Her beskriver vi en hjertetryksvolumen loop analyse under stigende doser af intravenøst infunderes isoproterenol at bestemme den iboende hjertefunktion og β-adrenergic reserve i mus. Vi bruger en modificeret åben brysttilgang til trykvolumensløjfemålingerne, hvor vi inkluderer ventilation med positivt endeudløbstryk.
Bestemmelse af hjertefunktionen er en robust endpoint analyse i dyremodeller af hjerte-kar-sygdomme for at karakterisere virkningerne af specifikke behandlinger på hjertet. På grund af muligheden for genetiske manipulationer er musen blevet den mest almindelige pattedyrsdyrmodel til at studere hjertefunktion og søge efter nye potentielle terapeutiske mål. Her beskriver vi en protokol til bestemmelse af hjertefunktion in vivo ved hjælp af trykvolumen loop målinger og analyse under basale forhold og under β-adrenergic stimulation ved intravenøs infusion af stigende koncentrationer af isoproterenol. Vi leverer en raffineret protokol, herunder ventilationsstøtte under hensyntagen til det positive slutudløbstryk for at forbedre negative virkninger under målinger af åbent bryst og potent analgesi (Buprenorphin) for at undgå ukontrollabel myokardiestre fremkaldt af smerte under proceduren. Alt i alt muliggør den detaljerede beskrivelse af proceduren og diskussionen om mulige faldgruber en meget standardiseret og reproducerbar trykvolumensløjfeanalyse, hvilket reducerer udelukkelsen af dyr fra forsøgskohorten ved at forhindre mulig metodologisk bias.
Hjerte-kar-sygdomme påvirker typisk hjertefunktionen. Dette spørgsmål påpeger vigtigheden af at vurdere in vivo detaljeret hjertefunktion i dyresygdom modeller. Dyreforsøg er omgivet af en ramme af de tre Rs (3Rs) vejledende principper (Reducer / Forfin/Erstat). I tilfælde af forståelse af komplekse patologier, der involverer systemiske reaktioner (dvs. hjerte-kar-sygdomme) på det nuværende udviklingsniveau, er den vigtigste mulighed at forfine de tilgængelige metoder. Raffinering vil også føre til en reduktion af de krævede dyretal på grund af mindre variation, hvilket forbedrer analysens og konklusionernes effekt. Hertil kommer, kombination af hjertekontraktilitet målinger med dyremodeller af hjertesygdomme, herunder dem induceret af neurohumoral stimulation eller ved tryk overbelastning som aorta banding, som efterligner for eksempel ændret katekolamin /β-adrenergic niveauer1,2,3,4, giver en kraftfuld metode til prækliniske undersøgelser. I betragtning af at kateterets baseret metode fortsat er den mest anvendte tilgang til en tilbundsgående vurdering af hjertekontraktilitet5, havde vi til formål her at præsentere en raffineret måling af in vivo-hjertefunktion hos mus ved trykvolumen loop (PVL) målinger under β-adrenergic stimulation baseret på tidligere erfaringer, herunder evaluering af specifikke parametre for denne tilgang6, 7.
At bestemme hjertehæmodynamiske parametre tilgange, der omfatter billeddannelse eller kateter-baserede teknikker er tilgængelige. Begge muligheder ledsages af fordele og ulemper, der omhyggeligt skal overvejes for det respektive videnskabelige spørgsmål. Billeddannelse tilgange omfatter ekkokardiografi og magnetisk resonans imaging (MRI); begge er blevet anvendt med succes i mus. Ekkokardigrafiske målinger indebærer høje startomkostninger fra en højhastighedssonde, der kræves til musenes høje puls; det er en relativt ligetil ikke-invasiv tilgang, men det er variabelt blandt operatører, der ideelt set bør opleves anerkende og visualisere hjertestrukturer. Derudover kan der ikke udføres trykmålinger direkte, og beregninger opnås ved kombination af størrelsesstørrelse og flowmålinger. På den anden side har det den fordel, at flere målinger kan udføres på samme dyr, og hjertefunktionen kan overvåges for eksempel under sygdomsprogression. Med hensyn til volumenmålingen er MRI guldstandardproceduren, men svarende til ekkokardiografi er det ikke muligt at foretage direkte trykmålinger, og kun forudindlæsningsafhængige parametre kan opnås8. Begrænsende faktorer er også tilgængelighed, analyseindsats og driftsomkostninger. Her er kateterbaserede metoder til måling af hjertefunktion et godt alternativ, der desuden giver mulighed for direkte overvågning af intracardiac-tryk og bestemmelse af belastningsafhængige kontraktilitetsparametre som præload recruitable stroke work (PRSW)9. Ventrikulære mængder målt ved hjælp af et trykledningskateter (gennem ledningsevnebestemmelse) er dog mindre end dem fra MRI, men gruppeforskellene opretholdes i samme interval10. For at bestemme pålidelige volumenværdier kræves den tilsvarende kalibrering, hvilket er et kritisk skridt under PVL-målingerne. Den kombinerer ex vivomålinger af blodledningsevne i volumenkalibrerede cuvettes (konvertering af ledningsevne til volumen) med in vivoanalysen for den parallelle ledning af myokardiet under bolusindsprøjtningen af den hypertoniske saltvand11,12. Derudover er placeringen af kateteret inde i ventrikel og elektrodernes korrekte orientering langs ventrikelens langsgående akse afgørende for detektionsevnen i det omgivende elektriske felt, som de frembringer. Stadig med den reducerede størrelse af musehjertet er det muligt at undgå artefakter produceret af ændringer i kateterets intraventrikulære orientering, selv i udvidet hjertekamre5,10, men artefakter kan udvikle sig under β-adrenergic stimulation6,13. Ud over ledningsmåden metoder udviklingen af optagelse baseret metode syntes at undgå kalibrering trin, men her volumenværdierne er temmelig overvurderet14,15.
Da musen er en af de vigtigste prækliniske modeller inden for hjerte-kar-forskning og β–adrenergic reserve af hjertet er af central interesse i hjertefysiologi og patologi, præsenterer vi her en raffineret protokol til bestemmelse af in vivo hjertefunktion hos mus ved PVL-målinger under β-adrenergic stimulation.
Her giver vi en protokol til at analysere in vivo hjertefunktionen hos mus under stigende β-adrenergic stimulation. Proceduren kan anvendes til at håndtere både baseline parametre for hjertefunktion og adrenergic reserve (f.eks inotropi og kronotropi) i genetisk modificerede mus eller ved interventioner. Den mest fremtrædende fordel ved PVL-målinger (Pressure Volume Loop) sammenlignet med andre midler til bestemmelse af hjertefunktion er analysen af iboende, belastningsuafhængig hjertefunktion. Alle andre metoder (…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter og holdet fra Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) fra Heidelberg Universitet for ekspert teknisk bistand.
Dette arbejde blev støttet af DZHK (Tysk Center for Hjerte-kar-forskning), BMBF (det tyske ministerium for uddannelse og forskning), en Baden-Württemberg føderale stat Innovation fonds og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tysk Research Foundation) Project-ID 239283807 – TRR 152, FOR 2289 og Collaborative Research Center (SFB) 1118.
1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
Excel | Microsoft | ||
Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |