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Bioengineering

मज़बूती से इंजीनियरिंग और स्तनधारी कोशिकाओं में स्थिर ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट को नियंत्रित करना

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62109
Automatic Translation
1,2,3, *2, *2, 1,2
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program
* These authors contributed equally

Summary

मज़बूती से प्रकाश-उत्तरदायी स्तनधारी कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक तरीकों के मानकीकरण की आवश्यकता होती है। इस लक्ष्य की ओर, यह अध्ययन जीन सर्किट निर्माण, सेल इंजीनियरिंग, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण संचालन, और सत्यापन assays की एक पाइपलाइन को रेखांकित करता है ताकि एक मामले के अध्ययन के रूप में नकारात्मक-प्रतिक्रिया ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट का उपयोग करके प्रकाश-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन को मानकीकृत किया जा सके।

Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं में विश्वसनीय जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए उच्च गुना परिवर्तन, कम शोर और निर्धारित इनपुट-टू-आउटपुट ट्रांसफर फ़ंक्शंस वाले उपकरणों की आवश्यकता होती है, भले ही उपयोग की गई विधि की परवाह किए बिना। इस लक्ष्य की ओर, ऑप्टोजेनेटिक जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों ने स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन के स्तर के स्पैटिओटेम्पोरल नियंत्रण के लिए पिछले दशक में बहुत ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, प्रकाश-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले अधिकांश मौजूदा सर्किट वास्तुकला में भिन्न होते हैं, प्लास्मिड से व्यक्त किए जाते हैं, और चर ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग करते हैं, जिससे स्थिर सेल लाइनों में ऑप्टोजेनेटिक घटकों के लक्षण वर्णन और मानकीकरण का पता लगाने की आवश्यकता होती है। यहां, अध्ययन स्तनधारी कोशिकाओं में प्रकाश-अपरिवर्तनीय जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए विश्वसनीय जीन सर्किट निर्माण, एकीकरण और लक्षण वर्णन की एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन प्रदान करता है, एक मामले के उदाहरण के रूप में एक नकारात्मक प्रतिक्रिया ऑप्टोजेनेटिक सर्किट का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल यह भी बताते हैं कि ऑप्टोजेनेटिक उपकरण और प्रकाश शासनों को मानकीकृत करने से जीन अभिव्यक्ति शोर और प्रोटीन अभिव्यक्ति परिमाण जैसी जीन सर्किट विशेषताओं को मज़बूती से प्रकट किया जा सकता है। अंत में, यह पेपर ऑप्टोजेनेटिक्स से अपरिचित प्रयोगशालाओं के लिए उपयोग का हो सकता है जो इस तरह की तकनीक को अपनाना चाहते हैं। यहां वर्णित पाइपलाइन को स्तनधारी कोशिकाओं में अन्य ऑप्टोजेनेटिक सर्किट के लिए लागू होना चाहिए, जिससे स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल, प्रोटिओमिक और अंततः फेनोटाइपिक स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के अधिक विश्वसनीय, विस्तृत लक्षण वर्णन और नियंत्रण की अनुमति मिलती है।

Introduction

अन्य इंजीनियरिंग विषयों के समान, सिंथेटिक जीव विज्ञान का उद्देश्य प्रोटोकॉल को मानकीकृत करना है, जिससे जैविक प्रणालियों से संबंधित प्रश्नों की खोज के लिए अत्यधिक पुनरुत्पादक कार्यों वाले उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है1,2। सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक डोमेन जहां कई नियंत्रण प्रणालियों का निर्माण किया गया है, जीन अभिव्यक्ति विनियमन 3,4 का क्षेत्र है। जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण प्रोटीन के स्तर और परिवर्तनशीलता दोनों को लक्षित कर सकता है (शोर या भिन्नता का गुणांक, सीवी = σ / μ, माध्य पर मानक विचलन के रूप में मापा जाता है), जो शारीरिक और पैथोलॉजिकल सेलुलर राज्यों में उनकी भूमिकाओं के कारण महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताएं हैं5,6,7,8। कई सिंथेटिक सिस्टम जो प्रोटीन के स्तर और शोर को नियंत्रित कर सकते हैं4,9,10,11,12 को इंजीनियर किया गया है, जिससे उपकरणों में प्रोटोकॉल को मानकीकृत करने के अवसर पैदा होते हैं।

उपकरणों का एक उपन्यास सेट जो जीन नेटवर्क को नियंत्रित कर सकता है जो हाल ही में उभरा है वह ऑप्टोजेनेटिक्स है, जो जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश के उपयोग को सक्षम करता है13,14,15,16,17। उनके रासायनिक पूर्ववर्तियों के समान, ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट को किसी भी सेल प्रकार में पेश किया जा सकता है, जिसमें बैक्टीरिया से लेकर स्तनधारियों तक शामिल हैं, जिससे ब्याज के किसी भी डाउनस्ट्रीम जीन की अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है18,19। हालांकि, उपन्यास ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की तेजी से पीढ़ी के कारण, कई प्रणालियां उभरी हैं जो आनुवंशिक सर्किट आर्किटेक्चर, अभिव्यक्ति के तंत्र (जैसे, प्लास्मिड-आधारित बनाम वायरल एकीकरण) और प्रकाश आपूर्ति नियंत्रण उपकरण11,16,20,21,22,23,24,25 में भिन्न होती हैं . इसलिए, यह जीन सर्किट निर्माण और अनुकूलन, सिस्टम उपयोग की विधि (जैसे, एकीकरण बनाम क्षणिक अभिव्यक्ति), प्रेरण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक उपकरण, और परिणामों के विश्लेषण जैसी ऑप्टोजेनेटिक विशेषताओं के मानकीकरण के लिए जगह छोड़ देता है।

स्तनधारी कोशिकाओं में ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल के मानकीकरण पर प्रगति करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में एचईके 293 कोशिकाओं (मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिका रेखा) में एकीकृत नकारात्मक प्रतिक्रिया (एनएफ) जीन सर्किट का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं में ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को इंजीनियर करने के लिए एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन का वर्णन करता है। NF मानकीकरण का प्रदर्शन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है क्योंकि यह प्रकृति में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में 26,27,28 है, जिससे प्रोटीन के स्तर को ट्यून किया जा सकता है और शोर न्यूनीकरण होने की अनुमति मिलती है। संक्षेप में, एनएफ एक दमनकारी द्वारा सटीक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए अपनी अभिव्यक्ति को पर्याप्त रूप से तेजी से कम करने की अनुमति देता है, जिससे किसी भी परिवर्तन को स्थिर स्थिति से दूर सीमित किया जा सकता है। स्थिर स्थिति को एक प्रेरक द्वारा बदला जा सकता है जो दमनकारी को निष्क्रिय या समाप्त कर देता है ताकि अधिक प्रोटीन उत्पादन की अनुमति दी जा सके जब तक कि प्रत्येक प्रेरक एकाग्रता के लिए एक नई स्थिर स्थिति तक नहीं पहुंच जाती है। हाल ही में, एक इंजीनियर एनएफ ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम बनाया गया था जो जीन अभिव्यक्ति की एक व्यापक गतिशील प्रतिक्रिया का उत्पादन कर सकता है, कम शोर बनाए रख सकता है, और स्थानिक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण 11 की क्षमता की अनुमति देने वाले प्रकाश उत्तेजनाओं का जवाब दे सकता है। ये उपकरण, जिन्हें लाइट-इनड्यूसिबल ट्यूनर्स (LITers) के रूप में जाना जाता है, पहले की प्रणालियों से प्रेरित थे, जिन्होंने जीवित कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की अनुमति दी 4,10,29,30 और दीर्घकालिक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए मानव सेल लाइनों में स्थिर रूप से एकीकृत किया गया था।

यहां, एक उदाहरण के रूप में LITer का उपयोग करते हुए, प्रकाश-उत्तरदायी जीन सर्किट बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है, एक लाइट प्लेट उपकरण (एलपीए, एक ऑप्टोजेनेटिक इंडक्शन हार्डवेयर) 31 के साथ जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, और कस्टम प्रकाश उत्तेजनाओं के लिए इंजीनियर, ऑप्टोजेनेटिक रूप से-नियंत्रणीय सेल लाइनों की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करता है। यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को किसी भी कार्यात्मक जीन के लिए LITer उपकरणका उपयोग करने की अनुमति देता है जो वे खोजना चाहते हैं। इसे विभिन्न सर्किट आर्किटेक्चर (जैसे, सकारात्मक प्रतिक्रिया, नकारात्मक विनियमन, आदि) के साथ अन्य ऑप्टोजेनेटिक प्रणालियों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जो नीचे उल्लिखित तरीकों और ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को एकीकृत करके किया जाता है। अन्य सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रोटोकॉल के समान, यहां उल्लिखित वीडियो रिकॉर्डिंग और ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल को विभिन्न क्षेत्रों में एकल-सेल अध्ययनों में लागू किया जा सकता है, जिसमें कैंसर जीव विज्ञान, भ्रूण विकास और ऊतक भेदभाव तक सीमित नहीं है।

