويمكن حساب التوصيل الموازي ديناميكيا في جميع تسجيلات PVL. ومع ذلك، فإن دقة هذا الأسلوب لا تزال قيد المناقشة5،8،24،25.
لقد حددنا من ملاحظاتنا أنه عند استخدام هذا البروتوكول في الفئران الذكور من النوع البري الصحي للبالغين (أي C57Bl6/N) ، يكون الضغط الانقباضي في نطاق 70 مم زئبق إلى 90 ملم زئبق عند خط الأساس وبين 80 و 100 مم زئبق أثناء التحفيز الأقصى مع إيزوبروتيرينول ناهض β الأدرينالين. وبالمثل، لوحظ أن حجم السكتة الدماغية يتراوح بين 13 ميكرولتر و20 ميكرولتر عند خط الأساس وبين 20 ميكرولتر و35 ميكرولتر أثناء التحفيز الأقصى. كان معدل ضربات القلب حوالي 450 إلى 520 نبضة في الدقيقة عند خط الأساس ويمكن أن يتجاوز 650 نبضة في الدقيقة خلال التحفيز الأقصى. وفيما يتعلق بالانقباض القلبي المستقل قبل التحميل، اعتبرت أقوى معلمة تعمل على التوظيف قبل السكتة الدماغية كافية بين 60 ملم زئبق و80 ملم زئبق عند خط الأساس وبين 100 ملم زئبق و140 ملم زئبق أثناء التحفيز الأقصى. إذا كانت معلمات خط الأساس تختلف بشكل كبير عن تلك التي يتم الحصول عليها عادة ، أو عندما تتفاعل وظيفة القلب بشكل غير مناسب مع التحفيز β الأدرينالية ، يجب أن تؤخذ في الاعتبار المضاعفات (على سبيل المثال ، فقدان الدم دون مراقبة ، انخفاض / ارتفاع في درجة حرارة الجسم أو مخدر فوق / تحت الجرعة).
وعلاوة على ذلك، قد تنشأ بعض القطع الأثرية خلال قياسات PVL في الفئران. القطعة الأثرية الأكثر شيوعا هو ارتفاع الضغط الانقباضي النهائي (ESPS ، الشكل 2C)، والذي ينتج عن فخ القسطرة ويمكن تصحيحه بسهولة عن طريق إعادة وضع القسطرة قبل القياسات القاعدية في 0 نانوغرام / دقيقة إيسوبروتيرينول. يجب ألا تبدأ القياسات قبل القضاء على ESPSs في ظروف خط الأساس من أجلالحصولعلى بيانات ذات مغزى ، حيث يمكن أن يؤثر ESPS على العديد من معلمات وظيفة القلب 6 . ومع ذلك، عندما يحدث ESPS أثناء التحفيز التدريجي مع إيسوبروتيرينول بسبب مورفولوجيا البطين المتغيرة في القياسات التي لم تتأثر عند خط الأساس، وهذا لا يمكن تصحيحه، لأن إعادة وضع القسطرة من شأنه أن يغير التوصيل الموازي خلال بروتوكول الاستجابة للجرعة. على المرء أن يدرس هذا عن كثب ، لأنه ، بالمثل تلك الموجودة في خط الأساس ، وقد ثبت أن هذه ESPSs لتغيير كبير في معايير وظيفة القلب ليس فقط من خلال زيادة كبيرة في الضغط الأقصى13،26، ولكن أيضا من خلال انخفاض حجم الكشف6.
القيم التمثيلية للمعلمات الهمودية التي تم الحصول عليها من قبل قياسات PVL في ظل ظروف خط الأساس وخلال التحفيز التدريجي مع إيسوبروترينول في الفئران تختلف اختلافا كبيرا مع النهج المنهجية المختلفة وفي سلالات الماوس المختلفة27،28. وعلاوة على ذلك، ينبغي للمرء أن يدرك أن الأنماط الظاهرية للفئران المعدلة وراثيا قد تقتصر أيضا على خلفيات وراثية متميزة. من الناحية المنهجية ، هناك نهجان أساسيان لإجراء تحليل حجم الضغط في الفئران. كل طريقة لها مزاياها (ديس) وطريقة الاختيار غالبا ما يعتمد على تجارب المختبر والمحققين. نحن نركز هنا على إجراء الصدر المفتوح ، حيث يتم وضع القسطرة عن طريق ثقب على القمة. هذا النهج لديه تقدم في وضع القسطرة تحت الرؤية التي تسمح لتحديد المواقع القسطرة دقيقة، وهو مؤشر أساسي لتسجيل بيانات ذات مغزى من وظيفة القلب في الفئران. وينطبق هذا بشكل خاص على تسجيل معلمات الحجم في نطاق الميكرويتر. في المقابل ، فإن الجانب الحاسم من هذا النهج هو فقدان الضغوط الفسيولوجية داخل الصدر ، مما يؤدي إلى انهيار الرئتين وتشكيل atelectasis وفقدان أعلى لسائل الجسم. ومع ذلك، باستخدام إيجابية نهاية الزواية الضغط (PEEP) التهوية، ونحن هنا وصف الاستراتيجية التي أثبتت التصدي للضرر الرئوي خلال PVL فتح الصدر في الفئران6. النهج التجريبي الثاني هو إدخال القسطرة عبر الشريان السباتي ومن ثم التراجع من خلال الصمام الأبهري. باستخدام هذه التقنية، يمكن عقد الضغوط داخل الصدر طبيعية نوعا ما، على الرغم من التهوية الميكانيكية لا تزال هناك حاجة، مما يضعف هذه الميزة. وعلاوة على ذلك، يحد نهج الصدر المغلق من إمكانيات المحققين لتحديد المواقع الدقيقة للقسطرة. وعلاوة على ذلك، القسطرة الكهروضوئية المستخدمة في الفئران لها أقطار تتراوح بين 1 إلى 1.4 الفرنسية (0.33 ملم إلى 0.47 ملم)، مما يعني عرقلة كبيرة من تدفق مسار مورين عند استخدام نهج مغلق الصدر، كما aortas من الفئران البالغة وعادة ما يكون أقطارها بين 0.8 ملم إلى 1.2 ملم29،30. فيما يتعلق باستخدام PVL في نماذج فشل القلب ، فإن نهج الصدر المفتوح له أهمية خاصة لنماذج الانقباض الأبهري العرضي ، حيث يقع الانقباض بين الشريان غير المنين والشريان السباتي الأيسر. هنا لا يمكن وضع القسطرة عبر الشريان السباتي. من ناحية أخرى ، فإن نهج الصدر المغلق هو موضع اهتمام للباحثين الذين يحققون في نماذج المورين من البطينين المتوسعين ، مثل بعد تحريض احتشاء عضلة القلب ، حيث ثقب القمة غير ممكن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يلزم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لمانويلا ريتزال، وهانز بيتر غينهايمر، وكريستين ريشتر، وفريق من جامعة هايدلبرغ للحصول على مساعدة تقنية من الخبراء.