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Protocol

1. जीन सर्किट डिजाइन

  1. एक एकल जीन सर्किट / प्लास्मिड में गठबंधन करने के लिए आनुवंशिक घटकों का चयन करें (उदाहरण के लिए, स्तनधारी डीएनए एकीकरण अनुक्रम रूपांकनों 32, प्रकाश-उत्तरदायी तत्व33, या कार्यात्मक जीन 34)।
  2. किसी भी आनुवंशिक इंजीनियरिंग और / या आणविक क्लोनिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, बाद में उपयोग और संदर्भ के लिए डीएनए अनुक्रमों को संग्रहीत करें, प्रत्येक अनुक्रम को एनोटेट करें, और सभी आवश्यक विशेषताओं (जैसे, START कोडोन, नियामक, या अनुवादित अनुक्रमों) की जांच करें।
  3. समग्र जीन सर्किट डिजाइन 36 के अनुसार भागों को विकसित या अपनाएं। एक उदाहरण के रूप में, LITers11 के रूप में optogenetic दमनकर्ताओं के लिए, एक डोमेन के लिए एक जीन अनुक्रम कोडिंग फ्यूज प्रकाश-inducible गिरावट 37,38 या एक दमनकारी की डीएनए बाध्यकारी क्षमता के inactivation के लिए सक्षम 39, आसन्न और दमनकारी जीन के फ्रेम में (जैसे, TetR)4.
    1. ऑप्टोजेनेटिक एक्टिवेटर के लिए, एक उत्प्रेरक डोमेन 40 की उपस्थिति सुनिश्चित करें जो प्रकाश-प्रेरित डीएनए बाइंडिंग 41 पर जीन अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है। नकारात्मक या सकारात्मक ऑटोरेगुलेशन के लिए, नियामक जीन के प्रमोटर के अंदर या अपस्ट्रीम में एक नियामक बाध्यकारी साइट की उपस्थिति सुनिश्चित करें (उदाहरण के लिए, टीईटीआर व्यक्त करने वाले प्रमोटर के अपस्ट्रीम में या अपस्ट्रीम में टीईटीओ साइटें)42।
  4. प्रत्येक जीन सर्किट के लिए आणविक क्लोनिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डीएनए अनुक्रम प्रवर्धन या प्लास्मिड के अनुक्रमण के लिए प्राइमरों को डिजाइन करें।
  5. आणविक क्लोनिंग सॉफ़्टवेयर (जैसे, अनुक्रम संरेखण) के अंतर्निहित feastures के माध्यम से प्लास्मिड निर्माण के लिए कम्प्यूटेशनल रूप से प्राइमरों को मान्य करें।
  6. निर्माता से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों का आदेश दें। इस काम में निर्मित और उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड को डिजाइन किए गए और उपयोग किए गए प्राइमरों के साथ मूल सहायक सामग्री 11 में पाया जा सकता है।
  7. डबल-आसुत पानी (ddH2O) में प्राइमरों को 100 mM स्टॉक एकाग्रता में पतला करें।
  8. पीसीआर के लिए 100 mM स्टॉक प्राइमरों के स्टॉक को 10 mM एकाग्रता में पतला करें।
  9. आगे प्राइमर के 1 μL, रिवर्स प्राइमर के 1 μL, टेम्पलेट डीएनए के 1 μL जीनोमिक के लिए 0.5-500 ng के कुल द्रव्यमान के लिए या प्लास्मिड या वायरल डीएनए के लिए 0.5 pg-5 ng, डीएनए पोलीमरेज़ 2x मास्टर मिश्रण के 12.5 μL (या वॉल्यूम जो निर्माता के कमजोर पड़ने के कारक को संतुष्ट करता है) के साथ पीसीआर मिश्रण तैयार करें, और 25 μL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए ddH2O के 9.5 μL।
  10. चुने गए एंजाइम के आधार पर उचित सेटिंग्स पर एक थर्मोसाइकलर में पीसीआर मिश्रण को इनक्यूबेट करें43। सुझाए गए प्रतिक्रिया चक्रों में शामिल हैं:
    चरण 1: 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस प्रारंभिक विकृतीकरण चरण का एक चक्र।
    चरण 2: 98 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण चरण के 5 एस के 40 चक्र।
    चरण 3: 65 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग चरण के 30 एस का एक चक्र (पहले डिज़ाइन किए गए प्राइमरों द्वारा निर्धारित)।
    चरण 4: 72 डिग्री सेल्सियस (~ 1 किलोबेस (केबी) टेम्पलेट टुकड़ा लंबाई) पर विस्तार के 1 मिनट का एक चक्र।
    चरण 5: 72 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के विस्तार का एक चक्र।
    प्रतिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर तब तक रखें जब तक कि जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से इसका परीक्षण नहीं किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल उपयोग किए गए अभिकर्मकों (जैसे, पोलीमरेज़ और बफर) के आधार पर भिन्न होगा।
  11. एक एकल परिपत्र डीएनए वेक्टर में रैखिक पीसीआर उत्पादों को जोड़ने के लिए आवश्यक डीएनए असेंबली प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले सभी टुकड़ों को बढ़ाने के लिए चरण 1.9 को दोहराएं।
  12. वांछित लंबाई के बैंड को शुद्ध करने के बाद 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों को चलाएं।
  13. एक डीएनए असेंबली प्रतिक्रिया के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें (तालिका 1)।
    नोट:: इस उदाहरण में, मदर-वेक्टर को समग्र असेंबली परिणाम में महत्वपूर्ण परिवर्तन किए बिना PCR चरणों की दक्षता बढ़ाने के लिए दो टुकड़ों में विभाजित किया गया है।
  14. डीएनए असेंबली प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण को थर्मोसाइकलर में 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (जब तक कि अन्यथा डीएनए असेंबली अभिकर्मक प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट न हो) और बैक्टीरिया के परिवर्तन के लिए प्रतिक्रिया उत्पाद का उपयोग करने के लिए प्रतिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  15. सक्षम ई कोलाई (Escherichia coli) कोशिकाओं और इसी जीवाणु परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीवाणु परिवर्तन (रासायनिक या इलेक्ट्रोपोरेशन) स्थापित करें। परिवर्तन के बाद, परिवर्तन मिश्रण को प्लेट करने के लिए चुने गए जीवाणु चयन मार्कर (जैसे, एम्पीसिलिन) युक्त बैक्टीरियल लुरिया-बर्टानी (एलबी) आगर प्लेटों का उपयोग करें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 44 पर इनक्यूबेट करें।
  16. अगले दिन प्लेटों की जांच करें। उपनिवेशों को टीका लगाने के लिए, प्लेटों से अलग-अलग कॉलोनियों को चुनें और उन्हें संस्कृति ट्यूबों में संबंधित जीवाणु चयन मार्कर के साथ एक तरल एलबी शोरबा में फिर से निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस, 300 आरपीएम रात भर में एक शेकर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  17. बैक्टीरियल संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए निकालने के लिए प्लास्मिड तैयारी प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करें।
  18. सर्किट को दो चरणों में सत्यापित करें। सबसे पहले, यह देखने के लिए कि अनुमानित प्लास्मिड उत्पाद प्राप्त किया गया था या नहीं, यह देखने के लिए कच्चे सत्यापन के रूप में प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके एक परीक्षण पाचन करें। दूसरा, यदि परीक्षण पाचन पारित / पुष्टि की जाती है, तो प्लास्मिड को एक सेंगर अनुक्रमण सुविधा (या उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करके प्रक्रिया) में जमा करें ताकि डिजाइन सॉफ्टवेयर में अपेक्षित अनुक्रम की तुलना करने के लिए सटीक डीएनए अनुक्रम प्राप्त किया जा सके।
    1. परीक्षण पाचन करने के लिए, कम से कम दो प्रतिबंध एंजाइमों का चयन करें जो उपयोग किए गए आणविक क्लोनिंग सॉफ़्टवेयर के आधार पर कम से कम दो टुकड़ों का उत्पादन करते हैं। एक बार एंजाइमों का चयन करने के बाद, प्रत्येक एंजाइम के 1 μL, उत्पन्न डीएनए के 5 μL, और उपयोग किए गए एंजाइमों के आधार पर उचित लवण और बफर के साथ 13 μL पानी जोड़कर परीक्षण नमूने तैयार करें। प्रतिक्रिया को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, या जैसा कि एंजाइम निर्माता का सुझाव है। एक 1% agarose जेल पर परीक्षण पाचन उत्पादों को चलाने के लिए और निर्धारित करें कि बैंड सही हैं या नहीं।
      नोट:: यदि बैंड सही हैं, तो अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ें।
    2. अनुक्रमण करने के लिए, सॉफ़्टवेयर में संग्रहीत डीएनए के आधार पर प्राइमर उत्पन्न करें ताकि प्राइमरों के एनीलिंग क्षेत्र लगभग 500 बीपी (बेस जोड़े) के अलावा हों और ब्याज (जीन सर्किट घटक) या पूर्ण प्लास्मिड के टुकड़े को कवर करें। शुद्ध न्यूक्लिएज मुक्त पानी (NF-H2O) के साथ प्राइमरों को 10 mM एकाग्रता के लिए पतला करें। 10 ng/μL DNA के 1 μL, प्राइमर के 1 μL, और NF-H2O के 8 μL को 0.2 mL ट्यूब में जोड़कर अनुक्रमण नमूने तैयार करें। प्रत्येक प्राइमर के लिए इसे दोहराएं।
      नोट: जब नमूने तैयार किए जाते हैं, तो उन्हें अनुक्रमण सुविधा पर छोड़ दें और आणविक क्लोनिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्लास्मिड अनुक्रम के साथ परिणामों की तुलना करें।
  19. इस चरण में, उचित सेल लाइन में जीन सर्किट युक्त प्लास्मिड को एकीकृत करने के लिए डीएनए नमूने के लगभग 100-1000 एनजी / μL उत्पन्न करें।

2. स्थिर सेल लाइन इंजीनियरिंग

  1. स्थिर उप-लाइनों की तेजी से पीढ़ी के लिए डिज़ाइन की गई एक स्तनधारी सेल लाइन का आदेश दें जो एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर से ब्याज के प्रोटीन की उच्च-स्तरीय अभिव्यक्ति सुनिश्चित करता है। सेल प्रकार और सेल लाइन इंजीनियरिंग की आसानी इस बात पर निर्भर करती है कि उपयोगकर्ता क्या पसंद करते हैं या प्राप्त करने का लक्ष्य रखते हैं, इसके आधार पर परिवर्तनीय हो सकते हैं।
    1. उदाहरण के लिए, यदि उपयोगकर्ता न्यूनतम मध्यवर्ती चरणों के साथ सेल लाइन इंजीनियरिंग पसंद करते हैं, तो उन कोशिकाओं को ऑर्डर करें जिनमें ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय जीनोमिक लोकस पर एकल स्थिर एकीकरण साइट (जैसे, एफआरटी) होती है। यदि अधिक सूक्ष्म सेल इंजीनियरिंग को प्राथमिकता दी जाती है, तो CRISPR / Cas9 जैसे आनुवंशिक इंजीनियरिंग उपकरणों का उपयोग करके पसंदीदा स्थानों पर एकीकरण साइटें बनाएं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर humidified हवा में 5% CO2 में कोशिकाओं को विकसित करें। सेल प्रकार के लिए आवश्यकतानुसार वृद्धि की स्थिति समायोजित करें.
  3. एक स्थिर सेल-लाइन पीढ़ी की प्रक्रिया शुरू करने के लिए पिछले चरणों से प्राप्त वांछित कोशिकाओं में ऊपर डिज़ाइन किए गए जीन सर्किट को ट्रांसफेक्ट करें। इसे प्राप्त करने के लिए, जीन सर्किट डीएनए के एक लिपोसोम मिश्रण 45 का उपयोग उचित पुनर्संयोजन के साथ करें (उदाहरण के लिए, एफएलपी-एफआरटी पुनर्संयोजन के लिए एफएलपी-पुनर्संयोजन) या इलेक्ट्रोपोरेशन जैसे अन्य तरीकों के माध्यम से।
  4. अभिकर्मक के दो दिन बाद, कोशिकाओं को 25% कन्फ्लूएंसी में विभाजित करें।
  5. कोशिकाओं को विभाजित करने के छह घंटे बाद, मीडिया को एक ताजा मीडिया में बदलकर एंटीबायोटिक चयन शुरू करें जिसमें हाइग्रोमाइसिन एंटीबायोटिक के 50 μg / mL (या प्लास्मिड निर्माण के दौरान चुने गए स्तनधारी एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के अनुरूप एक और एंटीबायोटिक एजेंट) शामिल हैं।
    नोट: जीन सर्किट निर्माण में उपयोग किए जाने वाले स्तनधारी एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन की एक किस्म है, जिनमें से प्रत्येक में एक अलग किल वक्र है। इसलिए, जो भी स्तनधारी एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन सर्किट निर्माण के लिए चुना जाता है, ब्याज की कोशिकाओं में एक उचित मार वक्र का अध्ययन किया जाना चाहिए। यह चरण यह सुनिश्चित करता है कि जीन सर्किट पेलोड वाली कोशिकाओं को समृद्ध किया जाता है जबकि सिस्टम के बिना उन लोगों को मार दिया जाता है।
  6. कोशिकाओं को एंटीबायोटिक चयन मीडिया में बढ़ने की अनुमति दें, हर 2-3 दिनों में ताजा मीडिया में बदलें जब तक कि प्लेट या फ्लास्क में कुछ दर्जन फोकी न हों। मार्ग अनुयायी संस्कृतियों जब वे लॉग चरण में हैं इससे पहले कि वे संगम तक पहुँचने.
  7. एक बार पर्याप्त रूप से कई फोकी होने के बाद, ट्रिप्सिन 0.25% ट्रिप्सिन के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ करें, हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में कैल्शियम, मैग्नीशियम और सोडियम बाइकार्बोनेट के बिना 0.1% ईडीटीए कई मिनटों के लिए। ताजा मीडिया के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें और सभी कोशिकाओं को एक ताजा कंटेनर में पारित करें।
  8. एक बार ताजा कंटेनर में कोशिकाएं 80% -100% confluent हैं, तो उन्हें 45% पुराने मीडिया, 45% ताजा मीडिया और 10% DMSO के मिश्रण में फ्रीज करें। शेष कोशिकाओं को एक बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें और मोनोक्लोनल कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से प्लेट में अलग करने के लिए एकल-सेल सॉर्टिंग करें।
  9. मोनोक्लोनल सॉर्टिंग के बाद लगभग 2-3 सप्ताह, 96-अच्छी तरह से प्लेट के भीतर कुओं में फोकी होना चाहिए। जब लगभग 50% -60% confluent, कोशिकाओं को 12-अच्छी तरह से प्लेट में विभाजित करें।
  10. एक बार जब 12-अच्छी तरह से प्लेट 80% -100% confluent है, तो एक ऊतक संस्कृति में विभाजित टी -25 फ्लास्क का इलाज किया। एक बार जब टी -25 फ्लास्क में कोशिकाएं 80% -100% confluent होती हैं, तो कोशिकाओं को फ्रीज करें और मोनोक्लोनल सेल लाइनों के लक्षण वर्णन और परीक्षण के लिए एक मार्ग बनाए रखें।
    1. प्रेरित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर उत्पादन के आधार पर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की रिपोर्ट करने के लिए माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री assays द्वारा मोनोक्लोनल सेल लाइनों को चिह्नित करें। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी लेबलिंग और immunofluorescence परख के माध्यम से कार्यात्मक प्रोटीन उत्पादन सत्यापित करें। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-PCR) के माध्यम से ट्रांसक्रिप्शनल-स्तर जीन अभिव्यक्ति प्रेरण का परीक्षण करें। क्लोन के स्थानीय और पूरे जीनोम अनुक्रमण के माध्यम से आनुवंशिक अनुक्रम और एकीकरण सटीकता को मान्य करें।

3. लाइट प्लेट उपकरण प्रेरण assays

  1. इंजीनियर कोशिकाओं के प्रकाश प्रेरण के लिए उपयोग किए जाने वाले एक एलपीए डिवाइस 31,46 का निर्माण करें। संक्षेप में, जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए उपयोग करने के लिए एलपीए बनाने के लिए कई व्यापक कदम महत्वपूर्ण हैं। इनमें 3 डी प्रिंटिंग एलपीए फ्रेम घटक, सर्किट बोर्ड निर्माण, माइक्रोकंट्रोलर प्रोग्रामर के माध्यम से सर्किट को प्रोग्राम करना, घटकों को अंतिम एलपीए में इकट्ठा करना, आईआरआईएस सॉफ्टवेयर के माध्यम से मेमोरी कार्ड को प्रोग्राम करना और तैयार डिवाइस को कैलिब्रेट करना शामिल है। अधिक गहन स्पष्टीकरण के लिए, उपरोक्त संदर्भों को देखें।
    1. Gerhardt et al. (2016 और 2019)31,46 में उल्लिखित 3D भागों को मुद्रित करें।
    2. Gerhardt et al. (2016 और 2019)31,46 में उल्लिखित सर्किट बोर्ड को इकट्ठा करें।
    3. Gerhardt et al. (2016 और 2019)31,46 में उल्लिखित माइक्रोकंट्रोलर प्रोग्रामर का उपयोग करके इकट्ठे किए गए एलपीए सर्किट में फर्मवेयर जोड़ें।
    4. Gerhardt et al. (2016 और 2019)31,46 में उल्लिखित 3 डी मुद्रित भागों और इकट्ठे सर्किट बोर्ड को संयोजित करें। इसमें बढ़ते प्लेट, सर्किट बोर्ड, एलईडी (प्रकाश उत्सर्जक डायोड) स्पेसर, प्लेट एडेप्टर, एक 24-अच्छी तरह से प्लेट, एक प्लेट ढक्कन, बढ़ते बोल्ट, और विंग नट और स्टैकिंग घटकों को लेना शामिल है जैसा कि फिल्माए गए वीडियो और चित्रा 2 में दिखाया गया है।
    5. मेमोरी कार्ड प्रोग्रामिंग और डिवाइस के अंशांकन के लिए, नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
  2. लाइट प्लेट उपकरण (LPA)31 के लिए एक एसडी कार्ड प्रोग्राम करने के लिए Tabor Lab website47 पर उपलब्ध IRIS सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें और ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग शुरू करने के लिए आवश्यक उचित प्रकाश स्थितियों का पता लगाएं।
    नोट:: IRIS सॉफ़्टवेयर ऑप्टोजेनेटिक इलेक्ट्रॉनिक हार्डवेयर प्रोग्रामिंग के लिए एक वेब-आधारित एप्लिकेशन है, जिसे LPA के रूप में जाना जाता है, जिसे Tabor Lab द्वारा विकसित किया गया है। सॉफ्टवेयर सापेक्ष IRIS मूल्यों की प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है जो LPA हार्डवेयर के प्रत्येक कुएं में व्यक्तिगत प्रकाश-उत्सर्जक डायोड (LEDs) को नियंत्रित करता है।
  3. LPA (4 x 6) ड्रॉप-डाउन विकल्प चुनें, इसके बाद उपयुक्त रोशनी दृष्टिकोण (स्थिर-स्थिति, गतिशील, उन्नत) पर क्लिक करें।
    नोट: इस पांडुलिपि के लिए, सभी assays स्थिर राज्य उदाहरणों पर ध्यान केंद्रित करेंगे। हालांकि, उन्नत सेटिंग उदाहरणों का उपयोग पल्स अवधि और शुल्क चक्र शासनों के लिए किया जा सकता है।
  4. चुनें कि प्लेट के कुओं के अनुरूप कोशिकाओं में मान दर्ज करके शीर्ष या नीचे के एल ई डी को रोशन किया जाएगा या नहीं। इस काम में उपयोग किए जाने वाले एलपीए के लिए, शीर्ष स्थान पर रखे गए नीले एल ई डी का उपयोग सभी प्रयोगों में किया गया था। प्रत्येक एलईडी, एक बार प्रोग्राम किए जाने के बाद, एक निरंतर प्रकाश तीव्रता के साथ निरंतर प्रकाश जोखिम प्रदान कर सकता है। IRIS सॉफ़्टवेयर 4096 तीव्रता स्तरों के लिए अनुमति देता है जिसे प्रोग्राम किया जा सकता है।
  5. एक बार एलईडी स्थानों को चुने जाने के बाद, वांछित प्रयोगात्मक रूपरेखा के लिए तीव्रता मान दर्ज करें। उदाहरण के लिए, प्रति प्लेट तीन तकनीकी प्रतिकृतियों के साथ 8 अलग-अलग प्रकाश तीव्रता (या पल्स अवधि या शुल्क चक्र) दर्ज करें (तालिका 2)। G.s. ग्रेस्केल इकाइयों को संदर्भित करता है - IRIS सॉफ़्टवेयर में LPA प्रोग्रामिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रकाश तीव्रता स्तर माप मान।
    1. आईआरआईएस प्रयोगात्मक फ़ाइलों को डिजाइन करते समय, एलपीए डिवाइस पर आसन्न कुओं से किनारे के प्रभावों को ध्यान में रखें, नीली रोशनी के जोखिम की तीव्रता बढ़ाने से प्रकाश विषाक्तता, और वांछित खुराक-प्रतिक्रिया के प्रकार का निर्धारण (उदाहरण के लिए, मोनोटोनिक बनाम गैर-मोनोटोनिक)।
    2. यदि उपयोगकर्ता एलपीए में कोशिकाओं को किसी विशेष प्रकाश पैरामीटर (जैसे, तीव्रता) के आरोही / अवरोही क्रम में प्रोग्राम करते हैं, तो कुएं प्रकाश क्रॉसस्टॉक या यहां तक कि गर्मी के किनारे के प्रभाव पैदा कर सकते हैं जो आसन्न कुओं को प्रभावित कर सकते हैं। यह अनजाने में मापा outputs के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं जब प्रयोगों के पूरा हो रहे हैं. इसे कम करने के लिए, उपयोगकर्ता आईआरआईएस सॉफ़्टवेयर पर एक यादृच्छिकीकरण मैट्रिक्स को अच्छी तरह से स्थानों पर स्क्रैम्बल करने के लिए लागू कर सकते हैं, किनारे के प्रभाव को कम कर सकते हैं। एक उदाहरण नीचे प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित है (चित्रा 4A-B)।
    3. इसके अलावा, नीली रोशनी की उच्च तीव्रता को सेलुलर विकास और व्यवहार्यता के साथ हस्तक्षेप करने के लिए पाया गया है। इसलिए, प्रकाश विषाक्तता को कम करने के लिए, जांच की जा रही रूपरेखा के आधार पर प्रकाश-तीव्रता, नाड़ी अवधि, या कर्तव्य चक्र प्रतिक्रिया वक्र का उत्पादन करना महत्वपूर्ण है।
      1. उदाहरण के लिए, प्रोग्राम 8 प्रकाश तीव्रता मान प्रति 24-अच्छी तरह से प्लेट में तीन प्रतिकृतियों के साथ, एलपीए की अधिकतम तीव्रता के लिए कोई प्रकाश से एक सीमा के साथ। फिर, इन नमूनों को एसएससी-एफएससी गेट के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर पर चलाएं या प्रत्येक प्रकाश मूल्य पर जनसंख्या सेल अस्तित्व (मृत कोशिकाओं / सेलुलर मलबे सहित कुल घटनाओं की तुलना में जीवित कोशिकाओं) को मापने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड जैसे लाइव दाग।
      2. फिर, प्रयोगात्मक सेटअप के लिए जनसंख्या अस्तित्व की आदर्श मात्रा निर्धारित करें, क्योंकि कोई भी उत्तेजना प्रसार, जीन अभिव्यक्ति, या अस्तित्व को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकती है (उदाहरण के लिए, एक उपयुक्त ट्रेडऑफ के रूप में 80% सेल अस्तित्व की स्थापना)। उदाहरण के लिए, इस काम में, एक बार कैलिब्रेट किए जाने के बाद, तीव्रता 3000 g.s. इकाइयों (~ 3/4 LPA डिवाइस की अधिकतम तीव्रता) से अधिक नहीं थी। इसका एक उदाहरण नीचे दिए गए प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित है।
    4. विषाक्तता के कारण प्रकाश मूल्यों को प्रतिबंधित करने के अलावा, उपयोगकर्ता खुराक-प्रतिक्रिया के एक विशेष हिस्से को चिह्नित करने के लिए प्रकाश मूल्यों को प्रतिबंधित करना चाह सकते हैं, जैसे कि मोनोटोन प्रतिक्रिया की सीमा।
      1. इसे प्राप्त करने के लिए, शुरू में प्रकाश तीव्रता, नाड़ी अवधि या कर्तव्य चक्रों की एक विस्तृत श्रृंखला को स्कैन करें, जो वांछित खुराक-प्रतिक्रिया (तालिका 2) को निर्धारित करते समय विश्लेषण किए जाने वाले साधनों के आधार पर ब्याज के प्रकाश शासन पर संकीर्ण होने के लिए, उदाहरण के लिए, जहां जीन अभिव्यक्ति एक मोनोटोनिक खुराक-प्रतिक्रिया के लिए प्रकाश मूल्यों को बढ़ाने के साथ सकारात्मक रूप से संबंधित है।
      2. ब्याज की प्रकाश सीमा निर्धारित करने के लिए, विभिन्न तीव्रता / पल्स अवधि / शुल्क चक्र / आदि या अधिक कुओं (जैसे, 48, 72, 96, आदि) के 24 कुओं के साथ एक एकल एलपीए प्रोग्राम करें, जो इस बात पर निर्भर करता है कि क्या कई एलपीए को बराबर प्रकाश मात्रा देने के लिए कैलिब्रेट किया गया है और सेल संस्कृति कार्य या नीचे उल्लिखित assays के साथ आगे बढ़ना है। इसलिए, वांछित जीन अभिव्यक्ति देने वाले रेंज अंतराल को निर्धारित करने के लिए प्रकाश उत्तेजनाओं की एक विस्तृत खुराक श्रृंखला के साथ एक ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम का लक्षण वर्णन शुरू करें और बाद में उस परिष्कृत खुराक सीमा में प्रयोग करें।
      3. उदाहरण के लिए, इस काम में, एक बार 3000 जीएस इकाइयों को विषाक्त प्रकाश तीव्रता के लिए दहलीज के रूप में निर्धारित किया गया था; इस दहलीज का उपयोग नीचे उल्लिखित assays के लिए प्रकाश के ऊपरी बाउंड के रूप में किया गया था (उदाहरण के लिए, immunofluorescence)।
        नोट: ऊपर दिए गए चरण LPA के ऑप्टिकल अंशांकन से स्वतंत्र हैं और प्रत्येक ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के लिए आणविक-स्तर के अंशांकन को संदर्भित करते हैं।
  6. एक बार जब उचित प्रकाश तीव्रता मान ों को IRIS में प्रोग्राम किया जाता है, तो फ़ाइलों को डाउनलोड और स्थानांतरित करने के लिए LPA में USB 3.0 आउटलेट के साथ एक मेमोरी कार्ड डालें।
  7. यदि LPA का अंशांकन complete31 है, तो प्रकाश प्रेरण परख की दीक्षा के लिए सेल संस्कृति काम करने के लिए आगे बढ़ें। अंशांकन नहीं किया गया है, तो LPA माइक्रोकंट्रोलर प्रोग्रामर के साथ प्रोग्राम किया गया है एक बार एक छवि विश्लेषण विधि (चरण 3.7.1-3.7.3) का उपयोग कर LPA कैलिब्रेट करें।
    1. संक्षेप में कार्यक्रम LPA एक ही IRIS स्तर के रूप में Gerhardt et al. (2016)31 द्वारा वर्णित है.
      नोट:: अंशांकन के लिए, LPA 2000 g.s का मान रखने के लिए प्रोग्राम किया गया था।
    2. एक बार जब डिवाइस को मेमोरी कार्ड के साथ प्रोग्राम किया जाता है और रीसेट बटन (एलपीए पर भौतिक बटन) दबाया जाता है, तो पूरे डिवाइस की एक छवि प्राप्त करें (उदाहरण के लिए, जेल स्टेशन इमेजर, स्कैनर डिवाइस, आदि)। अंशांकन के लिए, 180 ° द्वारा घुमाए गए डिवाइस के साथ दो छवियां प्राप्त करें।
    3. फिर, LPA प्लेट पर एलईडी तीव्रता में परिवर्तनशीलता दिखाने के लिए Gerhardt et al. (2016)31 द्वारा डिज़ाइन किए गए ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें और कुओं में तीव्रता को बराबर बनाने के लिए एलईडी मुआवजे के मूल्यों की गणना करें। इसका एक उदाहरण नीचे दिए गए प्रतिनिधित्व परिणामों में वर्णित है (चित्र3)। एक बार जब यह अंशांकन पूरा हो जाता है, तो प्रकाश-प्रेरण परख की दीक्षा के लिए सेल संस्कृति के काम पर आगे बढ़ें।
  8. जीन अभिव्यक्ति पर प्रकाश-प्रेरण प्रभावों की जांच करने के लिए पिछले अनुभाग से इंजीनियर मोनोक्लोनल कोशिकाओं के फ्लास्क प्राप्त करें।
  9. फ्लास्क से पुराने मीडिया को हटा दें।
  10. कोशिकाओं के लिए ट्रिप्सिन के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. 5 मिनट के बाद, ड्यूलबेको-संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम या अन्य वांछित मीडिया) के 4 एमएल को जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें आवश्यक रसायनों के साथ पूरक (इस काम में 50 μg / mL hygromycin, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, एफबीएस का उपयोग किया गया था)।
  12. 500 μL की कुल मात्रा में एक 24-अच्छी तरह से काली प्लेट में प्रति अच्छी तरह से ~ 75,000 कोशिकाओं जोड़ें। बीजित कोशिकाओं की संख्या वांछित प्रयोग की अवधि और उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकती है।
    नोट:: साथ ही, ध्यान दें कि सेल सीडिंग घनत्व संस्कृति रखरखाव और संभावित रूप से प्रयोग की अवधि को प्रभावित करता है। प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की कम संख्या में शुरू करना संस्कृति के confluency तक पहुंचने से पहले लंबे समय की अवधि सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, ब्याज के जीन सर्किट में एकीकृत ऑप्टोजेनेटिक घटकों का प्रकार प्रभावित करेगा जब जीन अभिव्यक्ति एक स्थिर स्थिति तक पहुंचजाती है और इसलिए प्रयोगों की अवधि को प्रभावित करती है। जिन अन्य कारकों पर विचार किया जा सकता है, वे सेल लाइन-विशिष्ट विकास दर, मीडिया संरचना और सशर्त विकास प्रभाव (यानी, प्रकाश) हैं।
  13. चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में रखें ताकि उन्हें 2-6 घंटे के लिए बसने की अनुमति मिल सके।
  14. इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को एक ऊतक संस्कृति हुड में स्थानांतरित करें, प्लास्टिक के ढक्कन को हटा दें, और प्लेट के शीर्ष पर एक चिपकने वाली पन्नी पट्टी जोड़ें (चित्रा 2 डी)। यह कदम कुओं के बीच न्यूनतम प्रकाश हस्तांतरण की अनुमति देता है, क्योंकि कुओं के शीर्ष और पक्षों को लेपित किया जाता है, और प्रकाश अब केवल कुएं के नीचे से प्रवेश कर सकता है जहां एलईडी रखा जाता है।
  15. प्लेट को एलपीए के फिट किए गए 3 डी भागों में रखें। फिर, प्लेट को 3 डी-मुद्रित एलपीए ढक्कन के साथ कवर करें, जो प्रत्येक कोने पर डिवाइस शिकंजा पर फिट बैठता है।
  16. डिवाइस को पावर स्रोत में प्लग करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि अद्यतन की गई LPA प्रयोग सेटिंग्स लागू की गई हैं, LPA डिवाइस पर रीसेट बटन दबाएं।
  17. मूल सीडिंग घनत्व, सेल लाइन-विशिष्ट विकास की गति और विकास की स्थिति के आधार पर, उचित मात्रा में समय के लिए प्रयोगात्मक प्रणाली के भीतर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इस उदाहरण में, जीन अभिव्यक्ति के लिए एक स्थिर स्थिति तक पहुंचने के लिए सेल लाइनों को लगातार 3 दिनों के लिए प्रेरित किया गया था। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम (जैसे, वीवीडी) स्थिर-राज्य जीन अभिव्यक्ति तक बहुत जल्दी पहुंच सकते हैं (उदाहरण के लिए, 24 घंटे), और इसलिए प्रयोगात्मक प्रेरण समय को कम या आवश्यकतानुसार लंबा किया जा सकता है।
  18. प्रकाश प्रेरण प्रयोग के अंत में, इंजीनियर सेल लाइनों (अनुभाग 4-7) को चिह्नित करने के लिए निम्नलिखित चार assays में से किसी के लिए नमूनों का उपयोग करें।