وقد دعم هذا العمل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، وBMBF (وزارة التعليم والبحوث الألمانية)، ومؤسسة بادن فورتمبرغ الاتحادية للابتكار الحكومي، ومؤسسة دويتشه فورشونجسجيمينشافت (DFG، مؤسسة الأبحاث الألمانية) مشروع الهوية 239283807 - TRR 152، FOR 2289 ومركز البحوث التعاونية (SFB) 1118.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
References
- Bacmeister, L., et al. Inflammation and fibrosis in murine models of heart failure. Basic Research in Cardiology. 114 (3), 19 (2019).
- Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Reviews Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovascular Research. 39 (1), 60-76 (1998).
- Lefkowitz, R. J., Rockman, H. A., Koch, W. J. Catecholamines, cardiac beta-adrenergic receptors, and heart failure. Circulation. 101 (14), 1634-1637 (2000).
- Cingolani, O. H. K. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 2198-2206 (2011).
- Bacmeister, L., et al. Assessment of PEEP-Ventilation and the Time Point of Parallel-Conductance Determination for Pressure-Volume Analysis Under beta-Adrenergic Stimulation in Mice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 36 (2019).
- Segin, S., et al. Cardiomyocyte-Specific Deletion of Orai1 Reveals Its Protective Role in Angiotensin-II-Induced Pathological Cardiac Remodeling. Cells. 9 (5), (2020).
- Clark, J. E., Marber, M. S. Advancements in pressure-volume catheter technology - stress remodelling after infarction. Experimental Physiology. 98 (3), 614-621 (2013).
- Glower, D. D., et al. Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work. Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).
- Winter, E. M., et al. Left ventricular function in the post-infarct failing mouse heart by magnetic resonance imaging and conductance catheter: a comparative analysis. Acta Physiologica. 194 (2), 111-122 (2008).
- Krenz, M. Conductance, admittance, and hypertonic saline: should we take ventricular volume measurements with a grain of salt. Journal of Applied Physiology. 107 (6), 1683-1684 (2009).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Wei, A. E., Maslov, M. Y., Pezone, M. J., Edelman, E. R., Lovich, M. A. Use of pressure-volume conductance catheters in real-time cardiovascular experimentation. Heart, Lung and Circulation. 23 (11), 1059-1069 (2014).
- van Hout, G. P., et al. Admittance-based Pressure-Volume Loops versus gold standard cardiac magnetic resonance imaging in a porcine model of myocardial infarction. Physiological Reports. 2 (4), 00287 (2014).
- Wei, C. L., Shih, M. H. Calibration Capacity of the Conductance-to-Volume Conversion Equations for the Mouse Conductance Catheter Measurement System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1627-1634 (2009).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Weiss, J. L., Frederiksen, J. W., Weisfeldt, M. L. Hemodynamic determinants of the time-course of fall in canine left ventricular pressure. Journal of Clinical Investigation. 58 (3), 751-760 (1976).
- Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavioral Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
- Jacoby, C., et al. Direct comparison of magnetic resonance imaging and conductance microcatheter in the evaluation of left ventricular function in mice. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 87-95 (2006).
- Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 443-450 (2000).
- Calligaris, S. D., Ricca, M., Conget, P. Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50050 (2013).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942 (2015).
- Pearce, J. A., Porterfield, J. E., Larson, E. R., Valvano, J. W., Feldman, M. D. Accuracy considerations in catheter based estimation of left ventricular volume. Conference proceedings - IEEE engineering in medicine and biology society. 2010, 3556-3558 (2010).
- Nielsen, J. M., et al. Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 534-540 (2007).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiological Genomics. 42 (2), 103-113 (2010).
- Oosterlinck, W., Vanderper, A., Flameng, W., Herijgers, P. Glucose tolerance and left ventricular pressure-volume relationships in frequently used mouse strains. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 281312 (2011).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (5), 1829-1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