4. प्रकाश प्रेरित इंजीनियर कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. 24-72 एच पोस्ट-इंडक्शन, इनक्यूबेटर से एलपीए में कोशिकाओं को हटा दें और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में रखें।
  2. पन्नी पट्टी निकालें और प्लेट को 1-2 मिनट के लिए बैठने दें। यह प्लास्टिक के ढक्कन पर संक्षेपण को बनने से रोकता है, अगर प्लेट पर तुरंत रखा जाता है।
  3. बैठने के 1-2 मिनट के बाद, मूल प्लास्टिक ढक्कन को प्लेट पर वापस रखें।
  4. उपयुक्त चरण कंट्रास्ट या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की छवि।
  5. उपकरण के आधार पर, एक्सपोजर समय, प्रकाश स्रोत तीव्रता, और इंजीनियर कोशिकाओं को प्रदर्शित करने के लिए लाभ समायोजित करें। इस प्रयोग में, निम्नलिखित पैरामीटर लागू किए गए थे: FITC / GFP (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) प्रकाश स्रोत एक्सपोजर समय के लिए 50 एमएस और प्रत्येक के लिए 100% तीव्रता पर चरण-कंट्रास्ट एक्सपोजर समय के लिए 1-5 एमएस।
    नोट: यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इष्टतम एक्सपोजर समय, लाभ के स्तर, और प्रकाश स्रोत तीव्रता अक्सर प्रतिदीप्ति रिपोर्टर में अतिसंतृप्ति को कम करने, सेलुलर क्षति को कम करने और गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त छवियों को कैप्चर करने के लिए इस काम के अनुभव से अनुभवजन्य रूप से प्राप्त की जाती है। इन मापदंडों में से प्रत्येक के स्तर का निर्धारण करते समय, ध्यान में रखने के लिए पहलुओं में सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करना, फोटोटॉक्सिसिटी को कम करना, प्रतिदीप्ति संकेतों की अतिसंतृप्ति को कम करना और कमजोर प्रतिदीप्ति संकेतों को बढ़ाने की क्षमता में वृद्धि करना शामिल है।
    1. इन मापदंडों को अत्यधिक तदर्थ रूप से ऑप्टिमाइज़ करें; हालांकि, पिछले प्रयोगात्मक मूल्यों (उदाहरण के लिए, प्रकाश स्रोत तीव्रता प्रतिदीप्ति रिपोर्टर के oversaturation के कारण) लागू होने पर भविष्य की प्रयोगात्मक सेटिंग्स का मार्गदर्शन कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, लाभ सेटिंग्स, एक्सपोज़र समय, और एक सर्किट (LITer1.0) या प्रयोगात्मक सेटअप (जैसे, प्रकाश तीव्रता) से प्रकाश तीव्रता प्रारंभिक मानों को एक समान लेकिन अलग जीन सर्किट (LITer2.0)11 या एक अलग प्रकाश पद्धति (जैसे, प्रकाश शुल्क चक्र) पर जाते समय एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
  6. माइक्रोस्कोपी सॉफ़्टवेयर में क्रमादेशित एक समन्वय टेम्पलेट द्वारा प्लेट इमेजिंग को सुव्यवस्थित करें, जिससे पूरे प्लेट आकार (जैसे, 24 कुओं) को कई छवि स्थानों से स्वचालित छवि अधिग्रहण करने की अनुमति मिलती है।

5. प्रकाश प्रेरित इंजीनियर कोशिकाओं के प्रवाह cytometry

  1. 24-72 एच पोस्ट-इंडक्शन, इन्क्यूबेटर में एलपीए से या इमेजिंग के बाद माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं को हटा दें और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में रखें।
  2. यदि सीधे एलपीए से हटा दिया जाता है, तो पन्नी पट्टी को हटा दें, और प्लेट को एक या दो मिनट के लिए बैठने दें।
  3. प्रत्येक कुएं से मीडिया को एस्पिरेट करें (यदि सभी कुओं का उपयोग किया जाता है तो पूरे 24-अच्छी तरह से प्लेट का)।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से 0.25% ट्रिप्सिन के 100 μL जोड़ें, प्लेट को प्लास्टिक के ढक्कन के साथ कवर करें, और इसे इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  5. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में अबाधित छोड़ दें।
  6. 5 मिनट के बाद, प्लेट को हटा दें और इसे ऊतक संस्कृति हुड में वापस कर दें।
  7. DMEM के 400 μL के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक ट्रिप्सिनाइज्ड को बेअसर करें।
  8. सेल छलनी के साथ एक 5 एमएल पॉलीस्टीरीन राउंड-बॉटम ट्यूब को लेबल करें (या उचित प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब जिसे कोशिकाओं के बड़े गुच्छे को हटाने के लिए फ़िल्टर किया जा सकता है, जो पूरी तरह से ट्रिप्सिनाइज्ड नहीं है) प्रत्येक अच्छी तरह से संबंधित नाम के साथ।
  9. एक P1000 पिपेट का उपयोग करें प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर और नीचे की सामग्री pipette करने के लिए 6-8 बार सेल clumps तोड़ने के लिए और प्रवाह cytometry49 के लिए एकल celled नमूने बनाने के लिए।
  10. छलनी के साथ लेबल ट्यूबों के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से (~ 500 μL) की पूरी सामग्री को स्थानांतरित करें।
  11. कोशिकाओं को सही तरंग दैर्ध्य के लेजर के साथ उपयुक्त प्रवाह साइटोमेट्री उपकरण में लाएं (बर्फ पर या बंद कोशिकाओं के साथ ट्यूब ला सकते हैं)।
    नोट: इस काम में उपयोग किया जाने वाला प्रवाह साइटोमीटर विश्वविद्यालय के अस्पताल में स्थित एक कोर सुविधा का एक हिस्सा था।
  12. प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ़्टवेयर पर मलबे और सेलुलर clumps को बाहर करने के लिए उपयुक्त आकार और ग्रैन्युलैरिटी की एकल कोशिकाओं को कैप्चर करने के लिए एक आगे और साइड-स्कैटर गेट (FSC और SSC, क्रमशः) बनाएं।
  13. एक बार गेट सेट होने के बाद, उपयुक्त गेट के साथ लगभग 10,000 कोशिकाओं को कैप्चर करें। उपयोगकर्ताओं की मांग कर रहे हैं सेलुलर डेटा की मात्रा के आधार पर इस संख्या को समायोजित करें। प्रयोग से कोशिकाओं युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए दोहराएँ।
  14. एक बार प्रयोग पूरा हो जाने के बाद, विश्लेषण के लिए उपलब्ध प्रवाह साइटोमेट्री डेटा सॉफ़्टवेयर में डेटा आयात करें।
  15. एक एफएससी-एसएससी गेट बनाएं (अधिग्रहण के दौरान पहले की तरह) और इसे प्रयोगात्मक डेटा के प्रत्येक बैच पर लागू करें। इस पांडुलिपि में इस गेट को बनाने के लिए संयुक्त राष्ट्र-प्रेरित सेल आबादी का एक संदर्भ अच्छी तरह से उपयोग किया जाता है, लेकिन गेट निर्माण के लिए अन्य मीट्रिक मौजूद हैं, जैसे कि घनत्व-आधारित द्वार।
  16. एक एफएससी-एसएससी गेट के साथ गेटेड प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ, प्रवाह साइटोमेट्री डेटा को हिस्टोग्राम के रूप में प्लॉट करें या प्राप्त अभिव्यक्ति पैटर्न को चित्रित करने के लिए अन्य तरीकों से प्रतिनिधित्व करें। इस प्रयोग में, प्रतिदीप्ति को GFP / FITC या PE / TexasRed चैनलों द्वारा कब्जा कर लिया गया था।

6. आरएनए निष्कर्षण और जीन सर्किट घटकों के मात्रात्मक पीसीआर

  1. 24-72 एच पोस्ट-इंडक्शन, इन्क्यूबेटर में एलपीए से या इमेजिंग के बाद माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं को हटा दें और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में रखें।
  2. यदि एलपीए से सीधे हटा दिया जाता है, तो पन्नी पट्टी को हटा दें, और प्लेट को एक या दो मिनट के लिए बैठने दें।
  3. प्रत्येक कुएं से मीडिया को एस्पिरेट करें (यदि सभी कुओं का उपयोग किया जाता है तो पूरे 24-अच्छी तरह से प्लेट का)।
  4. उपयुक्त आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कोशिकाओं से आरएनए निकालने के लिए आगे बढ़ें।
  5. एक बार आरएनए निष्कर्षण पूरा हो जाने के बाद, प्रत्येक नमूने की रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया करें (तालिका 3)।
  6. इसके अलावा, प्रत्येक नमूने का मात्रात्मक पीसीआर करें (तालिका 4)। पीसीआर प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने के लिए डीएनए पोलीमरेज़ और संबंधित प्रोटोकॉल का उपयोग करें। इस चरण के लिए, एक हाउसकीपिंग जीन और ब्याज के जीन के साथ एक मल्टीप्लेक्स्ड प्रतिक्रिया स्थापित करें, या अलग-अलग प्रतिक्रियाएं बनाएं। इस उदाहरण में, GFP, KRAS, और ग्लिसराल्डिहाइड -3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) के स्तर की जांच की गई थी। क्यूआरटी-पीसीआर प्रयोग को पूरा करने के बाद, आरएनए स्तर पर जीन सर्किट फोल्ड परिवर्तन को चित्रित करने के लिए उपलब्ध सॉफ़्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।

7. जीन सर्किट घटकों के immunofluorescence

  1. मेथनॉल को ठंडा करने के लिए आइस बाथ या फ्रीजर का उपयोग करें।
  2. 24-72 एच पोस्ट-इंडक्शन, इन्क्यूबेटर में एलपीए से या इमेजिंग के बाद माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं को हटा दें और उन्हें ऊतक संस्कृति हुड में रखें।
  3. यदि सीधे एलपीए से हटा दिया जाता है, तो पन्नी पट्टी को हटा दें, और प्लेट को 1-2 मिनट के लिए बैठने दें।
  4. प्रत्येक कुएं से मीडिया को एस्पिरेट करें (यदि सभी कुओं का उपयोग किया जाता है तो पूरे 24-अच्छी तरह से प्लेट का)।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से 0.25% ट्रिप्सिन के 100 μL जोड़ें, प्लेट को प्लास्टिक के ढक्कन के साथ कवर करें, और इसे इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  6. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में अबाधित छोड़ दें।
  7. 5 मिनट के बाद, प्लेट को हटा दें और इसे ऊतक संस्कृति हुड में वापस कर दें।
  8. DMEM के 400 μL के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक ट्रिप्सिनाइज्ड को बेअसर करें।
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से इसी नाम के साथ मिनी सेंट्रीफ्यूज ट्यूब लेबल.
  10. एक P1000 पिपेट का उपयोग करें और सेल clumps को तोड़ने के लिए 6-8 बार ऊपर और नीचे प्रत्येक अच्छी तरह से सामग्री pipette.
  11. लेबल ट्यूबों के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से (~ 500 μL) की पूरी सामग्री स्थानांतरित करें।
  12. 400 x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  13. पूरा होने पर, supernatant को त्याग दें और नमूनों को एक रासायनिक धुएं के हुड में ले जाएं।
  14. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (एक P1000 पिपेट और पिपेट का उपयोग करें और सेल clumps को तोड़ने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 6-8 बार नीचे) 750-1000 μL में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा, पीबीएस में पतला)।
  15. कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 15 मिनट तक बैठने की अनुमति दें।
  16. इनक्यूबेशन के बाद, PBS के 750-1000 μL जोड़ें। पिपेट कई बार ऊपर और नीचे।
  17. 400 x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  18. पूरा होने पर, supernatant को त्याग दें और नमूनों को एक रासायनिक धुएं के हुड में ले जाएं।
  19. बर्फ-ठंडे मेथनॉल के 750-1000 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (एक P1000 पिपेट और पिपेट का उपयोग करें और प्रत्येक ट्यूब में 6-8 बार सेल clumps को तोड़ने के लिए 6-8 बार नीचे)।
  20. कोशिकाओं को बर्फ पर 30 मिनट या -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में बैठने की अनुमति दें।
  21. इनक्यूबेशन के बाद, PBS के 750-1000 μL जोड़ें। पिपेट कई बार ऊपर और नीचे।
  22. 400 x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  23. पूरा होने पर, supernatant को त्याग दें और नमूनों को एक रासायनिक धुएं के हुड में ले जाएं।
  24. उपयोग किए गए एंटीबॉडी के प्रकार के आधार पर, इस बिंदु से प्रोटोकॉल को आगे बढ़ाएं। या तो चरणों का पालन करें 7.24.1-7.24.14 या 7.24.15-7.24.22।
    1. यदि प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं, तो प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μL में सेल clumps को तोड़ने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 6-8 बार P1000 / P200 पिपेट और पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। इस मामले में, स्टॉक एंटीबॉडी के लिए 1: 800 का एक कमजोर पड़ने वाला बनाया गया था, जिसमें केआरएस एंटीबॉडी या ईआरके एंटीबॉडी शामिल थे, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे तक बैठने की अनुमति दी गई थी। एंटीबॉडी को बीएसए के 0.5 ग्राम के साथ 1x पीबीएस से बने एक इनक्यूबेशन बफर में पतला किया गया था।
      नोट: एंटीबॉडी dilutions बनाम ब्याज के एंटीजन का एक मानक वक्र बनाने के द्वारा अनुभवजन्य रूप से एंटीबॉडी के सटीक कमजोर पड़ने का निर्धारण करें।
    2. एंटीबॉडी जोड़ने के बाद, लेबल एंटीबॉडी पर प्रकाश प्रभाव को रोकने के लिए एक पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें।
    3. इनक्यूबेशन बाद, इनक्यूबेशन बफर के 750-1000 μL जोड़ें। पिपेट कई बार ऊपर और नीचे।
    4. 400 x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. पूरा होने पर, supernatant को त्याग दें और नमूनों को एक रासायनिक धुएं के हुड में ले जाएं।
    6. एक P1000 / P200 पिपेट और पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया और प्रत्येक ट्यूब में 6-8 बार नीचे माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μL में सेल clumps तोड़ने के लिए। इस मामले में, कोशिकाओं को केआरएस एंटीबॉडी के लिए 1: 800 या ईआरके एंटीबॉडी के लिए 1: 2000 के कमजोर पड़ने पर 100 μL माध्यमिक एंटीबॉडी में फिर से निलंबित किया गया था और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दी गई थी। प्राथमिक एंटीबॉडी के समान, ऊपर वर्णित इनक्यूबेशन बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें। एक मानक वक्र के अनुभवजन्य निष्कर्षों के आधार पर द्वितीयक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने का निर्धारण करें।
    7. एंटीबॉडी जोड़ने के बाद, लेबल किए गए एंटीबॉडी पर प्रकाश प्रभाव को रोकने के लिए एक पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें।
    8. इनक्यूबेशन के बाद, इनक्यूबेशन बफ़र के 750-1000 μL जोड़ें। पिपेट कई बार ऊपर और नीचे।
    9. 400 x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    10. पूरा होने पर, supernatant को त्याग दें और नमूनों को एक रासायनिक धुएं के हुड में ले जाएं।
    11. पीबीएस के 500 μL में सेल clumps को तोड़ने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 6-8 बार एक P1000 पिपेट और पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया।
    12. प्रत्येक ट्यूब की पूरी सामग्री (~ 500 μL) को छलनी के साथ लेबल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    13. कोशिकाओं को सही तरंग दैर्ध्य के लेजर के साथ उपयुक्त प्रवाह साइटोमेट्री उपकरणों में लाएं (बर्फ पर या बंद कोशिकाओं के साथ ट्यूब ला सकते हैं)।
      नोट: यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई नियंत्रण होने के कारण प्रवाह साइटोमेट्री माप और इंजीनियर सेल जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के साथ प्रगति के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, पूरी तरह से अप्रकाशित कोशिकाओं, अकेले प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सना हुआ कोशिकाएं, और अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सना हुआ कोशिकाएं एंटीबॉडी से पृष्ठभूमि संकेतों के साथ परिणामों की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकती हैं।
    14. अगला, अनुभाग 5 में वर्णित विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
    15. यदि केवल एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं, तो एक P1000 / P200 पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और लेबल किए गए प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μL में सेल clumps को तोड़ने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 6-8 बार पिपेट करें। उपयुक्त एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का निर्धारण करें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। अनुभवजन्य रूप से मानक वक्र से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का निर्धारण करें।
    16. एंटीबॉडी जोड़ने के बाद, लेबल एंटीबॉडी पर प्रकाश प्रभाव को रोकने के लिए एक पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें।
    17. इनक्यूबेशन बाद, इनक्यूबेशन बफर के 750-1000 μL जोड़ें। पिपेट कई बार ऊपर और नीचे।
    18. 400 x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    19. पीबीएस के 500 μL में सेल clumps को तोड़ने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 6-8 बार एक P1000 पिपेट और पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया।
    20. प्रत्येक ट्यूब की पूरी सामग्री (~ 500 μL) को छलनी के साथ लेबल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    21. कोशिकाओं को सही तरंग दैर्ध्य के लेजर के साथ उपयुक्त प्रवाह साइटोमेट्री उपकरणों में लाएं (बर्फ पर या बंद कोशिकाओं के साथ ट्यूब ला सकते हैं)।
      नोट: यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई नियंत्रण होने के कारण प्रवाह साइटोमेट्री माप और इंजीनियर सेल जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के साथ प्रगति के लिए महत्वपूर्ण हैं। अकेले प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पूरी तरह से अप्रकाशित कोशिकाओं और कोशिकाओं को दाग दिया जाना एंटीबॉडी से पृष्ठभूमि संकेतों के साथ परिणामों की तुलना करने के लिए उपयोगी है।
    22. इस बिंदु से, अनुभाग 5 में वर्णित विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।

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Representative Results

इस लेख के भीतर जीन सर्किट असेंबली और स्थिर सेल लाइन पीढ़ी वाणिज्यिक, संशोधित एचईके -293 कोशिकाओं पर आधारित थी, जिसमें एक ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय, एकल स्थिर एफआरटी साइट (चित्रा 1) शामिल थी। जीन सर्किट का निर्माण वैक्टर में किया गया था जिसमें प्लास्मिड के भीतर एफआरटी साइटें थीं, जिससे एचईके -293 सेल जीनोम में एफएलपी-एफआरटी एकीकरण की अनुमति मिलती थी। यह दृष्टिकोण एफएलपी-इन कोशिकाओं तक सीमित नहीं है, क्योंकि एफआरटी साइटों को CRISPR / Cas950 जैसे डीएनए संपादन तकनीक का उपयोग करके जीनोम में कहीं भी रुचि की किसी भी सेल लाइन में जोड़ा जा सकता है।

एक बार जब उचित सेल लाइनों का निर्माण किया गया और सही सम्मिलन के लिए मान्य किया गया, तो एलपीए और आईआरआईएस सॉफ़्टवेयर को जीन अभिव्यक्ति 31,51 के प्रकाश प्रेरण के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल के रूप में चुना गया। एलपीए प्रणाली प्रकाश तीव्रता, नाड़ी अवधि और कर्तव्य चक्र (चित्रा 2) के आधार पर कई प्रयोगात्मक स्थितियों में स्तनधारी कोशिकाओं के प्रेरण के लिए 24-कुओं को क्रमादेशित करने की अनुमति देती है। इस लेख के भीतर, स्थानिक रूप से समान प्रकाश तीव्रता, नाड़ी अवधि और कर्तव्य चक्र को प्राथमिकता दी गई थी। हालांकि, शोधकर्ता अस्थायी प्रकाश तरंग पैटर्न के अधिक उन्नत प्रोग्रामिंग के लिए आईआरआईएस सॉफ्टवेयर और एलपीए का उपयोग कर सकते हैं।

प्रयोगों को शुरू करने से पहले संबोधित किए जाने वाले एलपीए के बारे में एक महत्वपूर्ण पहलू ऑप्टिकल अंशांकन है जिसे एकल या एकाधिक उपकरणों के लिए किया जा सकता है। अंशांकन के लिए उपयोग की जाने वाली पहले से वर्णित छवि विश्लेषण विधि 31 को ब्याज के सभी एलईडी के साथ पूरे एलपीए की एक छवि की आवश्यकता होती है, जिसे विभिन्न प्रकार के स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है52, जिसमें जेल इमेजर भी शामिल है। यहां, छवि अधिग्रहण (चित्रा 3 ए) के लिए एक कंप्यूटर स्कैनर का उपयोग किया गया था। एक बार छवि का अधिग्रहण करने के बाद, Gerhardt et al. (2016)31 द्वारा बनाए गए ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग प्रत्येक एलईडी के लिए मुआवजे के मूल्यों की गणना करने के लिए किया गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक एलपीए किसी दिए गए ग्रेस्केल मूल्य पर समान तीव्रता का उत्सर्जन करता है। सॉफ़्टवेयर पृष्ठभूमि संकेत को घटाता है, छवि को बाइनरी श्रेणी में थ्रेशोल्ड करता है, और पिक्सेल तीव्रता (चित्रा 3 बी) की गणना करता है। अंशांकन से, एल ई डी के बीच एक न्यूनतम भिन्नता पाई गई, जिसमें 96 कुओं के बीच 0.04 का सीवी था (या 4 प्लेटों को कैलिब्रेट किया गया, चित्रा 3 सी)। अंत में, अंशांकन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके स्थान (चित्रा 3 डी) द्वारा एलईडी भिन्नता का प्रदर्शन किया और एक ग्रेस्केल समायोजन (चित्रा 3 ई) बनाया ताकि प्रत्येक एलईडी को एक ही तीव्रता के लिए सामान्यीकृत किया जा सके।

अंशांकन के अलावा, एलपीए का उपयोग करने के अन्य महत्वपूर्ण पहलुओं में प्रयोगात्मक पाइपलाइन में कई नियंत्रणों को एकीकृत करना शामिल है जो प्रयोगात्मक सामग्रियों के आधार पर प्रकाश-विषाक्तता प्रभाव और डिजाइन सीमाओं जैसे भ्रमित चर को सीमित करके प्रणालीगत त्रुटियों को कम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, चित्रा 4 LPA कुओं में विभिन्न प्रकाश तीव्रता प्रोग्रामिंग के लिए दो अलग-अलग कॉन्फ़िगरेशन दिखाता है। चित्र 4A का पहला उप-फलक प्रकाश तीव्रता के आरोही संगठन को दर्शाता है। यह प्रोग्रामिंग और डेटा विश्लेषण में आसानी के लिए बना सकता है, लेकिन किनारे के प्रभाव पैदा कर सकता है जहां एलपीए की निचली पंक्ति में उच्चतम प्रकाश तीव्रता होती है और संभावित रूप से अवांछित गर्मी और पास के कुओं के प्रकाश प्रेरण का कारण बन सकती है। इसी तरह, चित्रा 4A के दूसरे उप-फलक में, IRIS सॉफ़्टवेयर पर एक यादृच्छिककरण मैट्रिक्स लागू किया गया है, जिससे यादृच्छिक पदों में विभिन्न प्रकाश तीव्रता पैदा होती है। यह किनारे के प्रभावों के प्रणालीगत प्रभावों को कम कर सकता है। एक descrambled मैट्रिक्स (चित्रा 4B) IRIS सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया है, जो तब प्रयोग के पूरा होने के बाद और विश्लेषण के दौरान प्रयोगात्मक स्थितियों को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुओं के यादृच्छिककरण के समान, उपयोगकर्ताओं को प्रकाश विषाक्तता प्रभावों के बारे में भी पता होना चाहिए जो हो सकते हैं (इस काम के भीतर नीली रोशनी)। चित्रा 4 C में, जीन सर्किट प्रेरण के लिए उपयोग की जाने वाली दो अलग-अलग प्रकाश तीव्रताओं को इंजीनियर कोशिकाओं की संयुक्त राष्ट्र-प्रेरित आबादी के आधार पर एक ही FSC-SSC गेट के साथ दिखाया गया है। जैसे, उपयोगकर्ताओं को प्रकाश विषाक्तता प्रभावों को निर्धारित करने के लिए ब्याज के प्रकाश साधन (जैसे, नाड़ी, शुल्क चक्र, आदि) पर एक खुराक-प्रतिक्रिया का प्रदर्शन करना चाहिए जो एक्सपोजर के उच्च अंत में हो सकता है (चित्रा 4 डी)। यहां, नीले प्रकाश के स्तर में वृद्धि ने गैर-उत्तेजित कोशिकाओं की तुलना में खुराक-निर्भर सेलुलर मलबे, मृत कोशिकाओं और clumps का कारण बना। इस प्रकार, निरंतर प्रकाश तीव्रता अधिकतम एलपीए तीव्रता (~ 3000 जीएस इकाइयों) के लगभग 3/4 तक सीमित थी।

एक बार उचित उपकरण स्थापित होने के बाद, जीन अभिव्यक्ति को तब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5) के माध्यम से इंजीनियर लिटर जीन सर्किट में प्रेरित किया गया था। कोशिकाओं को एलपीए पर विभिन्न प्रकाश नाड़ी अवधियों पर प्रेरित किया गया था, जिसने जनसंख्या स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की एक हल्की खुराक-प्रतिक्रिया दी थी। इस काम के भीतर कोशिकाओं को FITC / GFP प्रकाश स्रोत एक्सपोजर समय के लिए 50 एमएस का उपयोग करके जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए और चरण-विपरीत एक्सपोज़र समय के लिए 1-5 एमएस का उपयोग करके उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग के लिए चित्रित किया गया था। इस सेल लाइन-इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल की मजबूती को देखते हुए, जीएफपी के बजाय किसी भी प्रतिदीप्ति मार्कर का उपयोग किया जा सकता है। कोशिकाओं को कई प्रकाश शासनों के साथ प्रेरित किया जा सकता है और प्रतिक्रियाओं की एक बड़ी श्रृंखला का उत्पादन किया जा सकता है (चित्रा 5)। उत्तरार्द्ध कार्यात्मक जीन (उदाहरण के लिए, मूल work53 में KRAS (G12V) ऑन्कोजीन) की अभिव्यक्ति को और नियंत्रित करने में फायदेमंद है।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तुरंत बाद, कोशिकाओं का विश्लेषण विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में किया जा सकता है, जिसमें फ्लो साइटोमेट्री, क्यूआरटी-पीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस शामिल हैं। इस काम में, फ्लो साइटोमेट्री को पहली सत्यापन प्रक्रिया के रूप में किया गया था और ऊपर उल्लिखित विधियों का पालन करते हुए किया गया था (चित्रा 6)। माइक्रोस्कोपी के समान, कोशिकाओं को विभिन्न नाड़ी लंबाई मूल्यों पर प्रेरित किया गया था, और जनसंख्या स्तर पर संयुक्त राष्ट्र-प्रेरित राज्यों से चार गुना से अधिक परिवर्तन की जीन अभिव्यक्ति की खुराक-प्रतिक्रिया दिखाई गई थी (चित्रा 6 ए-बी)। इसी तरह, जीन अभिव्यक्ति शोर में कमी को LITer सिस्टम के लिए विभिन्न प्रकाश तीव्रता मूल्यों (चित्रा 6C-D) बनाम एक सकारात्मक विनियमन (कोई प्रतिक्रिया नहीं) प्रणाली जैसे कि VVD / LightOn54 की तुलना करके दिखाया जा सकता है। वीवीडी सिस्टम के साथ लिटर की तुलना करते समय, नकारात्मक प्रतिक्रिया पांच गुना जीन अभिव्यक्ति शोर में कमी से अधिक प्राप्त करती है। माइक्रोस्कोपी पर चित्रित एक ही पूर्व-प्रेरित कोशिकाओं का विश्लेषण क्यूआरटी-पीसीआर (चित्रा 7) के माध्यम से भी किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री के समान, इंजीनियर LITer कोशिकाएं आरएनए स्तरों को खुराक-उत्तरदायी तरीके से व्यक्त कर सकती हैं (संयुक्त राष्ट्र-प्रेरित राज्यों से 10 गुना से अधिक प्रेरण), प्रवाह साइटोमेट्री पर जीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा परिमाणित प्रोटीन स्तरों की खुराक-प्रतिक्रिया से मेल खाती हैं। उल्लिखित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री डेटा को गैर-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को व्यक्त किया जा सकता है, और फ्लोरोसेंट 6-8-पीक सत्यापन मोतियों (जैसे, FL1-चैनल ग्रीन, फ्लोरोसेंट मोतियों)। इनमें से प्रत्येक घटक एक ही प्रयोग में जीन अभिव्यक्ति के सामान्यीकरण की अनुमति दे सकता है। हालांकि, ये कारक जीन अभिव्यक्ति डेटा की तुलना और मानकीकरण की अनुमति देने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक प्लेटों, प्रयोगात्मक स्थितियों और दिनों में सर्किट और इंजीनियर कोशिकाओं के सामान्यीकरण की अनुमति भी दे सकते हैं।

अंत में, LITer जीन सर्किट को कार्यात्मक जीन को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, जैसे कि KRAS (G12V, चित्रा 8)। इस पाइपलाइन की बहुमुखी प्रतिभा उपयोगकर्ताओं को ब्याज के किसी भी कार्यात्मक जीन के लिए सेल इंजीनियरिंग के साथ LITer आर्किटेक्चर का उपयोग करने की अनुमति देती है, संभवतः सकारात्मक प्रतिक्रिया जैसे अतिरिक्त आर्किटेक्चर को शामिल करती है। LITer ने नीली रोशनी की बढ़ती मात्रा को दिखाया जिसके परिणामस्वरूप जीन सर्किट आउटपुट (केआरएस (जी 12 वी) प्रोटीन के स्तर में वृद्धि हुई और, नतीजतन, फॉस्फोराइलेटेड-ईआरके स्तर, जिनमें से दोनों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस एसेस के माध्यम से परिमाणित किया जा सकता है।

टुकड़ा अनुपात आकार (bp) डीएनए टुकड़ा वजन एकाग्रता (ng / μL) डीएनए टुकड़ा दाढ़ सांद्रता (fmol / μL) आयतन (μL) परिणामी डीएनए दाढ़ द्रव्यमान (fmol)
माँ वेक्टर टुकड़ा 1 1 3414.00 18.20 8.63 4.09 35.29
माँ वेक्टर टुकड़ा 2 1 4642.00 18.10 6.31 5.59 35.29
रुचि के जीन 1 549.00 37.90 111.70 0.32 35.29
कुल 10.00 105.87

तालिका 1: डीएनए असेंबली प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण गणना (चरण 1.13)। कॉलम 2 और 3 इकट्ठे किए गए डीएनए टुकड़ों के आकार और पीसीआर प्रवर्धन और एगारोज़ जेल निष्कर्षण (चरण 1.11) के बाद इन टुकड़ों की एकाग्रता पर आधारित हैं। चौथे स्तंभ (कुल प्रतिक्रिया वॉल्यूम) के निचले सेल को संशोधित किया जा सकता है; हालांकि, वर्णित मात्रा की सिफारिश की है। अनशेड किए गए कक्ष स्वचालित रूप से उत्पन्न होते हैं.

0 100 200 400 500 750
1500 3000 0 100 200 400
500 750 1500 3000 0 100
200 400 500 750 1500 3000

तालिका 2: तीन प्रतिकृतियों (चरण 3.4) के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट में प्रकाश प्रेरण प्रयोग के लिए प्रकाश तीव्रता (जी.एस.) की आईआरआईएस प्रोग्रामिंग। 0 से 3000 g.s. G.s. G.s.-grayscale इकाइयों तक की प्रकाश तीव्रता का वितरण। यह आवश्यकतानुसार IRIS सॉफ़्टवेयर द्वारा यादृच्छिक किया जा सकता है।

नमूना 1 नमूना 2 नमूना 3
रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज मास्टर मिक्स वॉल्यूम (μL) 4.00 4.00 4.00
आरएनए टेम्पलेट (1000 ng) वॉल्यूम (μL) 2.00 3.00 4.00
NF-H20 वॉल्यूम (μL) 14.00 13.00 12.00
कुल आयतन (μL) 20.00 20.00 20.00

तालिका 3: रिवर्स प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण गणना (चरण 6.5). प्रतिक्रिया की सिफारिश की कुल मात्रा 20 μL है, और इसके घटक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एंजाइम मास्टर मिश्रण (यहां: 5x), आरएनए टेम्पलेट, और न्यूक्लिएज मुक्त पानी हैं। इस उदाहरण में, नमूने 1, 2, और 3 की आरएनए सांद्रता क्रमशः 500, 333, और 250 एनजी / μL है।

नमूना 1 नमूना 2 नमूना 1 और 2 मल्टीप्लेक्स
GFP प्रोब वॉल्यूम (μL) 1 ----- 1
GAPDH प्रोब वॉल्यूम (μL) ------ 1 1
डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स वॉल्यूम (μL) 10 10 10
cDNA (100 ng) आयतन (μL) 2 2 2
NF-H20 वॉल्यूम (μL) 7 7 7
कुल आयतन (μL) 20 20 20

तालिका 4: मात्रात्मक पीसीआर मास्टर मिश्रण गणना (चरण 6.6). प्रतिक्रिया की सिफारिश की कुल मात्रा 20 μL है और इसके घटक डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम मास्टर मिश्रण (यहां: 2x), GFP और / या GAPDH जांच, cDNA (100 ng कुल), और न्यूक्लिएज मुक्त पानी (NF-H20) हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सर्किट डिजाइन और सेल इंजीनियरिंग. (ए) सेल इंजीनियरिंग उपकरण, जिसमें एफआरटी एकीकरण साइटों के साथ लिटर सिंथेटिक जीन सर्किट, सर्किट एकीकरण के लिए रीकोम्बिनेज एंजाइम (एफएलपी रिकॉम्बिनेज), उपयुक्त आनुवंशिक क्लोन के चयन के लिए उपयोग की जाने वाली दवा, और वांछित ऑप्टोजेनेटिक स्तनधारी सेल लाइनों को बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली ब्याज की सेल लाइन शामिल है। (बी) इंजीनियर आनुवांशिक प्रणालियों को मानव जीनोम के भीतर लोकस युक्त एक विशिष्ट एफआरटी-साइट पर एकीकृत किया जा सकता है। ये जीनोमिक लोकी तब ठीक से एकीकृत आनुवंशिक कैसेट के चयन के लिए विशिष्ट एंटीबायोटिक प्रतिरोध या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त कर सकते हैं। जीन सर्किट एकीकरण को पुन: संयोजन के उपयोग के साथ शुरू किया जा सकता है जो मूल आनुवंशिक कैसेट के भीतर विशिष्ट साइटों को पहचानता है। यह एक उपन्यास दवा प्रतिरोध चयन जीन का परिचय देता है जो वांछित जीन सर्किट के साथ सही ढंग से इंजीनियर कोशिकाओं की पीढ़ी सुनिश्चित कर सकता है। पैनल बी के नीचे ऑप्टोजेनेटिक नकारात्मक प्रतिक्रिया प्रणाली, LITer2.0 के लिए जीन सर्किट आर्किटेक्चर है। यह सर्किट एक स्व-दमनकारी TetR प्रोटीन से बना है जो एक लाइट-ऑक्सीजन-वोल्टेज-सेंसिंग डोमेन (LOV2), एक लिंकर अनुक्रम P2A के साथ जुड़ा हुआ है जो एक मल्टीसिस्ट्रॉनिक ट्रांसक्रिप्ट और जीएफपी को सक्षम बनाता है। जब नीली रोशनी लागू की जाती है, तो टिप अनुक्रम LOV2 डोमेन से खुलता है, TetR प्रोटीन को बाधित करता है, और TetR और GFP रिपोर्टर दोनों के बढ़े हुए, खुराक-उत्तरदायी प्रतिलेखन की अनुमति देता है। बाधित TetR प्रोटीन डीएनए ऑपरेटर साइट पर बांधने और दबाने में असमर्थ है, इस प्रकार प्रतिलेखन में वृद्धि हुई है। यह नकारात्मक प्रतिक्रिया जीन अभिव्यक्ति शोर को कम रखती है और जीन अभिव्यक्ति के उच्च गुना परिवर्तन की अनुमति देती है। FRT - फ्लिप मान्यता लक्ष्य, HygR - hygromycin प्रतिरोध, LacZ - β-galactosidase, ZeoR - zeocin प्रतिरोध, टी - TetR, tetracycline दमनकारी प्रोटीन, D2ir TwtO साइटों के साथ एक CMV-आधारित प्रमोटर है, LOV2 लाइट-ऑक्सीजन-वोल्टेज-सेंसिंग डोमेन है, टीआईपी टेट-बाधा पेप्टाइड है जो टीटीआर प्रोटीन को रोकता है। इस आंकड़े को गुइन और बालाज़ी (2020)55 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: LPA प्रयोगात्मक प्रोग्रामिंग. (ए) प्रयोगों को स्थिर-राज्य, गतिशील, या उन्नत एलपीए प्रोग्रामिंग 31 के लिए लचीलेपन के साथ टैबर लैब वेबसाइट 47 पर सूचीबद्ध उपकरणों का उपयोग करके प्रोग्राम किया जा सकता है। इसके अलावा, इलेक्ट्रॉनिक फ़ाइलों को तकनीकी प्रतिकृति या वैकल्पिक सेल लाइनों के प्रयोगात्मक प्रेरण के लिए भविष्य के उपयोग के लिए बचाया जा सकता है। (बी) शीर्ष और पक्ष (सी) से देखे गए मुख्य घटकों के साथ एलपीए डिवाइस। (डी) एलपीए पर रहने के लिए पन्नी-सील प्लेटों की छवियां। LPA - लाइट प्लेट उपकरण, एलईडी - प्रकाश उत्सर्जक डायोड. इस आंकड़े के तत्वों को गुइन (2019)11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रकाश प्लेट उपकरण का अंशांकन. (A) IRIS सॉफ़्टवेयर के आधार पर 2000 g.s. के लिए सेट LEDs के लिए LPA की प्रतिनिधि छवि. (बी) प्रत्येक एलईडी की पिक्सेल तीव्रता की गणना करने के लिए छवि को बायनेराइज़ करने के लिए उपयोग की जाने वाली पृष्ठभूमि घटाया और थ्रेशोल्ड के साथ पैनल (ए) से छवि। (सी) पिक्सेल तीव्रता का हिस्टोग्राम (MATLAB छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित) 96 एल ई डी (4 एलपीए प्लेटों) का एक ही आईआरआईएस सॉफ्टवेयर मूल्य (उदाहरण के लिए, 2000 g.s.) पर सेट किया गया है। लाल रेखा औसत एलईडी पिक्सेल तीव्रता का प्रतिनिधित्व करती है, और पैनल में सीवी 96 कुओं के लिए भिन्नता के गुणांक का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) हीटमैप पैनल (ए) में एलपीए छवि की एलईडी तीव्रता दिखा रहा है, जो अधिकतम तीव्रता एलईडी के लिए सामान्यीकृत है। (ई) अंशांकन मूल्य हीटमैप पैनल (ए) में एलपीए छवि के लिए निर्धारित किया जाता है, जब एलपीए के लिए प्रोग्राम किए गए प्रत्येक एलईडी के लिए समान तीव्रता उत्पादन बनाने के लिए। LPA - लाइट प्लेट उपकरण, एलईडी - प्रकाश उत्सर्जक डायोड, सीवी - भिन्नता का गुणांक. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: LPA और प्रकाश विषाक्तता प्रभावों का यादृच्छिककरण। (A) IRIS सॉफ़्टवेयर के आधार पर 25 से 4000 g.s तक सेट किए गए दो प्रोग्राम योग्य LPA LED कॉन्फ़िगरेशन की प्रतिनिधि छवि। पहला कॉन्फ़िगरेशन व्यवस्थित त्रुटियों जैसे कि गर्मी और प्रकाश के किनारे-प्रभावों को पार करने की अनुमति देने की अधिक संभावना है (उदाहरण के लिए, एलपीए की निचली पंक्ति दूसरी सबसे कम पंक्ति को प्रभावित करती है)। दूसरी छवि तीव्रता के स्थान को यादृच्छिक करती है, इसलिए किनारे के प्रभाव के कारण व्यवस्थित त्रुटि (पूर्वाग्रह) को कम करती है। (बी) पैनल (ए) में दिखाए गए एलपीए में प्रकाश तीव्रता के लिए यादृच्छिकता स्थान दिखाने वाले मैट्रिक्स, जिसका उपयोग किसी दिए गए प्रयोग के तीव्रता-निर्भर परिणामों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। (सी) दो अलग-अलग प्रकाश तीव्रता (1250 और 4000 जीएस) के लिए फ्लो साइटोमेट्री डेटा निरंतर रोशनी पर प्रेरण के 3 दिनों के लिए। काला द्वार अप्रेरित कोशिकाओं पर आधारित है। (डी) बार ग्राफ़ फ्लो साइटोमेट्री डेटा जैसे पैनल (सी) को दर्शाता है, लेकिन प्रकाश तीव्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए। LPA - लाइट प्लेट उपकरण, FSC - आगे तितर बितर, एसएससी - साइड स्कैटर, जी.एस. - ग्रेस्केल में मापा प्रकाश तीव्रता मूल्य। LITer cells11 में सेल अस्तित्व में एक खुराक-उत्तरदायी कमी थी जो 0.0022 के पी-मूल्य के साथ एनोवा 1-पूंछ परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इंजीनियर ऑप्टोजेनेटिक सेल लाइनों की प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियां। कोशिकाओं को चरण कंट्रास्ट और प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्राप्त करने के लिए एक कैमरे (14-बिट) के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया गया था। कोशिकाओं को चरण कंट्रास्ट (पैनल ए, प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र छवि) के लिए 5 एमएस और 100% प्रकाश स्रोत तीव्रता पर जीएफपी / एफआईटीसी अधिग्रहण (पैनल बी) के लिए 50 एमएस के लिए उजागर किया गया था। कोशिकाओं को वांछित स्थिर-राज्य अधिग्रहण या गतिशील प्रतिक्रिया के आधार पर विभिन्न समय बिंदुओं पर चित्रित किया जा सकता है, जिससे एक स्थिर स्थिति होती है। यहां कोशिकाएं निश्चित तीव्रता (1000 ग्राम एस) पर एक नाड़ी अवधि अनुमापन का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो प्रकाश जोखिम के 3 दिनों तक कोई प्रकाश जोखिम नहीं होती है। इकाई g.s ग्रेस्केल में मापा एक प्रकाश तीव्रता मान का प्रतिनिधित्व करता है। इस आंकड़े को गुइन (2019)11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: इंजीनियर ऑप्टोजेनेटिक सेल लाइनों की फ्लो साइटोमेट्री। कोशिकाओं का विश्लेषण एक BD LSRFortessa प्रवाह साइटोमीटर पर किया गया था, जिसमें लगभग 10,000 कोशिकाओं को एसएससी-एफएससी (साइड स्कैटर-फॉरवर्ड स्कैटर) गेट के भीतर एकत्र किया गया था। तब कोशिकाओं का विश्लेषण FCS एक्सप्रेस सॉफ़्टवेयर के साथ किया गया था। हिस्टोग्राम या स्कैटर प्लॉट्स को ब्याज के जीन (जैसे, जीएफपी) की अभिव्यक्ति को मापने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है। (ए) काली रेखा के भीतर गेटिंग के लिए एसएससी-एफएससी अक्षों पर प्लॉट किए गए इंजीनियर सेल। (बी) प्रतिनिधि लिटर कोशिकाएं 1000 ग्राम प्रति घंटे की प्रेरण के 72 घंटे तक प्रकाश दालों की अलग-अलग अवधि के साथ प्रेरित होती हैं, जो जीन अभिव्यक्ति की खुराक-प्रतिक्रिया को दर्शाती हैं। (सी) लाइट तीव्रता अनुमापन के लिए प्रतिनिधि खुराक-प्रतिक्रिया डेटा लिटर जीन सर्किट (टीआईपी-आधारित प्रणाली) बनाम वीवीडी या लाइटऑन सिस्टम 40 की तुलना में, जो बिना किसी प्रतिक्रिया के एक सकारात्मक विनियमन प्रणाली है। (डी) वीवीडी प्रणाली के अनुरूप हिस्टोग्राम, लिटर प्रणाली की तुलना में व्यापक वितरण (और इसलिए उच्च जीन अभिव्यक्ति शोर) को दर्शाता है। CV भिन्नता का गुणांक है, जीन अभिव्यक्ति शोर के लिए एक मीट्रिक। FSC - आगे तितर बितर, एसएससी - साइड स्कैटर, FITC - फ्लोरोसीन आइसोथियोसाइनेट, जी.एस. - ग्रेस्केल में मापा गया प्रकाश तीव्रता मूल्य। इस आंकड़े को गुइन (2019)11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: इंजीनियर ऑप्टोजेनेटिक सेल लाइनों के मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर। प्रतिनिधि डेटा दिखा रहा है कि कई जीन अभिव्यक्ति के स्तर को प्रेरित किया जा सकता है और एक उत्तेजना के रूप में प्रकाश का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है। इकाई Rq नियंत्रण की तुलना में अभिव्यक्ति गुना-परिवर्तन के सापेक्ष परिमाणीकरण का प्रतिनिधित्व करता है। LITer cells11 में आरएनए अभिव्यक्ति में एक खुराक-उत्तरदायी वृद्धि थी जो क्रमशः GFP और KRAS स्तरों के लिए 0.0352 और 0.0477 के पी-मान के साथ एनोवा 1-पूंछ परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी। इस आंकड़े को गुइन (2019)11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: इंजीनियर ऑप्टोजेनेटिक सेल लाइनों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस। immunofluorescence के आधार पर प्रोटीन स्तर के अनुमान दिखा प्रतिनिधि डेटा. (ए) फॉस्फोराइलेटेड-ईआरके के केआरएस (जी 12 वी) और (बी) प्रोटीन स्तरों का प्रोटीन स्तर, जिसे लिटर जीन सर्किट क्रमशः प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से प्रकाश की मात्रा में वृद्धि के अनुसार प्रेरित करता है। सलाखों में दिखाए गए डेटा माध्य मान हैं, त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (n = 3) हैं। A.u. - मनमाने ढंग से इकाइयों, जी.एस. - ग्रेस्केल में मापा प्रकाश तीव्रता मूल्य. LITer cells11 में प्रोटीन के स्तर में एक खुराक-उत्तरदायी वृद्धि हुई थी जो क्रमशः KRAS और फॉस्फोराइलेटेड-ERK स्तरों के लिए 2.79E-04 और 0.016 के पी-मूल्य के साथ एनोवा 1-पूंछ परीक्षण का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थी। इस आंकड़े को गुइन (2019)11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस लेख के पाठकों को ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट (साथ ही साथ अन्य जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों) की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण चरणों में अंतर्दृष्टि प्राप्त हो सकती है, जिसमें 1) जीन सर्किट डिजाइन, निर्माण और सत्यापन शामिल हैं; 2) स्थिर सेल लाइनों में जीन सर्किट शुरू करने के लिए सेल इंजीनियरिंग (उदाहरण के लिए, एफएलपी-एफआरटी पुनर्संयोजन); 3) एलपीए जैसे प्रकाश-आधारित मंच के साथ इंजीनियर कोशिकाओं का प्रेरण; 4) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्रकाश प्रेरण assays के प्रारंभिक लक्षण वर्णन; और 5) प्रवाह cytometry, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-PCR), या immunofluorescence assays सहित assays की एक किस्म के साथ अंतिम जीन अभिव्यक्ति लक्षण वर्णन.

इसके अतिरिक्त, ऊपर उल्लिखित तरीके अनिवार्य रूप से किसी भी जीन सर्किट आर्किटेक्चर के लिए अत्यधिक मॉड्यूलर हैं जो जीन-ऑफ-इंटरेस्ट को व्यक्त करते हैं, सर्किट निर्माण चरण में मुख्य संभावित प्रोटोकॉल संशोधनों और आयोजित assays के साथ। जीन सर्किट निर्माण के मामले में, आणविक क्लोनिंग का लचीलापन ब्याज के किसी भी जीन को प्राइमर डिजाइन या असेंबली प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों के साथ प्रतिदीप्ति मार्कर के साथ विनिमय या सह-व्यक्त करने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, जबकि यहां उल्लिखित प्रक्रियाएं ज्यादातर सटीक (कम शोर) जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए एनएफ जीन सर्किट डिजाइन पर ध्यान केंद्रित करती हैं, अन्य आर्किटेक्चर जैसे सकारात्मक विनियमन या सकारात्मक प्रतिक्रिया (पीएफ) को विभिन्न विशेषताओं को प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है जैसे कि उच्च गुना परिवर्तन या उच्च जीन अभिव्यक्ति शोर, क्रमशः56,57 . विभिन्न प्रकार के जीन सर्किट आर्किटेक्चर (जैसे, पीएफ, एनएफ, आदि) का उपयोग करके शोधकर्ताओं को विभिन्न जैविक प्रश्नों का पता लगाने की अनुमति मिल सकती है जैसे कि प्रोटीन स्तर के परिमाण और दवा प्रतिरोध या मेटास्टेसिस 58 में शोर खेलने की भूमिकाएं। यहां सूचीबद्ध प्रोटोकॉल भी जीन अभिव्यक्ति परिमाणीकरण के विभिन्न तरीकों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, लेकिन कार्यात्मक assays की किसी भी संख्या (जैसे, सेल गतिशीलता, घाव भरने, प्रसार, आदि) को माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण के बाद जोड़ा जा सकता है, जिसमें पूर्ववर्ती तरीकों पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। यह विशेष रूप से एकल-सेल अध्ययनों के लिए प्रासंगिक है जहां ऑप्टोजेनेटिक्स स्पंदन अभिव्यक्ति गतिशीलता 59 जैसे व्यवहारों का अध्ययन करने के लिए स्पैटिओटेम्पोरल प्रेरण का उपयोग कर सकते हैं।

पूरक विधि modularity, समस्या निवारण प्रत्येक मुख्य प्रोटोकॉल की एक और महत्वपूर्ण विशेषता है। सर्किट निर्माण के लिए, मुख्य अंतर उपयुक्त सर्किट-विशिष्ट प्राइमर डिजाइन में रहता है, जबकि बाद के तरीकों जैसे कि बैक्टीरिया के विकास के माध्यम से असेंबली और प्लास्मिड प्रवर्धन अधिक मानकीकृत होते हैं और आमतौर पर उनकी अपनी व्यापक समस्या निवारण प्रक्रियाएं शामिल होती हैं। सेल इंजीनियरिंग को उपयोग की जाने वाली सेल लाइन के आधार पर दवा अनुमापन घटता के साथ संशोधित किया जा सकता है। साथ ही, यदि कोई वाणिज्यिक कक्ष पंक्ति का उपयोग किया जाता है, तो समस्या निवारण मार्गदर्शिकाएँ सीधे सेल लाइन निर्माता से प्राप्त की जा सकती हैं. इसके अलावा, अनपेक्षित प्रकाश प्रभाव इंजीनियर सेल लाइनों पर मात्रा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, 470 एनएम प्रकाश के फोटोटॉक्सिक प्रभावों के कारण, आबादी में मृत्यु या क्षति के प्रेरण की जांच करने के लिए एक प्रकाश तीव्रता वक्र बनाया जाना चाहिए। एक बार जब विभिन्न प्रकार के प्रकाश मूल्यों का परीक्षण किया जाता है, तो उपयोगकर्ता एक एफएससी-एसएससी गेट बना सकते हैं या मृत / क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को मापने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड स्टेनिंग जैसी विधि का उपयोग कर सकते हैं, और इसलिए, प्रयोगात्मक रूप से उपयोग करने के लिए उचित प्रकाश श्रेणियों को निर्धारित करने के लिए एक उपकरण के रूप में कार्य करते हैं।

एलपीए समस्या निवारण के लिए, एलईडी आसन्न कुओं के साथ प्रकाश और गर्मी crosstalk के किनारे प्रभाव का उत्पादन कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, उच्च तीव्रता वाले कुओं से आसन्न कुओं में कुछ प्रेरण हो सकता है यदि कुओं के बीच एक अनुचित सील या एक बड़ी गर्मी / प्रकाश ढाल है। ये प्रभाव अधिकतम हो सकते हैं यदि एलपीए को प्रकाश पैरामीटर के एक विशेष क्रम (जैसे, आरोही / अवरोही) में क्रमादेशित किया जाता है। इसका मुकाबला करने के लिए, आईआरआईएस सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ताओं को अच्छी तरह से तीव्रता को यादृच्छिक करने के लिए एक यादृच्छिकीकरण मैट्रिक्स को नियोजित करने की अनुमति देता है और इसलिए व्यवस्थित त्रुटि को कम करता है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के समस्या निवारण पहलुओं के लिए, एक्सपोज़र समय, लाभ सेटिंग्स (कैमरे की संवेदनशीलता को नियंत्रित करना), और प्रकाश स्रोत तीव्रता मुख्य पैरामीटर हैं जिन्हें समायोजित किया जा सकता है। इन मापदंडों ट्यूनिंग इष्टतम छवि उत्पादन और आदर्श संकेत-से-शोर अनुपात के साथ-साथ अतिसंतृप्ति और फोटोटॉक्सिसिटी से बचने की अनुमति दे सकता है।

प्रवाह साइटोमेट्री समस्या निवारण के लिए, फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब वोल्टेज और सेलुलर गेटिंग मुख्य पहलू हैं जिन्हें समायोजित किया जा सकता है। इन मापदंडों ट्यूनिंग प्रयोगात्मक स्थितियों और नियंत्रण नमूनों के बीच आदर्श तुलना, कमजोर या मजबूत प्रतिदीप्ति संकेतों दोनों के लिए उचित संकेत अधिग्रहण, और सेलुलर मलबे या अवांछित सेल आबादी के बहिष्करण की अनुमति दे सकते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रवाह साइटोमेट्री वोल्टेज को उचित तुलना की अनुमति देने के लिए प्रयोगों में आदर्श रूप से स्थिर रखा जाता है। इसके अतिरिक्त, कई प्रतिदीप्ति आउटपुट (जैसे, FITC और PE) की आवश्यकता वाले ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के लिए, उपयोगकर्ताओं को फ्लोरोफोर के बीच क्रॉसस्टॉक दिए गए प्रतिदीप्ति मुआवजे के बारे में पता होना चाहिए। ऐसे परिदृश्यों में, उचित प्रतिदीप्ति संकेतों को निर्धारित करने के लिए नियंत्रण महत्वपूर्ण हैं। उपयोगकर्ताओं के प्रदर्शन के लिए आवश्यक नियंत्रणों में फ्लोरोसेंट मोतियों, ब्याज के मार्कर के साथ सना हुआ कोशिकाएं, या प्रतिदीप्ति प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं शामिल हैं जिनका उपयोग ब्याज के प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर में मुआवजा मैट्रिक्स बनाने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चाहे एक प्रतिदीप्ति मार्कर या अधिक का उपयोग करके, सभी उपयोगकर्ताओं को नियमित रूप से गैर-फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के लिए प्रत्येक मार्कर के प्रतिदीप्ति संकेतों को मापना चाहिए, जो ऑटोफ्लोरेसेंस / पृष्ठभूमि संकेतों को उत्पन्न करते हैं। qRT-PCR समस्या निवारण में अलग-अलग cDNA मात्रा और जांच डिज़ाइन शामिल हैं, जो अक्सर परियोजना-विशिष्ट होते हैं। अंत में, immunofluorescence समस्या निवारण के लिए, एंटीबॉडी सांद्रता परख परिमाणीकरण के लिए सबसे बड़ा चर हैं, इष्टतम एकाग्रता निर्धारण की आवश्यकता है।

एक समस्या निवारण पहलू जो उपरोक्त विधियों में से अधिकांश के लिए प्रासंगिक है, वह पन्नी के साथ कवर की गई कोशिकाओं के साथ एक सील प्लेट का उपयोग करने का अलगाव प्रभाव है। यह विधि विभिन्न सेल लाइनों के उचित विकास के लिए आवश्यक कार्बन डाइऑक्साइड गैस विनिमय में बाधा डाल सकती है। पिछले प्रयोगात्मक अनुभव से, यह इस पांडुलिपि के भीतर इंजीनियर सेल लाइनों का उपयोग करके 3-5 दिन के प्रयोग के लिए सेलुलर विकास के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा नहीं थी, लेकिन अन्य सेल लाइनों या प्रयोगात्मक अवधियों के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है। इस चिंता को दूर करने के लिए, सील प्लेटों के साथ लागू किए गए एक अनुकूलन में कार्बन डाइऑक्साइड स्वतंत्र मीडिया का उपयोग करना शामिल है, जिसने इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं के विकास को प्रभावित नहीं किया है। यह अन्य assays या सेल लाइनों के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए जहां चयापचय, पीएच स्तर, और सेल घनत्व महत्वपूर्ण हैं, अन्य हस्तक्षेपों की आवश्यकता हो सकती है जैसे कि मीडिया या पोषक तत्वों को अधिक बार बदलना।

यहां उल्लिखित तरीकों की सीमाएं उपयोग किए जाने वाले जीन सर्किट, ऑप्टोजेनेटिक प्रौद्योगिकी परिशुद्धता और एलपीए इंटरफ़ेस जैसे अन्य उपकरणों जैसे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ रहती हैं। यहां वर्णित तकनीक सस्ती, निर्माण के लिए त्वरित, और ऑप्टोजेनेटिक रूप से इंजीनियर कोशिकाओं की आबादी के लिए 46 को मान्य करना आसान है। हालांकि, कुछ स्थानिक सीमाएं हैं, जैसे कि प्रकाश प्रेरण सेटअप में संशोधनों के बिना एकल कोशिकाओं को नियंत्रित करने में असमर्थता, जैसे कि डिजिटल दर्पण उपकरणों (डीएमडी) का उपयोग करना, हाल ही में जीवित कोशिकाओं में प्रदर्शित लाभों के साथ 60,61। इसके अलावा, यहां उल्लिखित तरीके ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के दौरान लाइव-सेल ट्रैकिंग में सीमित हैं, जो केवल पूरे प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम के अंत-बिंदु डेटा अधिग्रहण के लिए अनुमति देते हैं।

इन सीमाओं के बावजूद, यहां उल्लिखित ऑप्टोजेनेटिक तरीके डीएमडी जैसी मौजूदा तकनीक के पूरक हैं, जिनके पास वास्तविक समय में एकल कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए लचीलापन है, लेकिन उन नमूनों की संख्या से सीमित हैं जो एक उत्तेजित कर सकते हैं। इसके अलावा, यहां चर्चा की गई स्थिर सेल लाइन इंजीनियरिंग विधियों ने मौजूदा सिंथेटिक जीव विज्ञान विधियों के विपरीत जो अक्सर क्षणिक अभिकर्मकों के माध्यम से इंजीनियर आनुवंशिक प्रणालियों की विशेषता होती है। क्षणिक अभिकर्मक दृष्टिकोण कोशिकाओं के बीच अधिक जीन सर्किट कॉपी संख्या भिन्नता के कारण स्वाभाविक रूप से शोर कर रहे हैं। इसके विपरीत, यहां प्रस्तुत विधियों में मोनोक्लोनल सेल वेरिएंट शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक में एक जीन सर्किट कॉपी होती है। स्थिर सेल लाइनें सेलुलर पहलुओं की खोज करने की अनुमति देती हैं जैसे कि जीन अभिव्यक्ति भिन्नता, फेनोटाइपिक परिदृश्य पर प्रोटीन स्तर के प्रभाव, और महीन परिशुद्धता के साथ एकल-सेल विधियों के बाद से उच्च आत्मविश्वास है कि प्रत्येक सेल अपने पड़ोसियों के समान है।

यहां काम ब्याज के किसी भी जीनोमिक रूप से एकीकृत ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट को डिजाइन करने के लिए एक मंच को प्रदर्शित करता है, विश्वसनीय प्रयोगात्मक उपकरणों के साथ ऐसी प्रणालियों को प्रेरित करता है, और उन्हें विभिन्न प्रकार के जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक / फेनोटाइपिक एसेस के साथ एक मानकीकृत तरीके से विशेषता देता है। इन प्रोटोकॉल के भविष्य के सुधारों में डीएमडी जैसी अन्य ऑप्टोजेनेटिक प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके लाइव-सेल ट्रैकिंग के साथ इन तरीकों का एकीकरण शामिल हो सकता है, जो एकल-सेल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक अनुप्रयोगों के स्पैटिओटेम्पोरल नियंत्रण की अनुमति देगा। इस तरह की प्रगति एकल कोशिकाओं में रुचि के जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का उत्पादन करने के लिए प्रकाश उपयोग की अनुमति देगी, प्रतिलेखन / अनुवाद गतिशीलता स्थापित करेगी, प्रोटीन के स्तर को निर्धारित करेगी, और सेल माइग्रेशन, प्रसार, मेटास्टेसिस और भेदभाव सहित विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में उनकी भूमिका का अध्ययन करेगी।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम टिप्पणियों और सुझावों के लिए Balázsi प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं, डॉ कार्ल पी Gerhardt और डॉ Jeffrey जे Tabor हमें पहले LPA का निर्माण करने में मदद करने के लिए, और LOV2-degron plasmids साझा करने के लिए डॉ Wilfried वेबर. इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों [R35 GM122561 और T32 GM008444] द्वारा समर्थित किया गया था; भौतिक और मात्रात्मक जीव विज्ञान के लिए लॉफर केंद्र; और एक राष्ट्रीय रक्षा विज्ञान और इंजीनियरिंग स्नातक (एनडीएसईजी) फैलोशिप। ओपन एक्सेस चार्ज के लिए फंडिंग: एनआईएच [R35 GM122561]।

लेखक योगदान: M.T.G. और G.B. ने परियोजना की कल्पना की। M.T.G., D.C., और L.G., ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया। M.T.G., D.C., L.G., और G.B. ने डेटा का विश्लेषण किया और पांडुलिपि तैयार की। G.B. और M.T.G. ने परियोजना की देखरेख की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid - Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site

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Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).

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